Környezetvédelmi biotechnológia A környezetvédelem célja a természet megóvása, a természet szennyezésének megakadályozása, hulladékkezelés. Gyakran alkalmaznak biotechnológiai módszereket e cél eléréséhez. Talajok, természetes vizek, szennyvizek állapotának felmérése, a szennyezett területek tisztulási folyamatának nyomonkövetése Talajok, vizek minőségének meghatározása fizikai, kémiai, biológai vizsgálatok elvégzéséből és kielemzéséből áll. A kémiai minősítés a klasszikus komponensek, valamint mikroszennyezők, radioaktivitás meghatározása. Fizikai felmérések pl. a talaj porozitása, vizek sótartalma, hőmérséklet (pl. hőszennyezés esetén fontos). A szennyvizek, szennyezett talajok igen sokféle szerves anyagot tartalmaznak, melyek egyenkénti mennyiségi meghatározása (sőt kimutatása is) rendkívül körülményes, ezért mennyiségüket közvetve mérve azzal az oxigénmennyiséggel jellemezzük, mely adott körülmények között oxidálásukra elhasználódik. Az oxigénigény meghatározására kétféle módszert alkalmazunk: A természetben lejátszódó folyamatokat legjobban a biokémiai oxigénigény (BOI) közelíti meg, de időigényes. A BOI az az oxigénmennyiség, amely a vízben levő szerves anyagok aerob úton, meghatározott idő alatt történő (ált. 5 nap) biokémiai lebontása során elfogy. BOI 5 = mg O 2 /L. A teljes biokémiai oxigénigény (TBOI) a szerves szennyezők teljes lebontásához szükséges oxigén mennyisége. A BOI nagy időigénye miatt gyakrabban alkalmazzák a kémiai oxigénigény (KOI) meghatározást. A víz (talajminta) K permanganáttal vagy K dikromáttal (erélyesebb oxidálószer, így pontosabb eredményt ad) történő forralása során elhasználódott vegyszerrel egyenértékű oxigénfogyasztással jellemeznek. További mérhető paraméterek a szennyezettség illetve a tisztulás meghatározására a nitrogén, foszfor, szerves és totál szén tartalom, a ph, valamint a mikroflóra összetétele, változása is információt nyújt a vizsgált minta állapotáról. A biológiai vízminőség azon tulajdonságok összessége, melyek a vízi ökoszisztémák életében fontosak, létrehozzák, és fenntartják azokat: halobitás, trofitás, szaprofitás, toxicitás. A toxicitás a víz mérgezőképessége, olyan anyagok jelenléte, melyek a vízi élőlények életműködését zavarják, csökkentik az öntisztulóképességet. Pl. toxinok, bomlástermékek, szintetikus anyagok. Mértékét biológiai tesztekkel állapítják meg, azzal a hígítással jellemzik, melyben adott idő alatt a kísérleti élőlények fele életben marad. A gyakorlat első részében talajminták biológiai oxigénigényének meghatározását indítjuk el az öt napos BOI mérési módszer segítségével (Lásd később: A biológiai oxigénigény mérése). Szennyezett talajok, vizek mikrobiális tisztítása Az elmúlt évtizedekben a növekvő gazdasági aktivitásnak köszönhetően egyre nagyobb mennyiségű szennyező anyag került ki a természetbe, melyek nagymértékben károsíthatják az élővilágot. Az ipar egyre nagyobb mértékben használ szintetikus vegyszereket (jelenleg több, mint öt millió vegyi anyagot írtak le), melyek a természetes környezetben élő szervezetek számára ismeretlenek, így lebontásuk nem történik meg. A problémát fokozza, hogy a hulladékok általában 1
összetettek, számos szennyező anyagot, és azok bomlástermékeit tartalmazzák. Ezek felhalmozódása egy egy területen döntően befolyásolhatja a kialakult mikro és makroflórát. Szennyezett vizeket, talajokat előszőr mechanikai úton tisztítják, pl. levegőztetés, szűrők alkalmazása, égetés, ioncserélő gyantákon történő megkötés, stb. A mechanikai úton tisztított talajok, vizek azonban még jelentős mennyiségű szerves anyagot tartalmazhatnak. Ezek további tisztítására biológiai módszereket használnak. A szennyeződések általában többkomponensűek, egyrészt a szennyező anyag(ok), másrészt bomlástermékei(k) is jelen vannak. Ezek