Tartalomjegyzék. Jellemző kutatások. Enzimológiai Intézet Biofizikai Intézet Genetikai Intézet Növénybiológiai Intézet...

Átírás

1 Tartalomjegyzék Az MTA SZBK főigazgatói, igazgatói és akadémikusai... 2 Az SZBK vezetői... 4 A születéstől az érett felnőttkorig: gondolatok az SZBK történetéről... 5 Enzimológiai Intézet Ovádi Judit: Sejtarchitektúra Csoport Patthy László: 44 év az szbk kötelékében Simon István: a Fehérjeszerkezet Kutatócsoport Tartalomjegyzék Jellemző kutatások az SZBK intézeteiben Tompa Péter: Negyed század az Enzimológiai Intézetben Závodszky Péter visszaemlékezései: 40 éves az szbk Biofizikai Intézet Ormos Pál: Optikai manipuláció speciális alakú testek alkalmazásával Dér András: Bakteriorodopszin-kutatás az szbk Biofizikai Intézetében Páli Tibor: Membránszerkezet és Dinamika Csoport Siklós László: Molekuláris Neurobiológiai Csoport Kovács Kornél: Energiaátalakító Redox Enzimek Laboratórium Zimányi László: Metalloprotein Biofizikai Csoport Biokémiai Intézet Kiss Antal: Restrikciós endonukleázok és dns-metiltranszferázok, a dns-kutatás eszközei Boros Imre: Variációk dns-sel és fehérjékkel: a transzkripciószabályozás - kutatás egyik iránya a Biokémiai Intézetben, a kezdettől máig Vígh László : Stressz, stresszbetegségek, lipidterápia Pósfai György: Szintetikus biológia: a kólibaktérium (Escherichia coli) áramvonalasítása Papp Balázs és Pál Csaba: Genomika, Rendszerbiológia és Evolúció (Evolúciós Rendszerbiológiai csoport) Genetikai Intézet Endre Gabriella: A nitrogénkötő szimbiózis molekuláris folyamatainak felderítése: A baktérium és növény együttélésének titkai Hadlaczky Gyula: Kromoszómakutatás. Szubjektív emlékképek tudományos tények Raskó István: Emlőssejtgenetikától a rákkutatásig Andó István: 40 év immunológia az szbk-ban Kiss István: A Fejlődésgenetikai Csoport 40 éve Növénybiológiai Intézet Dudits Dénes, Fehér attila és Magyar Zoltán: Tenyésztett sejtek osztódása, differenciálódása: út az új génkombinációkat hordozó növényekhez Vass Imre és Hideg Éva: A fotoszintetikus apparátus működése és fotooxidatív károsodása Garab Győző és Gombos Zoltán: Négy évtized a fotoszintézis-kutatásban. Membránok és proteinkomplexek önszerveződő rendszerei Györgyey János, Horváth V. Gábor és Szabados László: A növényi stressztűrés molekuláris háttere és növelésének biotechnológiai lehetőségei Nagy Ferenc, Kozma-Bognár László és Szekeres Miklós: A fény, a biológiai óra és a hormonok által szabályozott jelátviteli hálózatok molekuláris alapjai növényekben

2 Az SZBK vezetői Az MTA SZBK Főigazgatói, 1971 Straub F. Brunó Az SZBK alapító főigazgatója Alföldi Lajos Keszthelyi Lajos Dénes Géza Farkas Gábor Szabolcsi Gertrúd Garay András Friedrich Péter Kondorosi Ádám Patthy László Raskó István 2 Erdélyi Miklós Buday László

3 igazgatói és akadémikusai Az SZBK vezetői 2011 Venetianer Pál Dudits Dénes Ormos Pál Keleti Tamás Farkas Tibor Wollemann Mária Solymosy Ferenc Vígh László Vass Imre Pósfai György Závodszky Péter Kondorosi Éva Nagy Ferenc 3

4 Az SZBK vezetői Az SZBK vezetői Főigazgatók: Straub F. Brunó ( ) Alföldi Lajos ( ) Keszthelyi Lajos ( ) Venetianer Pál ( ) Dudits Dénes ( ) Ormos Pál (2010 ) Biofizikai Intézet: Garay András ( ) Keszthelyi Lajos ( ) Ormos Pál (1994 ) Igazgatók: Biokémiai Intézet: Straub F. Brunó ( ) Wollemann Mária ( ) Venetianer Pál ( ) Vígh László ( ) Pósfai György (2004 ) Enzimológiai Intézet: Straub F. Brunó ( ) Keleti Tamás ( ) Friedrich Péter ( ) Závodszky Péter ( ) Buday László (2010 ) Genetikai Intézet: Alföldi Lajos ( ) Raskó István ( ) Erdélyi Miklós (2010 ) Növénybiológiai Intézet: Farkas Gábor ( ) Solymosy Ferenc ( ) Dudits Dénes ( ) Vass Imre (2000 ) Alföldi Lajos Dénes Géza Dudits Dénes Farkas Gábor Farkas Tibor Friedrich Péter Garay András Akadémikusok: Keleti Tamás Keszthelyi Lajos Kondorosi Ádám Kondorosi Éva Nagy Ferenc Ormos Pál Patthy László Straub F. Brunó Szabolcsi Gertrúd Venetianer Pál Vígh László Závodszky Péter 4

5

6 Gondolatok az SZBK történetéről 6 túra megújításának az igényével, e folyamat szervezése az újonnan alakuló Osztály legelső feladata volt. Már az induló lépések során, 1963-ban meghatározták a komoly infrastruktúra-fejlesztéssel támogatandó irányokat. A meglévő Biokémiai és Genetikai Intézetek lényeges fejlesztését jelölték ki, illetve két új intézet biofizikai és növényélettani alapításának szükségességét állapították meg. Figyelemre méltó, hogy a koncepció rögtön központjellegű létesítményre vonatkozott. Az új központ egy régebbi, 1950-ben készített tanulmány modernizációjának is tekinthető akkor a Fővárosi Növény- és Állatkertet a Hűvösvölgybe gondolták áttelepíteni, és ehhez kapcsolódva terveztek létrehozni egy Kutató Állomást. Bár az Állatkert elköltöztetése lekerült a napirendről, a Biológiai Osztály új koncepcióját e régebbi terv újraélesztésével kívánta megvalósítani, természetesen a Hűvösvölgyben. Az, hogy a Központ végül Szegeden épült meg, az akkoriban domináns kultúrpolitika eredménye volt, amely a decentralizációt helyezte előtérbe: az Országos Tervhivatal csak vidéki telephelyen támogatta az új intézet létesítését. A történeti hűséghez hozzátartozik, hogy a vidéki elhelyezést kezdetben nem támogatták a létrehozók, köztük Straub sem, de végül a felsőbb politika döntött a kérdés már csak az maradt, melyik vidéki város lesz a szerencsés kiválasztott. Straub F. Brunó ezt követő hozzáállásában nyilvánvalóan közrejátszott, hogy korábban ő maga is Szent-Györgyi Albert munkatársaként nagyon eredményesen dolgozott Szegeden, és ez nemcsak az ő életében volt meghatározó, hiszen ez a szegedi időszak kiemelkedett a magyar tudomány történetében, valódi aranykor volt. Végül valamennyi adottságot mérlegelve a Tudományos és Felsőoktatási Tanács Szeged mellett tette le a garast ( ahol a meglévő egyetemi tanszékekkel illetve klinikákkal, valamint a Botanikus Kerttel való jó együttműködés és a továbbfejlesztés feltételei megfelelően biztosíthatók. ). A biológiai kutatóközpont megvalósítása az akadémiai kutatóhálózat kereteiben Megszületett tehát a döntés a Szegedi Biológiai Központ létrehozásáról. A központ az MTA kutatóintézeti hálózatának új tagja lett. Általa teljesedett ki az akadémiai kutatóintézetek tematikai palettája, ma valamenynyi tudományterület képviselteti magát a rendszerben. Kell itt néhány szót ejteni az akadémiai kutatóintézetekről általában, hiszen a kutatóhálózat teljes koncepciója, az ország kutatási rendszerében betöltött helyzete időnként viták tárgya. A kutatóhálózat valóban szovjet mintára jött létre a második világháború után. Az eredeti szovjet koncepciónak része volt az is, hogy a szellemi függetlenséget igénylő kutatásokat válasszák el a fiatalokkal foglalkozó egyetemektől, ahol a nagytömegű szakemberképzés révén a fiatalokkal kialakuló intenzív szellemi kapcsolat miatt a gondolkozást jobban akarták ellenőrizni. Mivel a kutatást a kisszámú kutatóintézetekre koncentrálták, itt jelentősen előnyösebbek voltak a körülmények, mint az egyetemeken. Ez a kiváltságos helyzet Magyarországon azonban a nyolcvanas évekre teljesen megszűnt, mégis, a dogmák sokáig tartják magukat, ma is gyakran találkozunk olyan véleményekkel, amelyek a kutatóintézetek megkülönböztetett támogatásáról szólnak. Időnként a kutatóintézetek szükségességét is megkérdőjelezik, mondván, a mai helyzetben elegendő az egyetemek kutatói kapacitása egy ország tudományos aktivitásához. A szovjet minta sem használ az általános kép alakulásának. Jó azonban emlékeztetni arra, hogy az eredeti szovjet akció mintája a német Kaiser Wilhelm Institut hálózata volt, ez alakult át később a méltán híres mai Max-Planck intézethálózattá. Anélkül, hogy e helyen különösen részletesen érvelnénk a kormány által fenntartott, koncentrált tudományos kutatást lehetővé tevő kutatóintézetek létjogosultsága mellett, elég talán megjegyezni, hogy valamennyi fejlett országban, amelyekben magas színvonalú kutatás-fejlesztés folyik, és amelyekhez egyébként minden tekintetben hasonlítani szeretnénk, működnek ilyen intézethálózatok. Ezen intézetek szervezeti helyzete országonként más és más. Magyarországon úgy alakult, hogy a gazda a Magyar Tudományos Akadémia. Meggyőződésem, hogy ez a megoldás kiállta az idők próbáját, jól működő rendszer alakult ki. E környezetben hosszú távon biztosítva van a kutatóintézetek jó hatásfokú, biztonságos működése. Az SZBK beindítása Az SZBK megalapításáról szóló 1965-ös döntéstől az 1971 évi beindításig eltelt hat év intenzív előkészítő munkával telt. A szervezés motorja Straub F. Brunó,

7 illetve Láng István, az MTA későbbi főtitkára voltak. Jól megtervezett koncepcióval, szisztematikus munkával válogatták a majdani szegedi kutatókat: már tapasztalatot szerzett éves, vezetőnek kiválasztott kutatókat és frissen végzett tehetséges fiatalokat nyertek meg az ügynek, évente tervszerűen új kutatói státuszokat adtak e célra. Az SZBK-hoz rendelt státuszokkal a gyarapodó gárda a legjobb magyar kutatóintézményekben dolgozott, képezte magát. E rendkívül gondos, előrelátó előkészítés eredményeként az 1971-es induláskor már egy nagyjából kialakult kutatói csapattal tudott beindulni a munka. Az indulást az UNESCO másfél millió dolláros támogatása is segítette: ezzel lehetőség nyílt nagyműszerek vásárlására, külföldi szakértők meghívására, illetve a magyar kutatók külföldi tanulmányútjainak a finanszírozására. A fenti lehetőségek, és a példátlanul demokratikus akkori vezetés eredményeként aztán nagyon hamar igen aktív, a bezártságot nem ismerő, inspiráló kutatói atmoszféra alakult ki Szegeden, ez akkortájt (az akkori viszonyok ismerői pontosan tudják, miről beszélek) valóban kivételes közeget teremtett, sok évvel megelőzte korát. Mindazok, akik részesei lehettek ennek az aranykornak, nosztalgiával és szeretettel gondolnak vissza erre az időszakra amely persze a fiatalságuk okán is különleges helyet foglal el életükben. Természetesen ez a kiváltságos helyzet mára megszűnt, a környezet mindenütt megváltozott, az akkori korra jellemző korlátok mindenütt eltűntek, az anyagi lehetőségek kiegyenlítődtek. Ez így természetes. Mindenesetre a hősi kor tanúi, résztvevői szeretnének a hangulatból, a lelkesedésből minél többet megtartani, átadni a fiataloknak, és a jelenlegi vezetés is mindent megtesz azért, hogy a ház méltó legyen a nagy elődökhöz. A Központ működése Az új intézet kutatóközpontként valósult meg. A koncepciót részben az alkalom szülte, hiszen egyszerre több intézetet hoztak létre a molekuláris biológia teljes tematikájának a lefedésére. Az új kutatóközpont egyetlen telephelyen épült meg. A szegedi központhoz csatlakozott az eredeti, budapesti székhelyű Biokémiai Intézet, ez, mint a Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézete, a Központ ötödik intézete lett. Ebben a felállásban remekül működött a központ, egészen a közelmúltig ben, alapvetően adminisztratív okok (új kincstári törvényi előírások) miatt nem maradhatott meg egy intézményként a több telephelyű szervezet, és az Enzimológiai Intézet mint MTA Enzimológiai Intézet jogilag és szervezetileg függetlenné vált. A szegedi intézmény hivatalos neve pedig 2010 ősze óta Szegedi Biológiai Kutatóközpont. Ettől függetlenül, az adminisztratív döntés a szakmai kapcsolatokat nem befolyásolja, a szoros együttműködés változatlanul folytatódik. A központ jellegű működés számos előnnyel jár, mind a működtetés, mind pedig a szakmai élet szempontjából. A független, de rokon területeken működő, és ezért hasonló infrastrukturális igényekkel rendelkező kutatóintézetek kiszolgálása közös szervezetekkel gazdaságosan megoldható, az épület költségei alacsonyabbak, mintha külön lennének elhelyezve. A ház működését biztosító, illetve adminisztratív feladatokat, mint a gazdasági vezetés, üzemeltetés, karbantartás, beszerzés, kapcsolattartás stb., közösen fenntartott csoportokkal oldjuk meg. Legalább ilyen lényegesek a tematikailag rokon intézetek hasonló érdeklődéséből, igényeiből adódó előnyök. A szakmai rokonság a műszerigényeket is meghatározza, a nagyműszerparkunk a teljes központot szolgálja ki, lényegesen javítva a rendszer hatásfokát. Ugyanígy közös a könyvtár: a négy intézet erőforrásainak összegzésével egyedülálló biológiai könyvtárat sikerült kialakítanunk, és mindent megteszünk fenntartásáért a mai nehéz időkben. Talán a legfontosabb hozadéka a közös elhelyezésnek az intenzív szakmai kapcsolat. A kutatás egyik legfontosabb megtermékenyítője a tapasztalatcsere hasonló területen dolgozó kutatókkal. Úgyszintén nagyon fontos a kapcsolat a távolabbi területek kollégáival, a rendszeres eszmecserék, egymás munkáinak megismerése segít a látókör kiterjesztésében, új szempontok elsajátításában, ezek megtermékenyítően hathatnak új irányzatok elindításában. Természetesen e kapcsolatok kiépítése, ápolása fontos, függetlenül attól, hogy milyen körülmények között dolgozik a kutató. A Szegedi Biológiai Kutatóközpontban e jó kapcsolatteremtési lehetőségek mind megvannak, a kutatók feladata ezek optimális kihasználása. Valóban, intenzív együttműködés folyik az egyes intézetek csoportjai között a vezetés feladata e kapcsolatok további erősítése. Gondolatok az SZBK történetéről 7

8 Gondolatok az SZBK történetéről 8 Alapfeladatunk: a kutatás Alapfeladatunk a magas színvonalú kutatás a modern molekuláris és sejtbiológia területén. Korábban már említettem, hogy alapításunkkor forradalmi változást képviselt a központ a magyarországi molekuláris biológiában. A modern biológia egyik kulcsfogalma a génsebészet. Az eljárás az élőlények genetikai állományának megismerését, akár megváltoztatását takarja. Óriási elméleti, gyakorlati jelentőségű új lehetőség nyílt ezzel az élővilág megismerése terén. Rendkívül szerteágazó ma már a terület, alapjaiban változtatta meg a biológiát, a kutatás, valamint az egészség- és gyógyszeripar, a növénynemesítés, állattenyésztés területén szinte mindenhol használt eljárás. A módszer magyarországi megjelenése az SZBK-hoz kötődik, kutatóink voltak a technika hazai úttörői. A magyarországi térhódításban is meghatározó szerepünk volt, közvetítésünkkel, gyakran az SZBK-ból elszármazott kutatókkal kerültek az új módszerek más kutatóhelyekre, illetve gyakorlati alkalmazásra. Mára már kivételezett helyzetünk megszűnt, a kiegyenlített lehetőségek mellett igyekszünk fenntartani a kutatás elvárhatóan magas színvonalát, sőt mindent megteszünk a színvonal emeléséért. A maga idejében újdonságnak számító intézkedéssel ban megkértük az európai molekuláris biológia legtekintélyesebb tudományos szervezetét, az EMBO-t (European Molecular Biology Organization) a központ intézeteinek felmérésére, jellemzésére, egyúttal tanácsadásra a kutatásra, kutatásszervezésre vonatkozóan. A nagyon alapos értékelés megállapította erényeinket, ugyanakkor hasznos tanácsokat is adtak módosításokra. Ezeket általában figyelembe vettük és elvégeztük a javasolt korrekciókat, valóban lényeges javulást okozva a működésünkben. Kiemelendő lépcsőfok a év, amikor elnyertük az Európai Unió Kiválósági Központja (Centre of Excellence of the European Union) címet. A címmel anyagi támogatás is járt. E forrást részben nemzetközi tanácsadó testület megalapítására, működésének finanszírozására fordítottuk. Látván a közelmúlt fejleményeit a Magyar Tudományos Akadémia kutatóintézet-hálózatában, a Kutatóintézeti Tanácsadó Testületi rendszer megszervezését, az értékelési-tanácsadó eljárások beindítását, ezen intézkedéseink megelőzték korukat. A Szegedi Biológiai Kutatóközpontnak jelenleg 240 kutatója, összesen 470 dolgozója van. Munkánkat természetesen a hazai és nemzetközi kutatóközösség tagjaként végezzük, számos aktív együttműködés segít eredményeink elérésében. Kutatómunkánk minősége tudománymetriai adatok tükrében jellemezhető, álljon itt a legutolsó év eredménye: 153 közlemény született, összesen 573 impakt faktorral. Az eredményeknek köszönhetően központunk kutatói a tudóstársadalom nagyrabecsült tagjai. Fennállása során a Központ öt intézetében a Magyar Tudományos Akadémia 19 tagja dolgozott, közülük jelenleg 8 fő Szegeden, és 3 az Enzimológiai Intézetben tevékenykedik. Oktatás az akadémiai kutatóintézetben Annak ellenére, hogy központunk alapvető feladata a kutatás, az oktatás szervesen beépült életünkbe, e tevékenység kutatómunkánk elválaszthatatlan része. Az oktatás valamennyi szintjén részt veszünk, természetesen adottságainknak megfelelően. Legfontosabb az egyetemi oktatási tevékenységünk. Többféle módon bekapcsolódunk az alap és posztgraduális szintű oktatómunkába. Tisztában vagyunk azzal, hogy az oktatás, a tudás átadásához szükséges rendszerezés a kutatói gondolkozást is segíti. Kutatóink minden szóbajöhető egyetemi szak, illetve doktori iskola aktív résztvevői, alapkurzusokat, doktori kurzusokat, speciális kollégiumokat tartanak. Alapvető partnerünk természetesen a Szegedi Tudományegyetem, de szoros oktatási és kutatási kapcsolatot tartunk az ország szinte minden egyetemével. Sok egyetemi hallgató központunkban készíti diplomadolgozatát, illetve végzi a PhD fokozat elnyeréséhez szükséges kutatómunkát. Jelenleg kb. 80 szakdolgozó és 60 PhD hallgató dolgozik nálunk, így elmondhatjuk, hogy szegedi egyetemi oktatás jelentős része az SZBKhoz kötődik. Az e fiatalok által végzett munka nagyon fontos összetevője a kutatói aktivitásnak, nélkülük sokkal nehezebb lenne a munka. Természetesen a fiatal munkatársak képzése az utánpótlás nevelésének is a legfontosabb útja. Sok nálunk végzett hallgató folytatja tudományos karrierjét központunkban. Speciális oktatási forma az SZBK-ban az International Training Course (ITC). Ezt nem sokkal a köz-

9 pont alapítása után, UNDP (Egyesült Nemzetek Fejlesztési Program), majd később UNESCO segítséggel, 38 éve indítottuk be. Az alapítást segítő támogatás keretében külföldi, elsősorban fejlődő országokból érkező, egyetemet végzett diákok egy évet töltenek az SZBK-ban, elméleti oktatásban részesülnek, illetve egy kutatócsoporthoz csatlakozva részt vesznek a kutatásban. Bár a támogatás igen hamar, öt év után megszűnt, a kurzust saját erőből fenntartjuk, mert a konstrukció igen jól bevált, mintegy előkészítő doktori iskolaként működik. Megfelelő intenzitással veszünk részt az oktatás további szintjein is. Rendszeresen tartunk nyílt napokat, itt elsősorban a középiskolásokat próbáljuk megnyerni az élettudományoknak. Kiemelendő e téren a Straub Örökség Alapítvány gondozásában évente megrendezett Középiskolás Élettudományi Kutatótábor, ahol kiváló érdeklődő (magyarországi és határon túli magyar) fiatalok elméleti és gyakorlati ízelítőt kapnak a kutatómunkából. Az általános ismeretterjesztés területén is igyekszünk teljesíteni kötelességünket, tájékoztatjuk a társadalmat munkánkról. Jellemző adatok: 2010 folyamán nagyjából 30 újságcikk jelent meg kutatóink munkájáról, illetve 20 televíziós műsor készült eredményeinkről. Ajánlás a tudományos összefoglalókhoz E kiadvány tudományos kutatóközpontunk első negyven évét méltatja. Az ünneplés legméltóbb módja munkánk, eredményeink ismertetése. A következőkben tehát jellemző kutatásokat mutatunk be, néhányat minden intézetünkből. Olyan témákat válogattunk, amelyek nagy ívű folyamatokat reprezentálnak, komoly eredményeket szolgáltattak, vagyis amelyek jelentősek voltak életünkben, és amelyekre büszkék vagyunk. Az összeállítás jellegzetes gyűjtemény. Az egyes részeket az adott témát jegyző szerzők írták. Meglehetősen eltérő a különböző részek stílusa, de ez így van rendjén: a stílus sokfélesége a kutatás személyességét, sokszínűségét fejezi ki. Reméljük, érdekes, ugyanakkor szórakoztató olvasmányt tart kezében a kedves olvasó, és ugyanolyan jó szívvel olvassa, mint ahogy mi írtuk. Gondolatok az SZBK történetéről Szeged, május Ormos Pál főigazgató 9

10 Jellemző kutatások az SZBK intézeteiben 10

11 SZBK Biofizika Biofizikai Intézet 6726 Szeged, Temesvári krt Szeged, Pf

12 Biofizika Optikai manipuláció speciális alakú testek alkalmazásával 12 Az új téma indításáról Egy téma hosszú idejű művelése során a kutató óhatatlanul kissé beleszürkül a kutatásba: a legtöbb eredeti ötlete már megszületett, a kezdetekkor felmerült kérdéseket ha jól dolgozott már megválaszolta. Arról nem is beszélve, hogy a kutatás előrehaladtával egyre nehezebb problémákkal találja magát szemben, egyre nagyobb intellektuális erőfeszítést igényel akár kis előrejutás is. Magamon is tapasztaltam, hogy amikor a körülmények megváltozása miatt új vagy legalábbis részben új témával kezdtem foglalkozni, például külföldi tanulmányutak során, új laboratóriumba kerülvén jóval több új ötletem született, eredményesebbnek, eredetibbnek láttam saját tevékenységemet. A magam példáján tanultam meg a közismert igazságot: egy kutatónak nagyon hasznos, ha időről időre megújul, új témába kezd. Ez persze nehézségekkel jár: a tudós az évek során egy kutatói közösség tagjává válik, ott jó esetben tekintélyt vív ki magának, új téma indítása esetén ezt a személyiségépítést újra kell kezdeni. Problémák jelentkezhetnek a produktivitásban is, hiszen kezdetben, az új terület indításakor valószínűleg ez kisebb lesz, ami a pályázati rendszer mai szerkezetében veszélyes lehet. Ezért aztán nagy elhatározás, mondhatni merészség szükséges a nagyobb irányváltásokhoz. Kísérleti tudományok esetében további nyilvánvaló nehézség, hogy egy gyökeresen új módszer bevezetése komoly beruházást is igényel. A kilencvenes években forradalmian új, érdekes eljárás jelent meg a biofizikában: az optikai mikromanipuláció, a lézercsipesz. A módszer lényege, hogy a fotonok által hordozott impulzust kihasználva, fény által kifejtett erőkkel manipulálnak mikroszkopikus testeket. Az eljárás megfelelő fényforrások, elérhető árú lézerek megjelenésével vált a gyakorlatban is elérhető lehetőséggé. A megközelítés a biológiában óriási lehetőséget nyújt, mivel az ilyen módon kifejthető és a biológiai rendszerekben ébredő erők éppen hasonló nagyságrendbe esnek. Itt egyes sejtek, molekulák vizsgálatára, manipulálására nyílik lehetőség, és ez lényegesen új információkat ígér a biológiai rendszerekről. Arról nem is beszélve, hogy az eljárás és a kapcsolódó egyéb komponensek (pl. fénymikroszkópia) nagyon érdekeltek. Rögtön szerettem volna e területen dolgozni, de az új irány beindítása az előzőekben vázolt okok miatt nem volt egyszerű ban abban a megtiszteltetésben részesültem, hogy az MTA levelező tagjává választott. Ez a tudományos életemben rendkívül fontos esemény aztán e téren is segített. Úgy gondoltam, most megengedhetem magamnak, hogy esetleg egy-két évig csökkenjen a produktivitásom. Szerencsére akkoriban fellendült a tudomány támogatása is. Így aztán lehetőség nyílt egy optikai mikromanipulációs műszeregyüttes összeállítására. A kezdeti lépéseket Galajda Péter doktorandusz hallgatóval tettük meg. Felépítettük a rendszert, megkezdtük a kísérletezést. A korai játszadozások során észrevettük, hogy a csapdázott testek gyakran forogni kezdenek ilyesmit az irodalomban akkoriban nem lehetett olvasni. A jelenség felkeltette érdeklődésünket: első látásra igen meglepő dolog volt, meglehetősen furcsa látvány a mikroszkópban. Úgy tűnt, hogy a csapdázott test alakjával van összefüggésben a megfigyelt viselkedés. Ezért aztán azt kezdtük vizsgálni, hogyan viselkednek különböző alakú testek az optikai csapdában. Ehhez kidolgoztunk egy eljárást tetszőleges alakú mikroszkopikus testek előállítására, és ezek forgásának tanulmányozása vált érdeklődésünk célpontjává. A munka nagyon eredményes volt, szerencsére nagy érdeklődést is keltett. Volt közleményünk, amelyet a legkülönbözőbb fórumokon tárgyaltak, volt Science Editor s Choice, kiemelték a Nature-ben, a Physics Today-ben, de olyan folyóiratokban is méltatták például, mint a Discovery, vagy a Business Week, illetve újságokban, mint a Welt am Sonntag, vagy a Time Magazine stb. Valószínűleg e sikereknek szerepe volt abban, hogy 2002-ben Széchenyi-díjjal tüntettek ki Galajda Péterrel megosztva megjegyzem, hogy Galajda Péter az egyetlen Széchenyi-díjas, aki PhD hallgató korában kapta meg a díjat. Azóta nyolc év külföldi munka után ő már független kutatócsoportot alapított Intézetünkben.