az anyagok bizonyos élő szervezetek számára tápanyagként szolgálhatnak, és kialakulhat egy természetes mikrobiológiai ökoszisztéma. Az egyedi fajok ritkán élik túl a többkomponensű (legtöbbször) toxikus környezetet. Az egymással szimbiotikusan együttélő mikrobák azonban képesek fennmaradni és felhasználni tápanyagként a környezetben jelenlévő vegyületeket. Ezt felismerve a mikrobiális eljárások nagy részében irányított tiszta kultúrák keverékét alkalmazzák a nagyobb tisztulás elérése érdekében. Aerob és anaerob eljárások egyaránt alkalmazhatók. Az aerob mikroorganizmusok a szerves vegyületek oxidatív lebontásakor felszabaduló energiát saját életműködésükhöz használják fel. A szerves anyagnak az energiatermeléshez használt része bonyolult biokémiai reakciókban szén dioxiddá, vízzé, stb, azaz szervetlen anyaggá, a szerves anyag fennmaradó része pedig legtöbb esetben sejtanyaggá alakul. A gyakorlaton egyféle mikroorganizmus segítségével mutatjuk be egy aromás vegyület mikrobiális lebontását, melyet három paraméter párhuzamos mérésével ellenőrzünk. A szulfanilsav Szulfanilsav bontása Sphingomonas sp vel A szulfonált aromás vegyületek egyik tipikus képviselője a szulfanilsav. Gyakorlati jelentősége igen nagy, mert azofestékek, növényvédőszereknek előállításában nagy mennyiségben használják, komoly jelentőségűek a gyógyászatban alkalmazott származékai, a szulfonamid készítmények. A szulfonamidok (pl a szulfanilamid, mely a szulfanilsav amidja) erős baktericid hatást mutatnak. Úgy bénítják a mikroorganizmusok szaporodását, hogy a folsav bioszintézishez szükséges para amino benzoesavat kiszorítják az enzim komplexéből, és ily módon blokkolják a reakciót [Bruckner 1979]. szulfanilsav NH 2 p aminobenzoesav NH 2 HO S O O HO O folsav O HO O OH N OH N N NH O H 2 N N N A szulfanilsav (M=173,19) szintetikus vegyület, az anilin közvetlen szulfonálásával nyerhető úgy, hogy az anilint tömény kénsavval 200 C ra hevítik [Bruckner 1979]. Hideg vízben igen rosszul, alkoholban nem oldódó vegyület. Ásványi savakkal nem képez sókat, mivel erősen savas szulfonsavcsoportja intramolekulárisan közömbösíti a gyengén bázisos aminocsoportot. 2
Xenobiotikus szulfoncsoportja és erős negatív töltése miatt sok baktérium sejtfalán nem vagy alig tud átjutni. Bár a szulfon csoportot hordozó aromás vegyületek általában mikrobiális módszerekkel nehezen bonthatóak, több baktérium törzset is sikeresen használtak ilyen típusú toxikus anyagok semlegesítésére. Sphingomonas subarctica A biológiai lebontó folyamatokban a Pseudomonas, Sphingomonas nemzettségek komoly szerepet játszanak. Talajban és természetes vizekben gyakran előfordulnak, ami e baktériumok fiziológiai változékonyságának, és széles táplálkozási szubsztrát spektrumának köszönhető. A Sphingomonas fajok közismert baktériumok a környezetvédelemmel foglalkozó kutatók körében. 1990 óta azokat a fajokat, melyek membránja szfingolipideket tartalmaz átcsoportosították új, Sphingomonas nemzetségként (régebben főleg Pseudomonas okként írták le őket). A legtöbb eddig izolált, degradációs képességéről nevezetes faj ebbe a csoportba sorolható. Pl. xilol, toluol, klórozott aromás vegyületeket, lignint bontó változatai ismertek e fajoknak. A gyakorlat során szulfanilsavat tartalmazó minimál tápoldaton (foszfátot, kalciumot, magnéziumot, nyomelemeket tartalmaz) szaporított S. subarctica tenyészet szulfanilsav bontó képességét követjük nyomon úgy, hogy mérjük a tápoldat szulfanilsav, szulfáttartalmának és szerves széntartartalmának időbeli változását. 3