13 jellemző koordinátája. Ha viszont a test bonyolultabb alakú, további koordináták szerinti kontroll orientáció, forgás stb. is elérhetővé válik. Ahhoz, hogy az ilyen eljárásokat vizsgálni tudjunk, módszert dolgoztunk ki tetszőleges alakú testek létrehozására. Biofizika 1. ábra. Galajda Péter Széchenyi-díjas PhD hallgató, a díjazás után a Parlament kapujában Az új témát azóta több munkatárssal folytatjuk, csatlakozott a csapathoz Kelemen Lóránd, Oroszi László, Valkai Sándor, továbbá Búzás András és Badri Prashad, Vizsnyicai Gaszton doktoranduszok, együttműködünk Dér Andrással. A vizsgálatokat kiterjesztettük, ma intézetünk egyik jelentős irányvonalát képviseli ben az MTA rendes tagjává választottak, és büszke vagyok arra, hogy székfoglaló előadásomban kizárólag a levelező tagságom után elért eredményeinkről, vagyis a drasztikus témaváltás utáni kutatásainkról beszéltem. Forgatás optikai csipesszel Az itt leírt kutatási téma kezdete tehát a legelső kísérletekre nyúlik vissza, amikor ismerkedni kezdtünk a lézercsipesszel. A jelenség felkeltette az érdeklődésüket, és mivel az irodalomban alig találtunk hasonló esetekre információt, elhatároztuk, részletesen kezdünk foglalkozni a problémakörrel. Az optikai csipesz alapvető megvalósításában fókuszált lézerfénnyel csapdáznak a környezetüknél nagyobb törésmutatójú tárgyakat. A csapdázott test leggyakrabban gömb alakú. A test helyzetét figyelik és szabályozzák e rendszerrel erőt lehet kifejteni, illetve mérni biológiai objektumokon. Az eljárás óriási lehetőségeket nyitott meg a biofizikai kutatásokban, a mechanikai kontaktus nélküli manipulációs eljárás korábban elképzelhetetlen kísérletekre nyújtott lehetőséget: sejtek csapdázása, egyes makromolekulák manipulálása, molekulák mechanikai paramétereinek a meghatározása, erőkifejtő fehérjék működésének fizikai jellemzése stb., a sor hosszan folytatható. Nyilvánvaló, hogy amennyiben a csapdázott test izotróp anyagból álló gömb, csak a helye az egyetlen Struktúraépítés fotopolimerizációval Kiváló lehetőség tetszőleges alakú, mikrométeres karakterisztikus méretű testek létrehozására a fotopolimerizáció. Ha lézerfényt fókuszálunk fényre keményedő fotopolimerbe, elérhető, hogy a keményedés csak a fókuszban történjék meg. Így, ha a fókuszt egy megfelelő, előre meghatározott pálya mentén pásztázzuk, felépíthető a háromdimenziós struktúra. Az eljárás sémáját az 2. ábra mutatja. A módszer térbeli feloldását a fókusz mérete határozza meg természetesen a fény hullámhosszával összevethető tartományról van szó, ami jellemzően néhány száz nanométer. Kiemelendő, hogy az eljárással tetszőlegesen bonyolult alakzatok is könnyen előállíthatók, hiszen csak a fókusz útvonalát kell megfelelően kialakítani. A feloldóképesség növelhető, ha kétfotonos gerjesztést alkalmazunk. Ehhez természetesen igen nagy teljesítmény szükséges, de ez ma már rendelkezésre áll a femtosecundumos impulzushoszszal működő impulzus üzemű (pl. titán-zafír) lézerek alkalmazásával. Jelenleg akár 100 nanométernél finomabb szerkezetek is előállíthatók. 2. ábra. A lézeres fotopolimerizáció sémája Az itt leírt módszerrel előállított mikroszkopikus testeken végezzük a mikromanipulációs kísérleteket. Természetesen ezeket nem könnyű megtalálni a 13

14 Biofizika mintatérben, úgyhogy eleve sokat kell belőlük készíteni. Fontos tehát, milyen gyorsan tudjuk őket előállítani, az egyenkénti pásztázással gyakran nem elegendő a sebesség. A gyártás párhuzamosításával nagyban növelhető a gyorsaság. Legegyszerűbben a polimerizáló fénynyaláb sokszorozásával többszörözhetjük a sebességet, ez technikailag könnyen megoldható diffraktív optikai elemek használatával. Ha aktív nyalábalakító eszközt, térbeli fénymoldulátort (spatial light modulator SLM) alkalmazunk, lehetőségeink nagyban megnőnek. E számítógéppel vezérelt eszközökkel nemcsak a nyalábtöbbszörözést lehet egyszerűen szabályozni, hanem összetett megvilágító nyalábformák is létrehozhatók, így akár egy lövéssel is kialakíthatók bonyolult struktúrák. A speciális alakú testek kialakítása, ezek használata az optikai manipuláció kereteinek a tágításában szinte korlátlan lehetőségeket ígér. Készítettünk az eljárással fény hajtotta mikrogépeket, integrált optikai motort, optikailag működtetett mikro manipulátorokat (3. ábra). Az ilyen eszközök természetes környezete a mikrofluidika, szinte természetes, hogy ebben az irányban is párhuzamos kutatásokat indítottunk: a fénnyel vezérelt mikrofluidikai rendszerek vizsgálata és fejlesztése biológiai alkalmazásokra szintén érdeklődésünk egyik tárgyává vált. Fény hajtotta rotorok, mikrogépek Korábban említettem, hogy a csapdázott testek forgása, illetve a jelenség jobb megértése volt egyik kiindulópontja az itt leírt kutatásoknak. A testek forgása a csapdában nagyon látványos jelenség, felkelti az érdeklődést tisztán esztétikai szempontok alapján, de nyilvánvaló, hogy potenciális mikrotechnikai alkalmazásokban is fontos szerepe lehet. 4. ábra. A lézercsipeszben fogott és a fény által forgatott propeller helyzete és a struktúrájának részletei A jelenség szisztematikus tanulmányozására jól meghatározott propeller alakú testeket építettünk, amelyeket lézercsipeszben forgatni lehet. Jóllehet a propeller elvi működése triviális, a feladat néhány ok miatt nem nyilvánvaló. Egyrészt, a méretek éppen a fény hullámhosszának nagyságrendjébe esnek, a fény-anyag kölcsönhatás számolása itt a legnehezebb. További komplikáció, hogy nem nyilvánvaló, milyen helyzetben stabilizálódik a propeller a lézercsipeszben, hiszen ettől nagyban függnek a forgás paraméterei is. Több jól működő propellert készítettünk, a 4. ábrán egy igen jó hatásfokú alak látható. Ez stabil, jó orientációjú helyzetet vett fel a lézercsipeszben, és jó hatásfokúnak bizonyult: kb. 20 mw lézerteljesítménynél néhány Hz fordulatszámmal forgott. A forgást számításokkal modelleztük. Klasszikus optikai eljárásokkal kezelve a fény által kifejtett erőket (amelyek a fény törése és visszaverődése során ébrednek) jól le tudtuk írni a tapasztaltakat. A rendszert több irányban fejlesztjük tovább. Létrehoztunk teljesen integrált, már a mikroszkóptól független optikai motorokat. Építettünk összetett mikromechanikai rendszereket, amelyekben több mozgó alkatrész található, ezekből mikrofluidikai szelepet, pumpát készítettünk. Ezekkel fénnyel vezérelt mikrofluidikai eszközök prototípusait készítettük el, pl. egy fénnyel működő sejtszeparátort, a fény áramlását is sikerült fénnyel vezérelni. Célunk a gyakorlatban jól használható optofluidikai rendszerek építése ábra. Jellegzetes fotopolimerizációval készített struktúrák. A. Üveglemezre épített integrált optikai motor. B. Négyszeres optikai csipesszel mozgatott optikai mikromanipulátor Mikroszopikus rotorok hidrodinamikai szinkronizációja A technológiai fejlesztés lehetőségén túl, e fénnyel hajtott eszközök a biológiai rendszerek modellezésére is kiválóan használhatók. Sejtek, szervecskék mozgásának jól definiált körülmények között végzett jellemzé-

15 sére nagyon jó lehetőséget biztosítanak. Illusztrációul itt a hidrodinamikai szinkronizáció jelenségét, annak modellezését mutatom be. A mikroszkopikus biológiai objektumok mozgása a kis Reynolds-számok tartományában zajlik, a viselkedés itt egészen más, mint amit a makroszkopikus világunkban látunk. Egymás közelében mozgó testek a köztük levő folyadék közvetítésével hidrodinamikai kölcsönhatásban vannak. Ilyen mozgások során gyakran előfordul, hogy a mozgások szinkronizálódnak: a baktériumokat mozgató flagellák, a csapkodó csillók egyszerre mozognak. Felmerült, hogy a szinkronizációnak hidrodinamikai eredete van: szimulációk történtek a jelenségre, de kísérleti kimutatása eddig nem sikerült. A fény hajtotta rotorjaink segítségével kerestünk bizonyítékot a következő kísérlettel: létrehoztunk két optikai csapdát a korábban leírt, SLM-en alapuló holografikus eljárással, és ezekben megragadtunk egy-egy rotort, melyek egymással ellentétes irányban forogtak (alakjuk egymás tükörképei voltak). Egymás közelében forgattuk őket, és sebességüket finoman változtattuk. A kísérlet és eredménye az 5. ábrán látható. Ha a két rotor sebessége közel azonos, forgásuk teljesen szinkronizálódik, vagyis valóban létrejön egy kizárólag a hidrodinamikai kölcsönhatás okozta csatolás a két rotor között Ezt mutatja a két rotor forgási fázisainak azonossága, illetve ugrásszerű változása. A jelenség részletes további jellemzése kiválóan végezhető eljárásunkkal. A B 5. ábra. Hidrodinamikai szinkronizáció kimutatása két egymáshoz közel forgó fény hajtotta rotor segítségével. A. A kísérlet menete: a két rotor sebességének lassú változtatása. B. A két rotor forgási fáziskülönbségének változása a kísérlet során Lapos testek orientációja polarizált fénnyel Speciális alakú testek fény hajtotta forgatásán túl az orientáció is érdekes manipulációs lehetőség. Az orientációs hatáshoz az szükséges, hogy a lézercsipeszt alkotó lézerfény és a test között irányfüggő kölcsönhatás legyen. Ez több módon is előállhat. Például, ha a test hosszúkás, úgy csapdázódik, hogy a hosszabb oldala az optikai tengely irányába mutat. Az optikai tengely körüli orientáció valósul meg, ha a csapdázott test kettősen törő anyagból készül, és a csapdát lineárisan poláros fény alkotja. Kiderült, hogy akkor is orientáció következik be, ha lineáris fénnyel képzett csapda lapos testet csapdáz. Tulajdonképpen nem meglepő a hatás, hiszen a csapdázó erőket szolgáltató kölcsönhatás függ a fény polarizációjától, és ha a test alakja nem izotróp, akkor a kölcsönhatás is ilyen lesz, és orientáció következik be. A jelenséget alaposan megvizsgálva kiderül, hogy az orientáció olyan, hogy a test laposabbik oldala a polarizáció irányába fog mutatni. Ez az effektus pedig szintén nagy lehetőségeket nyit a biológiai alkalmazások előtt gondoljuk csak meg, a valódi biológiai testek általában nem tökéletes gömb alakúak tehát így orientálni, rendezni tudjuk a testeket stb. Biológiai objektumokon megmutattuk, hogy valóban jól használható rendezési eljárásról van szó. Ezt az orientációs hatást részleteiben szintén fotopolimerizált, pontosan definiált alakú próbatesteken jellemeztük. Az orientációs csapdázás azt jelenti, hogy ha a testet az egyensúlyi helyzetéből kitérítjük, a fény viszszatérítő nyomatékkal fog rá hatni, és ez a forgatónyomaték arányos lesz a kitérés szögével (ez a lineáris viselkedés természetesen kis kitérésekre igaz, és a rugalmas erőt kalibrációs kísérletekben meg kell határozni). Az orientáló hatás módot ad forgatónyomaték kifejtésére, illetve mérésére is, mintegy molekuláris csavarkulcsnak használható. A kifejtett forgatónyomaték függ az optikai paraméterektől (a test alakja, törésmutatója stb.), de jellemzően megállapíthatjuk, hogy vízben egy kb. 2 mikrométeres, 1,5-es törésmutatójú lapos test esetén 20 mw lézerteljesítménnyel kb Nm nagyságrendű nyomaték fejthető ki. Ez éppen megfelelő a biológiai rendszerek rotációs manipulálására ame- Biofizika 15

16 Biofizika 16 lyeknél ez a fajta mozgás releváns, például az ATPáz motorok által kifejtett forgatónyomaték, vagy DNSmolekulák torziója. DNS-molekulák torziója 6. ábra. Egyetlen DNS-molekula csavarása lineárisan polarizált fénnyel kialakított optikai csapdával A módszer gyakorlati alkalmazásának jó példája a DNS-molekula torziós rugalmasságának a meghatározása. Általában, a DNS-molekula torziós tulajdonságai nagyon fontos biomechanikai jellemzők, hiszen a DNS működése során a csavarodásnak nagy szerepe van. Ha meg akarjuk érteni a DNS-molekulák és a velük kölcsönható fehérjék működésének részleteit, feltétlenül ismernünk kell a molekula ilyen mechanikai paramétereit. Ennek megfelelően, számos kísérletben próbálkoztak a kérdés megválaszolásával. A korai kísérletekben általában közvetett úton közelítették meg a problémát, hiszen nem volt lehetőség a forgatónyomaték közvetlen mérésére. A közvetett megközelítés miatt azután az értékelés sem direkt, ezért speciális, meglehetősen bonyolult modellekre van szükség. Ennek következtében a közölt adatok nagyon különbözőek voltak. Az itt leírt eljárás viszont közvetlen és direkt módon szolgáltatja a torziós paramétereket. Kísérleteinket λ-dns molekulán végeztük (ezek kontúrhossza 15,6 μm, aránylag könnyen lehet őket egyenként kezelni a lézercsipeszben). A molekulák egyik végét a mikroszkóp tárgylemezéhez rögzítettük, másik végére pedig lapos korongot erősítettünk. E lapos test szolgál rotációs eszközként, a polarizált fénnyel létrehozott optikai csapdában megragadva a DNS-molekulát kifeszítjük, illetve a polarizáció síkjának forgatásával tetszőlegesen beállítjuk helyzetét. Az ébredő forgatónyomaték a polarizáció síkjának, illetve a lapos test síkjának az orientációs különbségéből adódik. A kísérlet elrendezése a 6. ábrán látható. A mérés elengedhetetlen része a csapda kalibrációja. Mivel a nyomaték nagyon függ a minta paramétereitől (alak, a test és a közeg törésmutatója, stb.), minden egyes esetben külön kalibrációra van szükség. Szerencsére ez a mérések során egyszerűen megoldható. A lapos test rotációs Brown-mozgásos fluktuációja direkt kapcsolatban van a visszatérítő nyomatékkal, ez a fluktuáció pedig a mérések során jól megfigyelhető és jellemezhető, úgyhogy mindig rendelkezésre áll a pillanatnyi kalibráció. A kísérlet a következő: a lézercsipesszel forgatjuk, csavarjuk a DNS-molekulát, és mérjük a csavaráskor ébredő visszatérítő rugalmas forgatónyomatékot, majd ebből meghatározzuk a rugalmas állandókat. Méréseink alapján (a részletek taglalása nélkül) most leírjuk, hogy a DNS-molekula lokális torziós modulusza 420 ± 44 pn nm2 nagyságúnak adódott. Megjegyzem, hogy ezt a kísérletet 2006-ban végeztük, azóta több, a mienkhez hasonló módszerrel is elvégeztek ilyen kísérleteket, és a jelenlegi állás szerint ez a jó érték. Módszerünk arra is lehetőséget nyújt, hogy a molekula különböző feszítettségi állapotaiban is meghatározzuk e paramétert ez további fontos információt szolgáltat, mert részleges megnyúláskor a rugalmas energia megoszlik a nyújtási és csavarási deformációban. A DNS-molekulák jellemzésére kidolgozott polimer modellek különböző megoszlást jósolnak, vagyis mérésünk e modellek ellenőrzésére is használható. A jövő A felsorolt példák jól illusztrálják, hogy a kidolgozott eljárás kiválóan alkalmazható a mikroszkopikus biológiai rendszerek tanulmányozásában, akár úgy, mint új lehetőségeket nyújtó manipulációs vizsgálati módszer, akár úgy, mint jól definiált modellrendszer alapjelenségek részletes jellemzésére. Ebben az összefoglalóban nem tárgyaltuk a mikrofluidikai vonatkozásokat ez a további alkalmazások egyre táguló terepe, vagyis optimistán tekinthetünk a jövőbe. Ormos Pál

17 Bakteriorodopszin-kutatás az SZBK Biofizikai Intézetében Biofizika A bakteriorodopszin-kutatás története az SZBK-ban csaknem egyidős a Biofizikai Intézetével, amelynek évtizedeken keresztül emblematikus kutatási témája volt. A bakteriorodopszint 1968-ban fedezte fel Walther Stoeckenius a san franciscói UCSF egyetemen, az egyik legősibb ma élő egysejtű, a sótűrő Halobacterium salinarum morfológiai vizsgálata során. A sejtmembrán elektronmikroszkópos felvételein szokatlan, szabályos felépítésű domének mutatkoztak, amelyekről hamarosan kiderült, hogy egy addig ismeretlen retinálfehérje bíbor színű, kétdimenziós kristályai (1. ábra). 1. ábra. A bakteriorodopszin felfedezése képekben a Holt-tenger vizétől a molekula szerkezetig Mivel az új fehérje meglepő hasonlóságot mutatott a látópigmentként működő rodopszinokkal, a keresztségben a bakteriorodopszin (röviden br) nevet kapta. A funkció vizsgálatakor Stoeckeniust újabb meglepetés érte: kiderült, hogy a br elsődleges fiziológiai szerepe nem a fényérzékelés, hanem a biológiai energiaátalakítás fontos láncszemeként a protonok membránon keresztüli aktív transzportja, vagyis a protonpumpálás. A br ráadásul sokkal egyszerűbb felépítésű volt, mint az addig ismert protonpumpáló rendszerek, a fotoszintézis elsődleges folyamatait gyakorlatilag egymaga elvégezte. A dolog bioenergetikai jelentőségét felismerve a világ vezető biofizikai laboratóriumaiban az 1970-es évek elején szinte egyszerre kezdődött meg a br tüzetesebb vizsgálata. A kezdetek Szegeden a br-kutatást Dancsházy Zsolt honosította meg, amikor 1974-ben, a Lomonoszov Egyetemen frissen megszerzett biológusi diplomájával hazatérve az SZBK Biofizikai Intézetében kezdett dolgozni. Itt rajta kívül elsősorban fizikusok kutattak, akiknek megtetszett a könnyen kezelhető, szokatlanul stabil, fénnyel gerjeszthető fehérje. Az első lényeges eredmények már a 70-es évek második felében megszülettek: sikerült új módszert kidolgozni a br elektromos jeleinek vizsgálatára (Dancsházy Zsolt és Karvaly Béla), később pedig a módszer segítségével kimutatni, hogy a kék fénnyel történő megvilágítás képes blokkolni a protontranszportot (Ormos Pál, Dancsházy Zsolt, Karvaly Béla). Amikor 1979-ben a csoport akkori vezetője, Karvaly Béla nem tért vissza amerikai útjáról, a Biofizikai Intézet igazgatója, Keszthelyi Lajos vette át a csoport irányítását. Hatalmas kísérleti fizikusi tapasztalata és ötletei új lendületet adtak a br-kutatásnak, amely a világ vezető laboratóriumaiban is éppen hőskorát élte. Ebben az időben határozták meg például a br aminosavsorrendjét, valamint a fehérje 7Å felbontású elektronszerkezetét. Ezzel egy csapásra a br lett a legjobban jellemzett ionpumpáló membránfehérje. A gyors sikerek ellenére szép számmal voltak akkoriban és nem csak az SZBK-ban - br-szkeptikus kollégák is, akik a téma ugrásszerű kibontakozását látva azt a következtetést vonták le, hogy még legfeljebb egy-két év, és a br-kutatásnak vége, hiszen már mindent fogunk tudni erről a fehérjéről, amit érdemes. Ez amolyan biokémikusi megközelítés volt, Keszthelyi Lajos mint vérbeli fizikus azonban sokkal messzebbre tekintett. Tudta, hogy a br felfedezésével egyedülálló lehetőséghez jutottak a fizikusok egy bonyolult biológiai molekula tisztán fizikai módszerekkel történő leírására, ugyanakkor azzal is tisztában volt, hogy az ehhez szükséges idő inkább évtizedekben, mint években mérhető. Úgy ítélte meg, hogy megfelelő 17

18 Biofizika műszerek hiányában a szerkezetvizsgálati kutatásokba nem tudunk versenyképesen bekapcsolódni, ezért inkább a funkcióvizsgálathoz kapcsolódó módszertani fejlesztésekre koncentrált. Rövid időn belül fontos felfedezést tett a br-molekulák elektromos térrel történő orientációjára vonatkozóan (Keszthelyi, 1979), amire alapozva Ormos Pállal közösen - a korábbiaktól gyökeresen eltérő módszert dolgoztak ki a fehérjén belüli töltésmozgások időbeli követésére (Keszthelyi és Ormos, 1980). Az aranykor Az új módszer az elektromos jeleken kívül a br működését kísérő optikai változások követését is lehetővé tette (3. ábra), a segítségével elért tudományos eredmények pedig jelentős nemzetközi visszhangot váltottak ki, és egyben fordulópontot is hoztak a szegedi br-kutatás történetébe. 3. ábra. A br elektromos és abszorpciókinetikai jelei ábra. Keszthelyi Lajos, Ormos Pál és Fábián László Charles Simonyi vancouveri házában, 2002-ben Keszthelyi Lajos intuitív munkamódszeréből ízelítőt kaphatunk, ha felidézzük az új mérési eljárás kidolgozásának előzményeit. Első br-en végzett kísérlete a protonleadás és -felvétel kinetikájának tanulmányozására irányult, ezért a molekulákat körülvevő elektrolitikus közegnek a br működése közben fellépő vezetőképesség-változásait mérte. A kísérleti görbékben azonban a várt, vezetőképességi jelen kívül meglepő módon egy másik komponens is fellépett. További szisztematikus kísérleteket elvégezve rájött, hogy utóbbi csak egy olyan molekulafrakció jelenlétével magyarázható, amelyet a vezetőképesség-méréshez használt elektromos tér orientál. Hamarosan azt is kiderítette, hogy ez az extra komponens a molekulán belül lejátszódó töltésmozgásokról ad közvetlen felvilágosítást, s mint ilyen, információban sokkal gazdagabb, mint az eredetileg mérni kívánt vezetőképességi jel. Így lett egy eredetileg nem kívánt jelből a 80-as évek br-kutatásának nagyhatású módszertani fejlesztése. A Bioenergetika Csoport munkatársai közül egyre többen kapcsolódtak be eredményesen a br-kutatásba, így a 80-as évek első felére nemzetközi elismertségnek örvendő kutatóműhely alakult ki Szegeden. Ezt a folyamatot katalizálta, hogy Keszthelyi Lajos és munkatársai számos nemzetközi konferenciát rendeztek ebben az időszakban. Nagy siker volt pl. az ban megrendezett Selected Methods of Biophysics c. nemzetközi iskola (szponzor: UNESCO-ICRO), vagy az 1981-ben megrendezett International Workshop on Protein Dynamics (szponzor: NSF), ami lehetővé tette, hogy amerikai és orosz kollégák magyar közvetítéssel találkozzanak egymással. Ez tudományos jelentőségén túl az akkori viszonyok között jelentős tudománypolitikai teljesítmény is volt. Az 1980-as iskola sikerére való tekintettel 1982-ben hasonló rendezvényt szerveztünk (4. ábra), majd 1985-ben International Conference on Retinal Proteins címmel megrendeztük a rodopszinok tudományterületének konferenciáját. Ez hagyományt teremtve elindította a máig rendszeresen megrendezésre kerülő ICRP sorozatot, a tudományterület legfontosabb nemzetközi fórumát, amelyet minden második évben rendeznek meg európai, amerikai és ázsiai helyszíneket váltogatva.

19 ábra. Az 1982-es UNESCO-ICRO iskola résztvevői. Számozva a szegedi br-csoport munkatársai és a külföldi prominens br-kutatók 1: Sam Helgerson, 2: Groma Géza, 3: Yoshiaki Kimura, 4: Váró György, 5: Szundi István, 6: Dér András, 7: Ormos Pál, 8: Barabás Klára, 9: Zimányi László, 10: Juan Korenbrot, 11: Dancsházy Zsolt, 12: Keszthelyi Lajos, 13: Laura Eisenstein, 14: Walther Stoeckenius, 15: Roberto Bogomolni, 16: Hans-Wilhelm Trissl, 17: Hans Westerhoff 2000-ben újra az SZBK-ba hoztuk ezt a konferenciát, és hozzá kapcsolódóan egy NATO Advanced Research Workshop-ot is rendeztünk, amelynek legfontosabb témája a retinál fehérjék bioelektronikai alkalmazása volt. Valamennyi szegedi konferencia elnökségét Keszthelyi Lajos vállalta magára. A konferenciák szervezésén és látogatásán kívül a vezető külföldi laboratóriumokkal kialakított együttműködéseknek is meghatározó szerepük volt a szegedi br-csoport sikerességében. A 80-as évek elején elnyert MTA-NSF pályázat több mint egy évtizeden keresztül biztosította a kutatócsere lehetőségét a szegedi labor és két USA-beli vezető egyetem, a University of Illinois, Urbana-Campain és a University of California, San Francisco egy-egy kutatócsoportja között. Urbanában a fehérjedinamika tudományágának meghatározó egyéniségétől, Hans Frauenfelder professzortól tanulhattak a fiatal szegedi kutatók és értek el szép eredményeket (elsősorban Ormos Pál, Dancsházy Zsolt, Zimányi László, Czégé József és Váró György nevét kell itt kiemelni), San Franciscoban pedig a bakteriorodopszin atyjával, Walther Stoeckenius-szal dolgozhattak együtt (Dancsházy Zsolton és Ormos Pálon kívül Szundi István, Barabás Klára, Pósfai János, Groma Géza és Dér András kapott erre lehetőséget). Stoeckenius professzor nyugalomba vonulása után korábbi munkatársa, Roberto Bogomolni is fogadott szegedi látogatókat (Száraz Sándort és Tóth-Boconádi Rudolfot) Santa Cruz-i laboratóriumában Több kutató egyéni meghívást is kapott hosszabbrövidebb időre, és ezek egy részéből is hosszabb távú munkakapcsolat alakult ki. Így jött létre kooperáció pl. a frankfurti Max Planck Biofizikai Intézettel, ahol a Prof. Ernst Bamberg által vezetett és az alternatív elektrofiziológiai módszereiről híressé vált intézetben Dér András és Ormos Pál jártak tanulmányúton számos alkalommal. Az 1990-es évek közepétől a br-kutatás középpontja San Francisco-ból mindinkább a szintén kaliforniai Irvine-ba helyeződött át, ahol az egykori 56-os emigráns diák akkor már régóta professzor Lányi János dolgozott. Előszeretettel hívott meg magyar munkatársakat (így Zimányi Lászlót, Váró Györgyöt és Keszthelyi Lajost), akikkel együtt számos nagyhatású tudományos eredményt publikáltak több mint egy évtizeden keresztül. Fontosabb eredmények E visszaemlékezés keretében nincs mód a br-csoport munkatársai által kb. 30 év alatt elért tudományos eredmények részletekbe bocsátkozó elemzésébe, de az általam legfontosabbnak ítélt témák rövid felsorolására kísérletet teszek. Módszertani fejlesztések A korábbiakból már kiderült, hogy a szegedi br-csoport munkatársai eleinte főként módszertani újításokkal jeleskedtek, amelyekhez Keszthelyi Lajos és Ormos Pál 1980-as cikke adta meg az alaphangot. Váró György és munkatársai pl. olyan módszert dolgoztak ki Nagy Károly korábbi eredményeit továbbfejlesztve, amelynek segítségével a vízmolekuláknak a br protontranszportjában betöltött szerepét lehetett tanulmányozni. A Váró György által készített szárított, orientált br-tartalmú mintákon Groma Géza és munkatársai a fehérje működését kísérő elektromos jeleket detektáltak pikoszekundumos felbontással, az SZTE jelenlegi rektora, Szabó Gábor által az egyetem Optikai Tanszékén létrehozott ultragyors lézerrendszer segítségével (5. ábra). Ez akkoriban - a 80-as évek közepe táján gyorsasági világrekordnak számított, és az eredményeket a Nature folyóirat hasábjain közölték, ami természetesen óriási szakmai elismerést jelentett. Biofizika 19

20 Biofizika ábra. A br elektromos jelének pikoszekundumos komponense Mivel a Váró-féle száraz minták több V-os ampli tudójú fotoelektromos jeleket adtak, triggerdiódaként is fel lehetett őket használni időfelbontásos mérésekhez. A Groma-Szabó-Váró szerzőtrió szabadalmaztatta is az ötletet, ami valószínűleg a br technikai felhasználására tett első javaslat volt. Dér András és munkatársai az eredeti Keszthelyi-Ormos módszert fejlesztették tovább úgy, hogy az eredeti méréstechnika leegyszerűsödött, és a módszer alkalmazhatóságának határai nagymértékben kitolódtak. Az új eljárás ( gél-módszer ) más ionpumpáló membránfehérjék vizsgálatára is alkalmasnak bizonyult, és egyre népszerűbbé vált: a szegedi csoport tagjain kívül külföldön is egyre többen kezdték használni. A 90-es évek közepén pl. a módszer a frankfurti Goethe Egyetem hallgatói számára kijelölt biofizikai metodikai repertoárba is bekerült. Később a gél-módszert a molekulák orientációs fokának mágneses térrel történő javítása révén sikerült odáig fejleszteni, hogy a br-molekulán belüli töltésmozgások háromdimenziós követése is lehetővé vált (Dér András, Ormos Pál és Keszthelyi Lajos munkássága nyomán; 6. ábra). 6. ábra. A br-molekulán belüli töltésmozgások háromdimenziós mérése a mérési elv és a detektált jelek Az új módszerek fejlesztése persze nemcsak kísérleti, hanem komoly elméleti munkát is jelentett, hiszen a jeleket nemcsak megmérni, hanem értelmezni is kellett, ami távolról sem volt egyszerű feladat. Az elektromos jelek elméleti interpretációjának kidolgozásában elsősorban Keszthelyi Lajos, Ormos Pál, Dér András, Groma Géza és Oroszi László vett részt, a br működéséről ugyancsak lényeges információt hordozó abszorpciókinetikai jelek értelmezése terén pedig elsősorban Zimányi László, Váró György, Tokaji Zsolt és Dancsházy Zsolt alkotott maradandót. Egyéb tudományos eredmények A fenti módszertani újítások nagyon fontos szerepet játszottak a szegedi br-kutatások történetében, hiszen ezek határozták meg a csoport karakterét, a konkrét tudományos eredmények pedig jórészt ezek segítségével születtek meg től Keszthelyi Lajostól egykori tanítványa, Ormos Pál vette át a csoport vezetését és a Biofizikai Intézet igazgatását is, ami egyben biztosította, hogy a szegedi br-kutatás is még sokáig töretlenül folyhasson tovább. A főbb tudományos eredmények távirati stílusban, 1980-tól kb ig (zárójelben a kutatók): A br-molekulán belüli töltésmozgások nagyságának meghatározása (Keszthelyi Lajos, Ormos Pál, Váró György, Dér András, Groma Géza) A br-protonpumpa fotociklusának kinetikai jellemzése (Zimányi László, Váró György, Dancsházy Zsolt, Tokaji Zsolt, Keszthelyi Lajos, Ormos Pál, Dér András, Groma Géza, Czégé József, Gergely Csilla, Száraz Sándor) A víz szerepének tanulmányozása a br működése során (Váró György, Keszthelyi Lajos, Dér András) A fotociklus köztesállapotainak tanulmányozása második gerjesztéssel (Dancsházy Zsolt, Ormos Pál, Keszthelyi Lajos, Tóth-Boconádi Rudolf, Váró György, Zimányi László, Dér András) A fotociklus N formájának (újra)felfedezéséhez vezető kísérletek (Dancsházy Zsolt) Az M forma szintjén megjelenő konformációs kapcsolás kimutatása (Ormos Pál, Váró György) Az M forma atomi szintű szerkezetvizsgálata (Ormos Pál)

21 A br-molekulák közti kooperatív kölcsönhatás kimutatása (Tokaji Zsolt, Dancsházy Zsolt) Mutáns br-fehérjék vizsgálata (Váró György, Zimányi László, Keszthelyi Lajos, Tóth-Boconádi Rudolf) Más rodopszinfehérjék vizsgálata (Váró György, Zimányi László, Keszthelyi Lajos, Dér András) Merre tovább? időtartományban mennek végbe. A klasszikus spektroszkópiai módszerekkel a fenti folyamatok csak közvetve, a frekvenciaspektrumuk alapján voltak tanulmányozhatók, a technikai fejlődés azonban lehetővé tette lényegesen gazdagabb, ezelőtt elérhetetlen információk megszerzését. A kialakulóban lévő tudományterület amelyet sokan femtobiológiának hívnak első számú kísérleti objektuma a br. Biofizika Elméleti modellek Jóllehet az utóbbi tíz év világszerte jelentős tematikai hangsúlyeltolódásokat hozott, és az egykori munkatársak többsége ma már nem vagy csak ritkán foglalkozik br-kutatással, meggyőződésem, hogy a többség számára az áttekintett időszak kutatói pályájának fénykorát jelenti, amikor többnyire közös erővel sikerült valami maradandót alkotni. A fent felsorolt eredmények mindegyike valóban fontos mérföldkőnek számít azon az úton, ami a br működésének atomi szintű leírásához vezet. A kísérleti adatgyűjtés korszaka mára nemzetközi kitekintésben is lényegében lezárult. A célhoz vezető hátralévő lépések megtételében az elméleti fizikusoknak lesz döntő szerepük. A rendelkezésre álló kísérleti adatokból kiindulva már születtek olyan molekuladinamikai modellek, amelyek a protonpumpa-folyamat főbb vonásait kvalitatíve visszaadják. A továbblépés záloga a még több kísérleti adatot figyelembe vevő molekuladinamikai modellek kidolgozása. Munkatársaink (elsősorban Fábián László és Dér András) munkakapcsolatban vannak a br molekuladinamikai leírását megcélzó elméleti csoportokkal (Prof. Suhai Sándor, Heidelberg, és Dr. Nicoleta Bondar, Irvine). Femtobiológia Ugyancsak az utóbbi évek fejleménye, hogy az ultragyors lézerek megjelenésével lehetővé vált a biológiai rendszerekben a femtoszekundumos (10-15 s) időskálán lezajló jelenségek tényleges időbeli vizsgálata is. Noha a közismert biológiai reakciók általában ennél lényegesen lassabbak, az elemi molekuláris események, így kémiai kötések kialakulása és bomlása, valamint a vibrációs és rotációs mozgások ebben az 7. ábra. A retinálmolekula gerjesztésével együttjáró elektron-átrendeződés a dipólsugárzás forrása A kutatásokban természetesen a szegedi br-csoport tagjai is részt vesznek, mindenekelőtt az a Groma Géza, aki már a pikoszekundumos jel mérésében is meghatározó szerepet játszott. Feltételezte, hogy a br ultragyors elektromos jelét előidéző molekulán belüli töltésmozgások a közismert Hertzféle dipólsugárzás forrásaként kísérletileg detektálható elektromágneses sugárzást emittálnak (7. ábra). Erre alapozva hazai és nemzetközi kooperációban - femtoszekundumos időfelbontású spektroszkópiai kísérleteket végeztek a távoli infravörös és a terahertz tartományba eső emisszió vizsgálatára, amelyek analízisével a fényenergia-hasznosítási folyamatok kezdeti lépéseire lehet következtetni. Technikai alkalmazások A molekulamodellezésen és a femtobiológián kívül van egy másik, gyorsan fejlődő tudományterület is, ahol a br meghatározó szerepet játszik, mégpedig a biológiai anyagok lehetséges technikai alkalmazásait kutató bioelektronika. A 60-as és 70-es évek scifi írói még csak álmodoztak arról, hogy a biológiai 21

22 Biofizika anyag kifinomult funkcióit egyszer képesek leszünk a technika szolgálatába állítani. Ma úgy fest, hogy az álom hamarosan elérhető közelségbe kerül. A legnagyobb kihívást a biológiai anyag funkciójának megőrzése jelenti, aminek általában gátat szab a biológiai makromolekulák inherens instabilitása. A br ilyen szempontból üdítő kivétel, hiszen a környezeti paraméterek tág határai között igen stabil: a szárított br-filmek normális körülmények között évtizedekig megőrzik funkcionalitásukat. Emiatt, valamint kedvező optikai és elektromos tulajdonságainak köszönhetően a br ma sok bioelektronikai alkalmazás első számú anyaga (8. ábra). anyagokkal, sőt, pl. kapcsolási sebesség tekintetében felül is múlja azokat. Nemrégiben nanoszekundumos, még újabban pedig pikoszekundumos integrált optikai kapcsolást demonstráltak br-film mint aktív elem segítségével. (Utóbbi kísérletet az SZTE Optikai Tanszékén, Osvay Károllyal közösen végezték.) Megmutatták továbbá, hogyan lehet hasznosítani a br kedvező optikai tulajdonságait integrált optikai elven működő bioszenzorokban. Az eredmények elérésében nemzetközi pályázati támogatások (Phare, NATO) nyújtottak segítséget. (SZBK-résztvevők: Fábián László, Heiner Zsuzsanna, Ormos Pál, Valkai Sándor és Mathesz Anna). 8. ábra. Natív és mutáns bakteriorodopszinból előállított holografikus filmek (Keck Center, Syracuse, USA) A gyors fotodióda megalkotása, továbbá a es NATO Workshop kapcsán már említettem, hogy munkatársaink a br technikai alkalmazási lehetőségeit idejekorán felismerték. Az elektronikai technológiák gyors fejlődése azonban ma új, még izgalmasabb alkalmazások kipróbálására ad lehetőséget. Dér András és munkatársai néhány éve vetették fel, hogy a br-tartalmú filmeket integrált optikai áramkörök aktív (kapcsoló-) elemeként lehetne használni. Azóta több közleményben bizonyították, hogy a br versenyképes a hasonló célra jelenleg használt szilárd 9. ábra. A br beépítése tranzisztorba A Váró György által készített orientált, száraz mintákat térvezérlésű tranzisztorokba építették be amerikai munkatársakkal közösen (9. ábra). Legújabban Groma Géza és Zimányi László is foglalkozik a br és egyes fotonikus struktúrák összeházasításával. Minden jel arra utal tehát, hogy a br mint kutatási téma - és a vele foglalkozó kutatók - sokadvirágzása várható már a közeli jövőben. Dér András 22

23 Membránszerkezet és dinamika csoport Biofizika Lipidek és fehérjék a biomembránokban Sejtes életforma nem létezik biomembrán nélkül, amely elválasztja egyrészt a sejtet a külvilágtól, másrészt a sejt egyes belső részeit is egymástól. A biológiai membránok feladata nemcsak az elszigetelés, hanem az elválasztott térrészek közti anyag- és információáramlás biztosítása is. Sőt, az életfolyamatok jelentős része (pl. energiatermelés és felhasználás, sejtalkotók szintézise) is a biomembránokban vagy hozzájuk kötötten zajlik. A biomembrán alapvetően fehérjék és lipidek komplikált, összehangolt együttesét jelenti, amelyet igen leegyszerűsítve úgy jellemezhetünk, hogy a fizikai szerkezeti feladatokat a lipidek látják el, a biológiai működési feladatokat pedig a fehérjék. A biomembrán működésének megértéséhez elengedhetetlen alkotóelemeiknek és a köztük fennálló kölcsönhatások természetének, dinamikájának megértése. A Membránszerkezet és Dinamika Csoport a lipidek, fehérjék, és a köztük lévő kölcsönhatások vizsgálatával foglalkozik. 1. ábra. Foszfolipidek rendezett (all-trans) és rendezetlen lánckonfigurációval. Szabad lipid fázisban a két konfiguráció a gél, ill. fluid fázisú lipidek jellemzője. Feltüntettük a lipidek hidrofil és hidrofób molekularészeit is. A lipidek amfifil molekulák (1. ábra), azaz szerkezetük egyik része (a fejcsoport régió) poláros és ezért vízoldékony, ill. vízkedvelő (idegen szóval hidrofil), másik része, ami a szénhidrogénláncokból áll, pedig apoláros, ezért víztaszító (hidrofób). A hidrofób effektus lényege, amfifil molekulák esetén, hogy a víz azokat a szabadenergia-minimalizálás követelményének megfelelően olyan struktúrákba kényszeríti, amelyekben az apoláros kémiai csoportoknak a vízmolekulákkal való érintkezési felülete minimális. A biológiai lipidek esetében ez a struktúra legáltalánosabban egy olyan kettősréteg, amelyben a fejcsoportok adják a kettősréteg felszínét a vizes fázis felé, míg középen vannak a szénhidrogénláncok. A kettősrétegek szappanbuborékszerű összezáródásából alakulnak ki az egy- vagy többrétegű vezikulák, liposzómák (2. ábra), ill. a sejtek membránjai. Előbbiek a biomembránok kiváló kísérleti modelljei, ezért modell membránoknak is nevezik őket. A lipideknek az élettani folyamatok szempontjából második legfontosabb sajátossága a lipidláncok konformációs rendezettségének, mobilitásának és más fizikai jellemzőinek kooperatív változása a hőmérséklet függvényében, azaz a fázistranzíció. A sokféle fázistranzíció közül a legismertebb a gélfluid átmenet, amelynek során a lipidláncok egy szűk hőmérsékleti tartományban megolvadnak és a membrán fluiddá válik (1. ábra). A fázistranzíció hőmérséklete, szélessége, entalpiája jellemző az adott lipidre. Egy biomembránban akár több száz féle lipid is előfordulhat (az eltérő fejcsoportok, lánchosszak, telítetlen kötések száma és helye kombinációinak nagy száma miatt). Ezért a natív membránokban általában nincs éles fázistranzíció, de a biomembránban zajló életfolyamatokhoz szükséges az adott membrán megfelelő szintű fluiditásának fenntartása, amit a sejtek többféle úton (pl. a lipidösszetétel, telítettség vagy a lipid-fehérje kölcsönhatás szabályozásával) biztosítanak. Ezeknek a folyamatoknak a megismerése fontos pl. a membránokban ható helyi érzéstelenítők hatásának, vagy a sejtek fagy- vagy hősokktűrésének megértése szempontjából. Mindennek nagyon komoly alkalmazott kutatási vonatkozásai is vannak. Elsősorban a membránfehérjék hordozzák egy biomembrán aktív funkcióit. Ide tartoznak például a receptorok, ionpumpák, csatornák, sejtek közötti jeladó rendszerek, az energiatermelés, transz-membrán potenciál és ph-különbség fenntartása, idegi vezetés. A fehérjéket alkotó aminosavak között vannak hid- 23

24 Biofizika rofób és hidrofil oldalláncú aminosavak is. A membránfehérjék valamilyen gombolyodott formában úgy helyezkednek el a membránban, hogy a hidrofób-hidrofób és hidrofil-hidrofil kölcsönhatásuk egymással, a vizes közeggel és a lipidekkel is optimális legyen a szabadenergia szempontjából. A 3. ábra mutatja egy transz-membrán α-hélixekből álló pentamer fehérje membránbeli elhelyezkedését és a hidrofób, hidrofil kölcsönhatások optimalizálását. A fehérjék többféleképpen kötődhetnek a membránokhoz. Az integráns membrán fehérjék (egyszeres vagy többszörös) spirális α-hélix, vagy β-hordó szerkezetben nyúlnak át a membrá non, a kicsi hidrofób régióval rendelkező, inkább hidrofil felületű fehérjék a membrán felszínére tapadnak, de vannak olyanok is, amelyek ugyan a vizes fázisban vannak, de a hozzájuk kova len sen kötött lipidek horgonyozzák őket a membránban (2. ábra). diffrakciós és magmágneses rezonancia technikák jelentős eredményeket hoztak. Ezek a kísérleti módszerek szolgáltatják a legpontosabb és legrészletesebb molekulaszerkezeti modelleket a biomembrán molekuláiról is. 3. ábra. Transz-membrán α-hélix típusú fehérjék elhelyezkedése egy foszfolipid kettősrétegben. A kék-sárga skála a vízkedvelő-víztaszító (hidrofil-hidrofób) tulajdonság változását érzékelteti a membrán síkjára merőleges egyenes mentén ábra. A vezikulává záródott lipid kettősréteg gyakran a biológiai membránok kísérleti modellje. A kettősréteg középső hidrofób régióját a rudacskák, hidrofil régióját pedig a kis körök mutatják. A biomembránokhoz különböző módon kötödő membránfehérjék is láthatóak, sematikus ábrázolásban. (Középütt egy korai számítógépes technikával készült SZBK logótanulmány látható. A rajz eredetije a csoport által is szervezett egyik nemzetközi membrániskola plakátján szerepelt.) Ahogyan az sejthető, a membránfehérjék szerkezete és működése nagyon függ az őket körülvevő lipid mátrix összetételétől és fizikai, kémiai állapotától. Ezért a membránhoz kötött életfolyamatok megértésének egyik feltétele a lipid-fehérje kölcsönhatás törvényszerűségeinek megismerése. Az utóbbi években komoly fejlődésen átment klasszikus szerkezetbiológiai módszerek, az elektronmikroszkópia, a röntgen Széleskörű alkalmazhatóságuk az integ ráns membrán fehérjékre azonban még mindig jelentős nehézségekbe ütközik. Az egyik ilyen a hidrofób környezetben történő kristályosítás, illetve szolubilizálás nehézsége, ami éppen ezen fehérjék hidrofób vagy amfifil voltának következménye. A cél szinte mindig csak úgy érhető el, hogy az integráns membránfehérjét a natív lipidkörnyezetétől jelentősen eltérő hidrofób (pl. detergens) környezetbe építik. Csakhogy ekkor elvész az optimális hidrofób és hidrofil kölcsönhatás és megváltozhat a szerkezet vagy a funkció, esetleg mindkettő. Ezért gyakran jogos a kérdés, hogy a kristályos vagy detergens-szolubilizált forma azonos-e a biológiailag aktív formával. További korlátozó tényező ezen technikák jelentős anyag- és költségigénye. Nem véletlen, hogy a mintegy ismert fehérjeszerkezet között csupán néhány tucat membránfehérje van, miközben pl. a humán genom fehérjét kódoló génjeinek harmada membránfehérjét kódol. A munkacsoport először Horváth László, majd 1999-től Páli Tibor irányításával mindig is a biológiai és az azokat modellező mesterséges membránokkal, kiválasztott membránfehérjékkel és a hozzájuk kapcsolódó élettani folyamatokkal foglalkozott. A csoport fő metodikáit meghatározta, hogy a munkatársak közül legtöbben mindig fizikusok voltak. Ennek

25 két következménye volt: a fizikai, azon belül a spektroszkópiai technikák iránti vonzalom, valamint az adatok minél teljesebb és részletesebb, számítógépes programozással történő kiértékelése. Valószínűleg a fentiek következménye az is, hogy általánosságban a csoport a fizikailag jobban definiált problémák (pl. egykomponensű modellmembránok olyan speciális fázisai, mint a kristályos szubgél fázis, az egymásba fésült láncú kettősréteg, az inverz hexagonális fázis, vagy a lipidek membránbeli transzlációs diffúziója), a spektroszkópiai módszerek elméleti és technikai fejlesztésén, a modellmembránokon és azokba épített fehérjéken (pl. citokrómok, antibakteriális polipeptidek, pórusképző és vírusfehérjék) végzett kísérletek felől haladt a fizikailag kevésbé jól definiált, ugyanakkor biológiai szempontból kézzelfoghatóbb és szélesebb érdeklődésre számot tartó problémák felé, egészen a natív (pl. fotoszintetikus vagy élesztő vakuólum) membránokig, illetve a membránfehérjék szerkezetével kapcsolatos általánosabb megfigyelésekig. A membránfehérjék szerkezetbiológiájával kapcsolatban említett problémán olyan spektroszkópiai megközelítéssel segítenek, amelyben a membránfehérjékről membrán környezetükben gyűjtenek szerkezeti adatokat, s ezeket azután modellezésre használják fel. Az eredetileg Memrán Biofizika Csoportot 1999 ig Horváth László ( ) vezette, aki, azután is, hogy súlyos betegsége fizikailag nem engedte, szellemével majdnem haláláig jelen volt a csoportban. Egyénisége, munkamorálja, felvetett kérdései a mai napig is inspirálólag hatnak a csoport szellemére. A csoport 2007-ben egy nemzetközi tudományos emlékülésen és a tevékenységét méltató közleményben is megemlékezett róla. Az alábbiakban bemutatásra kerülő biofizikai problémák tanulmányozásával a csoport tagjai sok európai kutatási hálózatban, nemzetközi kooperációban is részt vettek, koordinátorként is, több mint kétszáz közleményt jelentettek meg, és számos nemzetközi konferenciát is szerveztek, ill. konferencián vettek részt meghívott előadókként. Egyik aktualitás, hogy a augusztus végén esedékes Membránfehérjék szerkezete, funkciója, gombolyodása és szerveződése biofizikai betekintés című, a 8. Európai Biofizikai Kongresszushoz kapcsolódó nemzetközi konferenciának a munkacsoport a kezdeményezője és fő szervezője. Vibrációs spektroszkópiai kutatások Már az intézet alapításakor felmerült, hogy az akkor a biológiai kutatásokban rendkívül újszerűnek számító Raman spektroszkópiát (a biológiai minták Raman vizsgálatát is lehetővé tevő lézerek alig 10 évvel korábban születtek) és az akkor szintén új spinjelző elektron paramágneses rezonancia (EPR) spektroszkópiát is beveszik az alkalmazandó vizsgálati módszerek közé. A vibrációs spektroszkópiai kutatásokat Szalontai Balázs irányította és irányítja jelenleg is. Az intézet Raman spektrométerét 1975 őszén állították üzembe. Tekintettel az akkor rendelkezésre álló lézerek hullámhossztartományára, olyan rendszerek vizsgálatát lehetett célul kitűzni, amelyek vagy egyáltalán nem, vagy nagyon is elnyeltek az alkalmazott Argon ion lézer nm-es tartományában. Ilyen rendszerek voltak a lipidekből készített multirétegek, amelyekben már akkor rákkeltő anyagoknak, illetve különböző ionoknak a lipid kettősréteg szerkezetére, fázisátmenetére gyakorolt hatását vizsgálták. Ez a területet tulajdonképpen 40 év múltán is aktív, csak jelenleg Fourier transzformációs infravörös (FTIR) spektroszkópiával és főleg valódi membránokon végzik a méréseket, részben azért, mert a gyógyszeripar mostanában kezdi végre felismerni, hogy a különböző drogok membránokkal való kölcsönhatása mennyire fontos a gyógyszerek hatékonysága szempontjából. Így, a sokéves tapasztalatokat egyre inkább a gyakorlatban is hasznosítják. A Raman spektroszkópia lehetőséget adott arra már a kezdetektől, hogy kihasználják az egyes pigmentmolekulák abszorpciójában rejlő Biofizika 25

26 Biofizika 26 lehetőségeket is. A legelső pigmentmolekulák, amelyeket természetes Raman-aktív riporterként használtak, a karotinoidok voltak. Egy mai napig meglehetősen egyedülálló kísérletben demonstrálták, hogy a béka ideg (nervus ischiadicus) membránjában levő karotinmolekulák rezonancia Raman spektrumának változásaiból kimutathatóak az akciós potenciál végigfutásához kapcsolódó membránpotenciál-változások. Ezt az eredményt felhasználva később elsőként megmérték, hogy a bakteriorodopszin-molekulák protonpumpálása révén milyen időállandóval nő még a membránpotenciál a Halobacterium halobium sejtekben. A karotinoidok nagy szerepet játszanak a fotoszintetikus rendszerekben is, egyrészt mint energiabegyűjtők, másrészt mint fényvédő molekulák. Rezonancia Raman spektrumaik fényérzékenységének változásából következtetni tudtak az őket körülvevő fotoszintetikus membránoknak a hőmérséklet-, illetve a fényintenzitásváltozására adott szerkezeti, dinamikai válaszaira. Következő fejezetként a cianobaktériumok (abban a korban még kék-zöld algák) fénybegyűjtő antennáiban, a több száz fehérje csaknem 100%-os együttműködésén alapuló fikobiliszómákban található fiko bili proteinek kromofórjait tanulmányozták. Stabil 15N izotóp alkalmazásával elsőként azonosították a kromofórok rezonancia Raman spektrumának sávjait, amely eredményeknek később fontos szerepe volt a fejlett növények körében rendkívül fontos, hasonló kromofórt tartalmazó fitokrómok (mások által végzett) vizsgálatában. A fikobili proteineket egyes meghatározott konformációkban rögzítették is, néhányszor 10 nm-es kolloid részecskék felszínén, és felület-erősített rezonancia Raman spektroszkópia (SERRS) segítségével meghatározták a különböző abszorpciós spektrumokhoz tartozó kromofórkonformációkat, ami a fikobiliszómákon belüli szinte veszteségmentes fluoreszcencián alapuló energiaátadás megértéséhez volt fontos. Az ilyen kolloid felületeken végzett vizsgálatok ma reneszánszukat élik, csak a kolloid szemcséket nanorészecskéknek hívják. A 90-es évek közepén az anyagi lehetőségek szűkülése nem tette lehetővé egy kompetens Raman laboratórium fenntartását, ezért fordultak a hasonló problémák vizsgálatában időközben rendkívül kifejlődött, és lényegesen olcsóbb Fourier transzformációs infravörös (FTIR) spektroszkópia felé. Ez a tökéletesen roncsolásmentes technika nagyon jó lehetőségeket ígért izolált, intakt biológiai membránok vizsgálatára. Együtt lehet tanulmányozni a lipideket és a fehérjéket egyazon biológiai membránon belül, mert az infravörös spektrumban, nagyon szerencsés módon, jól elválnak az elsősorban lipidekre, illetve fehérjékre jellemző spektrumtartományok. Vizsgálataik során egy olyan problémának jártak utána, mint a fotoszintetizáló rendszerek, ezen belül a cianobaktériumoknak a különböző növekedési hőmérséklethez való alkalmazkodásának, amelyről nagyon sok biokémiai információ állt rendelkezésre, de nem lehetett semmit sem tudni a tilakoid, illetve a citoplazmás membránokban végbemenő szerkezetváltozásokról. Kimutatták, hogy annak a biokémiai adatokból már ismert ténynek, hogy a sejtek alacsony hőmérsékleten való nevelése során megnő a telítetlen (olajszerű) zsírsavláncoknak a mennyisége a membránlipidekben, az a szerkezeti következménye, hogy így a membránokban a lipidek mozgási lehetőségei függetlenül a növekedési hőmérséklettől azonosak maradhatnak. Kimutatták, hogy ha genetikai manipulációkkal elveszik a sejtektől ezt a lipiddeszaturáción alapuló membránfluiditás-szabályozási lehetőséget, akkor valóban elvész az azonos membrándinamika fenntartásának képessége is. Megmutatták, hogy míg alacsony hőmérsékleten elsősorban a lipidek tulajdonságai változnak érzékenyen a hőmérséklettel a nagyjából változatlan fehérjék mellett, magas hőmérsékleten a lipidek rendezetlensége már olyan magas értéket ér el, hogy az nem nagyon érzékeny a hőmérséklet aktuális értékére. Ezzel szemben a fehérjék dinamikája és ennek következtében denaturációja nagyon felgyorsul a fiziológiás hőmérsékleti tartomány felső határánál és afölött, a hőmérsékleti stressz tartományában. Ebből arra lehet következtetni, hogy a magas hőmérsékleti stressz érzékelésében és az arra adott sejtválaszban elsősorban a (stressz)fehérjéknek lehet szerepe. Mindez a lipidek és membránfehérjék szerkezeti és dinamikai csatolódására is felhívta a figyelmet. A legutóbbi évtizedben a csoport bekapcsolódott nanotechnológiai kutatásokba is. Elsősorban a

27 néhányszor 10 nm vastag polielektrolit filmek, illetve a rájuk adszorbeáltatott fehérjék, modell- és biológiai membránok szerkezetét vizsgálták. Elsőként határozták meg egy sor vázfehérje szerkezetét, stabilitását polielektrolit filmekre adszorbeált állapotukban. Ezen ismereteknek nagy jelentősége van, amikor biokompatibilis felületeket kell készíteni orvosi alkalmazások céljaira (pl. implantátumok). Egy másik igen érdekes lehetőséget is megvizsgáltak, amikor maga a polielektrolit film készül biokompatibilis anyagból, a vizsgált esetben pl. poliaminosavakból: ezekből olyan felületeket lehetett kialakítani, amelyek fehérjékre jellemző másodlagos szerkezettel (α-hélix, β-redőzött szerkezet) rendelkeztek. Meghatározták ezen szerkezetek mibenlétét, egymásba alakulásuk feltételeit. Jelenleg ezeknek a polielektrolit filmeknek lipidekkel, fehérjékkel való kölcsönhatása révén vizsgálnak nanotechnikai, szinte egy-molekula megközelítésben olyan klasszikus problémákat, mint például a kazein micellák szerkezete. Ezekben a vizsgálatokban is igyekeznek a felhalmozott alapkutatási ismereteiket olyan alapkutatási és technológiai problémák vizsgálatában kamatoztatni, amelyeknek gyakorlati következményei lehetnek. Orientált fehérjeminták lineárisan polarizált infravörös spektruma amidsávjának dikroikus arányai alkalmasak a fehérje másodlagos szerkezeti elemei orientációjának meghatározására a minta normálisához képest. Ez a szerkezeti információ különösen fontos membránfehérjék esetében, melyek ráadásul általában könnyen orientálhatóak akár natív membránkörnyezetükkel együtt is. A csoportból Páli Tibor vett részt a módszer elméleti hátterének kidolgozásában. A módszer teljesen általánosan használható ismert kristályszerkezetű membránfehérjék esetében amid rezgések rendparaméterének számítására és membránfehérjék membránbeli orientációjának meghatározására. A β-szalagos szerkezetű membránfehérjék kiértékeléséhez kidolgozott geometriai modell új, optimalizált paraméterek segítségével lehetővé teszi, hogy orientált membránokba épített β-hordó fehérjéknek polarizált infravörös fénnyel felvett abszorpciós spektruma amid sávjának dikroikus arányaiból meghatározható legyen a β-szalagok csavarodási szöge és egymáshoz képesti szöge. Ezek a szerkezeti adatok bemenő kísérleti adatként szolgálhatnak membránfehérjék szerkezeti predikciója során. Metodikai fejlesztések A vibrációs és mágneses rezonancia spektroszkópiától a membránok és membránfehérjék funkcionális szerkezetbiológiájáig A vibrációs (Raman és Fourier-transzformációs infravörös, FTIR) és spinjelző elektron paramágneses rezonancia (EPR) spektroszkópiai módszerek a kezdetektől és jelenleg is a Membrán Szerkezet és Dinamika csoport fő módszerei. Az EPR spektroszkópiának kezdetben Horváth László, később Páli Tibor volt az irányítója. A biomembránok kutatásában sok szempontból az EPR és FTIR spektroszkópia egészítik ki egymást legjobban. A spinjelző EPR technika lényege, hogy a vizsgálni kívánt molekulákra egy stabilis szabadgyököt kötnek kovalensen, amelynek a nitroxil kötésen lévő párosítatlan elektron spinje mágneses térben mikrohullámú rezonanciaabszorpcióval mérhető. A spektrumvonal az elektronspinnek a nitrogén magspinnel való kölcsönhatása miatt felhasad, és mivel az elektronspinnek mind a mágneses térrel, mind a magspinnel való kölcsönhatása irányfüggő, a spektrum alakja függ a molekula mozgásától, legalábbis a technika időablakán belül. Míg az FTIR spektroszkópia egy pillanatfelvételt mutat a mintában zajló összes vibrációról, addig a spinjelző EPR spektroszkópia csak a spinjelzett molekulákat (az itt említett kutatásokban lipideket vagy fehérjéket) látja, és a spektrum alakja függ a molekulák mozgásának gyorsaságától és amplitúdójától is, ha a mozgás a technika másodperces időablakán belüli periódusidővel jellemezhető. Az időablak hasonló a fényképezőgép expozíciós idejéhez: ha ahhoz képest nagyon lassú a mozgás, akkor egy éles képet látunk a felvételen, ha nagyon gyors, akkor teljesen elmosódottat, ha pedig összemérhető vele, akkor a felvételen mérhető elmozdulást látunk, amelynek alapján meg tudjuk határozni a mozgás sebességét. A spinjelző EPR technika azért vált az egyik legtermékenyebb módszerré a membrándinamika kutatásban, amihez a munkacsoport eredményei is jelentősen hozzájárultak, mert a fenti időablak jól illeszkedik a biomembrán fluiditását meghatározó molekuláris dinamikához. Ez azért is Biofizika 27

28 Biofizika fontos, mert az utóbbi időben felerősödött szerkezeti szemlélet egyik mellékhatása, hogy a biológiai rendszerek dinamikus volta kevesebb figyelmet kap, pedig egy biológiai membrán fehérje- és lipidmolekulái közelítőleg 20 nagyságrend széles időskálán végeznek vibrációs, rotációs és transzlációs mozgásokat. A mérési technikák kombinálása előnyeinek érzékeltetésére tekintsük meg egy lipidmolekula egyik szénhidrogénláncának a 4. ábrán látható egy fragmentumát. Pusztán a (pl. FTIR mérésekből származó) konformáció alapján bárki azt mondaná, hogy fluid fázisban lévő lipidről van szó. Csakhogy ez a lipidlánc-darab történetesen egy membránfehérjére tapadt lipid szénhidrogénláncának egyik fragmentuma. A normál fluiditási időskálához viszonyítva meg sem mozdul, azaz, ugyan rendezetlen a konformációja, de mégis teljesen merev. A membránfehérjék általában rendezetlen felszínére tapadó lipidek hasonlóan viselkednek. Mint a következő fejezetben látjuk, a spinjelző EPR spektroszkópia ezeket a lipideket immobilis lipidekként azonosítja, helyesen, de nem ad információt a lánc konformációjáról. átfedő, részben egymást kiegészítő szerkezeti adatokat a legkonzisztensebb módon molekulamodellezéssel lehet egységesen értelmezni. Ezt a stratégiát korábban megalapozta, hogy a 90-es években a csoport korábbi és jelenlegi vezetője úttörőkként vett részt olyan, nem lineáris EPR technikák kifejlesztésére irányuló európai fejlesztésben, amelyek helyspecifikus spinjelzéssel kombinálva lehetővé tették lipideken vagy fehérjeoldalláncokon kötött spinjelzők egymás közötti, valamint a vizes fázistól, a membrán közepétől, vagy bizonyos fehérjék paramágneses fémcentrumaitól mért távolságok mérését, közel atomi felbontásban. Ugyanezekkel a módszerekkel a spinjelző EPR technika időablakát is sikerült kiszélesíteni a lassúbb, mikroszekundumos mozgások tartományával. Ezekről a módszerekről könyvfejezetekben és áttekintő közleményekben is beszámoltak, amelyekben áttekintik a kifejlesztett ún. integrál módszereket és a szerkezeti adatok típusait, amelyek ezekkel a nemlineáris EPR módszerekkel nyerhetőek spinjelzett membránfehérjékről. A fentiekben leírt lehetőséget az ezredforduló óta a csoport egyre jobban kihasználja. Ugyanis a klaszszikus szerkezetbiológiai módszerekkel szemben a fenti módszerek használhatóak natív biomembránok esetén is, vagy olyan modell membránokban, amelyekben a vizsgálni kívánt membránfehérje működése ellenőrizhető. Ez azt jelenti, hogy az ilyen módon gyűjtött szerkezeti, dinamikai, termodinamikai adatok a biológiai funkció szempontjából bizonyosan relevánsak, következésképpen az ezek alapján készített molekula- vagy fizikai modell is az. Ez a módszer a spektroszkópiára alapozott funkcionális szerkezetbiológia ábra. Lipid szénhidrogénlánc-fragmentum rendezetlen konfigurációban. A csoport metodikai palettája, sikeres pályázatoknak és külföldi kapcsolatoknak köszönhetően az ezredforduló környékén és utána differencia pásztázó kalorimetriával, fluoreszcencia spektroszkópiával és, az SZBK-ban elsőként telepített modellező munkaállomás révén, molekulamechanikai modellezéssel bővült. A fenti kísérleti technikákkal nyert, részben Lipid-fehérje kölcsönhatás, ahogyan az spinjelzett lipidláncok dinamikájában megjelenik A szakirodalomban a 70-es években írták le először azt, hogy fehérjét is tartalmazó fluid membránban a spinjelzett lipidek EPR spektruma két komponensből áll: az egyik megfelel a fehérje nélküli minta spektrumának, a másik inkább hasonlít egy gél fázisú membrán spektrumára. A két komponenst mobilis és immobilis komponensnek nevezték el (5. ábra).