Talaj ill. szennyvízminták szerves C tartalmának meghatározása (módosított Mebius módszer) A módszer elve: A talajban, szennyvízben lévő szervesanyag oxidációja tömény savas közegben K bikromát oxidálószer segítségével. A folyamat során a szerves szén CO 2 á alakul (ez alapján is lehet mérni IR vagy hővezetőképességi detektorral), a Cr(VI) pedig Cr(III) á redukálódik. A K bikromátot feleslegben alkalmazzuk, és a nem redukálódott bikromátot vas ammónium szulfáttal (Mohr só) visszatitráljuk. Az elfogyott titráló oldat mennyiségéből következtetni tudunk a vizsgált minta szerves széntartalmára. Létezik olyan módszer is, ahol titrálás helyett fotometriásan mérik a redukciót, de ez kevésbé pontos. A reakciót a klorid ionok zavarhatják, ebben az esetben kismennyiségű Ag 2 SO 4 t kell a talajhoz keverni. Problémát okozhat, ha sok redukált mangán és vas van a talajban. A módszer nem alkalmas nagy szerves anyag tartalmú talajok, (>8%) tőzegek, komposztok, kertészeti földkeverékek vizsgálatára. Ezekben az esetekben az izzítási veszteség alapján célszerű a szervesanyag meghatározása. A módszer során óvatosan kell dolgozni, jó huzatú vegyi fülke és védőfelszerelés szükséges a tömény savak használata miatt, és a K bikromát is méreg. Laboreszközök: analitikai mérleg, 100 és 250 cm 3 Erlenmeyer lombikok, 25 ml es büretta, 2 db savadagoló diszpenzer, 1 db dikromát adagoló diszpenzer Biztonsági eszközök: vegyi fülke, gumikesztyű, köpeny, üveggyöngy Vegyszerek, oldatok: desztillált v. ioncserélt víz koncentrált kénsav, legalább 96% os K dikromát oldat: Analitikai mérlegen bemérünk 2,4515 g K 2 Cr 2 O 7 t óvatosan beleszórjuk egy 100 cm 3 es főzőpohárba, desztillált vízben felodjuk, majd pontosan kiegészítjük 400 ml re. Titráló oldat (Mohr só): Bemérünk (legalább 0,01 g pontossággal) 7,8390 g Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 *6H 2 O t 200 cm 3 főzőpohárban lévő desztillált vízbe. Óvatosan hozzáadagolunk 1 cm 3 koncentrált kénsavat. Átöntjük, majd maradéktalanul átöblítjük egy 1 literes mérőlombikba, és kiegészítjük 1 L re. Ferroin indikátor (készen kapható, 1/40 N oldata) (Ag 2 SO 4 alkalmazása akkor szükséges, ha a talaj Cl ionokat tartalmaz) Szulfanilsav (SA) standard: 0,118 g SA 100 ml desztillált vízben oldva (6,94mM). (1g SA 0,416 g szenet tartalmaz, tehát 1 ml SA stanard = 0,5 mg C) A gyakorlat során nem talajmintával fogunk dolgozni! (csak azt szeretnénk szemléltetni, hogy talajra is alkalmazható, sőt elsősorban arra alkalmazzák) Eljárás talajminták esetén Talajminta előkészítése: A légszáraz talajt jól összekeverjük, kiveszünk belőle kb. 20 30 g ot, a szemmel látható szerves anyag (gyökérmaradvány, rovar stb.) maradványokat csipesszel kiszedjük, és dörzsmozsárban lisztfinomságúra öröljük és 0,5 mm es szitán átszitáljuk. A porítás azért fontos, hogy a szerves anyag oxidációja minél tökéletesebb legyen. 4
Roncsolás: Az analizishez 0,2 2,0 g ot lemérünk (szervesanyag tartalomtól függően) analitikai mérlegen és 100 cm 3 es Erlenmeyer edénybe helyezzük. 5 cm 3 (4x töményebb törzsoldatból, mint a törzsoldatoknál megadott érték) K bikromát oldatot öntünk a talajhoz. Vegyi fülke alatt 7 cm 3 tömény kénsavat adagolunk diszpenzer segítségével a lombikba, (vigyázat, azonnal forrni kezd!) gyengén összerázzuk, majd az elektromos főzőlapra helyezzük, és 1 5 percig forraljuk. 15 20 db üveggyöngyöt kell hozzáadni a kénsav bemérése előtt!!!! Vak oldat készítése: kétfajta vak oldatot készítünk 5 cm 3 4x K bikromát + 7 cm 3 kénsav hozzáadásával, legalább 2 2 ismétlésben. Az egyik a forralás nélküli vak, a másikat pedig 1 5 percig forraljuk. FONTOS! hogy a forralásra készített vakhoz tiszta üveggyöngyöket rakjunk előzetesen, mert különben hirtelen kifuthat forralás közben. A forralás nélküli vak oldat a Mohr só faktorozásához kell, a forralt vak pedig annak a megállapítására, hogy a forralás hatására mennyi K bikromát bomlik el. A forralás után, kb. 20 perc múlva az oldatok kihűlnek. A mintákhoz és a vak oldatokhoz 2.5 ml tömény foszforsavat adunk, majd óvatosan, 