29 kötési kölcsönhatását nagyon jó spektrális felbontással tanulmányozni lehet. A 80-as évek közepétől Páli Tibor, mintegy másfél évtizeddel később Kóta Zoltán is csatlakozott ezekhez a kutatásokhoz. Kiderült, hogy jóllehet léteznie kell egy mobilitási gradiensnek a membránfehérjétől távolodva (7. ábra), de az első, szolvatációs lipidréteg rotációs dinamikája olyan mértékben korlátozott, hogy az EPR spektrumban ezek egyedül adják az immobilis komponenst, míg az összes többi lipid a mobilis komponenshez tartozik. Biofizika 5. ábra. A membránfehérjék által immobilizált (szolvatációs) és mobilis (szabad) lipidek EPR spektrum komponenseinek szétválasztása egy membránfehérjét és spinjelzett lipideket is tartalmazó modellmembránban Kiderült, hogy az immobilis lipidek koncentrációja arányos a membránban lévő fehérjekoncentrációval, azaz egy darab fehérjére jutó immobilis lipidek száma konstans. Ezek az eredmények ráirányították a figyelmet a fehérje-lipid határfelület (6. ábra) lipidjei dinamikájának jelentőségére. 6. ábra. Egy integráns membránfehérje térkitöltő modellje a határfelületi, immobilis lipidekkel együtt (az utóbbiak egy része rejtve van) Ezekben a kutatásokban a csoport Horváth László irányításával rögtön a kezdetektől aktívan részt vett, és a göttingeni Biofizikai Kémiai Max-Planck Intézet Derek Marsh vezette csoportjával együttműködésben úttörő szerepe volt abban, hogy egy új kutatási irány, a lipid-fehérje kölcsönhatás vizsgálata elindult és kiteljesedett. Ugyanis a spinjelző EPR technika az egyetlen, amellyel a lipidek és fehérjék nem 7. ábra. Egy transz-membrán α-hélix és az azt körülvevő lipidláncok felülnézeti geometriai ábrázolása. A szürkeárnyalati skála a rotációs dinamika sebességének felel meg (sötétebb = lassúbb). Baloldal: a szolvatációs lipidek első rétege, jobboldal: a laterális mobilitási grádiens Az is kiderült, hogy a membránfehérjék válogatnak a lipidek között, azaz eltérő lipideket eltérő mértékben kötnek, pontosabban a membrán síkjában zajló diffúzió révén érkező különféle lipidek eltérő hosszúságú ideig tartózkodnak a fehérje felszínén. A membránfehérjék lipidspecificitásáról nagyrészt ezekből a mérésekből tudunk. Olyan ismert szerkezetű fehérjék molekulamechanikai modellezésével, amelyeken történtek spinjelző EPR mérések is, nemrégiben független módszerrel is sikerült igazolni, hogy a spinjelző EPR által azonosított immobilis lipidek valóban a membránfehérjét körülvevő határfelületi lipideket jelentik. Ez azt jelenti, hogy meg lehet határozni a membránfehérjék intramembrán felszínét, ami fontos szerkezeti adat. A témában nagy számú közlemény (cikk, könyvfejezet, áttekintő közlemény) született. A technikai fejlesztések és az egyre jobb kiértékelő algoritmusok révén a 80-as évek végétől lehetővé vált a lipidek membránsíkbeli, ún. laterális diffúziójának mérése a spinjelző EPR technika segítségével. A csoport két EPR spektroszkópusa kétféle módszer kifej- 29

30 Biofizika 30 lesztésében és alkalmazásában vett részt. Az egyik módszerrel meg lehet határozni a spinjelzők ütközési gyakoriságát a spektrumvonalak kiszélesedésének és eltolódásának számítógépes követésével. A másik módszer a térben inhomogén (lineáris grádiens), időben modulált mágneses teret használ, aminek következtében a mintának csak egy kis szeletében teljesül a mágneses rezonancia feltétele. Ezt a módszert Páli Tibor egy együttműködés keretében még az egykori Kelet-Berlinben adaptálta membránokra. A módszerrel meg lehet határozni a paramágneses centrumok (spinjelzők) membránon belüli eloszlását. A fizikai háttér hasonló a mai orvosi képalkotó technikához. Ezekkel a módszerekkel igazolták, hogy a membránfehérjék a lipideknek nemcsak a rotációs diffúzióját, hanem a membrán síkjában zajló laterális diffúzióját is befolyásolják. Különösen érdekes ez a membránok felszínére kötött fehérjék esetében, amelyek általában csak kis mértékben perturbálják a lipidek láncmozgását. Az egyik ilyen vizsgált objektum a mielin bázikus fehérje volt, amelynek kiemelkedően fontos szerepe van az idegsejtnyúlványok, axonok szigetelő burkának, a mielinhüvelynek a stabilizálásában. A mielinhüvely egy spirálisan feltekert membrán, amelyben a rétegeket többek között ez a fehérje tartja összekapcsolva. A sclerosis multiplex betegségben az immunrendszer valamiért megtámadja ezeket és más fehérjéket, amitől szétesik a mielinhüvely, ennek pedig egyenes következménye az idegvezetés megszűnése az érintett idegsejtnyúlványokon. Az utóbbi két évtizedben számos megfigyelés azt igazolta, hogy a lipid = szerkezet, fehérje = funkció szereposztás biomembránokban túlzottan leegyszerűsítő, ami a figyelmet a lipid-fehérje kölcsönhatás funkcionális szerepére irányította. A kérdés aktualitását felismerve egy összefoglaló közleményben vették számba, jórészt saját kutatásokra alapozva, a lipid-fehérje kölcsönhatás funkcionális jelentőségét fotoszintetikus membránokban, a membránszerkezet és -dinamika szemszögéből. A membránfehérjékkel kölcsönható lipidek szerepet játszanak a membránfluiditás szabályozásában, bizonyos membránfehérjék szerkezetének stabilizálásában, ill. biológiai funkciójának ellátásában csakúgy, mint a fehérje-oligomereknek, ill. -aggregátumoknak akár a normális fejlődés során bekövetkező, akár az abnormális körülmények okozta átszerveződésében. A közlemény rámutat a fotoszintetikus membránok lipidösszetételét befolyásoló enzimek és gének, ill. azok manipulálásának jelentőségére. A lipid-fehérje kölcsönhatás vizsgálatát ma is kiemelt feladatának tekinti a csoport. Fehérjék gombolyodása és szerveződése biomembránokban A fehérjék gombolyodásának megértése ma a biofizika egyik legnagyobb kihívása. Ez fokozottan érvényes membránfehérjék esetében, amelyek szerkezetileg, dinamikailag és funkcionálisan is kapcsolódnak a lipidekhez. A lipid-fehérje kölcsönhatásban nagyon különböző természetű erők vesznek részt, hiszen a membránok és a felszínükhöz kötődő fehérjék között elsősorban poláros, ezzel szemben a membránok hidrofób, belső régiójában a lipidek és a beágyazódott fehérjék között elsősorban apoláros kölcsönhatások hatnak. Ez a problémakör azért is érdekes, mert membránfehérjéknek a funkciójukat megőrző módon való membránba építéséhez szükség van arra, hogy azok megfelelően épüljenek be és szerveződjenek össze a lipid kettősrétegben. Az integráns membránfehérjék többsége két nagy szerkezeti osztályba sorolható: egyedi vagy kötegekbe rendeződött transzmembrán α-hélixek (mint pl. a csoport által is vizsgált bakteriorodopszin), vagy transz-membrán β-hordók (mint pl. a szintén vizsgált E. coli pórusfehérjék). Egy működő biológiai membrán kialakulásának központi kérdése, hogy a membránfehérjék hogyan tekerednek fel, hogyan veszik fel végső szerkezetüket, illetve hogyan épülnek be a membránba. A fenti okok miatt a Membrán Szerkezet és Dinamika Csoport az ezredfordulótól elkezdett foglalkozni kiválasztott membránfehérjék membránbeli helyzetének és termikus stabilitásának vizsgálatával és elsősorban spektroszkópiai adatokon alapuló szerkezeti predikciójukkal. Az alábbiakban bemutatásra kerülő, kiragadott példák és a csoport további hasonló vizsgálatai indították el a spektroszkópiára alapozott funkcionális szerkezetbiológiai megközelítésük kidolgozását. Az M13 egy kicsi, szálas E. coli specifikus bakteriofág (vírus), mely fontos szerepet játszik a bakté-

31 rium génmanipulációjában. A vírus genetikai anyaga egy kör alakú DNS, amelyet mintegy burokfehérje burkol. Ezek 98%-a az 50 aminosavat számláló fő burokfehérje. A vírus, illetve fő burokfehérjéje biofizikai szempontból igen érdekes objektum. Ugyanis a burokfehérje a vírus-gazdasejt kölcsönhatásának különböző fázisaiban különböző szerkezeti funkciókat lát el, melyek során lipid-fehérje, DNS-fehérje és fehérje-fehérje kölcsönhatások játszanak fontos szerepet, és ezekben a fázisokban a fehérje valószínűleg eltérő szerkezeteket vesz fel. A burokfehérje a gazdasejtben szintetizálódik, és annak plazmamembránjában tárolódik mielőtt az új DNS-t körbevéve összegyűlik, és az új bakteriofágban a DNS-el együtt elhagyja a sejtet. Mindez úgy történik, hogy eközben a gazdasejt plazmamembránjának folytonossága nem szakad meg. A bakteriofág működésének megértése szempontjából fontos a fő burokfehérje szerkezetének és membránbeli helyzetének ismerete. Magmágneses rezonancia spektroszkópiai módszerrel más kutatók a fehérje valószínű vázszerkezetét határozták meg kétféle detergensben (mosószerhez hasonló vegyületekben). Ugyanakkor membránbeli elhelyezkedéséről kevés adat állt rendelkezésre. A munkacsoport tagjai ezen szerkezeti adatokat saját EPR mérésekkel egészítették ki, amelyek bizonyos spinjelzett aminosavak térbeli elhelyezkedését és mobilitását írták le. Az adatok segítségével kiválasztották a szerkezetek 3-4 fehérjéből álló csoportját, és ezen szerkezeteknek a lipidköpenyben való vertikális eltolásának vizsgálatával finomították a burokfehérje membránbeli lokalizációját. Az így elkészített lipid-fehérje modell (8. ábra) segítette az újabb spektroszkópiai adatok értelmezését, és molekuladinamikai számítások kiindulópontja is volt egyben. 8. ábra. Az M13-as bakteriofág fő burkolófehérjéjének szekvenciája és gyöngymodellje, amely a fehérje membránbeli elhelyezkedését mutatja az első réteg szolvatációs lipidekkel együtt mágneses rezonancia spektro szkópiai adatok alapján A 80-as évek elejétől több kutatócsoport izolált különböző szövetekből egy magas redoxpotenciálú, aszkorbáttal redukálható, erősen hidrofób b-típusú citokróm fehérjét, amelynek redukált mínusz oxidált optikai spektrumában a jellegzetes α-sáv maximuma 561 nm-nél van. Ezek a fehérjék egy családot alkotnak, amelyeken keresztül transz-membrán elektronátvitel zajlik. Az elektronátvitel mechanizmusa részleteiben máig sem ismert. A fenti okok miatt a munkacsoport célul tűzte ki a családhoz tartozó fehérjék részletes feltérképezését és az első modellszerkezetek elkészítését. Kapcsolódó közleményük a cyt b-561 fehérjecsalád addigi legteljesebb és legrészletesebb szekvenciahasonlósági térképét mutatta. A munka fő eredménye a fehérjecsaládnak a mai napig egyetlen 3 dimenziós szerkezeti modellje (9. ábra). 9. ábra. A citokróm b-561 membránfehérjék konzervált elektronszállító magjának legvalószínűbb szerkezeti modellje, az elektronfelvevő és -leadó helyek feltüntetésével A négy α-hélix közötti csatornában található a két hem csoport horgonyzására szolgáló 2 pár hisztidin, valamint számos, nagyon konzervált aromás aminosav, melyek nagy valószínűséggel részét képezik a membránon áthaladó elektron útvonalának. Az eredmények azt mutatják, hogy a citokróm b-561 membránfehérje-család szerkezeti sajátságai jól konzerváltak mind a szekvencia, mind a 3-dimenziós szerkezet szintjén. A szerkezeti modell már publikálása előtt komoly érdeklődést váltott ki, és azóta a fehérjecsalád egyik alaphivatkozása lett, melyet biofizikai és genetikai kísérletek tervezésénél is folyamatosan figyelembe vesznek. A citokróm b-561 fehérjékkel kapcsolatos kísérleti munkákat Bérczi Alajos végezte. Biofizika 31

32 Biofizika A bakteriális betegségek elleni harc fontos fegyverei az antibakteriális polipeptidek, amelyek a baktérium membránját támadják meg. A gramicidin A, ez a kisméretű, a membránokban pórusokat létrehozó antibakteriális polipeptid ideális az antibiotikumok specificitásának és membránbeli elhelyezkedésének vizsgálatára. A csoportban Kóta Zoltán a gramicidin A membránba épülését, membránbeli orientációját és lipidekkel való nem kovalens kölcsönhatását tanulmányozta polarizált teljes visszaverődéses FTIR és spinjelző EPR spektroszkópiával, mégpedig különféle lipidekből készített modellmembránokban. Az eredmények szerint a polipeptid membránba épülése, az abban felvett szerkezete és iránya, valamint a membránlipidekkel való kölcsönhatása (specificitás és sztöchiometria) erősen függ az adott membrán lipidösszetételétől és fizikai állapotától (10. ábra). Ezért a membránfehérje-szerkezetek iránt, részben a gyógyszer- és kozmetikai ipar által is felfokozott hatalmas igény alternatív eljárásokat sürget. A csoportban egyre intenzívebben foglalkoznak a fehérjegombolyodás és a szerkezeti predikciók elméleti, szimulációs aspektusaival. A 8. ábra a szerkezetbiológia alapvető problémájának matematikai, fizikai lényegét is reprezentálja, amely egyben az egyik legnagyobb kihívás a biofizikában, a molekuláris biológiában és a bioinformatikában is: ha ismerjük egy fehérje szekvenciáját, hogyan tudjuk megjósolni natív szerkezetét? A 8. ábrán a nyíllal jelzett szekvencia gombolyag kódolás érvényes a fehérje natív környezetében, csakhogy a kódnyelvet nem ismerjük. Bármely technika, legyen az kísérleti vagy tisztán elméleti, amely közelebb visz a fehérjék gombolyodásának részletes megértéséhez, és azon keresztül a szerkezeti predikciók megbízhatóságának javításához, jelentős előrelépést jelenthet. Ez különösen fontos a membránfehérjék esetében, és mindennek közvetlen gyógyászati és egyéb ipari jelentősége is van ábra. Egy antibakteriális polipeptid (a gramicidin A) membránban felvett kétféle konformációja, középütt egy foszfolipiddel A csoportban más antibakteriális polipeptidekkel is végeztek hasonló vizsgálatokat, melyek fontosak olyan új membránspecifikus antibiotikumok tervezése és szintézise során, amelyek az emberi vörösvértestek membránjában nem aktiválódnak, miközben a baktériummembránokban kifejtik pórusformáló, sejtromboló hatásukat. A fehérjék működésük közben jól meghatározottan konformációk során mennek keresztül, melyeket ismerni kellene a működés megértéséhez. Ugyanakkor az atomi felbontású fehérjeszerkezetek között zavaróan csekély számban található membránfehérje (aminek okát fentebb már említettük). A Membrán Szerkezet és Dinamika Csoportban membránfehérjékkel, spektroszkópiai és modellezési technikákkal kapcsolatos tapasztalataikra alapozva egy újszerű eljárás fejlesztésébe kezdtek, amely olyan egyszerűsített szerkezetet, gombolyagot generál, amely megfelel az adott fehérjén, annak membránkörnyezetében mért szerkezeti adatoknak. Ezért a jósolt gombolyagok funkcionálisan relevánsak lesznek. Mint ahogyan a fenti példákból is kiderült, kézzel ezt az eljárást már sikerrel alkalmazták. A jelenlegi egyik legfontosabb cél egy olyan szoftvercsomag kifejlesztése, amelyben a különféle szerkezeti adatok egységesen és automatikusan kezelhetőek lesznek, a jobb szerkezeti predikciók számítása érdekében. Az algoritmust először transzmembrán α-hélix és β-hordó fehérjéken mért saját és más publikált szerkezeti és kinetikai adatokkal finomítják. Ehhez molekulamechanikai számításokat végeznek a kísérleti adatokra alapozva. Kutatásaik másik célja annak vizsgálata, hogy a membránba beépülő vagy annak felszínére kötődő fehérjék gombolyodását és szerveződését hogyan befolyásolja a membránok kémiai összetétele és fizikai állapota.

33 Egy membránhoz kötött, protont szállító molekuláris motor: a vakuoláris proton-atpáz Az élő sejtek egyik legfontosabb sajátossága, hogy bennük az ionok nem egyenletesen oszlanak el. Ez egyes életfolyamatoknak következménye, míg másoknak hajtómotorja is egyszerre. A közeg a sejtek belső kamráiban és sok szövetben a sejtek közötti térben is savasabb, mint a sejt belsejében, a citoplazmában. Ezt a protonkoncentrációban meglévő különbséget elsősorban a sejtkamrák membránjában és a plazmamembránban is megtalálható, két doménből álló membránfehérje, a vakuoláris proton-atpáz (V-ATPáz) biztosítja. A V-ATPáz az ATP hidrolíziséből (bontásából) nyert kémiai energiát a rotor-domén megforgatására használja, bizonyos alegységek közötti forgatónyomaték generálása révén, ami pedig a kar- és a rotor-domének közötti határfelületen megvalósuló protonpumpálást eredményez a membránon keresztül (11. ábra). 11. ábra. A vakuoláris protonpumpa (V-ATPáz) forgó mechanizmusa, amely összekapcsolja az ATP hidrolízist és a protonpumpálást. A forgó rész a c alegységből álló gyűrű és annak tengelye. (Az áttekinthetőség érdekében az ábráról hiányzik a fehérjekomplexum néhány alegysége.) A fehérjekomplexum atomi felbontású térszerkezete nem ismert, mint ahogy működési mechanizmusának részletei sem. A 12. ábra csak a membránban lévő, protont szállító rész fő alegységeit illusztrálja. Működése során a fehérje 6 alegységből álló központi gyűrűje (az ábrán téglapiros rotor) forgó mozgást végez a membránban rögzített alegységhez képest (ami az ábrán a zöld kar). Proton csak a rotor és a kar érintkezési felületén, a forgás miatt periodikusan kialakuló és megszűnő csatornán keresztül haladva juthat át a membránon. A V-ATPáz tehát afféle motoros futószalag, amely protonokat szállít egy gáton, a membránon keresztül. 12. ábra. A V-ATPázban a hat darab c alegységből álló gyűrű a motor rotorja, az a alegység pedig a fehérje katalitikus (az ábrán nem látható) doménjéhez rögzített kar (a motorblokk). Transzmembrán protonmozgás csak a két alegység határfelületén található hidrofil csatornákban lehetséges. Az ilyen molekuláris motorok atomi felbontású szerkezetének meghatározása és működésének, szabályozásának megértése a biofizika egyik legfontosabb problémaköre napjainkban. Továbbá a V-ATPáz fontos szerepet játszik olyan betegségekben, mint a csontritkulás vagy a rosszindulatú daganatok. Emiatt közvetlen orvosi és gyógyászati jelentősége van, hiszen a V-ATPáz szelektív, szövetspecifikus gátlása terápiás potenciállal bírna. Kiterjedt nemzetközi kutatások részeseként a munkacsoport korábban igazolta, hogy a V-ATPáz Vo doménjének c alegysége az eredményeik alapján felfedezett, nagy szekvenciahomológiát és szerkezeti hasonlóságot mutató és ductin-nak (vezeték) keresztelt fehérjecsaládhoz tartozik. Megállapították, hogy természetes membránokban a 6 c alegységből álló gyűrű 4-hélixes kötegekből épül fel. Azt is megmutatták, hogy a V-ATPáz ismert specifikus gátlóanyagai perturbálják a Vo domén lipidfehérje határfelületét. Továbbá meghatározták egy kitüntetett cisztein és a protonszállításhoz nélkülözhetetlen glutamin aminosavak helyét a membránban, és igazolták, hogy ezek az aminosavak érintkeznek lipidekkel is. Azonosítottak egy fémkötő régiót is a c alegységen. A legújabb, még nem publikált kísérletek legnagyobb része élesztő vakuólumból készült vezikulákon, Biofizika 33

34 Biofizika azaz natív biomembránon történt: különböző feltételek mellett mérték a V-ATPáz működését. Kimutatták, hogy az oszcilláló elektromos tér befolyásolja a V-ATPáz ATP-hidrolizáló aktivitását. Maximális ATPáz aktivitás ~ 88 Hz-el oszcilláló elektromos térben mutatkozik. Ezek az eredmények azért nagyon fontosak, mert ez az első kísérlet, amelyben a V-ATPáz forgó mechanizmusát ugyan indirekt módon, de natív membránban és mindenféle genetikai és kovalens módosítás nélkül sikerült kimutatni. További cél a molekuláris motor szerkezet-funkció kapcsolatának jobb megértése fizikai modellek segítségével, valamint a működés szempontjából releváns szerkezeti változások azonosítása, konkrétan a funkcionális szerkezetbiológiai módszerekkel gyűjtendő adatok alapján az a és c alegységek szerkezeti modelljének elkészítése. Biofizikai módszerek más diszciplínák és regionális kutatások szolgálatában A Membrán Szerkezet és Dinamika Csoport a biomembránok kutatásán túlmenően mindig is részt vett olyan kutatási együttműködésekben, amelyekben a csoport által használt egyedi módszerek hatékonynak bizonyultak. Ez leginkább az EPR spektroszkópia esetében merült fel, ugyanis a csoport által üzemeltetett EPR készülék jelenleg is az egyetlen a régióban, ami a csoportétól merőben eltérő kutatási projektekben való részvételét is indokolttá tette. Kiemelendő az SZTE Biokémiai Intézetével való igen sikeres együttműködés, amelyben emberi és állati szövetek szabadgyök tartalmát EPR technikával mérték, és ezzel jelentősen hozzájárultak a különféle szabadgyökök keringési és szívbetegségekben betöltött szerepének jobb megértéséhez. Az Élelmiszeripari Főiskolával való tartós együttműködés keretében pedig élelmiszer-készítmények (szárított hagyma, tejpor, paprikaőrlemény) gyártása során keletkező szabadgyököket vizsgálták. A mérési eredmények segítettek abban is, hogy a γ sugárzással történő csírátlanításhoz szükséges optimális dózist meghatározzák, ill. a túlzottan magas dózis alkalmazását utólagosan is kimutassák (amely lehetőség pl. egy vagonnyi besugárzott hagyma miatti bírósági perben szakértői vélemény alapját képezte). Páli Tibor 34

35 Molekuláris Neurobiológiai Csoport Biofizika A Molekuláris Neurobiológiai Csoport az idegrendszer fiziológiás és kóros működésével összefüggő mechanizmusokat tanulmányozza az alapés alkalmazott kutatások legszélesebben értelmezett spektrumában. Így vizsgálataik az elemi idegi történések felfedező jellegű kutatásától a memóriafolyamatok alapjául szolgáló plasztikus változások jellemzésén át az idegrendszer akut sérülésének és krónikus degeneratív elváltozásainak vizsgálatáig, végső soron pedig az ezek gyógyítására irányuló törekvésekig terjednek. A Csoport Siklós László vezetése mellett Deli Mária, Hajszán Tibor, Hoyk Zsófia, Krizbai István, Párducz Árpád közreműködésével, és tradicionálisan számos egyetemi- és PhD hallgató valamint fiatal kutató segítségével folytatja tevékenységét. A Molekuláris Neurobiológiai Csoport jogelődje 1965-ben alakult. Ekkor hozták létre az akkori József Attila Tudományegyetem Természettudományi Karán (TTK) az Elektronmikroszkópos Laboratóriumot. A Magyar Tudományos Akadémia vezetése ebben az időben kezdte el a Szegedi Biológiai Központ (SZBK) kutatói gárdájának kialakítását, és a TTK-n megalakuló munkacsoport megszervezésével szándékozott műszeres és szakmai hátteret biztosítani a leendő intézet nemzetközi szintű sejtbiológiai és finomszerkezeti kutatásaihoz. Az idegtudományi kutatási profil kialakításában döntő szerepe volt a Laboratórium felügyeletével, illetve vezetésével megbízott Csillik Bertalan és Fehér Ottó professzoroknak, így az újonnan felvett munkatársak 1969-tól 1996-ban bekövetkezett haláláig Dr. Joó Ferenc, majd 2007-ig Párducz Árpád vezetésével az idegi alkalmazkodóképesség (neuronális plaszticitás) különböző vonatkozásait kezdték tanulmányozni. Az SZBK épületének elkészülése után a Csoport a Központ Biofizikai Intézetébe került, és ekkor állították üzembe az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) Fejlesztési Programjának (UNDP) támogatásával beszerzett nagyteljesítményű JEOL 100B elektronmikroszkópot (1. ábra), mely a Csoportnak az idegrendszer működése finomszerkezeti alapjainak a vizsgálatára irányuló fő kutatási vonalát évtizedekre meghatározta, és alapvető műszerezettségét biztosította. Hamarosan a Neurobiológiai Csoport a szegedi idegtudományi kutatás egyik központjává, iskolájává vált, melyet legjobban egy korabeli interjúból vett idézet szemléltet: a szakma iránt szűnni még ma sem akaró lelkesedésük szinte mágnesként vonzza már a tanulni vágyó egyetemi hallgatókat és az együttműködésre jelentkező hazai és külföldi szakembereket. 1. ábra. Dr. Joó Ferenc a JEOL 100B elektronmikroszkópnál. Agyunkban az idegrendszer építőelemei az idegsejtek igen bonyolult nyúlványrendszerrel összekötött ún. neuronhálózatot hoznak létre. Az információ feldolgozása ebben a hálózatban történik, az információcsere elemi lépései viszont az idegnyúlványok közötti átkapcsoló helyeken, az ún. szinapszisokban mennek végbe. A munkacsoport egyik kutatási területe az idegi működés alapját képező szinaptikus ingerületátvitel elemi jelenségeinek, elsősorban az átvivő anyagnak az idegvégződésből történő felszabadulásának tanulmányozása volt. Macska felső nyaki szimpatikus ganglionján végzett kombinált élettani, elektrofiziológiai és finomszerkezeti vizsgálatokkal kimutatták, hogy a kolin kettős szere- 35

36 Biofizika 36 pet játszik ebben a folyamatban, hiszen a membránok fontos alkotórésze és ugyanakkor az egyik legfontosabb átvivő anyag, az acetilkolin (ACh) prekurzora is. Az a felismerés, hogy a kolin hiánya az ACh szintézis zavara mellett finomszerkezeti változásokat is okoz az idegvégződésekben, az Alzheimer-kór patomechanizmusának egy lehetséges magyarázatát adja. Később az átvivő anyag idegvégződésekből történő felszabadulását tanulmányozták a márványos zsibbasztórája (Torpedo marmorata) elektromos szervének kolinerg szinapszisain. Hagyományos elektronmikroszkópos, gyorsfagyasztással kombinált fagyasztva töréses, elektrofiziológiai és neurokémiai módszerek alkalmazásával elsősorban az ingerlés hatására létrejövő finomszerkezeti változásokat vizsgálták. Az irodalomban először tudtak fiziológiás körülmények között, milliszekundumos időfelbontással egyetlen inger hatására bekövetkező, néhány msec-ig tartó és a szinapszisok működésével összefüggésbe hozható finomszerkezeti eltéréseket kimutatni a preszinaptikus membránban. Az ACh felszabadulás ideje alatt, ill. az ezt követő 10 msec-ban nem találtak fokozott exocitózisra utaló morfológiai jeleket, ugyanakkor az elektromos válasszal szinkronban átmenetileg megnövekedett a 10 nm-nél nagyobb intramembrán részecskék száma. Ez a megfigyelés az általánosan elfogadott ún. vezikula hipotézissel szemben ami szerint az átvivőanyag felszabadulása exocitózissal történik egy, a membráncsatornákon történő felszabadulást valószínűsít. Az ingerületáttevődés folyamatában kulcsfontosságú szerepet töltenek be a kalciumionok, hiszen az ingerületátvivő anyag felszabadulását, így az információ átkapcsolódását rendre kalcium-beáramlás előzi meg, viszont ezen ionok hiánya vagy többlete egyaránt rendellenes működéshez vezet. A kalciumionok finomszerkezeti változásokhoz rendelhető mozgásának követésében nagy előrelépést jelentett egy az Alsó-Szászországi Parlament hathatós anyagi támogatásával 1990-ben beszerzett, spektroszkópiai képalkotással működő elektronmikroszkóp (2. ábra), melylyel a Csoportnak a Göttingeni Egyetemmel több mint 20 éven át a felsőnyaki szimpatikus ganglionban mint modell rendszerben a szinaptikus plaszticitás kutatása terén folytatott sikeres együttműködése is elismerésre került. 2. ábra. Spektroszkópiai képalkotással működő Zeiss 902 elektronmikroszkóp A berendezés, amellett, hogy a transzmissziós elektronmikroszkópos képalkotást is magasabb minőségben tette lehetővé, egyazon mintából kétdimenziós, elemeloszlás-jellegű analitikai információ származtatását is biztosította (3. ábra). 3. ábra. Egy mitokondrium elektronmikroszkópos képe, és kalciumeloszlása (színezve) A módszertan felhasználásával számos említésre méltó technológiai fejlesztésen túl a Csoport munkatársai komoly eredményeket értek el a kalciumionok alapvető idegi funkciókhoz köthető eloszlásának jellemzésében. Így az idegvégződések kalcium-anyagcseréjének vizsgálata során bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a szinaptikus vezikulák aktív szerepet játszanak az idegvégződésbe bejutó kalciumionok felvételében, átmeneti raktározásában és az onnan exocitózissal történő felszabadításában. Az idegsejtek közötti információcsere hatékonyságának megváltozása végső soron a teljes neuronhálózat, így az agy működésére is kihatással van, tehát a kapcsolatok stabilizálódása vagy fellazulása elemi

37 emléknyomok megerősítésével vagy elvesztésével, vagyis a tanulás folyamatával, illetve a demenciával hozható összefüggésbe. A jelenség tanulmányozására a Csoport munkatársai olyan agyi régiót választottak (hippokampusz), melyben a főbb idegi kapcsolatok egyfajta könnyen áttekinthető rendbe szerveződnek, így élettani eszközökkel jól manipulálhatók, morfológiai eszközökkel pedig jól azonosíthatók. A hippokampuszban elektrofiziológiai módszerekkel létrehozott elemi emléknyom (angol szóhasználattal long-term potentiation; LTP) tanulmányozása során kimutatták, hogy a jelenség kialakulása is kalciumfüggő, éspedig a vizsgált sejtek közötti kapcsolatban az információt fogadó komponens kalciumtartalmának növekedésével jár. A jelenség részletesebb vizsgálata igazolta, hogy a kalciumionok koncentrációjának egy szűk tartománytól való eltérése a kisebb értékek irányába ún. inaktivitásos károsodással jár, megemelkedett értéke szükséges a fokozott idegi tevékenységhez, így a tanuláshoz is, túlzott emelkedése viszont újból csak ártalmas, ún. kalcium-közvetített toxicitást vált ki. Ez a felismerés a további kutatásokat az idegrendszeri degeneratív károsodások és ezek kalciumfüggése tanulmányozásának irányába tolta el. a leíró vizsgálatok állatmodelleken kapott eredményekkel közvetlenül összevethetők. Így a választás az amiotrofiás laterálszklerózisra, a mozgató idegsejtek gyógyíthatatlan betegségére esett, mert a betegek izombiopsziáiból az érintett idegsejtvégződések kipreparálhatók, jellemezhetők, és hasonló végződések összehasonlítás céljára kísérleti állatokból is nyerhetők (4. ábra). A betegek izombiopsziamintáiban található idegvégződésekben általánosítva, emberi degenerálódó idegszövetben világelsőként kimutatták, hogy a betegségben érintett (mozgató) idegsejtek megemelkedett kalciumtartalommal rendelkeznek. Az eredményekre további állatkísérleteket alapítottak, melyek során kimutatták, hogy az idegsejtekben még a kalciumszint emelkedésének átmeneti kivédésére irányuló, megnövelt kalciumpufferkapacitással, azaz a kalcium-kötő fehérje megemelt szintjével megvalósított beavatkozás is megnöveli azok ellenálló képességét. További kutatásaikat az idegsejtekbe történő kalciumbeáramlás csökkentésére irányuló beavatkozásokra, illetve ezek protektív hatásának jellemzésére fókuszálták. A szinaptikus plaszticitás finomszerkezeti tanulmányozásának eredményei mellett a molekulaszintű ismeretek megszerzése és ezek párhuzamba állítása felé tett első lépések közé sorolhatók azok a vizsgálatok, melyeket a Csoport kutatói a felnőttkorban is nagyfokú plaszticitást mutató szaglógumón végeztek (5. ábra). Biofizika 4. ábra. Harántcsíkolt izmot beidegző idegvégződés szinaptikus vezi kulákkal Az idegsejtek kalciumeloszlása vagy -szint változása és a degeneratív károsodásokkal való összefüggések vizsgálatára irányuló felfedező jellegű kutatásokra, valamint az eredmények gyógyászati alkalmazásainak megkönnyítésére a Csoport munkatársai olyan humán betegséget választottak, ahol 5. ábra. Az 1990-ben megjelent monográfia Így általánosították a morfológiailag eltérő kisagyi szinaptikus vezikulák funkcionális különbözősé- 37

38 Biofizika 38 gére tett korábbi észrevételüket, illetve a szaglógumó belső, funkcionális morfológiai és neurokémiai vizsgálataiból következtettek annak alapvető neurokémiai működési mechanizmusaira. Vizsgálataik eredményeit, melyek a gerinces agy egészének a működése szempontjából a szaglórendszer hozzájárulását értékelik, egy monográfiában összegezték (5. ábra). A molekuláris információk és a finomszerkezeti kutatások eredményei összekapcsolásának természetes, bár a 70-es években úttörőnek mondható igénye olyan tanulmányok kapcsán is felmerült, amelyek az agyszövetbe az agyi hajszálereken keresztül történő anyagtranszportnak az akkor még jórészt ismeretlen körülményeit vizsgálták, s melyek során az adenilátcikláz (a ciklikus AMP-t adenozin-trifoszfátból szintetizáló enzim) szerepét tisztázták. A vizsgálatok során sikerült elektronmikroszkópiával az agyi hajszálereken az adenilát-cikláz jelenlétének kimutatása, azonban a párhuzamosan futó biokémiai vizsgálatokhoz, azaz a különböző receptoroknak, ezek szerepének és érzékenységének kimutatásához megfelelő mennyiségű és minőségű hajszálér-preparátumra volt szükségük. Ezért a 70-es évek elején megfelelő mikromódszert dolgoztak ki olyan, viszonylag tiszta hajszálér-preparátum előállítására, mely hosszú időn keresztül a vér és az agy között fennálló szabályozott transzport röviden a vér-agy gát nemzetközileg elismert in vitro modelljéül szolgált. Különösen értékesek a Csoportnak a hisztamin, camp és cgmp szerepének tisztázására irányuló kutatásai, valamint az agyi iszkémia patogenezisére vonatkozó eredmények. Később, az agyi endotélsejtek tenyésztésének bevezetésével egy tiszta preparátumon sejt- és molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával ezen sejtek jeltovábbítási folyamatainak precíz feltérképezése vált lehetővé. Az in vitro vér-agy gát modell továbbfejlesztése azonban az endotélsejteknek további sejttípusokkal történő együttes tenyésztését igényelte, melyet a Csoport munkatársai sikerrel oldottak meg. Az irodalomban elsőként írták le és jellemezték az agyi mikroerekből származó endotélsejtek, periciták és gliasejtek felhasználásával készült új modellt (6. ábra), amely alapkutatási kérdések megválaszolása mellett alkalmas gyógyszerjelölt molekulák és a vér-agy gát kölcsönhatásának vizsgálatára, illetve ezek agyba való bejuttathatóságának tesztelésére is. 6. ábra. A vér-agy gát ko-kultúrán alapuló sejttenyésztéses modellje A modell felhasználásával sikerült többek között az agyi endotélsejtek közötti interendoteliális kapcsolatok molekuláris szintű működésébe betekintést nyerni. A sejtek kapcsolatait biztosító fehérjék lebontási mechanizmusainak tisztázása mellett kiderült, hogy ezek a fehérjék fontos szerepet töltenek be jeltovábbító folyamatokban is. Ígéretes a vér-agy gátnak, illetve az endotélsejteknek a rosszindulatú daganatok agyi áttétek kialakulásában játszott szerepének vizsgálata is. Egyéb módszerek mellett többféle mikroszkópos technika alkalmazásával új adatokat nyertek az agyi endotélsejtek és bizonyos tumorsejtek kölcsönhatásáról. A vér-agy gát modellen és egyes betegségek állatmodelljein végzett vizsgálatok mutattak rá arra is, hogy számos központi idegrendszeri patológiás folyamat során, mint amelyek az Alzheimer kór, a prion betegség, az agyi iszkémia vagy gyulladásos folyamatok velejárói, a vér-agy gát sérül, ami negatívan befolyásolja az említett betegségek lefolyását. Romlik az agyi endotélsejtek idegrendszert tápláló és védő működése, a barrier funkció és a szállítófehérjék aktivitása. Az agy mikroereinek endotélsejtjeiből vazoaktív mediátorok és gyulladásos citokinek szabadulnak fel, sőt a károsodott agyi mikroerek neurotoxikus fehérjét is képesek termelni, amelyek közvetlenül idegsejtpusztulást okoznak. A vér-agy gát áteresztőképességének megnövekedése másodlagos neuronpusztuláshoz és a betegségek súlyosbodásához vezet. Az agyi hajszálerek működésének kismértékű változása is súlyos és tartós idegi működési zavart okozhat. Mindezek alapján a vér-agy gátat alkotó agyi endotélsejtek védelmét mint új lehetséges terápiás célpontot azonosították. Sikerült az agyi endotélsejteken ható protektív mechanizmusokat is feltárni. Külö-