25 cm 3 desztillált vizet tartalmazó 200 cm 3 es Erlenmeyer lombikokba áttöltjük, és még kétszer kb. 10 cm 3 desztillált vízzel átöblítjük. Megvárjuk míg kihül (kb.20 perc) majd hozzákezdhetünk a titráláshoz. A gyakorlat menete: SA törzsoldatot használva hígítási sort készítünk (kalibráció): 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 mg C. A SA standard törzsoldatból a megfelelő mennyiségeket pipettával 100 ml s erlenmeyer lombikokba mérjük, és 2 2 ml re kiegészítjük őket desztillált vízzel. Az ismeretlen mintákból (gyakorlat második napján) 1 ml t mérünk szintén 100 ml s lombikokba, a végtérfogat 2 ml (desztillált vízzel egészítjük ki a mintát). (Magas C koncentráció esetén a mintát először hígítanunk kell desztillált vízzel, utána veszünk ki 1 ml t a méréshez.) Vegyi fülke alatt 2 ml K bikromát oldatot adagolunk a folyadékmintához, majd lassan! 5 cm 3 tömény kénsavat csepegtetünk diszpenzer segítségével a lombikokba, (vigyázat, azonnal forrni kezdhet!) gyengén összerázzuk, és a fülke alatt 10 percig inkubáljuk, időnként megrázzuk. Ha az oldatok kihűlnek a lombikok tartalmát maradéktalanul, óvatosan, 10 cm 3 desztillált vizet tartalmazó 200 cm 3 es Erlenmeyer lombikokba áttöltjük, és még kétszer kb. 5 5 cm 3 desztillált vízzel átöblítjük. Megvárjuk amíg ismét kihűl (kb.10 perc) majd hozzákezdhetünk a titráláshoz az indikátor (60µl) hozzáadása után. Az indikátor magas hőmérsékleten elbomlik, ezért csak a már lehűlt oldatba szabad belemérni! Titrálás: Az Erlenmeyer lombikokba 0.06 ml Ferroin indikátort cseppentünk és Mohr só oldattal 25 cm 3 es bürettából megtitráljuk. A fogyott ml értékeket feljegyezzük. A vak mintára (mely szenet nem tartalmaz) 12 13 cm 3 körüli lesz a fogyás. Ha a K bikromátnak több mint 70 % a redukálódott a roncsolás során akkor meg kell ismételni, kevesebb minta bemérésével. Színátcsapás: halvány kék(eszöld) barnás(rózsaszín). Szulfát tartalom mérése A szulfát (SO 2 4 ) a természetben mindenhol megtalálható, előfordul természetes vizekben, bányászati hulladékban, kőzetekben. Mérésére többféle megoldás létezik, ion kromatográfiás (0.1 mg SO 2 4 /L), gravimetriás (10 mg SO 2 4 /L), turbidimetriás (1 40 mg SO 2 4 /L) módszer. A gyakorlat során a turbidimetriás módszer segítségével mérjük a tápoldat szulfát tartalmát. A mérés elve: A szulfát ionok acetátos környezetben bárium kloriddal csapadékot képeznek, miközben bárium szulfát kristályok keletkeznek. Fotometriásan mérjük a Ba szulfát szuszpenzió fényelnyelését, és a szulfát koncentrációt standard kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg. (A 5
pontos mérést befolyásolhatja, ha a mérendő minta színes vagy csapadékos. Ha nagy mennyiségű szerves anyagot tartalmaz a minta, előfordulhat, hogy a Ba szulfát nem csapódik ki megfelelően). A módszer érzékenysége: a minimális detektálható koncentráció, 1 mg SO 4 2 / L. Kellékek: mágneses keverő, spektrofotométer (420 nm), stopperóra, bemérő kanál, köpeny. Vegyszerek, oldatok: 1. Bárium klorid (BaCl 2 ) 20 30 mesh kristályokkal 2. Puffer oldat: oldj fel 30 g MgCl 2 x 6 H 2 O, 5 g Na acetát (CH 3 COONa x 3 H 2 O), 1 g KNO 3 és 20 ml ecetsavat (99%) 500 ml desztillált vízben, majd egészítsd ki 1000 ml re. 3. Standard szulfát oldat: 0.1479 g vízmentes Na 2 SO 4 ot oldj fel desztillált vízben, és hígítsd 100 ml re (1.00 ml = 1000 µg SO 4 2 ). A gyakorlat menete: Kalibrációs egyenes készítése: 0 50 100 200 400 600 µg SO 4 2 /ml hígítási sort készítünk a szulfát törzsoldatból, kémcsövekbe mérjük (desztillált vízzel hígítunk), majd kiegészítjük azokat 10 ml re desztillált vízzel. /Az ismeretlen mintákból (gyakorlat második napján) 1 1 ml t mérünk a kémcsövekbe, és ezeket is kiegészítjük desztillált vízzel 10 ml re./ Ba SO 4 csapadék képzése: 10 ml mintát 25 ml s lombikba