39 nösen ígéretesnek tűnik a pentozán poliszulfát, egy negatív töltésű növényi eredetű poliszacharid, amely több patológiás modellben is kivédte az endotélt károsító hatásokat. Mivel a vér-agy gát természetes funkciója következtében megakadályozza különböző tervezett vagy akár természetes vegyületek agyba jutását, a kutatások egyik fontos területe, hogy miként lehet gyógyszereket hatékonyan a központi idegrendszerbe juttatni. Az egyik ilyen lehetséges megoldás a vér-agy gát ozmotikus sokkal (pl. mannitollal) való átmeneti megnyitása, amelynek molekuláris mechanizmusait részletesen tisztázták. Eredményesek az intranazális útvonal alkalmazásával kapcsolatos kutatások is. Ilyen módon (különböző formulálásokat felhasználva) sikeresen juttattak be mind jelzőanyagot, mind biológiailag aktív peptidet állatkísérletekben az agyba. Egy másik stratégiát is vizsgálnak a vér-agy gát korlátozott permeabilitásának megváltoztatására. Olyan biokompatibilis nanoméretű gyógyszertechnológiai hordozórendszereket, többek között nem ionos felületaktív anyag alapú vezikulákat, (röviden: nioszómákat) terveznek, jellemeznek és vizsgálnak, amelyek a vér-agy gát szállítófehérjéin keresztül irányított módon tudják fokozni hatóanyagok agyba jutását. Ezekkel a vizsgálataikkal hozzájárulhatnak az idegrendszeri betegségek hatékonyabb kezelését szolgáló új módszerek kifejlesztéséhez. Kétségtelen, hogy számos kísérleti adat és klinikai megfigyelés utal az idegrendszer degeneratív elváltozásai során a vér-agy gát komponenseinek különböző mértékű és lefolyású sérülésére, az azonban továbbra sem tisztázott, hogy ez a jelenség az egyes betegségek kiváltó okaként működik, mellékjelenségként, vagy esetleges következményként alakul-e ki. Amellett, hogy a jelenség tanulmányozása a Csoport kutatómunkája során is új perspektívákat nyithat meg az idegi degeneráció folyamatainak megértésében és befolyásolásában, a megfigyelés rávilágít egy ma már magától értetődő tényre, nevezetesen, hogy az idegrendszer degeneratív elváltozásai nem a különböző idegsejtek betegsége, hanem az idegsejtek és az azokat körülvevő egyéb sejtek megváltozott kooperációja nyomán alakul ki. Ebben a komplex mechanizmusban a neurovaszkuláris egység említett sejtjei mellett az idegrendszerben az immunfelügyeletet ellátó mikroglia sejtek a jelenleg ismert fontos meghatározó elemek. A mikroglia sejtek (7. ábra) és az idegsejtek kooperációjának tanulmányozása jelenleg a Csoport kutatásainak fókuszában áll, és máris számos, igen érdekes megfigyelést sikerült tenniük. 7. ábra. Nyugalmi, és idegi sérülést követő reaktív mikroglia sejtek Így a mozgató idegsejtek és a környező mikroglia sejtek sérülés során, a sérülés mértékétől függő kooperációjára utaló jelként megfigyelték, hogy ha a mozgató idegsejtek ellenállóképességét (pl. kalcium által kiváltott toxicitással szemben) megnövelték, a környező mikroglia sejtes reakció mértéke is lecsökkent ami az idegsejtekből a mikroglia sejtek irányába történő megfelelő, pl. citokinek, kemokinek által közvetített jelátvitellel magyarázható. Egy ellentétes irányú szignalizáció jelenlétére a motoneuron betegség egy transzgenikus modelljének tanulmányozásával mutattak rá: amennyiben a mutáns állatokban a mikroglia sejteket egészséges állatokból származó donorsejtekre cserélték, a mozgató idegsejtek sérülésének mértéke csökkent, túlélésük pedig megnövekedett. Bár ezek a megfigyelések a gliasejteket is (az idegsejtek mellett) terápiás beavatkozási célpontokként jelölik meg, az állatkísérleteken túlmutató (csontvelő-átültetésen alapuló) kipróbálásuk még nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket. A laboratóriumban kidolgozott ún. target deprivációs modell alkalmazásával is tanulmányozták az idegi sérülést követő mikroglia-válaszokat. Kísérleteikben az extraokuláris izmokat beidegző III. agyideg axonjainak károsodását követően a III. agyideg centrális magjában, a nucleus oculomotoriusban immunhisztokémiai módszerekkel követték egyes mikroglia-markerek expressziójának időbeli változásait. Kimutatták, hogy 17β-ösztradiollal történő kezelés szignifikáns módon csökkenti a sérülésre adott Biofizika 39

40 Biofizika mikroglia-választ és valószínűsítették, hogy a hatást a β típusú ösztrogén receptor modulálja. Az idegrendszeri degeneratív betegségek terápiája, vagy a neuroprotekció során további lehetőségek merültek fel az utóbbi időszak kutatásainak fényében a nemi hormonok és elsősorban az ösztrogén szerepét illetően megváltozott szemléletünknek köszönhetően: egyre több kísérleti adat utal arra, hogy fontos szerepet játszanak az idegrendszeri plaszticitásban és a neuroprotekcióban. A munkacsoport ezen a területen végzett vizsgálatai azon sejt- és molekuláris szintű mechanizmusok megértésére irányulnak, melyek a hormonok által befolyásolt szinaptikus átrendeződést és az idegi sérüléseket követő neuronális és glia reakciókat befolyásolják. Ezek során kimutatták, hogy az ösztrogén ténylegesen plasztikus szinaptikus változásokat indukál a hipotalamusz egy magjában, a nucleus arcuatusban. 8. ábra. Elektronmikroszkóposan jelölt GABAerg és jelöletlen nem GABAerg idegvégződések egyazon dendriten A 17ß-ösztradiol kezelés után a neuronok GABAerg axo-szomatikus szinapszisainak száma szignifikánsan csökkent, a dendro-dendritikus kapcsolatok esetében nem találtak változást, míg az ún. tüske szinapszisok (döntően glutamát tartalmú, ingerlő hatású idegvégződések) sűrűsége növekedett. Különböző kísérletes állatmodelleket alkalmazva tanulmányozták továbbá a központi idegrendszeri sérüléseket követő neuronális, asztrocita és mikroglia reakciókat, valamint a 17ß-ösztradiol és az egyik legfontosabb neuroszteroid, a dehidroepiandroszteron (DHEA) hatását ezekre a folyamatokra. Igazolták, hogy patkány agykérgen hideg lézióval előidézett sérülés mértéke DHEA kezeléssel csökkenthető, a károsodott terület mérete szignifikánsabban kisebb azoknál az állatoknál, melyeket a beavatkozás előtt, vagy közvetlen azután dehydroepiandroszteron szulfáttal (DHEAS) kezeltek. A deafferentációt követő szinaptikus degeneráció, ill. a reinnerváció folyamatának követésére az idegrendszer egyik legplasztikusabb területe, a szaglógumó egy alkalmas objektum. A primer érzéksejtek szinkronizált lézióját követően a szaglógumó glomeruláris rétegében reaktív gliózist mutattak ki, melyet DHEA-kezeléssel moduláltak. Eredményeik azt mutatják, hogy DHEA képes a deafferentációt követő reaktív gliózist csökkenteni és így befolyásolni a szaglógumó glomerulusaiban lejátszódó plasztikus gliális változásokat. A hatás valószínűen nem közvetlen, mert azt nem maga a neuroszteroid, hanem az abból lokálisan szintetizálódó 17ß-ösztradiol közvetíti. Az SZBK 40 éves fennállása során a Molekuláris Neurobiológiai Laboratórium tematikailag is és módszertanilag is egy nagy ívet átölelő fejlődésen ment át. A laboratórium megalakulásakor jellemző, az alapítók elképzelése szerint működő kezdeti finomszerkezeti kutatások egyre magasabb szintre kerültek, az aktuális kutatási problémák igénye szerint folyamatosan további sejt- és molekuláris biológiai módszerekkel egészültek ki, és a megcélzott problémák megoldásai további részletek megismerésére irányuló kísérleteket kényszerítettek ki. A választott tudományág kutatásának természetes fejlődése napjainkra, úgy tűnik, a Csoport munkatársai által megszerzett tudományos ismeretek, módszertani tapasztalatok olyan konvergenciájához vezet, mely az idegrendszer működésének magasabb szintű megértését eredményezheti. Az elmúlt 40 év alatt a Csoport munkatársai nemcsak, hogy kivívták méltó helyüket a neurobiológiai kutatásokkal foglalkozók erősen kompetitív hazai és nemzetközi mezőnyében, hanem volt, illetve jelenlegi, és várhatóan számos jövőbeni sikeres munkatársuk, tanítványuk nevével fémjelezve az SZBK Biofizikai Intézetének Molekuláris Neurobiológiai Csoportjában egy hazai neurobiológiai iskolát mondhatnak otthonuknak. Siklós László 40

41 EnergiaÁtalakító Redox Enzimek Laboratórium Biofizika Biohidrogén A legegyszerűbb kémiai szerkezettel rendelkező molekulára, a hidrogénre (H2) ma már világszerte úgy tekintenek, mint olyan energiahordozóra, amely az emberiség fenntartható fejlődése érdekében képes lesz kiváltani a fosszilis energiahordozókat. Az ismert gáz halmazállapotú üzemanyagok közül egységnyi tömegre vonatkoztatva a H2 rendelkezik a legnagyobb energiatartalommal (143 GJ tonnánként). Ha a H2-t megújuló forrásokból állítjuk elő, használata megszabadíthat bennünket a globális felmelegedés okozta környezeti katasztrófáktól, és megszüntetheti sok háborús konfliktus kiváltó okát. A hosszabb távra tervező országok növekvő és tekintélyes összegeket költenek a H2-gazdaság bevezetését elősegítő kutatásokra, fejlesztésekre, demonstrációs projektekre és a szükséges infrastruktúra kiépítésére. Önként kínálkozik az ötlet: hasznosítsuk primer energiaforrásként azt az óriási fúziós reaktort, amit Napnak hívunk, és amely tőlünk biztonságos távolban üzemelve valódi kiutat jelenthet az energetikai zsákutcából. Az emberiség mai egy éves teljes energia felhasználása a Földet érő mintegy 1 órányi napenergiával egyenértékű! Tehát a globális energiaigények kielégítéséhez bőségesen elegendő a hozzánk érkező napenergia. Azonban a napenergia hasznosítása sem egyszerű feladat, hiszen energiakoncentrációja alacsony és nem teljesen kiszámítható. Létezik a természetben olyan biológiai rendszer, amely az evolúció évmilliói alatt éppen a nehezen megfogható napenergia kémiai energiává alakításának képességét fejlesztette ki. A fotoszintézis kulcsfontosságú energiaraktározási és szervesanyag-felépítési folyamat, amely a biomasszát a globális felmelegedést okozó légköri széndioxid megkötésével hozza létre. A zöld növények és algák jó része a megkötött fényenergiát első lépésben vízbontásra használja fel, a vízből oxigéngáz, emellett a kémiai energiát hordozó elektronok valamint protonok keletkeznek. Az elektronokban átmenetileg raktározott kémiai energia akkor stabilizálódik, amikor valamilyen szerves molekula szintéziséhez használódik fel, így cukrok, aminosavak, nukleinsavak, végső soron egy új fotoszintetizáló élőlény képződik. A folyamat végterméke, amit biomasszának is hívunk, jelentős mennyiségű, kémiai kötésekben raktározott napenergiát tartalmaz. Az energetikailag leggazdaságosabb megoldás a vízbontás során képződő elektronok és protonok egyesítése hidrogénné. Így a gyakorlatilag kimeríthetetlen Napot egy olyan körfolyamatban tesszük energetikailag hasznosíthatóvá, amelyben tároláskor vizet bontunk összetevőire, felhasználáskor pedig a komponensekből vizet állítunk elő (1. ábra). 1. ábra. A hidrogén-gazdaság koncepciója. (az International Hydrogen Energy Society alapján) A feladat ellátására alkalmas biológiai rendszer a természetben nem létezik. Ennek oka az, hogy a biológiai rendszerek számára egy vízből O2-t és H2-t gyártó feladatsor teljesen értelmetlen. Könnyen belátható, hogy a reprodukcióra, a saját faj minél szélesebb körben való elterjesztésére programozott élő rendszerek a rendelkezésükre álló, változatos és furfangos molekuláris szabályozó mechanizmusok bevetésével igyekeznek elkerülni azt az állapotot, amelyben aktivitásuk arra fordítódna, hogy az életük és a faj fenntartása szempontjából értéktelen gázokat állítsanak elő a nehezen megszerzett napenergiából. Ezért 41

42 Biofizika a természetben a kívánatos rendszer elemeit megtaláljuk ugyan, de az egyes elemek különálló fajokban fordulnak elő. A hosszú távú stratégia a vízbontással O2-t és H2-t termelő mikroorganizmusok mesterséges kifejlesztése, molekuláris biológiai módszerekkel való létrehozása lehet. Ez elvileg és technológiailag ma már nem lehetetlenül bonyolult feladat, bár a rendelkezésre álló ismeretanyag birtokában az ipari szinten használható rendszerek létrehozása 5 8 éven belül valószínűtlen. 2. ábra. A Thiocapsa roseopersicina 42 Mint a legtöbb biológiai feladatot, a H2-képződést is egy enzim katalizálja, amit hidrogenáznak nevezünk. A hidrogenáz az evolúció időskáláján ősi enzimnek számít, elsősorban baktériumokban és algákban találjuk meg. A hidrogenáz enzim egy olyan fehérje, amely a természetben előforduló legegyszerűbb reakciót, a H2 képződését vagy elbontását katalizálja. Az SZBK Biofizikai Intézetében a hidrogenázok kutatása 1978-ban kezdődött, miután Garay András, az Intézet korábbi igazgatója az USA-ba távozott és korábbi munkatársainak új témák után kellett nézni. Ekkor kezdett el együtt dolgozni a fizikus Bagyinka Csaba és a biológus Kovács Kornél. Csábító volt a gondolat, hogy az egyszerű reakciót katalizáló enzim megismerésével az enzimek működésének általános modelljét vizsgálhatjuk. Akkoriban még keveset lehetett tudni erről az enzimféleségről, később tanultuk meg, hogy a természet másként gondolkodik és az egyszerűnek tűnő feladatot az enzim meglehetősen összetett molekuláris mechanizmus szerint oldja meg. Az ismert hidrogenázok zöme az aktív centrumában fématomokat tartalmazó enzim. Az élő szervezetben a fémeket körülvevő különleges és bonyolult elrendezésű fehérjemolekula, a fehérje és a fématomok közötti kölcsönhatás ruházza fel a molekulába zárt fématomokat azzal a képességgel, hogy a H2-gyártás vagy -bontás elemi lépéseit katalizálni tudják. Ebből látszott, hogy a hidrogenázok izgalmas feladatokat adhatnak fizikusnak és biológusnak egyaránt. Némi válogatás után egy fotoszintetizáló baktériumot (2. ábra), a Thiocapsa roseopersicina-t illetve a benne talált hidrogenázt választottuk vizsgálataink tárgyául. A baktérium viszonylag egyszerűen és ami nagyon fontos volt olcsón tenyészthető nagy menynyiségben, ráadásul a benne levő enzim meglepően stabilnak mutatkozott az irodalomból ismert hasonló enzimekhez képest. A hidrogenázok hírhedten nagyon érzékenyek például az oxigénre, oxidatív inaktiválódásuk általában irreverzibilis. Ezzel szemben a mi enzimünket mindenféle drága és nehezen kezelhető anaerob környezetet biztosító berendezés nélkül tudtuk tisztítani. Az Északi tengerből származó Thiocapsa-törzsünknek van még egy érdekes tulajdonsága: 30 C felett nem tud szaporodni. Ez ma már inkább hátrány, de akkoriban hozzásegítette a laboratóriumot egy, a nyári hőségben menedéket nyújtó légkondicionáló berendezéshez, ami legfeljebb a nagyműszereknek otthont adó laboratóriumok kiváltsága volt. A hidrogenázunk biokémiai és biofizikai módszerekkel elvégzett jellemzése (ld. még a Metalloenzimek Biofizikája Csoport írását) nem adott kielégítő magyarázatot az enzimnek a hidrogenázok között meglepő stabilitására. Új módszerek után kellett nézni, amire Kovács Kornélnak lehetőséget adott egy hoszszabb USA tanulmányút, ezalatt megismerkedett a hidrogenázok kutatásában akkor kezdődő molekuláris biológiai megközelítés alapjaival. Az új irányzatot hazatérve is folytatta, ami többek között azt eredményezte, hogy a két kutató érdeklődési területe elvált egymástól. Több SZBK-s valamint amerikai és francia együttműködéssel végzett munka során kiderült, hogy a T. roseopersicina nem csak egy hidrogenázt tartalmaz. A hidrogenázok molekuláris biológiai vizsgálata akkor gyorsult fel, amikor Rákhely Gábor 1994-ben csatlakozott a csoporthoz ban Kovács Kornél a Szegedi Tudományegyetem Biotechnológiai Tanszékének vezetésére kapott megbízást, ahova hamaro-

43 san részben átigazolt Rákhely Gábor is, de a szakmai kapcsolatot az SZBK Biofizikai Intézetével azóta is szorosan megtartották. Az egyetemi munka egyik következménye volt, hogy hamarosan több lelkes fiatal kapcsolódott be a kutatásba re kiderült, hogy a Thiocapsa-ban összesen 5 hidrogenázt kódoló géncsalád van, ezek közül legalább négyről aktív fehérje keletkezik. Ezzel ez a baktériumtörzs tartja a hidrogenázok diverzitásának világbajnoki címét (Rákhely Gábor, Fodor Barna, Kovács Ákos, Maróti Gergely, Maróti Judit, Kovács Kornél és sokan mások). Számos olyan mikrobát ismerünk, amelyben egynél több eltérő szerkezetű, de azonos reakciót katalizáló hidrogenáz van, de annyi, mint a mi kedvencünkben máshol nem ismert (3. ábra). 3. ábra. A T. roseopersicina aktív hidrogenázainak és nitrogenáz enzimjének sejten belüli lokalizációja (a lila téglalap a fotoszintetizáló membránt jelöli) Természetesen a többféle hidrogenáz léte ugyanabban a baktériumban számos izgalmas kérdést vet fel: ki kell deríteni, miért és mire jó ez a feleslegesnek tűnő munka a baktérium részéről. A katalizált reakcióban és számos tulajdonságban azonos, más tulajdonságokban eltérő enzimeket vizsgálva azt látjuk, hogy ha egyesíteni tudnánk a számunkra hasznos elemeket, akkor abból egy kiváló, az energiagondokat feltehetően megoldó enzimet lehetne fabrikálni. Ennek megvalósítása még várat magára, hiszen az egyes Thiocapsa hidrogenázok sem ismertek eléggé. A hidrogenázok, mint afféle redox metalloenzi mek, ráadásul meglehetősen bonyolult molekuláris mechanizmus szerint szerelődnek össze, a polipeptidlánc szintézise még nem elegendő, a poszttranszlációs folyamatokban a fématomoknak be kell épülni a fehérjébe időben és térben nagyon pontosan szabályozott módon, majd a nagy alegység C-terminális végét egy speciális enzim lehasítja, és az ezt követő konformációs változás alakítja ki az aktív enzimet. Az egyes elemi lépéseket ezen a molekuláris szerelő futószalagon ún. kisegítő fehérjék végzik, amelyeknek szintézise, a meghatározott módon és időben való alkalmazása ugyancsak a parányi baktériumban működő bonyolult szabályozások függvénye. A kisegítő fehérjék egy része minden hidrogenáz összeszerelése során elvégzi a dolgát, mások csak egy-egy enzim poszttranszlációs modifikálására képesek (Rákhely Gábor, Palágyi-Mészáros Lívia, Maróti Gergely, Dorogházi Emma, Maróti Judit, Kovács Kornél). A sokszereplős molekuláris történések további alapkutatási kérdéseket vetnek fel, melyek egy része messze túlmutat a hidrogenázbioszintézis témakörén. Az alapkutatási eredmények időnként közvetlen gyakorlati alkalmazási lehetőségeket is kínálnak. Jó példa erre az egyik, a Thiocapsa membránkötött, HupSL és HynS-isp1-isp2-L elnevezésű hidrogenázainak érésében, összeszerelődésében szerepet játszó HupK fehérje esete. Pontosan nem tudjuk, mit és hogyan csinál ez a fehérje, de az egyértelmű, hogy a baktérium fotoszintetizáló membránjában működő két hidrogenáz aktív formában való szintéziséhez elengedhetetlenül szükséges a HupK. A citoplazmában található Hox1FUYHE és Hox2FUYH enzimkomplexek viszont HupK nélkül is működőképesen össze-szerelődnek. A membránban ülő hidrogenázok in vivo körülmények között elsősorban a H2-felhasználás irányában aktívak, elvesztésük tehát a H2-termelés szempontjából előnyös. A hupk génben deléciós mutáns Thiocapsa-törzs (Maróti Gergely, Nyilasi Andrea, Rákhely Gábor, Kovács Kornél) hoszszantartó H2-termelésre képes (4. ábra). Biofizika 4. ábra. A nitrogenáz és Hox1 hidrogenáz (hupk génben deléciós mutáns) napi hidrogéntermelése 43

44 Biofizika 44 A példa azt demonstrálja, hogy viszonylag egyszerű molekuláris biológiai beavatkozással, a hupk gén kiütésével olyan baktériumtörzs hozható létre, amely a korábbi szokásától eltérő módon az ember számára hasznos, megújuló H2-energiahordozót termel. Tehát az ezoterikusnak tűnő alapkutatási ismeretek, a hidrogenáz enzimek működésének megértésére irányuló vizsgálatok valóban közvetlenül hasznosítható eredményekhez vezethetnek. A kutatócsoport fejlődése és növekedése magával hozta a kutatási irányok bővülését. A H2 biotechnológiai előállítása egy másik enzim, a nitrogenáz segítségével is lehetséges. A nitrogenáz viszont olyan sok kémiai energiát igényel a reakció katalizálásához, hogy az egész dolog energetikailag ráfizetés a sejt számára. Meg kell itt jegyezni, hogy érdekes kutatások folynak in vitro rendszerek kifejlesztésével kapcsolatban is, ahol a figyelemre méltó stabilitással rendelkező Thiocapsa Hyn hidrogenáz biofizikai és molekuláris biológiai tanulmányozása hoz ígéretes eredményeket. Ilyenkor az élő sejtekből kinyert komponenseket (fotoszintetizáló komplexeket és hidrogenázokat) próbáljuk meg közös munkára bírni egy Európai Uniós konzorcium tagjaként. Az in vitro megoldás előnye az, hogy megszabadulunk az élő rendszerekben ellenünk dolgozó molekuláris szabályozó mechanizmusoktól, hátránya azonban a komponensek stabilitásának gyors elvesztése. A legújabb kutatások eredményeként (Rákhely Gábor, Szőri-Dorogházi Emma, Maróti Gergely, Kovács Kornél) a fehérjemolekulán belüli protonmozgás útvonalát sikerült felderíteni. A baktérium kénanyagcseréje (Rákhely Gábor, Tengölics Roland, Kovács Kornél), valamint a tartalék tápanyagok és a hidrogéntermelés közötti kapcsolat megismerése (Rákhely Gábor, Fülöp András, Béres Rita, Kovács Kornél) újabb lehetőségeket kínál egy kiváló hidrogéntermelő baktériumtörzs létrehozására. A fototróf Thiocapsa baktérium mellett a csoport másféle hidrogenázokat is vizsgálni kezdett. Így kerültek az érdeklődés körébe a metanotróf baktériumok és a termofil, illetve hipertermofil mikrobák. A metanotrófok olyan élőlények, amelyek az életükhöz szükséges szén- és energiaforrásként csak metánt tudnak felhasználni. A metán oxidációjához és a szénforrás biztosításához redukált koenzimeket kell gyártaniuk, a koenzim-redukcióhoz pedig hidrogén kell. A metán- és hidrogén-anyagcsere itt kapcsolódik egymáshoz. A metanotrófok emellett számos, a környezetbe kerülve nagyon veszélyes vegyület (poliaromás szénhidrogének, halogénezett vegyületek) biotechnológiai ártalmatlanításában is jeleskednek. A csoport megtalálta és jellemezte a hidrogenáz enzimeket ezekben a baktériumokban (Bodrossy Levente, Csáki Róbert, Hanczár Tímea, Kovács Kornél) és tanulmányozza a metánanyagcsere lépéseit szabályozó mechanizmusokat. A termofil és hipertermofil mikrobákban nyilvánvalóan hőstabil enzimeknek kellett kialakulni. Ezért tanulmányozásuk az enzimek stabilitásának kérdéséhez vezethet közelebb. Az alapkutatás izgalmas kérdései, a fehérjék szerkezetét stabilizáló molekuláris mechanizmusok megismerésén túl a gyakorlati felhasználás szempontjából is meghatározó jelentőségűek az ilyen kutatások. A termofilok túlnyomó többsége szerves molekulákat hasznosít, heterotróf anyagcserét végez. Sok mikróba képes arra, hogy szerves anyagokat hasznosítva, fermentációval azokat átalakítva szerezze meg a fennmaradásához és szaporodásához szükséges energiát és nyersanyagokat. A fermentáció energetikailag nem a leghasznosabb, de jól megoldható anyagcsereforma, a feleslegben keletkező energiától a sejtek viszonylag egyszerűen, H2 formájában szabadulnak meg. A fermentatív H2-termelés esetében tehát találkozik a termelő baktérium és az energiára vágyó ember érdeke. Sok mindent tudunk a folyamatról és a benne szereplő enzimkatalizátorokról egyaránt. A fermentatív H2-termelésnek az ember szempontjából egy hibája van: a sejtek csak azt a kémiai energiát fordítják H2-termelésre, ami számukra feleslegként jelentkezik. Különféle, az anyagcsere-útvonalakat befolyásoló molekuláris biológiai csalafintaságokkal azért rá lehet őket venni a szorgosabb H2-termelésre, ami nem teszi tönkre a sejtek túlélését. A termofilok közül az anyagcsereutak változatosságával és a hidrogéntermelő képességével kiemelkedik a Caldicellulosiruptor saccharolyticus baktérium

45 (egyszerűsített becenevén Caldi). Ez a lenyűgözően sokféle szerves polimert hasznosítani képes mikroba megeszi a cukron kívül a lignocellulóz alapú biomasszát is, és elég jó hatásfokkal gyárt belőle hidrogént (Galina Ivanova, Rákhely Gábor, Herbel Zsófia, Kovács Kornél). Sajnos a Caldi-ban nemzetközi összefogással sem sikerült még elég jól működő genetikai rendszert kidolgozni, ezért molekuláris biotechnológiai vizsgálata még várat magára. Kiváló tulajdonságai miatt a Caldi nagyszerűen alkalmazható a biogáztermelés hatékonyságának fokozására is (ld. alább). A hipertermofilok nagy része a legősibb élőlények, az archea-k közé tartoznak. Ezekre igen magas, jellemzően C feletti optimális növekedési hőmérséklet a jellemző. Tanulmányozásuknak a mikrobiális hidrogén-anyagcseréhez való kapcsolódási pontjai világosan láthatóak: a hipertermofil archaeák enzimjeit stabilizáló erők megismerése segítheti a stabil hidrogéntermelő katalizátorok kifejlesztését. Emellett a hipertermofilok anyagcserefolyamatai a magas hőmérsékletű környezet miatt nagyon gyorsan zajlanak, a túlpörgetett anyagcsere miatt keletkező felesleges energia nagy részétől ezek az élőlények H2 formájában szabadulnak meg. A H2-termeléshez vezető anyagcsereutak feltárásában értékes új információkat szereztek a csoport kutatói (Rákhely Gábor, Tóth András, Takács Mária, Kovács Kornél). A felderített új és H2-termelésben fontos szerepet játszó anyagcsereutak a hipertermofilok jövőbeli energetikai biotechnológiai hasznosításához járulnak hozzá. Összegezve azt mondhatjuk, hogy az élő szervezetek különböző utakon termelhetnek jelentős mennyiségű H2-t. Ezek közül több önmagában vagy kombinálva a mai tudásunk alapján is képes gazdaságosan megújuló H2-termelésre. Például egy ilyen rendszer ipari kifejlesztésére vállalkozott az a 11 országban működő 24 kutató-fejlesztő és ipari partner, akik az EU támogatásával a biomasszát kétlépcsős fermentációval alakítják át hidrogénné. Az első fermentorban (5. ábra) a biomasszát C hőmérsékleten szorgoskodó baktériumok H2 CO2 gázkeverékké és szerves savakká alakítják át. 5. ábra. Hatékony, kétlépcsős biohidrogén-termelő rendszer vázlata egy EU projekt alapján. Az utóbbiakat a második, szobahőmérsékleten működő fermentorban fényenergia felhasználásával fotoszintetizáló baktériumok tovább bontják, a termék szintén H2 CO2 gázkeverék. Végeredményben a napenergia közvetett (növényi biomassza) és közvetlen (fotoszintetizáló baktériumok) hasznosításával a biomasszában raktározott kémiai energia 65 70%- át tudjuk hidrogénné alakítani, ami közel van az elméletileg várható felső határhoz, hiszen valamenynyi energiát a baktériumoknak is hagyni kell az életük fenntartásához. A mindkét fermentációs lépésben szerepet kapó mikrobák okosításában, azaz új, hatékonyabban és stabilabban dolgozó mikrobák előállításában a konzorcium tagjaként részt vállalt a szegedi biohidrogénes csapat. Jelenleg a technológia élettartamának növelése, a működési stabilitás növelése és léptéknövelő ipari fejlesztés folyik. Biogáz A hidrogén-anyagcsere kutatása közben tett, véletlennek is nevezhető megfigyelés terelte a csoport figyelmét a biogáztermelés biotechnológiájával kapcsolatos témákra még az 1980-as években. A szerves hulladékok és biomassza anaerob, levegőtől elzárt közegben végzett biotechnológiai kezelése a környezet tisztaságának megóvásán túlmenően jelentős, megújuló energia forrása is lehet. A biogáz szerves anyagok anaerob erjedése során képződő, a földgázhoz hasonló légnemű anyag. Az anaerob lebontási folyamat mikroorganizmusok közreműködésével megy végbe. A biomassza majdnem minden formájának szerves része beleértve a szennyvíziszapot, az állati melléktermékeket és az üzemi szennyvizet anae- Biofizika 45

46 Biofizika rob emésztéssel metánra és szén-dioxidra bontható. A biogáztermelést biotechnológiai úton szabályozni, irányítani és fokozni lehet, ami a technológia gazdaságosságát jelentősen javítja. A kutatások célja olyan fermentációs rendszerek kifejlesztése, melyek hatékonysága meghaladja a hagyományos eljárásokban használt biotechnológiai megoldások színvonalát. Ehhez szükség van a fermentációban szerepet játszó baktériumtörzsek alapos megismerésére, elsősorban a különféle mikróbák közötti kapcsolatok feltárására. A biogázelőállító folyamat spontán beindul olyan területeken, ahol nagy koncentrációban, oxigénmentes környezetben van jelen nedves szerves anyag. A spontán kialakuló biogáz-fermentáció viszonylag alacsony hatékonyságú, azonban mesterséges beavatkozással a gáztermelés megnövelhető. A mikrobatársadalomban uralkodó bonyolult egyensúlyok fő hajtóereje az egész rendszer túlélése, ennek megfelelően alakul ki az egyes fajok aránya és élettere. A biogáz ennek a folyamatnak végterméke, a mikrobiális társadalom salakanyaga. Nyilvánvalóan a közösség egésze nem a maximális salakanyag-képződés felé törekszik, ezért lehetőségünk nyílhat arra, hogy a mikrobatársadalom életébe beavatkozva az egyensúlyokat a biogázképződés irányába toljuk el anélkül, hogy a közösség életét nagyon megzavarnánk. Az eredmények azt mutatták, hogy több olyan pont van a rendszerben, melyek döntően befolyásolják a fermentáció hatékonyságát, gazdaságosságát. dolgozni. Ebből az időből származik az SZBK-ban legendásnak számító, meglepően jó eredménnyel záródó kísérletünk, amikor néhány 5 literes, trágyával megtöltött lombik robbant fel az SZBK Genetikai Intézet féltve őrzött termosztátszobájában, beterítve az ott tartott értékes emlős sejttenyészeteket illatosnak nem nevezhető szubsztrátunkkal. A pozitív kísérleti eredmények megerősítették hipotézisünket, hogy a biogáztermelés folyamatába sikeresen be lehet avatkozni és a folyamatot irányítani, serkenteni lehet. A 6. ábrán egy (már nem az SZBK-ban végzett) félüzemi kísérlet eredménye mutatja, hogy a korábban kiváló H2-termelő képességével figyelmünket felkeltő C. saccharolyticus hozzáadása egy termofil biogáz-fermentorban dolgozó mikrobaközösséghez hosszú időn keresztül képes a biogáztermelés felgyorsítására (Bagi Zoltán, Ács Norbert, Kovács Etelka, Rákhely Gábor, Kovács Kornél). A fejlesztési lehetőségek nincsenek még kimerítve, a mikrobaközösségek összetételének valós idejű molekuláris genetikai vizsgálata új betekintést nyújt az összetett rendszer működésébe, így szót érthetünk a mikrobákkal, irányíthatjuk az életüket szabályozó kölcsönhatások rendszerét. 46 Az egyik ilyen szűk keresztmetszet éppen a biogáz termelők számára rendelkezésre álló H2 menynyisége. Azt leírják a kézikönyvek, hogy a folyamatban H2-termelők is közreműködnek és a redukálószerre szükségük van a sorban utánuk következő metanogén mikrobáknak. A végtermék biogázban viszont alig van H2. Azt is lehet tudni a korábbi vizsgálatokból, hogy a kívülről adagolt nagy mennyiségű hidrogén gátolja a biogáztermelők teljesítményét. Feltételezésünk szerint egy nagyon érzékeny egyensúlyi állapot alakult ki a hidrogéntermelő és felhasználó törzsek között. A kísérleti tesztelés során először csak cukros vízzel, később igazi biomasszának számító sertés hígtrágyával kezdtünk 6. ábra. Biogáz-termelési kísérlet félüzemi léptépkben. A piros nyíllal jelölt ponton egy hidrogéntermelő baktériumot adunk a természetes biogázfejlesztő rendszerhez felgyorsítva a folyamatot Bioremediáció Az elmúlt évszázad ipari fejlődésének egyik súlyos következménye, hogy jelentős mennyiségű szintetikus vegyület, ártalmas anyag került környezetünkbe. A környezetszennyezések azon túlmenően, hogy károsítják a helyi ökoszisztémát, különösen veszélyesek olyan

47 területeken, ahol a talajvízbe és/vagy felszíni vizekbe mosódva nagy távolságokra eljuthatnak és ivóvízbázisokat, illetve élővizeket veszélyeztethetnek, ezért ezek ártalmatlanítása mind az emberiség, mind a földkerekség fenntartható léte miatt elengedhetetlen. Ha megfigyeljük a természetben a szennyező anyagok lebomlását, azt látjuk, hogy összetett mikrobaközösségek alakulnak ki, és szervezett/összehangolt munkával távolítják el a toxikus vegyületeket környezetükből. Az egyes fajok adottságai/képességei összehangolódnak, és egy egységes rendszerben hatékonyan fejeződnek ki. Biofizika A bioremediáció biológiai rendszereket használ a környezet megtisztítására. A bioremediáció leggyakrabban előforduló formája a mikroorganizmusokkal történő biodegradáció. A mikroorganizmusok sokfélék, nagyon változatos anyagcsereutakkal rendelkeznek, ezért képesek a legtöbb szennyező anyagot számukra hasznosakká átalakítani szaporodásuk és/vagy energiaigényük fedezésére. 7. ábra. Bioremediációs feladatokat végző mikróbákat előállító fermentorok Amikor egy mikroorganizmus új vegyülettel találkozik környezetében, képes új géneket szerezni más mikroorganizmusoktól horizontális géntranszferrel, amelyekkel még változatosabb funkciók ellátására képes. A természeti környezethez történő igazodás egy másik lehetősége a spontán mutáció, mely új katalitikus sajátságokat eredményezhet. Kutatásaink során olyan törzseket izolálunk, illetve fejlesztünk, melyek képesek különféle az ipari tevékenység során képződő toxikus szerves anyagok, mint pl. olajok, halogénezett szénhidrogének, szulfonált aromás vegyületek stb. bontására (Rákhely Gábor, Perei Katalin, Kovács Kornél és sok szorgos hallgató). A mikrobák általános tanulmányozásán túl csoportunk fontos kutatási témája a sejten belüli folyamatok tanulmányozása, a biodegradációs utak pontos leírása. Korszerű molekuláris technikákkal feltárjuk, hogy hogyan lesz képes egy sejt a mérgező vegyületből a sejt számára hasznosítható táplálékforrást előállítani. Ezek alapján pedig új, hatékony biokatalizátorokat fejlesztünk. Kovács Kornél 47

48 Biofizika METALLOPROTEIN BIOFIZIKAI CSOPORT 48 Noha a Metalloprotein Biofizikai Csoport a Biofizikai Intézet legfiatalabb 2010-ben alakult csoportja, létrejötte nem új téma megjelenésének, hanem az intézetben már régóta egymástól függetlenül dolgozó három szenior kutató, Bagyinka Csaba, Bérczi Alajos és Zimányi László összefogásának az eredménye. Ezt az összefogást kutatási területeik természetes közeledése tette indokolttá és kívánatossá. A csoport megalakulása előtt tagjai a Membrán Bioenergetikai, a Membrán Szerkezet és Dinamika, illetve a Mikrobiális Gázanyagcsere Csoportokban végezték munkájukat, és járultak hozzá ezen csoportok tudományos sikereihez. Az új csoport három tapasztalt kutatója, akikhez több fiatal munkatárs csatlakozott, fizikus végzettségű biofizikusok, akik mindig is igyekeztek a fizika szemléletét, módszereit és a fizikai kutatásokban kifejlesztett kísérleti eljárásokat, berendezéseket alkalmazni a biológiai problémák, különösen a fehérjeszerkezet és funkció kapcsolatának megközelítésében. A fehérjék aminosavak hosszú láncából álló, és általában stabil térbeli szerkezetben felgombolyodó makromolekulák. A fehérjék döntő többsége más kémiai csoportot, illetve idegen atomot nem tartalmaz. Azok a fehérjék, melyek fématomokat, fémionokat (pl. vas, réz, nikkel) vagy ezeket tartalmazó szerves kémiai csoportokat is tartalmaznak, idegen szóval a metalloproteinek, jellemző módon a fématom változó oxidációs állapotait használják ki biológiai feladatuk ellátására. A változó oxidációs állapot azt jelenti, hogy a beágyazott fématomok elektronok felvételére, illetve leadására képesek, azaz ún. redox folyamatokban képesek részt venni. A redoxfehérjék a redukált és oxidált állapotok (röviden redox állapotok) váltogatásával fontos szerepet játszanak az élő rendszer energetikai folyamataiban. Mivel energiaátalakító, energiatermelő és -használó folyamatok az összes élőlényben megtalálhatóak, a redoxfehérjék kutatásának fontosságát nem lehet túlbecsülni. Fémtartalmú fehérjéket a Biofizikai Intézet alapítása óta vizsgálnak az intézet kutatói. Kezdetben a vastartalmú fehérjékre koncentráltak, mivel Keszthelyi Lajosnak, az Intézet akkori igazgatóhelyettesének (későbbi igazgatójának) és néhány munkatársnak a Mössbauer effektus alkalmazásában volt jelentős tudományos előélete. Hamar kiderült azonban, hogy az akkori keretek között a Mössbauer spektrométer kihasználásához nem volt megoldott a fehérjék nagy mennyiségű előállítása, mely az ilyen típusú mérések előfeltétele. Nagy mennyiségű fémtartalmú fehérjeminta előállítása 1978-ban vált lehetővé, mikor Kovács Kornél puscsinói tanulmányútjáról hazatérve egy bíbor színű, fotoszintetizáló kénbaktérium törzset (Thiocapsa roseopersicina) hozott haza, melynek tenyésztéséhez berendeztek egy nagy hozamra képes baktériumnevelőt. Ez liter baktériumtenyészet érlelésére képes. Ugyanakkor létrehoztak egy fehérjetisztító laboratóriumot is, amely lehetővé tette fémtartalmú fehérjék tisztítását a baktériumtörzsből. A baktériumtörzs érdekességét az adta, hogy egy hőtűrő, oxigéntoleráns hidrogenáz enzimet tartalmazott. A hidrogenáz enzim kutatása ekkor vált kiemelt témává. Emellett megnyílt az út új, eddig nem vizsgált fémtartalmú fehérjék tisztításához, s azok szerkezetének és funkciójának tanulmányozására is. Ugyanakkor továbbra is vizsgáltak vizsgálnak kereskedelmi forgalomban kapható fémtartalmú fehérjéket (pl. lószív citokróm c), melyből mutánsokat is előállítottak. A későbbiek során növényi és állati szervezetekből is izoláltak biofizikai jellemzésre alkalmas menynyiségben fémtartalmú fehérjéket. A hidrogenázok A Thiocapsa roseopersicina baktériumból izolált fehérjékkel Bagyinka Csaba és munkatársai foglalkoztak. Fő kutatási területük a hidrogenáz enzim maradt, de emellett részletesen vizsgálták az úgynevezett HiPIP fehérjét, a baktériumban levő citokrómok számos fajtáját, továbbá egyéb redoxfehérjéket is. A hidrogenáz enzim alacsonyabbrendű élőlényekben (prokariótákban, archeákban, stb.) fordul elő. Azt feltételezik, hogy akkoriban alakult ki, mikor a Föld légkörét még zömmel redukáló hatású gázok, (így hidrogén is) alkották. A hidrogenáz enzim igen egyszerű reakciót katalizál:

49 H2 2p + + 2eazaz a hidrogéngázt bontja el elektronokra és protonokra, illetve, mint minden katalizátor, fordítva is működik, tehát protonokból és elektronokból hidrogéngázt tud készíteni. A csoport által vizsgált (a Thiocapsa roseopersicinában található stabil hyn-sl) hidrogenáz enzim vas- és nikkelatomokat tartalmaz. A hidrogenázok szerkezete A fehérjék működésének megértéséhez az esetek többségében ismerni kell a fehérje szerkezetét; még akkor is, ha a régi dogma (működőképes fehérje csak jól definiált másodlagos szerkezettel képzelhető el) az utóbbi évtizedben, a rendezetlen de működő fehérjék egyre bővülő családjának felfedezésével megdőlt. A fehérjék szerkezetének megállapítása legcélszerűbben kristályosítással és azt követő röntgendiffrakciós méréssel történhet. A kísérlet szűk keresztmetszete a kristályosítás, mely minden fehérje esetében más és más körülményeket kívánhat meg. Néhány Ni-Fe hidrogenáz szerkezete már ismert, de ezek egy kivétellel ugyanabból a baktériumcsaládból származnak. A Thiocapsa roseopersicina egyik közeli rokona, a Chromatium vinosum hidrogenázának nemrég megoldott szerkezete a másik ismert példa. A csoport által vizsgált hidrogenázon is végeznek kristályosítási kísérleteket, de jelenleg még csak mikrokristályokat sikerült előállítaniuk. 1. ábra. A Chromatium vinosum hidrogenáz szerkezete (ez a baktérium a Thiocapsa roseopersicina legközelebbi rokona). A molekula két alegységből áll (az ábrán a nagy alegység lila, a kis alegység kék színnel van jelölve). A nagy alegység tartalmazza a két fématomot tartalmazó Ni-Fe aktív centrumot, melyen a hidrogén megkötődik. A vasatomhoz két cianid és egy szénmonoxid-ligandum kapcsolódik, a nikkelatomot ciszteinek rögzítik a fehérjéhez. A kis alegységen három vas-kén kocka található, (két Fe4-S4 és egy Fe3-S4 kocka), melyek az elektronvezetésben vesznek részt. A hidrogénmolekula a nagy alegységben található csatornákon keresztül jut el a két fématomos Ni-Fe aktív centrumhoz. A hidrogenázok szerkezetét különböző spektroszkópiai módszerekkel is igyekeztek feltérképezni kutatóink. PIXE-PAGE módszerrel (lásd később) megállapították a hidrogenázban a Fe:Ni arányt, melyből kiderült, hogy a Thiocapsa roseopersicina hidrogenázában csak két vas-kén kocka foglal helyet. Egy általuk kifejlesztett röntgenspektroszkópiai módszer (lásd később) segítségével kimutatták, hogy a hidrogén elbontásának különböző fázisaiban a nikkelatomon sem az elektronsűrűség, sem a nikkelatom koordinációs szférája nem változik, valamint, hogy a hidrogenáz enzim nikkelatomja közelében egy másik fématom található (más lehetőség híján ez csak vas lehet). Ezt később mások a fehérje kristályszerkezetének meghatározásával igazolták. A hidrogenáz működése A hidrogenáz reakciójának mechanizmusa, annak megértése nemcsak az alapkutatás, a felfedező tudomány szempontjából érdekes, hanem egyben biotechnológiai jelentőségű is. A csoport kutatói abban ugyan nem hisznek, hogy a hidrogenáz segítségével biológiai úton, ipari méretekben hidrogéngázt fognak termelni, de a fordított irányú reakció hasznosításában, pl. a hidrogénnel működő tüzelőanyag-cellákban valószínűleg fontos szerepe lehet ennek az enzimnek. Kiválthatja az ott jelenleg egyeduralkodó platina- és más nemesfém-katalizátorokat, mert olcsóbb és könynyebben hozzáférhető, hiszen nem kell bányászni, hanem a baktériumból, napenergia segítségével állítható elő. Ahhoz azonban, hogy a hidrogenáz beváltsa a hozzá fűzött biotechnológiai vonatkozású reményeket, még jelentős erőfeszítéseket kell tenni a fehérje szerkezetének és működésének megértése érdekében. Bagyinka Csaba és kollégái a szerkezetkutatások mellett vizsgálták a hidrogenáz enzim aktivitását is. Kimutatták, hogy az enzimreakció nem szokványos viselkedésű. A hidrogént termelő reakció a mérési technikából következően diffúziólimitált, a mért reakciósebesség lineárisan függ a folyadék-gáz határfelület nagyságától. Emellett a reakció sebessége függ az enzim koncentrációjától is, ami enzimek esetében igencsak rendhagyó jelenség. A hidrogénfelvevő aktivitás jól látható késleltetési periódussal kezdődik, ennek hossza szintén függ az enzim koncentrációjától. Biofizika 49

50 Biofizika 50 Mindezek a jelenségek arra a következtetésre vezettek, hogy a hidrogenáz enzim reakciója autokatalitikus természetű. Egy reakciót akkor nevezünk autokatalitikusnak, ha a reakció sebessége nem csak a kiindulási anyagok koncentrációjától, hanem valamelyik termék koncentrációjától is függ. Az autokatalitikus folyamatok az élővilágban makroszkopikusan igen gyakran megfigyelhetőek. Az élet maga is egy autokatalitikus folyamat: egy sejt létrejöttéhez egy már meglevő sejtre van szükség. Bár az autokatalitikus reakciók makroméretekben szinte mindennaposak, elemi reakciókban mégis ritkaság az autokatalitikus működés. Tiszta enzim esetében pillanatnyilag a hidrogenáz reakciója az egyetlen ismert példa. Komplex, több enzimet tartalmazó enzimreakciók esetében több példát ismerünk (pl. glikolízis). Az autokatalitikus folyamatok legkönynyebben jellegzetes térbeli mintázatukról ismerhetők fel. Ha semmilyen körülmény nem zavarja meg a magára hagyott autokatalitikus reakciót, akkor tipikusan gömb alakú (sík reakciótér esetén köralakú) reakciófrontok alakulnak ki, melyek sugara az időben állandóan növekszik. Munkatársaink kidolgozták a hidrogenáz enzimreakció esetében a megfelelő mérési elrendezést, amellyel kétséget kizáróan igazolni tudták a reakció autokatalitikus voltát (2. ábra). 2. ábra. Egymás utáni pillanatképek a hidrogenáz autokatalitikus oszcilláló reakciójáról. A reakcióedény 4 cm átmérőjű és 0,4 mm vastagságú, felette hidrogéngázt áramoltatnak. A reakció során a hidrogén elbomlik, protonok és elektronok keletkeznek. Az elektronokat metil-viologén veszi fel, mely oxidált állapotban színtelen, redukált állapotban viszont élénk kék színű. A reakció előrehaladását a kék szín megjelenése jelzi. Autokatalitikus reakció esetén a reakcióedényben a redukált (kék) metilviologén diszkrét pontokban jelenik meg. A kék pontok ezután időben állandó sebességgel növekednek (A-C felvételek). Ha a reakciót nem puffereljük (a ph szabadon változhat), akkor a reakciótérben ún. fázisoszcilláció jön létre, időben mozgó frontok alakulnak ki. (D-L felvételek) A hidrogenáz reakciósebességének ph-függését (azaz hidrogénion-koncentráció függését) kihasználva sikerült lecsengő oszcilláló reakciót is előállítaniuk. A hidrogénion a reakció terméke (fordított irányban szubsztrátja), s egyben befolyásolja az enzimek reakciósebességét is. Mivel a reakcióban a ph változásával a reakció iránya megváltozik, s mindkét irányban autokatalitikus folyamat megy végbe, a két autokatalitikus reakció lehetővé teszi az oszcillációt. Autokatalitikus folyamatok más elemi biológiai jelenségek esetében is megjelennek. Autokatalitikus folyamatok játszanak szerepet az úgynevezett prion betegségek (kergemarhakór, Creutzfeldt-Jakob betegség, stb.) esetében is. Az autokatalízis kinetikai megfigyelése (hogyan játszódik le a folyamat, mi történik a folyamatok során a reaktánsokkal, termékekkel, köztes állapotokkal) a prionfehérjék esetében igen nehéz. Mivel a hidrogenáz reakciója könnyen kezelhető és könnyen megfigyelhető, a csoport kutatói azt remélik, hogy a megfigyeléséből kapott információk, az itt kifejlesztett mérési technikák a prion betegségek vizsgálata során is alkalmazhatóak lesznek. A citokróm fehérjecsalád A csoport másik fő kutatási objektumai a citokrómredoxfehérjék. A citokrómok legalább egy hemmolekulát azaz vasatomot kötő porfiringyűrűt tartalmaznak, és elsődleges feladatuk az elektronok szállítása. A citokrómok legkülönbözőbb formái megtalálhatóak a baktériumoktól az emberig minden élő szervezetben, a sejteken belül a legváltozatosabb helyeken, a biokémiai folyamatok legkülönbözőbb szintjein. Bár felfedezésük már a XIX. század végén megtörtént (C.A. McMunn, 1884), nevüket David Keilin orosz származású, angol biokémikustól kapták, aki újra felfedezte, majd osztályozta is a citokrómokat az 1920-as években. Míg az a és b típusú citokrómokban a hemcsoportok nem kötődnek kovalensen a fehérjéhez, a c típusúakban igen. A Thiocapsa roseopersicina citokrómjai A Thiocapsa roseopersicina baktériumban számos citokrómfehérje is található. Bagyinka Csaba és tanítványai három különböző, c típusú fehérjét izoláltak. Az egyik egy flavocitokróm-fehérje, melynek biokémiai és biofizikai jellemzése folyamatban van. Egy másikat a fotoszintetizáló baktériumokban eddig isme-

51 retlen citokróm c 4 redoxfehérjeként azonosítottak. Meghatározták jellemző adatait (redoxpotenciál, molekulatömeg, stb.). Spektroszkópiai mérésekkel kiderítették, hogy a citokróm c 4 anaerob körülmények között hőtűrő, dacára annak, hogy maga a baktérium 30 C felett elpusztul. Megállapították, hogy a hőmérséklet emelésének hatására a citokróm c 4 -ben konformációs változások mennek végbe, melyek anaerob körülmények között reverzibilisek, aerob körülmények között viszont a jelenlevő oxigén hatására a konformációs változások fixálódnak. Ezek a felfedezések a fehérjék hőstabilitásának okaiba engednek bepillantást. A flavocitokróm és a citokróm c 4 fehérjék kristályait is sikerült előállítaniuk (3. ábra). Az SZBK szegedi intézeteinek történetében a hidrogenázzal együtt ez a három fehérje az első példa arra, hogy az intézetben felfedezett és tisztított fehérjéket kristályosítani tudták, és így jó eséllyel a szerkezetüket is meg fogják tudni határozni. A Az elektrontranszport vizsgálata mutáns citokróm c redoxfehérjében A Metalloprotein Biofizikai csoport tagjai nem csak bak teriá lis eredetű citokrómok biofizikai jellemzésével foglalkoznak. Az egyik legszélesebb körben elterjedt, egyben legegyszerűbb szerkezetű c típusú citokróm az állati (és humán) sejtek mitokondriumának citokróm c fehérjéje. Ez a szolubilis, de a mitokondrium belső membránjához tapadó globuláris fehérje egyetlen hemcsoportot tartalmaz két kovalens kötéssel rögzítve. Feladata elektronok szállítása a légzési elektrontranszportlánc két membránhoz rögzített (transzmembrán) komplexe között. A fehérjemolekulákon belüli elektrontranszfer kísérleti vizsgálatára, a fehérje elektromos vezetőképességének tanulmányozására ez a citokróm azért különösen alkalmas, mert a genetikai módosítására kidolgozott rendszer már elérhető volt, noha további tökéletesítésre szorult. Ilyen módon lehetséges volt ennek a citokrómnak a felszínén úgy cserélni ki aminosavakat, hogy ha ezekhez kovalens kötéssel rögzítenek egy olyan festékmolekulát, amely fénnyel gerjesztve elektrondonorrá válik, akkor spektroszkópiai módszerrel nyomon tudják követni az elektron útját erről a donorról a citokróm hemcsoportjára és vissza. Zimányi László és munkatársai a fehérje felszínének különböző pontjait jelölték meg oly módon, hogy helyspecifikus mutációval ciszteinre cseréltek egyéb felszíni aminosavakat, majd az így bevezetett ciszteinre kötötték a fényérzékeny elektrondonor molekulát. A fehérje belsejében modellszámítással határozták meg az elektrontranszport lehetséges útvonalait és várható sebességét (4. ábra). Biofizika B 3. ábra. Fehérjekristályok. A flavocitokróm, B citokróm c 4, C hidrogenáz C 4. ábra. Egy lehetséges elektrontranszfer-útvonal a mitokondriális citokróm c hemcsoportja és a fehérje felszínére kötött elektrondonor molekula között. Halványan látható a fehérje atomi felbontású szerkezete 51

52 Biofizika 52 A számítások eredménye és a kísérletileg meghatározott elektrontranszfer-sebességek közötti összefüggéseket az elektrontranszfer sebességét leíró Marcus elmélet alapján értelmezték. A kísérletek eredményét olyan dinamikai modellel tudták legjobban magyarázni, mely figyelembe veszi a fehérje és a felszínéhez kötött elektrondonor festék flexibilitását, térbeli mozgását. Azt is sikerült kimutatniuk, hogy a festékmolekula fénnyel gerjesztett ún. triplett állapota nemcsak elektrondonorként, hanem elektronakceptorként is képes működni. Ez megnyitotta az utat az elektrontranszfer fehérjék nem csupán reduktív, hanem oxidatív gerjesztéséhez is. A csak a festékmolekulákat tartalmazó oldatban elvégzett elektrontranszfer-mérések eredményét pedig egy komplex reakcióutakat magába foglaló modellel tudták értelmezni, mely modell figyelembe veszi a gerjesztett állapot spontán és indukált lecsengését, valamint a gerjesztett festékmolekulák közötti elektrontranszfert is. Hogyan kerül a kovalensen kötött hemcsoport a citokróm c fehérjébe? A c típusú citokrómokban a kovalens hemkötés előnyeire nézve nincs általánosan elfogadott vélemény, ugyanakkor nem valószínű, hogy a kovalens kapcsolat a véletlen műve lenne, hiszen c típusú citokrómok a baktériumoktól az emberig mindenhol megtalálhatóak, és mindenhol jelentős élettani szerepet játszanak a sejtek energiaháztartásában. A hem kovalens kötése poszttranszlációs módosulás eredménye, amit a citokróm c érése során különböző érlelő enzimrendszerek katalizálnak. A legegyszerűbb rendszer a csupán egyetlen fehérjéből, a citokróm c hem liáz (CCHL) fehérjéből álló rendszer, ez működik az állati (és humán) sejtek mitokondriumában (humán sejtben a rövidítése HCCS). Annak ellenére, hogy a mitokondriális citokróm c az egyik legelterjedtebb fehérje, és számos vizsgálat, sőt, technológiai fejlesztés tárgyát képezi, a hem kovalens kötésének kialakulásáról, a fehérje éréséről szinte semmit nem lehet tudni. Ezért a kutatócsoport tagjai együttműködve Rákhely Gáborral a Szegedi Tudományegyetem Biotechnológiai Tanszékén célul tűzték ki az élesztőből származó CCHL fehérje rekombináns előállítását, tisztítását, és az általa katalizált citokróm c érés in vitro vizsgálatát. Ehhez mindenekelőtt a megfelelő plazmidkonstrukciót kellett megtervezni, tekintettel a fehérje expressziójának szabályozhatóságára is, és a megfelelő Escherichia coli gazdasejtet kellett kiválasztani. A CCHL fehérje tisztítása és a fehérjeanalitikai vizsgálatok során már olyan előjeleket tapasztaltak, amelyek a fehérje nem szokványos szerkezetére utaltak. Ezért számítógépes szerkezetbecslést is végeztek a fehérje aminosav-szekvenciájának felhasználásával. Megállapították, hogy a fehérje N-terminális végén egy összefüggő, legalább 67 aminosavból álló szakasz nagy valószínűséggel nem vesz fel határozott másodlagos szerkezetet (pl. hélix vagy béta-lemez), hanem úgynevezett rendezetlen állapotban marad. Ez az eredmény különösen annak fényében figyelemreméltó, hogy ezen a szakaszon található két, az irodalomból ismert, cisztein-prolin-valin (CPV) aminosavsorrendű hem-szabályozó motívum. Kézenfekvőnek látszott tehát egy olyan munkahipotézis felállítása, miszerint a CCHL egyik szubsztrátja, a hem, ezzel a rendezetlen szakasszal lép kölcsönhatásra. A rendezetlen szerkezetű fehérjéknek vagy fehérjeszakaszoknak egyébként éppen az az érdekes tulajdonsága, hogy szemben a régi biokémiai tankönyvi állítással, miszerint a fehérjék működése jól meghatározott másodlagos szerkezetet feltételez, és a denaturáció során éppen a másodlagos szerkezeti elemek elvesztése okozza a funkcióvesztést, ezek a fehérjék rendezetlen állapotban tudják kifejteni aktivitásukat, általában éppen a flexibilitásuknak köszönhetően. A CCHL enzimnek tehát két szubsztrátja van, a hemcsoport és a hemet még nem tartalmazó citokróm (úgynevezett apocitokróm). A CCHL és a hem in vitro kölcsönhatását vizsgálva a kutatócsoport tagjai további bizonyítékot szereztek arra vonatkozóan, hogy a már említett rendezetlen szakasz hogyan hat kölcsön a hemmel. A hem abszorpciós spektrumának változásaiból arra lehetett következtetni, hogy ez a kölcsönhatás feltehetőleg két lépésben történik. Először a szabad hem kölcsönhatásba lép a fehérje rendezetlen szerkezetű szakaszával, majd a következő lépésben a két CPV motívum axiálisan koordinálja a hem vasatomját, ezzel kialakítva a hatszorosan koordinált, erős ligandumtérben lévő, alacsony spinű hem spektrumát. A megfigyelés tehát azt valószínűsíti,

53 hogy a rendezetlen szakaszokkal rendezetlen: az ezzel járó flexibilitás, mozgékonyság valószínűleg ahhoz kell, hogy a hemcsoportot a fehérje képes legyen átmenetileg becsomagolni. Ehhez hasonló funkciót más kutatócsoportok egyéb rendezetlen fehérjék vagy fehérjeszakaszok esetében is kimutattak már az utóbbi években. a CGCytb molekulával. Ezek a fehérjék (pl. DCytb, LCytb, TCytb, TSCytb, ld. alább) alkotják a citokróm b561 (röviden Cyt-b561) fehérjecsaládot. Biofizika Citokrómok a membránban a citokróm b561 fehérjék Míg a szolubilis citokróm c a biológiai membrán ugyanazon oldalán maradva vesz fel és ad le elektront, és így nem járul hozzá közvetlenül a membrán két oldala közötti elektromos feszültség felépüléséhez, számos citokrómfehérje transzmembrán elhelyezkedésű, és bizonyítottan vagy feltételezhetően a membránon keresztül folyó elektrontranszportot katalizálja. Ilyen fehérjék a citokróm b561 fehérjecsalád tagjai, mely családdal Bérczi Alajos foglalkozott és foglalkozik behatóan. Az első citokróm b561 fehérjét az 1970-es évek elején norvég kutatók fedezték fel marha mellékvesekéreg kromaffin granula membránjaiban (CGCytb). A CGCytb olyan, aszkorbáttal (azaz C-vitaminnal) redukálható, két b-típusú hemet tartalmazó fehérje, melynek standard redoxpotenciáljai +50 mv és +150 mv körüli értékek, és amelyben a két hemet 4 db hisztidin aminosav köti a fehérje membránon keresztül elhelyezkedő részeihez (az ún. transzmembrán α-hélixekhez). A fehérje fontos szerepet játszik az idegsejtekben termelődő neurotranszmitterek (ingerületátvivő anyagok) szintézisében. A membránon keresztülnyúló fehérje citoplazma felőli oldalán lévő hemje elektront vesz fel a citoplazmában megtalálható, redukált aszkorbáttól, azt a fehérje belsején keresztül eddig még részleteiben nem ismert módon és úton továbbítja a membrán másik oldalán elhelyezkedő hemnek, amely aztán a kromaffin granula belsejében keletkezett aszkorbil-szabadgyöknek adja tovább az elektront (5. ábra). Az elmúlt évtizedben bizonyossá vált, hogy mind a növényekben, mind az állatokban található több olyan, két hemet tartalmazó, aszkorbáttal redukálható, b-típusú citokróm is, amelyek szerkezetüket tekintve nagyon szoros hasonlóságot mutatnak 5. ábra. A CGCytb molekula elképzelt, sematikus elhelyezkedése a bio lógiai membránokban, és az elektrontranszport elképzelt útja. AH aszkorbát gyök Bérczi Alajosnak amerikai-belga együttműködésben sikerült azonosítania és tisztítania, valamint jellemeznie az LCytb jelöléssel ellátott fehérjét egér makrofágok lizoszómájában. Az egérben azonosított CGCytb, DCytb (duodenum Cytb) és LCytb fehérjék rekombináns változatát sikerült előállítani élesztősejtekben. A rekombináns fehérjék segítségével kimutatták, hogy ezek a fehérjék képesek a citoplazmában található redukált aszkorbátról, az élesztősejt membránján keresztül, elektronokat szállítani a membrán másik oldalán levő vaskelátoknak (pl. ferricianid); azaz valamennyi molekula képes transzmembrán vasredukcióra. A DCytb esetében ez nem volt meglepő dolog, hiszen ezt a molekulát éppen ilyen funkciójának kapcsán fedezték fel. Az LCytb esetében azonban a valódi biológiai funkció még nem ismeretes, így a rekombináns fehérjékkel az idegen biológiai rendszerben kapott eredmények ötleteket szolgáltathatnak a valódi funkció megtalálásához. Az elmúlt évtizedben növényi szervezetben is megtaláltak egy 2 hemet tartalmazó, aszkorbáttal redukálható, b-típusú citokrómot. Bár a növényi plazmamembránban talált, ilyen paraméterekkel rendelkező fehérjéről eddig még nem bizonyosodott be, hogy tagja a Cyt-b561 fehérjecsaládnak, a vakuoláris membránban (a tonoplasztban) szintén Bérczi Alajos és munkatársai megtalálták és azonosították az első növényi eredetű, biztosan a Cyt-b561 családba tartozó 53