mérünk. Hozzáadunk 2 ml puffer oldatot, és mágneses keverőn kevertetjük. Keverés közben hozzáadunk egy spatula BaCl 2 ot, és azonnal indítjuk a stoppert. Egy percig tovább kevertetjük állandó sebességgel (fontos,hogy minden mintát azonos sebességgel keverjünk!!). Turbiditás mérés: az egy perc keverés eltelte után az oldatból öntsünk műanyag küvettába, és mérjük meg az oldat zavarosságát 420 nm en. Mindig ugyanazt a küvettát használjuk. (A mintáink mérése során különösen színes, zavaros oldatok esetén használjunk olyan kontrollt is, mely a szulfátot tartalmazza, de a BaCl 2 ot nem, mely azért fontos, hogy a minta önmagában való zavarosságát megmérve, a kapott értéket le kell vonni a BaCl 2 dal kapott értékből!!) 6
Szulfanilsav tartalom mérése Az aromás vegyületeknek van fényelnyelése az ultraviola tartományban. Általában 254 nm en jól mérhetőek, ettől eltérő lehet az elnyelési maximumuk a funkciós csoportoktól függően. A szulfanilsav (SA) fényelnyelési maximuma 248 nm en mérhető, a méréshatár 100 µm SA. A mérés menete: Kalibráció sort készítünk 1 mm SA törzsoldatból 0 100 µm tartományban. A hígításhoz desztillált vizet használunk. Majd kvarcküvettában megmérjük az egyes hígítási pontok fényelnyelését 248 nm en. Az ismeretlen mintákat (gyakorlat 2. napján) 100x hígítjuk desztillált vízzel, jól összekeverjük, és a hígított mintáknak megmérjük a fényelnyelését 248 nm en. Szennyvizekben, szennyezett talajokban az oxigénfogyasztás mérése Szennyvizek, szennyezett talajok vizsgálata során hasznos információt nyújthat a szennyezettség fokáról, és a mikroflóra jelenlétéről vagy hiányáról az oxigénfogyasztási ráta mérése. Mérni lehet oxigén szenzitív elektróddal a minta oldott oxigén szintjét, a legjobb megoldás erre a membránelektród módszer, melynek lényege, hogy az elektród egy oxigén permeábilis membránnal védett, ami védi az elektródot a szennyeződésektől, de az oxigén számára átjárható. Állandó feltételek mellett a mért áram (kiírón megjeleníthető, és a ráillesztett egyenes meredekségéből számolható az oldott oxigén konc. változása) egyenesen arányos az oldott oxigén koncentrációval. A biológiai oxigénigény meghatározására alkalmazott öt napos mérési módszer egyszerű, bár hosszadalmas. A mérendő minta szervesanyagainak biokémiai elbontásához felhasznált oxigén koncentrációt határozhatjuk meg (figyelembe kell venni azonban, hogy a szulfidok, Fe 2+ ionok, valamint a nitrogén redukált formáinak oxidálására elhasznált oxigént is mérjük ebben a tesztben. Az utóbbi inhibítorokkal gátolható). Amennyiben egy mikroorganizmus képes felhasználni a talajban található szennyeződéseket, az ehhez szükséges oxigén fogyasztás mértéke az alábbi módszerrel egyszerűen detektálható. BOI 5 mérése: Kellékek: BOI üvegek tartozékokkal, inkubátor (20 C), mérleg Anyagok: erősen szennyezett talaj, vagy szennyvíz minta 5 x M9 törzsoldat: 15 g KH 2 PO 4, 64 g Na 2 HPO 4 x 7H 2 O, 2,5 g NaCl (ph=7,0) M9 minimál tápoldat: 200 ml 5 x M9, 2 ml 1 M MgSO 4, 0,1 ml 1 M CaCl 2 felhasznált mikroorganizmusok: pl. Sphingomonas sp., Bacillus fajok, Streptomyces sp., talajizolátumok, Pseudomonas fajok, Enterobacter sp., A gyakorlat menete: Mérlegen lemérünk 5 5 g talajt, vagy 10 ml szennyvizet, majd M9 tápoldattal belemossuk a BOI üvegekbe (a végtérfogat 97 ml legyen). A negatív kontroll üveg kivételével az üvegekbe 5 5 ml mikroorganizmus kultúrát mérünk, keverőbotot dobunk bele, a kosárba két két NaOH szemcsét ejtünk, majd lezárjuk a speciális mérőfejjel az üvegeket (A NaOH szerepe, hogy a keletkező CO 2 ot megkösse. A mérőfej az oxigén fogyasztás által kialakult nyomásváltozást méri, amit a keletkező 7