54 Biofizika 54 fehérjét, a TCytb molekulát. A fehérje rekombináns változata redukálta a vaskelátokat (ferricianid, Fe-EDTA) redukált aszkorbáttól származó elektronok felhasználásával. Pontmutánsok és különböző spektroszkópiai, valamint titrálási módszerek segítségével megkezdték a molekula működési mechanizmusának feltérképezését. Ennek első eredményeként dupla pontmutációval előállítottak egy olyan TCytb-t, amelyben csak egy hemcsoport volt a kettő helyett; az így kapott molekula spektroszkópiai jellemzőinek segítségével sikerült egyértelműen meghatározniuk, hogy a molekulában található 2 hem közül melyik helyezkedik el a transzmembrán helyzetű TCytb molekula citoplazma felőli oldalán, és melyik a másik oldalon (lásd az 5. ábrát). Feltételezhető, hogy a TCytb hasonló feladatot lát el a növényi sejtekben, mint a DCytb az állati sejtekben. Pillanatnyilag azonban nem ismeretes, hogy a TCytb-nek mi is a pontos biológiai feladata. Rákos sejtek genomjainak tanulmányozása során kimutatták, hogy az egyik, ún. tumorszuppresszív hatást mutató fehérje aminosavszekvenciája és másodlagos szerkezete is nagy hasonlóságot mutat a CGCytb fehérjéhez (TSCyb). A fehérje mind in vivo, mind in vitro kísérletekben mutatta a tumorszuppresszív (azaz tumorsejtek szaporodását gátló) hatást. Bérczi Alajosnak sikerült előállítani az egérben található TSCytb rekombináns változatát, és biofizikai módszerekkel megmutatni, hogy a fehérje valóban a Cyt-b561 fehérjecsalád tagja, bár távolabbi rokonnak tekinthető, mint a DCytb, TCytb vagy az LCytb. Azt is megmutatták, hogy a fehérje nem csak aszkorbáttal, hanem redukált ditiol reagensekkel is redukálható (pl. ditiotreitol, dihidrolipoénsav), ami feltételezhetővé teszi a molekulának többféle redoxfolyamatban való szereplését is. A közeljövő legnagyobb kihívása mind a Metalloprotein Biofizikai csoport, mind a témában kutató más csoportok számára a háromdimenziós atomi felbontású szerkezet meghatározása legalább egy Cyt-b561 fehérje esetében. A szerkezet ismeretében megbízhatóbban értelmezhetőek lennének a kutatócsoport által tervezett funkcionális (pl. elektron transzfer) mérések eredményei, ami közelebb vinne a fehérjecsalád egyes tagjai élettani szerepének a megértéséhez is. Nagy a valószínűsége annak, hogy a Cyt-b561 fehérjecsalád tagjai kulcsszerepet játszanak a C-vitaminhoz kapcsolható transzmembrán elektrontranszport folyamatokban, a membránbioenergetikában és az életfolyamatok redox regulációjában. A fehérjecsalád tagjainak minél pontosabb megismerése és az élettani funkcióiknak minél pontosabb feltérképezése új lehetőségeket nyithat mind a növénynemesítésben és -termesztésben, mind a gyógyszerkutatásban és a gyógyászatban. A kutatás a módszerek folyamatos fejlesztése is A redoxfehérjékkel végzett mérések során a csoport tagjai számos új technikát is kidolgoztak. Ezek közül legjelentősebb, hogy egy amerikai kutatócsoporttal közösen egy új fehérjeszekvenáló módszert fejlesztettek ki. Az új módszerrel tömegspektrométer segítségével határozzák meg a fehérje aminosavsorrendjét. Az aminosavsorrendet mostanában jellemzően a nukleinsavsorrend meghatározásával és átkódolásával állapítják meg. Ez a módszer egy genetikailag nem feltérképezett organizmus esetében (s az élőlények többsége ilyen) meglehetősen komplikált és időigényes, továbbá nem is minden esetben valósítható meg. Ugyanakkor nem feltétlenül a működő fehérje szekvenciáját kapják meg. Az új módszer időben versenyképes a nukleinsavból történő szekvenciameghatározással, s további fejlesztéssel a szükséges anyagmennyiség is annyira csökkenthető, hogy kétdimenziós gélelektroforézis fehérjefoltjaiból is meghatározható lesz a szekvencia. Hátránya pillanatnyilag az, hogy drága és terjedelmes műszert (több tömegspektrográfot) igényel, ezért csak kevés helyen alkalmazható. Ennek ellenére munkatársaink meggyőződése az, hogy ez az új módszer nagy lökést ad majd a fehérjeszerkezet és -funkció kutatásának. A Központi Fizikai Kutatóintézet Részecske- és Magfizikai Intézetének munkatársaival együtt kidolgoztak egy új eljárást (PIXE-PAGE), mellyel a fehérjék fémtartalmát a különböző alegységekhez rendelhetik, valamint megállapíthatják a fehérjében található fémek mennyiségének egymáshoz való arányát is. Amerikai kutatókkal közösen kidolgoztak egy új módszert fémtartalmú fehérjék röntgen spektroszkópiai vizsgálatára, melyet azóta mások is széleskörűen használnak. A módszer lényege, hogy a

55 röntgenspektrumokat és a fehérje redox változásait ugyanazon a mintán lehet nyomon követni, s a méréssel párhuzamosan a röntgensugárzás kalibrációját is el lehet végezni. Egy kis kitérő A kutatóknak néha lehetőségük nyílik külföldi egyetemeken, intézetekben eltölteni hosszabb-rövidebb időt. Egyes országokban ennek az úgynevezett sabbatical távollétnek még az intézményes keretei is adottak. Az ilyen külföldi munkavállalásoknak a pályájuk derekán lévő kutatók számára az a célja, hogy az itthon művelt kutatási témától kicsit eltávolodva, felfrissülve, új ötletekkel és együttműködési lehetőségekkel felvértezve térjenek haza. Zimányi László Franciaországban, Montpellierben volt vendégprofesszor a közelmúltban, és ott kapcsolódott be világszínvonalú biofotonikai kutatásokba Gergely Csilla professzorasszony laboratóriumában, aki a szegedi Biofizikai Intézetben szerezte meg PhD fokozatát. A szilíciumlapkákból maratással kialakított, porózus szilíciumalapú vékonyrétegek által alkotott érdekes fotonikus anyagok önmagukban is izgalmas tulajdonságokkal rendelkeznek (a fotonikus kristály a fény hullámhosszával összemérhető periodikus struktúrák elnevezése). A porózus szilícium fotonikus kristályok további jó tulajdonsága, hogy biológiai makromolekulák, pl. fehérjék felvételével hibrid biofotonikai struktúrák alakíthatók ki. Ezeknek a rendszereknek számos hasznos alkalmazása képzelhető el vagy valósult már meg. Ilyenek például a nagyérzékenységű molekuláris szenzorok vagy a molekulák (gyógyszerek) irányított célbajuttatása. A francia csoporttal az együttműködés tovább folytatódik, és kiegészült két, a területen vezetőnek számító mexikói csoporttal is. A szegedi kutatók érdeklődése elsősorban arra irányul, hogy milyen új, nem lineáris optikai tulajdonságok lépnek fel a hibrid biofotonikai anyagokban. Megfelelő lézerrel kombinált úgynevezett nem lineáris optikai mikroszkóppal még Franciaországban sikerült például kimutatniuk két fehérje, a bakteriorodopszin és a glükóz-oxidáz kétfotonos fluoreszcencián és másodharmonikus gerjesztésen alapuló erősített fénykibocsátását. Ezzel a hatással eddig nem látott háromdimenziós képet sikerült alkotniuk a porózus szilícium réteges szerkezetéről (6. ábra). 6. ábra. Porózus szilícium fotonikus kristály mikroszkopikus szerkezetének láthatóvá tétele fehérje fényemissziójával. A közeljövőben tervezik redoxfehérjék elsősorban az eddig is tanulmányozott citokrómok beültetését a porózus szilícium fotonikus kristályokba. Ezzel ötvözni remélik a citokrómok elektrontranszfer képességét a nagyfelületű porózus szilíciumlapkák által nyújtott nagy érzékenységgel, és bioelektrokémiai mérésekre alkalmas, de egyben érdekes optikai tulajdonságokkal is rendelkező elektródot próbálnak építeni. Ennek a törekvésnek egyelőre nehezen megjósolható eredményei lehetnek, az alapkutatást bemutató tudományos publikációktól akár a hasznosítható szabadalmakig is. Zimányi László Biofizika 55

56 Biokémia 56

57 SZBK Biokémia Biokémiai Intézet 6726 Szeged, Temesvári krt Szeged, Pf

58 Biokémia Restrikciós endonukleázok és DNSmetiltranszferázok, a DNS-kutatás eszközei A restrikciós-modifikációs (R-M) rendszerek, és az ezeket alkotó enzimek, a restrikciós endonukleázok és a modifikációs DNS-metiltranszferázok vizsgálata egyike az SZBK első évtizedében kezdett és máig művelt kutatási témáknak. Ez minden bizonnyal összefügg az R-M enzimek érdekességével és fontosságával. A baktériumok és archeák jelentős része tartalmaz R-M enzimeket. E rendszerek sokfélék lehetnek, biotechnológiai jelentősége az ún. II. típusú rendszereknek van. A II. típusú rendszerek többsége két enzimből, egy restrikciós endonukleázból (REáz) és egy modifikációs DNS-metiltranszferázból (MTáz) áll. Mindkét enzim ugyanazt a néhány bázispárból álló, a rendszerre jellemző szekvenciát ismeri fel a DNS-en. A REáz ennél az ún. felismerőszekvenciánál hasítja a DNS-t, míg a modifikációs enzim a felismerőszekvencia mindkét szálán egy-egy adenint vagy citozint metilál. A metilált bázis az R-M rendszerre jellemzően N6-metiladenin, C5-metilcitozin vagy N4-metilcitozin lehet. A metilált DNS rezisztens a saját REázzal szemben. A II. típusú REázoknak a molekuláris biológia fejlődésére gyakorolt rendkívüli hatását melyhez talán csak a PCR technikáé és a DNS-szekvenciameghatározás Sanger-módszeréé mérhető az magyarázza, hogy felhasználásukkal vált lehetővé a heterogén és kezelhetetlen méretű DNS-molekulák specifikus, kisebb fragmentumokká való darabolása. Ez a metodikai lépés az előfeltétele a génklónozásnak, a genomikának, a szintetikus biológiának, tehát közvetlenül vagy közvetve szinte mindennek, amit a molekuláris biológiai kutatásban a DNS-sel csinálunk. Az alábbiakban az SZBK Biokémiai Intézetének egykori Nukleinsav-, majd később a DNS-Fehérje Kölcsönhatások Csoportjában folyó, R-M enzimekkel kapcsolatos kutatások néhány fontosabb eredményét fogom áttekinteni. A kezdetek A téma eredete az 1970-es évek közepére nyúlik viszsza. A Venetianer Pál által vezetett Nukleinsav Csoport az SZBK alapításától kezdve az Escherichia coli baktérium riboszomális RNS génjeit vizsgálta: arra kerestek választ, mi magyarázza ezeknek a géneknek a rendkívül intenzív működését. Munkájuk során, akárcsak más molekuláris biológusok akkoriban, szembesültek azzal a ténnyel, hogy egy-egy gén a baktérium DNS-ében olyan kis részt képvisel, hogy igazán informatív biokémiai vizsgálatok számára gyakorlatilag hozzáférhetetlen. Ez a helyzet a II. típusú REázok és az ezek felhasználásán alapuló génklónozás felfedezésével a 70-es évek első felében döntően megváltozott. Venetianer Pál, azonnal felismerve az új technikában rejlő lehetőségeket, az akkor frissen a csoportba került Sain Bélát bízta meg a restrikciós enzimek aktivitásméréséhez szükséges technikák beállításával és az akkor ismert 2 3 enzim tisztításával. Később a restrikciós enzimek számának növekedésével a Nukleinsav Csoport szinte valamennyi tagja hozzájárult a közös enzimkészlet bővítéséhez. Ez a tevékenység végül kényszerűségből oda fejlődött, hogy néhány éven át az enzimtisztítást kisipari méretekben folytattuk, és az enzimeket a REANAL közvetítésével árultuk. Ez az akkori viszonyok között jelentősen hozzájárult szűkös keményvaluta-keretünk kiegészítéséhez, a munkánkhoz szükséges vegyszerek beszerzéséhez. E munka során részben a tudatos keresés, részben a véletlen szerencse három új REáz felfedezéséhez vezetett (zárójelben a specifitás): BspRI (GGCC), BepI (CGCG) és BcefI ACGGC. Klónozás, gének, szekvenciák A 80-as évek elejétől a restrikciós-modifikációs enzimek kutatómunkánknak nemcsak nélkülözhetetlen eszközei, hanem tárgyai is lettek. Ennek oka, hogy igen nagy szekvenciaspecifitásuk miatt különlegesen alkalmasak a szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálatára. Nyilvánvaló volt, hogy minden alaposabb biokémiai-enzimológiai vizsgálat előfeltétele az R-M 58

59 gének klónozása. Ezt először a BspRI MTáz génjével sikerült elérnünk. A klónozáshoz használt módszer azon a feltevésen alapult, hogy ha egy E. coli sejtbe bejut egy, a BspRI MTáz génjét hordozó plazmid, akkor a plazmid által kódolt MTáz metilálni fogja a plazmidon lévő BspRI felismerőhelyeket, melyek ezáltal rezisztenssé válnak a BspRI endonukleázzal szemben (1. ábra). B. sphaericus DNS-fragmentumait plazmidvektor segítségével E. coliban klónoztuk, ezután a több ezer klón közös tenyészetéből plazmidot tisztítottunk. Ezt a plazmidpreparátumot megemésztettük BspRI endonukleázzal, majd az emésztett DNS-sel újra E. coli baktériumokat transzformáltunk. A BspRI emésztés hatására a plazmidok óriási többsége darabokra esett, és így nem adott antibiotikum-rezisztens transzformánst, kivéve azt a plazmidot, amely a BspRI MTáz génjét hordozta, és amely a specifikus metiláció miatt védetté vált a BspRI endonukleázzal szemben. Ez az épen maradt plazmid E. coliba juttatva visszanyerhető volt (1. ábra). Ez a módszer a MTáz génre szelektál, de ha a REáz és a MTáz gén elég közel van egymáshoz (ma már tudjuk, hogy ez minden R-M rendszerben így van), akkor egy nagyobb méretű fragmentumon mindkét gén egyszerre klónozható. Ezt a módszert, amely egyszerűsége és a rendkívüli hatékonysága miatt azóta az R-M rendszerek klónozásának szinte kizárólagos eszköze lett, mi alkalmaztuk először, ezért az irodalomban Hungarian-trick néven is emlegetik. A BspRI MTáz gén klónozása tette lehetővé a gén nukleotidszekvenciájának, és ezen keresztül a BspRI MTáz aminosavszekvenciájának a meghatározását. Ez egyike volt az első publikált DNS MTáz szekvenciáknak. A továbbiakban még több teljes R-M rendszert, ill. MTáz gént klónoztunk, meghatároztuk a gének szerkezetét, és több esetben azt, hogy az enzim melyik bázist metilálja. Hogy az összehasonlításban rejlő lehetőségeket kiaknázhassuk, olyan rendszereket válogattunk, melyek specifitása hasonló (1. táblázat). Felismertük, hogy a C5-MTázok között aminosavszekvencia-hasonlóság van. A későbbiekben az egyre szaporodó C5-MTáz szekvenciák analízise lehetővé tette az erre az enzimcsaládra jellemző konzervált szekvenciamotívumok azonosítását. Biokémia 1. ábra. A BspRI modifikációs metiltranszferáz gén klónozása név baktérium specifitás gén BspRI BsuRI SPR Sau96I BepI EcaI KpnI Bacillus sphaericus Bacillus subtilis Bacillus subtilis fág Staphylococcus aureus Brevibacterium epidermidis Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae GGCC GGCC GGCC, CCGG GGNCC CGCG GGTNACC GGTACC M + R M + R M M + R M + R 1. táblázat. Klónozott restrikciós endonukleáz és modifikációs metiltranszferáz gének. A felismerőszekvencián belül aláhúzás jelöli az általunk meghatározott metilált bázist M M 59

60 Biokémia 60 Egy új kutatási irányt nyitott az a munka, amelyben a klónozott BspRI MTáz gént bejuttattuk élesztőbe. Bár a M.BspRI gént tartalmazó élesztőből izolált DNS nagy része emészthető volt BspRI endonukleázzal (tehát nem volt metilált), a két vizsgált működő élesztő gén részben vagy teljesen rezisztens (metilált) lett. Ezt úgy értelmeztük, hogy az idegen MTáz azokat a géneket metilálta, amelyek aktívak és ezáltal hozzáférhetőek voltak, és javasoltuk, hogy a DNS-MTázokat ilyen módon fel lehet használni a kromatin állapotának vizsgálatára, az aktív és inaktív genomrégiók megkülönböztetésére. Ezt később mások kvantitatív vizsgálatokkal megerősítették és ez a technika a kromatinszerkezet in vivo vizsgálatának egy fontos módszere lett. DNS-metiltranszferázok A klónozott MTáz génekkel végzett munka vezetett arra a felfedezésre, hogy a BspRI és BsuRI MTázok egyes csonka, inaktív fragmentumai képesek aktív enzimmé összeállni. Mint azóta kiderült, ezt a fragmentumkomplementációnak nevezett jelenséget néhány más C5-MTáz is mutatja. A fragmentumkomplementációja jelzi a C5-MTázok szerkezetének bizonyos fokú plaszticitását és lehetőségeket kínál egyes biotechnológiai felhasználásokra. Egyik fő célunk annak vizsgálata, hogy a REázok és MTázok hogyan ismerik fel a szubsztrát szekvenciá jukat a DNS-en. Ennek érdekében kollaborációt kezdtünk krisztallográfusokkal a klónozott MTázok DNS-sel alkotott komplexeinek szerkezeti vizsgálatára, de egyelőre több sikert hozott három másik megközelítés. A fehérje-dns kontaktusokat vizsgáló ún. footprinting technika alkalmazása azt mutatta, hogy a BspRI MTáz DNS-hez való kötődésének módja hasonló a szintén GGCC-specifitású HaeIII MTázéhoz, ugyanakkor jelentősen különbözik két másik, más specifitással rendelkező MTázétól. Azt, hogy a különböző specifitású C5-MTázok szubsztrátfelismerési mechanizmusában nagy különbségek lehetnek, alátámasztották azok az eredményeink is, amelyek szerint különböző specifitású C5-MTázok eltérő mértékű görbületet hoznak létre a DNS-ben, amikor a szubsztrátszekvenciához kötődnek. Hat különböző C5-MTáz DNS-sel alkotott specifikus komplexét egy gélelektroforetikus módszerrel megvizsgálva azt találtuk, hogy az indukált DNS görbület mértéke 13 -tól (M.HhaI) ~55 -ig (M.Sau96I) terjed. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a specifitástól függően a DNS-felismerés nagyon eltérő mechanizmussal történhet, ami valószínűleg összefügg a szubsztráthelynek a báziskifordulás utáni stabilizálásával. Ennek az enzimcsaládon belüli heterogenitásnak a szerkezeti igazolása röntgendiffrakciós vizsgálatokra vár. A MTáz-DNS kölcsönhatás tanulmányozásának harmadik útja az volt, hogy megpróbáltunk olyan MTáz mutációkat izolálni, melyek megváltoztatják az enzim specifitását. Azt reméltük, hogy a mutáns enzimek vizsgálata segít azonosítani a szubsztrátfelismerésben szerepet játszó aminosavakat. Mivel ekkorra már elég sok figyelmeztető irodalmi adat gyűlt össze arra vonatkozóan, hogy a DNS- MTázokban nagyon nehéz specifitásváltozást elérni, olyan rendszert kerestünk, amelyben egy jól meghatározott és viszonylag kis specifitásváltozásra tudtunk szelektálni. Erre a célra a SinI MTáz kitűnő lehetőséget kínált. Ennek az enzimnek a specifitása GG A / T CC, azaz a középső pozícióban A:T vagy T:A bázispárnak kell lenni. A célunk olyan M.SinI mutánsok előállítása volt, amelyekben elromlott a középső bázispár felismerése, és ezért a GG A / T CC szekvencia mellett a GG G / C CC szekvenciát is képesek metilálni. A SinI MTáz génjét in vitro random mutagenezisnek vetettük alá, majd a mutáns géneket plazmidba ültetve, E. coli sejtekbe juttattuk. A kívánt csökkent specifitással rendelkező enzimeket kódoló plazmidok szelekciója hasonlóan történt, mint a BspRI MTáz gén klónozása (l. fenn és 1. ábra), de a közös tenyészetből izolált plazmidpreparátumot most Sau96I endonukleázzal emésztettük. A Sau96I endonukleáz specifitása GGNCC, így az ezzel való emésztés során csak azok a plazmidok maradtak épek, amelyekben mind a GG A / T CC mind a GGG / C CC helyek védettek voltak. A mutáns gének vizsgálata váratlan eredménynyel szolgált. Az általánosan elfogadott nézet szerint a C5-MTázok egy nagy és egy kis doménből állnak, és a kis domén lép kontaktusba a DNS nagy árki felszínével, míg a nagy domén a kis árok felé fordul. Minden addigi adat arra utalt, hogy a szekvenciaspecifitásért kizárólag a kis domén és a bázispárok nagy árki felszíne közötti kölcsönhatások felelősek. Meglepe-

61 tésünkre valamennyi, a specifitásváltozásért felelős mutáció az enzim feltételezett nagy doménjának megfelelő részben volt. Ez arra utalt, hogy a SinI MTáz szekvenciaspecifitásának meghatározásában a nagy domén és a kis árok közötti kölcsönhatások is szerepet játszanak. Ezt a feltevést a SinI és egy másik C5-MTáz (M.EcoRII, CC A / T GG) esetében oligonukleotid-szubsztrátok segítségével, biokémiai kísérletekkel is igazoltuk. Eredményeink azt mutatják, hogy olyan C5-MTázok esetében, amelyek célszekvenciájában egy pozícióban elfogadható az A:T és T:A is, de kizárandó mind a G:C, mind a C:G bázispár, a szubsztrátfelismerésnek ez az eleme a nagy domén és a kis árok közötti kölcsönhatások révén valósul meg. Restrikciós endonukleázok Rendkívüli specifitásuk ellenére időnként a REázok is tévesztenek, azaz olyan szekvenciáknál is hasítanak, melyek az igazi szubsztráthelytől egy bázispárban eltérnek és amelyeket in vivo nem véd a saját metiláció. Ezeknél a majdnem-szubsztrát helyeknél azonban általában csak az egyik szálat hasítják. Kimutattuk, hogy az így keletkezett DNS-lánctörések (nickek) javításához a sejt DNS-ligáz kapacitása csak egy határig elég, e fölött a túlélés RecA- és RecB-függő javítómechanizmustól függ. A BspRI egyike volt az első, homogenitásig tisztított és biokémiailag jellemzett restrikciós enzimeknek. Igen nagy aktivitása mellett érdekes tulajdonsága, hogy szemben a II. típusú REázok zömével valószínűleg nem homodimerként, hanem monomerként működik. Ezt támasztja alá az is, hogy a szubsztráthely két szálát nem egyszerre, hanem egymástól függetlenül hasítja (2. ábra). Az utolsó két év érdekes eredménye volt az MvaI endonukleáz különleges viselkedésének felfedezése. A CG-specifikus SssI DNS-MTázzal végzett munka során figyeltük meg, hogy az MvaI, melynek ismert szubsztrátja az 5 bázispárból álló 5 -CCAGG/5 - CCTGG szekvencia, néhány olyan DNS-t is emészt, amely nem tartalmazza ezt a felismerőhelyet. Kimutattuk, hogy ilyen esetekben a hasítás CCCGGG/ CCCGGG szekvenciáknál történik, de csak akkor, ha az aláhúzással jelölt citozin bázisok helyén 5-metilcitozin van: CC 5m CGGG/CC 5m CGGG (CG-specifikusan metilált SmaI hely). Megállapítottuk, hogy a hasítás a metilált bázis 3 oldalán, a két szálon egymással szemben következik be: CC 5m C GGG/CC 5m C GGG (3. ábra). Biokémia 2. ábra. Egyetlen BspRI helyet tartalmazó plazmid emésztése BspRI endonukleázzal. Agaróz gél-elektroforézis. Sc: szuperspiralizált; l: lineáris; oc: egyik szálán hasított plazmid. C: teljesen emésztett (lineáris) plazmid. A reakció kezdetén felszaporodik a csak egyik szálán emésztett forma. 3. ábra. Az MvaI hasítja a metilált BcnI helyek (CC 5m CGG/C 5m CGGG) G-szálát. Egy BcnI helyet tartalmazó DNS-fragmentumot in vitro metiláltunk SssI MTázzal, a kezelt fragmentumot MvaI-gyel emésztettük, majd mindkét irányból végzett DNS-szekvenciameghatározáshoz templátként használtuk. A C-szálon a szintézis folyamatos, míg a G-szálon a metilált C után abbamarad. A csillaggal jelölt A csúcs független a templáttól, a kísérletben használt DNS-polimerázra jellemző műtermék. Alsó sor: az MvaI szubsztráthelyei, 1: ismert metilálatlan hasítóhely; 2: metilált BcnI hely; 3: metilált SmaI hely; piros vonal mutatja a hasítás helyét. Kimutattuk, hogy a tényleges felismerőhely nem a 6 bázispárból álló CC 5m CGGG/CC 5m CGGG, hanem az annál egy bázispárral rövidebb C 5m CGGG/ CC 5m CGG szekvencia (CG-specifikusan metilált BcnI 61

62 Biokémia 62 hely), melynek azonban az enzim csak az egyik szálát hasítja, azt, amelyikben G van középen: C 5m C GGG/ CC 5m CGG. Kettősszálú hasítás akkor történik, ha két ellentétes irányú C 5m CGGG/CC 5m CGG szekvencia átfedő módon egymás mellé kerül: CC 5m C GGG/ CC 5m C GGG (3. ábra). Ez az első példa arra, hogy egy restrikciós enzim kettős specifitással rendelkezhet, azaz a szokásos metilálatlan felismerőhely mellett egy attól eltérő szekvenciájú másik helyet is hasít, amennyiben az meghatározott módon metilált. Az MvaI metiláció-függő aktivitása új hasítási specifitást jelent (CC 5m C GGG/CC 5m C GGG), amely bővíti a DNS-kutatás eszköztárát. Irányított DNS-metiláció Az elmúlt néhány évben nemzetközi együttműködés keretében művelt és két EU pályázat által támogatott témánk egy irányított DNS-metilációs rendszer kidolgozása volt. Magasabbrendű szervezetekben, így az emberben is a DNS-metilációnak, más epigenetikus faktorokkal együtt, fontos szerepe van a génműködés szabályozásában és egyes betegségek patogenezisében. Mivel a gének promotereiben a CG dinukleotidok metilálása a génműködés kikapcsolásához vezet, meghatározott génszakaszok mesterségesen előidézett, szelektív metilálása fontos kísérleti, sőt távlatilag terápiás eszköz lehetne. Az irányított DNSmetilációra kidolgozott korábbi módszerek a DNShez szekvenciaspecifikusan kötődő cink-ujj fehérjék (ZFP) és egy DNS-MTáz genetikai fúzióval előállított hibridjeit alkalmazták, amelyben a ZFP töltötte be az irányítódomén szerepét. A projektünk célja egy olyan irányítható DNS-metilációra képes rendszer kidolgozása volt, amelyben az irányítódomén egy oligonukleotid (triplex forming oligonucleotide, TFO), amely a DNS egy szakaszával specifikus triplexet tud képezni, és ezáltal a MTázt a célhely közelében rögzíti. DNS-MTázként az SssI MTázt alkalmaztuk, mert ennek specifitása megegyezik az emlős DNS-MTázok specifitásával (CG), de azoknál erre a célra sokkal alkalmasabbnak látszott. Csoportunk feladata a konzorciumon belül olyan M.SssI változatok előállítása, tisztításának kidolgozása volt, amelyek alkalmasak a TFO-hoz való kémiai kapcsolásra. Legfontosabb eredményeink a következők voltak: 1) Sikerült egy olyan expressziós rendszert találni, amely az E. coli számára toxikus M.SssI termelésére alkalmas. 2) Megállapítottuk, hogy az enzim aktív helyében lévő és minden C5-MTázban megtalálható katalitikus cisztein (C141) szerinre cserélése nem jár az aktivitás teljes elvesztésével. 3) Létrehoztunk affinitáskromatográfiával tisztítható, C-terminálisan ciszteint hordozó M.SssI változatokat. Ezek az eredmények voltak a feltételei a TFO és az M.SssI közötti kémiai kapcsolásnak. A TFO-M.SssI(C141S)- konju gátummal egy plazmidon in vitro sikerült helyspecifikus metilációt elérni. További terveink is elsősorban az irányított DNSmetilációhoz kapcsolódnak, de a jövőben főleg ZFP irányítódomént kívánunk használni. A célzott metilációra eddig kidolgozott módszerek nem megfelelőek, mert túl magas a háttérmetiláció, és/vagy mert az alkalmazott MTáz specifitása (CCGG, ill. GCGC) miatt a CG helyeknek elvben is csak kis hányada metilálható. Célunk olyan programozható MTázok létrehozása, amelyek képesek elvben bármely CG hely szelektív metilálására akár egy humán genom méretű DNS-en belül is. A tervezett módszerek a DNS-metiláció vizsgálatának széles körben felhasználható kísérleti eszközei és terápiás célú fejlesztés kiindulásai lehetnek. Zárszó A fentiekben leírt és a hely hiányában itt nem említett eredmények egy része hazai és nemzetközi kollaborációban jött létre. Itt azonban most álljon csak azoknak a neve ABC sorrendben, akik kutatók, laboránsok, egyetemi hallgatók e három és fél évtized során a két SZBK-s csoport tagjaként járultak hozzá az itt összefoglalt eredményekhez: Anton Józsefné, Frank Baldauf, Vladimir Brenner, Tungalag Chuluunbaatar, Csábrádi Ákos, Csorba Imréné, Csordás-Tóth Éva, Erdei Sára, Fehér Zsigmond, Finta Csaba, Groma Gergely, Tatyana Ivanenko, Kiss Antal, Koncz Csaba, Kovács Attila, Dagmar Kupper, Magyaródi Erzsébet, Ruslan Meleshko, Orosz András, Pósfai Eszter, Pósfai György, Raskó Tamás, Sain Béla, Ślaska-Kiss Krystyna, Stier Ildikó, Urszula Sulima, Szilák László, Szomolányi Éva, Tímár Edit, Venetianer Pál, Jian-Guang Zhou, Zsurka Gábor. Kiss Antal