széndioxid pontatlanná tenne). Az indításhoz nyomjuk le egyszerre a fejen lévő két fekete gombot, és lenyomva tartjuk a 00 megjelenéséig. Az üvegeket 20 C os inkubátorban lévő keverőlapra tesszük. Öt nap elteltével az üvegek fejében tárolt adatokat leolvassuk, kiértékeljük. Az M gomb megnyomásával megjelenítjük a számokat, léptetni az S gomb megnyomásával lehet. Az S gombot kétszer kell megnyomni, hogy megjelenjen az I., mely az első napot jelenti, rögtön megjelenik a hozzátartozó érték is, majd az S megnyomásával lépünk tovább a 2. napra. A leolvasott adatokat 97ml térfogat esetén 20 al megszorozva kapjuk meg az oxigén igény értékeket mg O 2 /L ben. Feladat: a kapott értékek elemzése, értékelése a kontroll(ok) figyelembevételével. A talajminta mikroflórájának vizsgálata A talajok, természetes, és szennyvizek minőségéről információt nyerhetünk, ha megvizsgáljuk azok mikroflóráját. Erősen szennyezett minták esetén, a természetes mikroflóra elpusztul, és csak olyan mikrobiális élőlényeket találunk, melyek képesek voltak a rendkívül toxikus környezethez adaptálódni, a fellelhető szervesanyagot tápanyagként felhasználni. Kellékek: mérleg, szűrőpapír, tölcsér, 100 ml s Er. lombik, rázógép, (centrifuga) Anyagok: szennyezett talajminta, 0.85 % NaCl (fiziológiás sóoldat), LB tápagar lemez (mely élesztőkivonatot, triptont, NaCl ot és agart tartalmaz) A gyakorlat menete: Mérlegen lemérünk 1 g talajt, majd a lombikba mossuk 10 ml fiziológiás sóoldattal. Két órán át rázógépen kevertetjük közepesen erős keveréssel, szobahőmérsékleten. Az elegyet leszűrjük, (ha nagyon kevés mikroorganizmusra számítunk a szűrletet le lehet centrifugálni, és a csapadékot 1 ml fiziológiás sóoldatban felszuszpendálni, így kisebb térfogatban kapjuk meg a talajmikrobákat) és 10 µl t tápagarra kikenünk, 30 C on inkubáljuk. Egy nap, illetve egy hét után vizsgáljuk a telepképződést. Húsfeldolgozó üzemekben keletkező keratintartalmú hulladék lebontása mikrobiológiai úton Demostratív gyakorlat a napi aktuális problémák közül. Be szeretnénk mutatni egy olyan újonnan kifejlesztett illetve még jelenleg is fejlesztés alatt álló eljárást, amelynek során a húsipar által kibocsátott nagy mennyiségű keratin fehérjét tartalmazó hulladék mikrobiális eljárással feldolgozható. Önmagukban a toll, szőr, köröm, képletek nem toxikusak, azonban szervesanyagtartalmuk igen nagy, így veszélyes hulladéknak minősülnek. Elhelyezésükre, megsemmisítésükre jelenleg nincs elfogadott módszer, így igen fontossá válik mikrobiális lebontásuk. Az állati eredetű tollak, szőrők természetes úton nagyon lassú mikrobiális aktivitás eredményeképpen lebomlanak. A toll, szőr képletek stabilitását az azokat felépítő keratin szálak között kialakult kénhidak biztosítják. A baromfi feldolgozó üzemekben nagy mennyiségben keletkező hulladékot a természetes folyamatnál sokkal gyorsabban kell eltávolítani a környezetből, hiszen elhelyezése, tárolása gondot jelent. 8
A biológiai lebontáshoz megfelelő mikroorganizmust kellett találni, mely az üzemekből kikerülő tollat hatékonyan elbontja nagy mennyiségben is. Elsősorban dermatofita gombák, Streptomycesek, Bacillus licheniformis bontják több kevesebb sikerrel. Sikerült izolálnunk egy mikroorganizmust, mely rövid adaptációs idő után képes a leforrázott tollat egy nap alatt elbontani extracelluláris proteázai segítségével, és saját szaporodásához felhasználni a szerves anyagot. Hosszúkás, pálca formájú baktérium, mely kedvezőtlen körülmények között gömb formájú, mikroszkóp alatt látványos, fényes spórákat képez. Előnye, hogy már az inkubálás első napján elkezdi termelni keratinolitikus aktivitású extracelluláris proteázát. A keratin vízben oldhatatlan fehérje (1. ábra), mely igen ellenálló a proteolitikus aktivitással rendelkező enzimekkel szemben. Három fő csoportba sorolható fehérje építi fel: 1. glicin/tirozin gazdag fehérjék (6 9K) 2. alacsony kéntartalmú fehérjék (40 60K), melyek ~10nm es filamentumokat alkotnak 3. magas kéntartalmú fehérjék (10 25K). Az 1. és 3. csoportba tartozó fehérjék a filamentumok közötti anyagot képezik. A filamentumok között kénhidak és másodlagos hidrogén kötések alakulnak ki, melyek nagy számuk miatt megnehezítik a keratin mikrobiális lebontását. Habár keratin felhalmozódás a természetben eddig nem volt tapasztalható, lebomlása igen lassú folyamat. Több módszer is lehetséges ezen diszulfid hidak felhasítására. Ezek közül említhetjük a kémiai kezeléseket. Az egyik legdrasztikusabb módszer a savas hidrolízis. Ez esetben teljesen elroncsoljuk a fehérjét NaOH al való kezelés esetén töménységtől függően a keratin fehérjét aminosavaira bontjuk, és a keletkezett hidrolizátumot tápanyagként alkalmazzuk a baktériumok számára. A hidrolízist magas hőmérsékleten (forralva) kell elvégezni. Egyéb kémiai módszerek is léteznek pl.: thioglikolsav, dithiothreitol vagy dimetilszulfoxid redukálószerekkel történő előkezelések, azonban az itt alkalmazott vegyszerek környezetet károsító, veszélyes anyagoknak minősülnek, ezért ezek a módszerek nem jelenthetnek megfelelő megoldást. További lehetséges megoldás a hőkezelés. Magas hőmérsékleten, nyomás alatt a keratinban lévő kénhidak jelentős része elbomlik, közben káros melléktermék nem keletkezik. 9
Hidrofób és van der Waals kölcsönhatások Hidrogén kötés Polipeptid váz Diszulfid híd Ionos kötés 1. ábra Az α keratin szerkezeti felépítése Hőkezelést követően a fehérje elveszíti stabil szerkezetét, így a mikróbák által termelt proteázok számára hozzáférhetővé válik. A mikroorganizmusok által termelt proteázoknak több típusa létezik. Azon proteázokat, melyek a sejten kívül fejtik ki aktivitásukat extracelluláris proteázoknak, amelyek a sejten belül intracelluláris proteázoknak nevezzük. A keratin tartalmú szennyeződések eltávolítására csak az extracelluláris proteázok jöhetnek szóba. A proteázok csoportosíthatóak aszerint, hogy milyen felépítésű aktív centrummal rendelkeznek. Léteznek szerin, cisztein, aszparagin típusú, illetve metalloproteázok. A metalloproteázok aktív centrumában fém iont találunk, míg a szerin, cisztein és aszparagin títusú proteázok aktív centrumában szerin, cisztein illetve aszparagin helyezkedik el. További fontos ismertetőjegye a proteázoknak működésük ph optimuma. A ph optimum alapján megkülönböztetünk alkalikus, semleges és savanyú proteázokat. Egyes enzimek aktivitása magas hőmérsékleten maximális, ezeket nevezzük hő, vagy termostabil proteázoknak. A GYAKORLAT MENETE 10
A kísérlet során a mikroorganizmust tápanyagdús (pepton, húskivonat) oldatban előneveljük. A hőkezelt tollat tartalmazó foszfátos oldatba (ph=8.0) inokuláljuk az előnevelt sejtek egy ml ét. A kultúrát 43 C on, 150 rpm sebességgel keverve növesztjük. Másnapra jól látszik a tollakon a változás, demonstrálva, hogy ilyen komplex összetett stabil struktúrák, mint a toll is bonthatóak mikrobiológiai módszerekkel. (Az intenzív növekedési szakaszban a kultúrához friss tolldarabokat (hőkezelt, nem hőkezelt) mérhetünk). Az enzim jelenléte kimutatható enzimaktivitás méréssel a tápfolyadékból. A lecentrifugált sejtek felülúszóját használjuk, szubsztrátként pedig oldott keratint, ennek hiányában kazeint vagy bovine serum albumint (BSA). A reakcióelegy összemérése után 50 65 C közötti hőmérsékletet biztosítva, nyomonkövethető a fehérjetartalom változása 280 nm en. Vízoldékony keratin előállítása: Hibino [Hibino 1985] eljárását alkalmazzuk módosítva: autoklávozzuk a keratin tartalmú anyagokat 142 C on, 45 percig. Ezt követően mossuk 140 mm NaCl, 100 mm TRIS HCl, ph=8.0 pufferoldatban. A nem oldódó frakcióhoz 8 M urea, 50 mm 2 merkaptoetanol, 25 mm TRIS HCl, ph=9.0 pufferoldatot adunk, majd inkubáljuk egy éjszakán keresztül 45 C on. A felülúszót 5 mm TRIS HCl, ph=3,5 oldatban dializáljuk. A keratin ph=5.0 alatt kicsapódik. A kapott csapadékot lecentrifugáljuk (10000 rpm, 10 perc), majd 5 mm foszfát pufferoldatban feloldjuk (ph=8.0). Enzimaktivitás mérés: Poliakrilamid gélen: Fehérjével (1 mg/ml BSA, kazein, keratin) keresztkötött poliakrilamid gélelektroforézis: elkészítjük az akrilamid gélt a szokásos módon [Sambrook és mtsai 1989], azzal a különbséggel, hogy az elegyhez még polimerizáció előtt hozzámérjük a fent említett fehérjék egyikét. A mintákat forralás nélkül mérjük a gél zsebeibe, az aktivitás megóvása érdekében. A futtatás után a gélt 50 ml 2.5 % Triton X 100 oldatban mossuk. A megmosott gélt 50 ml 0.1 M glicin NaOH ph=8.3 oldatban min. 4 órát inkubáljuk, majd Coomassie Brillant Blue R 250 festékkel tesszük láthatóvá a gélben az el nem bontott fehérje hátteret. A nem specifikus festődést színtelenítő oldattal távolítjuk el. Fotometriás úton: A keratin tartalmú reakcióelegy fehérjetartalmának változását 280 nm en követjük nyomon, az enzimet tartalmazó oldat hozzáadását követően. Reakcióelegy összetétele: 5 mm foszfát puffer (ph=8.0), 0,5 ml 0,3 mg/ml es keratin oldat, 0,2 mg/ml fehérjét tartalmazó enzimoldat 3 ml végtérfogatban. 11
Jegyzőkönyv Biotechnológia gyakorlat 4. éves környezettudós hallgatóknak, Biotechnológiai Tanszék 2007 2008 II. félév Név: 1. BOI 5 leolvasott érték x 20 (97 ml esetén) = mg O 2 /L mikroorganizmus leolvasott értékek alapján számolt oxigénigény (mg O 2 /L) talaj: 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap 5. nap 1 Ø 2 3 4 5 6 Az adatok alapján a kísérlet értékelése: 12
2. Talaj mikroflóra vizsgálatának eredménye 3. Keratin hulladék biodegradációja 13
14
4. A tápoldatban oldott szerves széntartalom változása a szulfanilsav mikrobiális bontása során a, Kalibrációs egyenest készítünk 0,5 mg C/ml szulfanilsav (SA) standardból készült hígítási sorozat segítségével. (A kapott értékeket ábrázoljuk milliméter papíron) mg C 1 0.0 2 0,1 3 0,2 4 0,3 5 0,4 6 0,5 µl SA standard titráló oldat fogyása (ml) b, A szulfanilsav tartalom változásának nyomonkövetése a szulfanilsavas tápoldat (felülúszó) szerves széntartalmának mérésével a fenti adatokból elkészített kalibrációs egyenes alapján: mintavétel ideje 0 1 óra 1,5 óra 2 óra titráló oldat fogyása (ml) a számolt koncentráció (mg C/ml tápoldat ) 15
5. A tápoldat szulfát tartalmának változása a szulfanilsav mikrobiális bontása során a, A szulfát kalibráció pontjai: mg SO 4 2 / ml 1 0 2 0,05 3 0,10 4 0,20 5 0,40 6 0,60 µl Na 2 SO 4 törzsoldat (1000 µg SO 4 2 / ml) OD 420 b, A szulfát koncentráció változásának nyomonkövetése a szulfanilsavas tápoldat (felülúszó) szulfáttartalmának mérésével a fenti adatokból elkészített kalibrációs egyenes alapján: mintavétel ideje a minta szulfát 0 OD 420 konc. (mg/ml) mg S /ml 1 óra 1,5 óra 2 óra 16
6. A tápoldat szulfanilsav tartalmának változása a szulfanilsav mikrobiális bontása során Szulfanilsav (M=173,19) kalibráció: SA konc. (mm) 1 0 2 0,01 3 0,02 4 0,04 5 0,06 6 0,08 7 0,10 µl szulfanilsav törzso. (1 mm) OD 248 b, A szulfanilsav tartalom változásának nyomonkövetése a szulfanilsav (SA) bontó baktérium tápoldatának felülúszójában: Elfogyott mintavétel ideje a minta SA konc. SA kén 0 1 óra 1,5 óra 2 óra OD 248 tartalma mm SA mgsa/ml mgc/ml mgs/ml 17
Feladatok: 3 kalibrációs egyenes készítése; a szerves szén mérésből kapott C tartalom összehasonlítása a szulfanilsav tartalom mérésből számolt C tartalommal grafikonon az idő függvényében; az időben változó, a tápoldatban feldúsult szulfát tartalomból ki kell számolni a kén tartalmat, valamint az elfogyott! szulfanilsav tartalomból is ki kell számolni a kén tartalmat, és a kettőt együtt szintén ábrázolni kell az idő függvényében. A szulfanilsav bontás eredményeinek összefoglalása, következtetések: 18