63 Variációk DNS-sel és fehérjékkel: a transzkripciószabályozás - kutatás egyik iránya a Biokémiai Intézetben, a kezdettől máig Biokémia A Biokémiai Intézetben megalakulása óta sikeres kutatási téma a transzkripciószabályozás vizsgálata. A kezdetet az Escherichia coli RNS-polimeráz enzim és a baktériumsejt legaktívabb génjei között létrejövő erős kapcsolat kimutatása jelentette. A bakteriális promóterek és polimeráz vizsgálata a Nukleinsav Csoport munkájának fókuszában maradt az Intézet működésének első tíz-tizenöt évében. Az eredmények a promoter pontos szerkezetétől a gyakorlati használatáig elvezetve rámutattak, hogy egy DNS-darab és egy fehérje egyszerűnek tűnő kapcsolata is számos variációban valósulhat meg. A nyolcvanas években szétágaztak az Intézet génműködés-szabályozásra irányuló kutatásai. Az egyik területen, a retrovírusok transzkripciójának vizsgálatával kimutattuk, hogy két fehérje még változatosabb kölcsönhatásokra képes egy alkalmas DNS-darabbal, és ez például egy vírus megbetegítő képességének is alapja lehet. Mai ismereteink szerint egy eukarióta gén transzkripciójának indításához fehérje pontos együttműködése szükséges. A közöttük fennálló kapcsolatok rendszerének feltárása és leírása új megközelítéseket kíván. Az új módszerek alapjait azonban szinte mindig viszszavezethetjük azokra az egyszerű esetekre, amelyekből oly sokat lehetett tanulni egy DNS-molekularészlet és egy fehérje kapcsolatának vizsgálatával. Elképzelésünk formálódását a transzkripció szabályozásáról az eltelt negyven év során ahhoz hasonlíthatjuk, mint ahogy egyre gazdagabb részleteket fedezünk fel egy légifelvétel közelítő nagyításain. Számos képkockán van olyan részlet, amelyet a Biokémiai Intézet munkatársai az elsők között vettek észre. Az SZBK megalakulásakor a molekuláris biológia már megtette első nagy lépéseit, de még gyerekcipőben járt: ismert volt a gének anyaga és megszólalásuk módja. Egyes gének kézbevételére és működésük molekuláris részletekre menő vizsgálatára azonban még alig-alig volt lehetőség. Mai módszereink ismeretében nehéz is értékelni azokat a kísérleteket, melyek alapján a Biokémiai Intézet munkatársai 1974-ben a Nature-ben közölték, hogy az E. coli RNS-polimeráz enzim erősen kötődik a riboszóma RNS (rrns) génekhez. Következtetésük lényege az volt, hogy az rdns szerkezete miatt az enzim ezeket a géneket sokkal többször választja átírásra, mint más géneket. Pedig a baktériumsejt valamennyi génjéről ugyanaz a polimeráz készít RNS-átiratot. Az rrns gének átírását szabályozó DNS-résznek a promóternek tehát sajátos szerkezettel kell rendelkeznie, ami különösen erőssé teszi. A következtetés ma is igaz. A hetvenes évek végétől exponenciálisan fejlődő DNS manipulációs technikákkal elkülönítve egyedi géneket és jellemezve kapcsolódásukat a polimerázzal, több laboratóriumban, többszörösen bizonyították ben az RNS-polimerázzal kapcsolódó DNS-darabokat még in vivo radioaktívan jelölt ( 3 H) és mechanikai hatásokkal összetört baktérium DNS oldatából kellett kiszűrni, majd az rdns mennyiségét ugyancsak in vivo jelöléssel radioaktívvá ( 32 P) tett rrnshibridizációval meghatározni. A polimeráz és a riboszómális promoterek kapcsolódása több mint egy évtizeden át szolgált érdekes kérdésekkel a Nukleinsav Munkacsoport tagjainak. Számomra is, akinek az idézett cikk az egyik első különlenyomat alakjában (!) kézbevett tudományos közleménye volt. A fejlődő módszerek változatos kombinációit alkalmazva végül meghatároztuk a promóterek szerkezetét és bizonyítottuk, hogy az valóban önmagában biztosítja az RNS-polimeráz preferenciális kapcsolódását és a gyakori transzkripcióiniciációt (1. ábra). A klónozás, nukleotidsorrend-meghatározás, in vitro transzkripció, a fehérje-dns kölcsönhatás kimutatása és hasonló kísérleti megközelítések akkoriban szinte megszületésükkel egyidejűleg a csoport technikai arzenáljának részévé váltak. Azt, hogy a szokásos E. coli promóterszekvenciák előtt elhelyezkedő AT- 63

64 Biokémia 64 gazdag nukleotidrészlet a promótert különösen erőssé teszi, ma is az rrnb riboszóma RNS gén promóterének példájával említik a tankönyvek. A B C 1. ábra. A: Elektronmikroszkópos felvételen láthatóvá tehető az E. coli RNS-polimeráz molekulák kapcsolódása rrns gén szabályozó részéhez (Kiss Ibolya felvétele, 1978) B: Az E. coli rrns gének átírását két erős promóter biztosítja, amelyekről tisztított RNS-polimerázt használva, kémcsőben is kimutatható az RNS-képződés. A kép akrilamid gélen elválasztott radioaktív RNS-minták autoradiográfiája. P: promóter, T: terminátor. (A nyolcvanas évek elején munkabeszámolón használt fólia saját archívumból ) C: A génsebészeti eljárással represszálhatóvá és indukálhatóvá alakított rrns gén promótere expressziós plazmidba építve nagy mennyiségű idegen fehérje (pl. humán inzulin, HIV proteáz) termelését biztosítja E. coliban. Bal oldalon a szabadalmaztatott expressziós plazmid térképe a fontos részek jelölésével. Jobb oldalon elektroforézissel elválasztott baktériumfehérje-minták. A 3. sz minta erős csíkja a termelt idegen fehérje. (Boros I: kandidátusi dissz. 1984) A rrns gén promótereinek megismerése lehetőséget adott gyakorlati alkalmazásukra is. Néhány trükkel a hosszú és ezért instabil rrns gént kezelhetővé rövidítettük, a kóbor transzkripció lehetőségét terminátorokkal kizártuk és indukálhatóságot biztosító részeket kapcsolva hozzájuk a baktériumsejt e legerősebb promótereit hatékony expressziós vektorok részeivé alakítottuk. Ez igazi génsebészet volt potenciális üzleti lehetőségeit azonban elmulasztottuk kihasználni! A baktérium rrns gének vizsgálatával a transzkripció szabályozásáról felhalmozott adataink hozzájárultak és illeszkedtek a nyolcvanas évek elején e kérdésben elfogadott szemlélethez: egy specifikus nukleotidsorrend és egy ahhoz kapcsolódó fehérje (az adott estben az RNS-polimeráz) alapvetően meghatározza a génműködés intenzitását. De a nyolcvanas évek derekára már egyre nyilvánvalóbbá vált, hogy az elefánt e tekintetben is más, mint a coli. Felfedezték az enhancereket, szekvenciaspecifikusan DNS-t kötő fehérjecsaládokat írtak le és megkerülhetetlenné vált annak tekintetbe vétele, hogy egy DNSdarabon egyidejűleg egynél több fehérje is éreztetheti hatását. Ilyen esetre kínált példát a CREB (camp response element binding) fehérje és a humán T-sejt leukémia vírus (HTLV) transz-aktiváló faktorának (Tax) az esete. A kérdés misztériumát az adta, hogy a Tax fehérje nem kapcsolódik DNS-hez, mégis csak a promóterükben meghatározott nukleotidsorrendet tartalmazó gének egy részének működését fokozza. A HTLV és vele rokon BLV különös működésű Tax fehérjéi és a hatásukat közvetítő víruspromóterek kapcsolatának problémáját az NIH-ből importáltuk. A megoldást is hozzá az Intézetre mindig jellemző kiterjedt nemzetközi együttműködésben találtuk meg: az SZBK ITC programból Amerikába exportált, thaiföldi munkatárssal mutattuk ki, hogy a Tax fehérje érzékeli, hogy a CREB kapcsolódása meghajlítja a DNS-t. A DNS-CREB dimer a hajlítás irányától függően lehet közömbös, vagy kínálhat kapcsolódási pontot a Tax fehérje számára (2. ábra). A CREB-DNS dimerek egy részének szerkezete olyan, amilyenhez a Tax képes kötődni pedig különkülön a dimer egyik alkotójához se, ha pedig kapcsolódik, akkor fokozza a polimeráz működését. Így érthető a trükk, amivel a vírus egy DNS-hez nem is

65 kötődő fehérjét használva, DNS-szekvenciától függő génaktivációra képes. A transzkripciószabályozás logikáját tekintve: ebben az esetben két fehérje sajátos szerkezetű kapcsolódása egy DNS-részlethez biztosítja, hogy több száz CREB kötőhelyet tartalmazó gén sokaságából csak annak a néhánynak a transzkripciója aktiválódik, amelyek a vírus szaporodásához fontosak. A vírussal fertőzött beteg tragédiája, hogy ez számára a fehérvérsejtek túlzott szaporodását jelenti. enzim, az új ezred első éveiben gyorsan megfogalmazásra került a hisztonkód-hipotézis. A hipotézis szerint a nukleoszómafehérjék N-terminális végeinek módosítási mintázata jelzésként szolgál. A jelzések, melyeknek egyik része folyamatosan változik, míg más része osztódáskor sejtről-sejtre átadódik, a transzkripciót végző fehérjék számára egy kód szerint értelmezhetők. Az acetil-, foszfát-, metil- és további módosító csoportok meghatározott kombinációi egy gén aktivációját, a módosítások egy másik kombinációja gátlását jelezheti. A módosításokat kód-író fehérjekomplexek hozzák létre és kód-olvasó komplexek értelmezik. Egyes kód-író komplexek szerepének és összehangolt működésének feltárásához a Biokémiai Intézet és a Szegedi Egyetem együttműködésével járultunk hozzá (3. ábra). Biokémia 2. ábra. A CREB transzkripciós faktor és a HTLV-1 aktiváló fehérje csak a specifikus nukleotidszekvencia-részletet tartalmazó, egy adott irányba meghajló DNS-darabokhoz képes kapcsolódni. A bemutatott gélen azonos hosszúságú és pontosan azonos nukleotid-összetételű DNSfragmentumok elválasztása történt. A CREB fehérje kötődési helye az egyes fragmentumokban azok végétől számítva más-más pozícióban van, ezért a létejövő hajlás miatt eltérő a molekulák végeinek távolsága, ami miatt eltérő az elmozdulás a gélelektroforézis során. Az inszert sematikusan mutatja a hajlás helyzetét az egyes fragmentumokban (saját nem közölt adat, 1993). Bármilyen szép eredményeket is adott egy-két tisztított fehérje és a DNS kölcsönhatásának jellemzése, az ezredfordulóra megyőződéssé vált a területen dolgozókban, hogy a kémcsőben végzett reakciókból valami lényeges hiányzik. Azért nem tudunk kémcsőben szabályozott eukarióta transzkripciót megvalósítani soha nem sikerült az enhanszer erősítő hatását in vitro kimutatni, mert a rendszer leegyszerűsítésével valami fontos komponensét elveszítjük vagy megváltoztatjuk. Egyre nyilvánvalóbbá vált, hogy a gének helyes működésében szerepet játszik az is, hogy hogyan van összecsomagolva a temérdek DNS a sejtmagban. Felismerték a nukleoszómák és módosításaik szerepét a transzkripció szabályozásában. Miután egy ismert transzkripciós faktorról kiderült, hogy az egyben egy nukleoszómamódosító 3. ábra. A Drosophila lárva nyálmirígyek óriáskromoszómáin láthatóvá tehetők az aktívan átíródó gének. A felső képen DNS-festékkel (orcein), az alsón trimetilguanozinhez kapcsolódó fluoreszkáló ellenanyaggal festve látható ugyanaz a kromoszómarészlet. Az ellenanyag a transzkripcióban képződő RNS-molekulák módosítását végző komplexhez kapcsolódik. Vegyük észre, hogy az alsó kép erősen festődő az éppen folyamatban levő transzkripció helyeit jelző csíkjai nem a felső kép erősen festődő csíkjainak felelnek meg. Azaz ott folyik transzkripció, ahol a DNS laza szerkezetben van, a fehérjék számára hozzáférhető (Komonyi O. felvétele, 2005) Az ecetmuslica óriáskromoszómáit fluoreszkáló ellenanyagokkal festve láthatóvá tettük, hogy a nukleoszómák hiszton3 és hiszton4 fehérjéinek meghatározott lizin oldalláncaira más-más fehérjék raknak acetilcsoportokat és annak más-más a hatása. Eltérően módosítják az egyes hisztonok acetilációi a gének transzkripcióját. A sejt valamenynyi génjének aktivitásváltozását megmérve, azaz teljes transzkriptóm-analízist végezve ami 30 éve még elképzelhetetlen volt, ma rutin módszer, elgon- 65

66 Biokémia dolkodtató megállapításokat lehetett tenni. A változások jelentős része ugyanis nem felel meg annak, amit a hisztonkód-hipotézis alapján várhatnánk. Az acetiláció nem mindig aktiváló hatású, hanem sokszor látszólag gátolja a transzkripciót. Hasonló mértékűnek tűnő acetilációváltozás egyszer a teljes genomra kiterjedő, más esetben csak néhány gént érintő transzkripcióváltozást okoz. Egyes esetekben nyilvánvalóan láthatóvá tehetjük, hogy a hisztonmódosítás és a transzkripció, bár együtt járnak, nem állnak ok-okozati kapcsolatban egymással. A hisztonkód-hipotézissel nehezen magyarázható vagy összeegyeztethetetlen megfigyelések egyre halmozódnak. A mai módszerekkel naponta végeznek genomszintű összehasonlításokat egyes módosítások és transzkripciót szabályozó fehérjék egymáshoz viszonyított elhelyezkedésének kimutatására. Az adatok arra utalnak, hogy a hisztonkód-hipotézis túlzottan egyszerűsítő. A valós állapotot jobban tükrözi talán egy hisztonmódosításokból felépülő szabályozási nyelv elképzelése. A transzkripciószabályozás molekuláris nyelvében hisztonmódosítások mint bővítmények és létrejöttük sorrendje mint szórendi szabályok határozzák meg a jelentést. Mi több, egyes sejttípusok fehérjevariációi mint dialektusok a beszélt nyelvben, finoman árnyalják és ízesítik azt. A gének működtetésének nyelvét most tanuljuk. Még azt se tudjuk biztosan, hogy felismertünk-e már minden írásjelet. Az RNS-ek szerepéről halmozódó újabb és újabb ismeretek arra utalnak, hogy még nem. De már a hiányos nyelvtan ismeretében is egyre olvashatóbbá válik az útikönyv, amely leírja az utat, amit a sejtek differenciálódásuk során megtesznek. A totipotens még mindenre képes sejt egyre szűkülő transzkripciós mintázatot jelentő ösvényen haladva éri el az egyes szövetek differenciálódott sejtjeire jellemző génműködés-kombinációt. Várakozásunk az, hogy ha ezen az ösvényen előbb visszafele, majd újra előre hajtunk sejteket, azaz a génműködésüket specifikus gének aktiválásával és gátlásával módosítjuk, akkor egy már differenciálódott sejtből mindenféle más sejttípust is előállíthatunk. Az addig elvezető megismerés időben várhatóan rövidebb lesz, mint az rdns-rns-polimeráz kölcsönhatás-vizsgálatának kezdete óta eltelt közel negyven év. Bizonyára érdekes lesz, és reményünk szerint a Biokémiai Intézet jelenlegi és majdani munkatársai számára a felfedezés izgalmaiban is bővelkedő. Boros Imre 66

67 Stressz, stresszbetegségek, lipidterápia Biokémia Azt, hogy a környezetünkből számos károsító hatás éri szervezetünket, mindannyian tudjuk, sőt érezzük a saját bőrünkön: versenyt futunk az idővel, rágódunk, mert igazságtalan velünk a főnökünk, szívjuk a dohányfüstöt és a járművek kipufogógázát, túl sokáig napozunk, húst eszünk hússal és mértéktelenül nassolunk, alkoholt iszunk örömünkben, bánatunkban. Azonos életvitel mellett van, akinek mindettől kutya baja, más viszont megbetegszik rákban, cukorbaja vagy infarktusa lesz. Hogy ennek mi lehet az oka? Eddig többnyire genetikai magyarázatot adtak erre a szakemberek. A membránkutatás legfrissebb fölfedezései azonban új irányt szabtak a fenti vizsgálódásoknak és napjainkra forradalmasították a stresszkutatást. Az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpontja Biokémiai Intézetében, a néhai Farkas Tibor akadémikus alapította membránlipid-iskola eredményeire alapozva a Vígh László által a nyolcvanas évek közepétől vezetett Molekuláris Stresszbiológia Csoport kutatói azt vizsgálják, hogy a stressz miként alakul át jellé, amely parancsot küld a génállománynak a sejtvédő fehérjék (az ún. stresszfehérjék vagy dajkafehérjék) elkészítésére, azaz miképpen jön létre a stresszadaptáció. Nemrégiben megdőlt egy korábbi tévhit: a biokémikusok eddig ugyanis azt hitték, hogy a sejt olyan, mint egy ház, amely körül a sejtfelszíni membrán a kerítés. Olyan kerítés, amelynek cölöpjei zsírszerű anyagok, a lipidek. Kiderült azonban, hogy a kerítés része a háznak, a cölöpök pedig az épület egyedi berendezési tárgyai. A sejtnek több ezer lipidmolekulája van, és a nagyszámú, különböző szerepű lipidmolekula alkot egy végtelen kombinációs lehetőséget kínáló rendszert. Miután a technikai fejlődés lehetővé tette ezek azonosítását, igazolódott az a korábbi gyanú, hogy a lipidek ezrei önálló hatásúak, melyekhez saját funkció kapcsolható. A membránok lipidjeinek olyan alapvető szerepe van, mint pld. a sejtfelszíni receptorok, az ioncsatornák, az energiatermelésben érintett enzimek működésének szabályozása, a különböző immunbiológiai folyamatok irányítása. Alapvetőnek tűnik az a felismerés is, hogy a nagy számú lipidmolekula nem önállóan, környezetétől független módon működik, hanem a szomszédos lipidekkel és a membránba ágyazott fehérjékkel kölcsönhatásba lépve látja el feladatát. Azaz a membrán lipidszabályozás alatt áll, ami azt is jelenti, hogy ha elromlanak egyes lipidjeink, elromlik az általuk szabályozott sokféle membránfunkció is. Mindez miként függ össze mindennapi stresszeinkkel, az általuk okozott betegségekkel? Stressztűrő képességünket alapvetően meghatározza az, hogy a lipidek és a lipidekbe ágyazott fehérjék egymással kölcsönhatásban működnek. Azt eddig is tudtuk, hogy a stresszválasz nagysága, minősége függ a membránok fizikai állapotától, amit főleg a lipidek szabályoznak. Ez univerzális tulajdonság, a növényi, állati, emberi sejtre egyaránt jellemző. Ugyanakkor a lipidek szerepe rendkívül egyedi is: szövetenként, sejtenként, sőt membránonként különbözik. A lipidek diverzitása jól tükrözi például az élőhely, a földrajzi elhelyezkedés stresszviszonyait, egyedi mintázatuk felismerhetővé teszi a hőmérséklet, az ultraibolya sugárzás vagy a betegségek okozta károsodásokat. Ez az univerzalitás és a specifikáció együtt azt jelenti, hogy a lipideknek óriási jelentőségük van az élet működésében és szabályozásában. Gondoljuk el: ha belázasodunk, és a 37 fokos emberi sejt 40 fokosra melegszik föl, a sejtjeink beindítanak olyan védekező mechanizmusokat, amelyekkel a lázat kiváltó baktériumot vagy vírust képesek elpusztítani, és olyanokat is, amelyek a sejtet mindeközben óvják, hogy elviseljék a magas hőmérséklet okozta megpróbáltatást. Erről a védelemről a stresszfehérjék gondoskodnak. Ezt bizonyítja, hogy ha mesterségesen transzgenikus úton vagy gyógyszerrel - túltermeltetjük azokat, akkor jelentősen lehet javítani a szervezetek stressztűrő képességét. A Vígh László vezette csoport munkatársai hoszszú éveken át arra keresték a választ, hogy a legkülönbözőbb eredetű stressz miként alakul át jellé, amely azután parancsot küld a génállománynak, hogy lásson hozzá a sejtvédő a stresszadaptációt, a stresszel szembeni védelmet megalapozó dajkafehérjék termeléséhez. Arra a felismerésre jutottak, hogy a stressz érzékelésben a membránok bizonyos 67

68 Biokémia 68 lipidjei képesek speciális szenzorokként, érzékelőként működni. Azaz, a membránok molekuláris kapcsolókként viselkednek, a stressz bizonyos küszöbértékét fölfogják és beindítják a stresszválaszt. Ráadásul a képződő stresszfehérjék egy része képes ugyanezekhez a stresszérzékelő membránokhoz kötődni, és a szenzorfunkciót negatív visszacsatolással csillapítani (1. ábra). 1. ábra Még szemléletesebben, ez a kapcsoló olyan rádiógombhoz hasonlítható, amellyel nemcsak ki-be kapcsolni, de hangosítani és halkítani is lehet a hangot. Erre azért van szükség, mert a kor előrehaladtával vagy számos betegség esetén egyre kevésbé fogjuk a vészjeleket, föl kell erősíteni azokat, hogy a védekező mechanizmus meghallja az S.O.S. üzeneteket és akcióba kezdhessen. Ám meglepő módon a rákos beteg kórosan felerősítve érzékeli a külvilág stresszeit, amit a túl magas dajkafehérje-szint jól igazol. Ahhoz, hogy a stresszérzékelő membránok működését megértsük, egy korszerű, gyors, megbízható analitikai eljárás, az ún. lipidomika kifejlesztésére volt szükség. A lipidomika segítségével rövid időn belül követhető, hogy a teljes élő sejtben például a hőmérséklet extrém módosítására, dohányfüstre vagy károsan magas UV-sugárzásra miként változik az egész lipidállomány, illetve, hogy a környezeti stressz hatására milyen sokszor éppen lipideredetű jeltovábbító molekulák képződnek. Akár a genomika vagy a proteomika, a lipidomika távlatai is beláthatatlanok. Főként a diagnosztikában nyílhatnak eddig ismeretlen lehetőségek. Ezzel a módszerrel vérből, emberi szövetből lipidek ezrei vizsgálhatók egyszerre, viszonylag rövid idő alatt. A különböző betegségek az egészséges ember lipidés membránmintázatától eltérő változásokat idéznek elő, ami ily módon mérhető. Az eddigi kísérletek megalapozzák az egészségügyi alkalmazás vázolt lehetőségét. Miként a genetikai elváltozások szolgálhatnak egyes betegségek ujjlenyomataként, ugyanúgy a membránjainkban található lipidek rendellenességei is utalhatnak bizonyos kóros állapotokra. Létezik olyan lipidösszetétel-beli eltérés, amely már évekkel a tünetek jelentkezése előtt lehetővé tenné a később létrejövő betegség prognosztizálását. A szegedi kutatók összegyűjtötték pl. a cukorbetegséggel (diabétesz) együttjáró markáns lipidelváltozásokat, amelyek a sejt membránjában levő inzulinreceptorok működésében okoznak zavarokat. Ha felismerjük ezeket a membránelváltozásokat, megnyílik az út a kettes típusú cukorbetegség elleni új orvosságok fejlesztésére. A kettes típusú cukorbetegség vagy az Alzheimer-kór ugyanis részben lipidbetegség: ilyenkor a sejt néhány ezer féle lipidmolekulájából akár csak 5-10 elromlik vagy rossz helyre kerül a sejtjeinkben. Azt egyelőre nem tudjuk, miért válik súlyossá bizonyos neurodegeneratív betegségben szenvedők állapota idősebb korban, vagy miért van esély azok kialakulására akár esztendősen. A föltételezés szerint ebben is döntő szerepe lehet a sejtjeink membránjaiban végbemenő lipidösszetétel-módosulásnak. Vígh és munkatársai laboratóriumban genetikusan cukorbeteggé tett patkányokat kezeltek különféle gyógyszerjelöltekkel, majd szívszövetüket analizálva megállapították, hogy mely molekulacsalád hatásos a diabétesszel együttjáró kóros membránlipidprofil helyreállításában. De a kutatók a kezelt állatok egyedi viselkedéséről is képet kaptak. Ezek az eredmények hozzájárulhatnak a ma egyre népszerűbb személyre szabott gyógyszerezés kifejlesztéséhez is, hiszen tudjuk, hogy nem mindenki reagál egyformán bizonyos hatóanyagokra. Egy fölmérés szerint csak az USAban százezrek halnak meg az univerzális gyógyszerezés miatt: a klinikák és a kutatói világ együttműködésével, megfelelő adatbázis létrehozásával személyre

69 szólóan kidolgozható, hogy az illető sajátos mintázatú lipidállománya alapján bizonyos betegségei kezelésére milyen gyógyszerkombináció alkalmazása a legmegfelelőbb. Ugyancsak reményt keltő a lipidomika pl. az érelmeszesedés vagy a szívinfarktus veszélyének igen korai fölismerése, s a gyógyítás optimális lehetőségének a meghatározása szempontjából is. Visszatérve a bevezetőben mondottakra, a környezet, az életmód, például a helytelen táplálkozási szokások is lenyomatot hagynak membránjaink lipidmintázatán. A megfelelő diéta alkalmazása után, már néhány hét elteltével ellenőrizhető lehet a tudatosan megválasztott étrend áldásos hatása. Hogy valóban mennyire fontos egyik vagy másik lipidmolekula (pl. a sokat emlegetett omega-3 zsírsavakban gazdag lipidek) az egészségünk megőrzése szempontjából, azt ma már senki nem vonja kétségbe. Sőt, ez a szemlélet megvetette az alapjait egy új gyógyító eljárásnak, a lipidterápiának. Szemben a hagyományos farmakoterápiával, a lipidterápia (2. ábra) amely a Vígh csoport egyik legfontosabb jelenlegi kutatási profilja két fő irányáról beszélhetünk. 2. ábra Egyrészt, a sejtmembránjainkba célzottan olyan membránlipideket vagy lipidszármazékokat juttatunk, amelyek a membránjainkba épülve képesek korrigálni azok elromlott funkcióit. A természetes táplálékainkban előforduló olajsav (legtisztább forrása a közismert olívaolaj, a mediterrán diéta lelke) bizonyos származékaival végzett laboratóriumi és klinikai tesztek tipikusan ilyen célokat szolgálnak. Ahogy azt egy spanyol kutatócsoport nemrégiben igazolta, az említett lipidek táplálékkal való bevitele képes átállítani a membránokban bizonyos lipidkapcsolókat, és ez által ígéretes a rákterápiában, a magas vérnyomás kezelésében. A lipidterápia másik megközelítési módjának viszont az a lényege, hogy a szervezetbe a membránlipidjeinkkel speciális kölcsönhatásra képes, gyógyszerjelölt kismolekulákat juttatunk. Ilyen lipidterápiás molekulák (pl. az ún. hidroximsavak, mint a bimoclomol, arimoclomol, stb.) mechanizmusának felderítésében, kifejlesztésében a Vígh csoport közel húsz éve aktívan részt vesz. Olyan gyógyszereket kívánnak kifejleszteni, amelyek nem károsak a szervezetre, ám a szervezet megbomlott stresszfehérje-egyensúlyát membránkölcsönhatásaik révén képesek fenntartani. Tipikusan egy rizikócsoportba tartozó embereknek akik pl. túlsúlyosak, 40 év felettiek, sok környezeti stresszhatásnak vannak kitéve érdemes lenne az ilyen gyógyszereket akár preventív módon is szedni. Az ún. kettes típusú cukorbetegség előállapota a metabolikus szindróma, ami azt jelenti, hogy elromlik a szervezet inzulinérzékenysége. Ekkor valójában nem az inzulin a kevés, hanem éppen sok, a cukorral együtt, mert az inzulin nem képes kifejteni a hatását az izmokon. Az inzulin ugyanis nem tudja bejuttatni a cukrot a sejtekbe, és ezért halmozódik fel a vérben a cukor. Ennek eleinte szinte alig vannak tünetei, ám ma már tudjuk, hogy a szervezet stresszfehérje-szintje is alacsonyabb a kelleténél. Ez az előállapot preventív módon kezelhetővé válna az új lipidterápiás gyógyszerekkel, a stresszfehérje-egyensúly helyreállításával. A lipidterápia egyéb területeken is nagy jövő elé néz, gondoljunk csak az öregkorban oly gyakori neurodegeneratív betegségekre. A lipidomikát mint új tudományt az Európai Unió is felvette kutatási programjába, csoportunk pedig 2008-tól egy ilyen, 11 országból verbuvált konzorcium (LipidomicNet) egyik tagja. Csak remélni tudjuk, hogy hamarosan akár a hazai klinikákon is megjelenhet egy új, gyors és olcsó, lipidomikai alapú diagnosztikai módszer. Vígh László Biokémia 69

70 Biokémia Szintetikus biológia: a kólibaktérium (Escherichia coli) áramvonalasítása A kólibaktérium viszonylagos egyszerűsége, könnyű kezelhetősége miatt évtizedek óta a biológusok egyik kedvenc modellszervezete. A Biokémiai Intézet Genommérnöki Csoportjában aprólékos, tervezett genetikai változtatások révén sikerült egy még egyszerűbb, ugyanakkor hatékonyabb sejtet készíteni belőle. A fölösleges genetikai ballaszttól, szükségtelen génektől megfosztott, lomtalanított sejtet tudományos kérdések megválaszolásához és sejtgyárként működtetve ipari alkalmazásokhoz is munkába lehet fogni. Az újkori biológia története valójában nem más, mint az élő anyag egyre kisebb egységeit vizsgáló kutatások sorozata. A populációk, egyedek és szervek vizsgálatát egyre inkább felváltotta a sejtek és a sejtalkotók, majd a kromoszómák és a gének tanulmányozása, végül a múlt század hetvenes éveire eljutottunk az élő szervezetek építőkő-molekuláihoz, s ezzel megszületett a molekuláris biológia. A kilencvenes években a biológia története újabb fordulatot vett: a technikák fejlődésével az építőköveket, molekulákat (géneket, fehérjéket) nemcsak egyesével, hanem összességében is lehetett tanulmányozni ezzel foglalkozik a genomika és a proteomika. Az új lehetőségek hatalmas adathalmazt eredményeztek; ebben próbált rendet vágni, törvényszerűségeket felismerni a bioinformatika, s az egzakt biológiai nyelv létrehozására törekvő rendszerbiológia. S ha már egyes biológiai folyamatokat modellezni tudunk, miért ne próbálkozzunk meg azzal, hogy biológiai alkatrészekből valóban működő rendszereket alkossunk ezzel foglalkozik a szintetikus biológia. A kutatások iránya tehát kezd megfordulni: eddig igyekeztünk mindinkább szétszedni a szervezeteket, most megpróbálkozunk az összerakással, áttervezéssel. Ma már nem csak science fiction regényekben lehetséges rendelésre, hasznos célokra specializált élőlényeket készíteni. Ennek azonban jelenleg csak a legegyszerűbb élőlények, egysejtű baktériumok esetében van realitása. A szintetikus biológia védjegyeként emlegetett mérnöki a dolgok működési mechanizmusát kutató, s ehhez eszközöket, módszereket fejlesztő megközelítés a kezdetektől jelen volt a Biokémiai Intézetben folyó kutatásokban. A genetic engineering (rekombináns DNS) technikák hajnalán központi szerepet játszott az élő sejtet meghatározó DNS-molekula szabás-varrása, és az ahhoz szükséges enzimek kutatása, használható formában történő tisztítása. A Venetianer Pál vezette Nukleinsav Csoport tagjai nemzetközi hírnevet szereztek a DNS-vágó restrikciós enzimek felfedezésében, kutatásában. A csoport tagjai módszereket dolgoztak ki az enzimek génjeinek klónozásához, a fehérjék tisztításához, nem egyszer házi barkácsolású eszközöket használva. A Genommérnöki Csoport az elmúlt évtizedben tulajdonképpen ennek az örökségnek a folytatója: a genomika eredményeinek felhasználásával a DNS szabás-varrást fejlesztette újabb szintre, s a baktérium teljes genetikai anyagának tudatos átszabását valósítja meg. Szintetikus biológia: az alkalmasan módosított kólibaktérium egyszerű tápanyagokból gyógyszereket, táplálékkiegészítőket, ipari alapanyagokat termel. 70 Mérnöki megközelítés Túl sokoldalú A kólibaktérium, tudományos nevén Escherichia coli sok más baktérium mellett mindannyiunk bélrendszerében megtalálható. Sokféle változata létezik,

71 amelyek többnyire hasznosak szervezetünk számára, de akadnak betegséget okozó variánsok is. Jól tanulmányozható modellszervezetként e baktérium a tudomány számára is igen hasznosnak bizonyult; amit ma a sejtműködés alapvető folyamatairól tudunk, azt főleg a kólibaktériumon végzett kutatásoknak köszönhetjük. Genetikai anyagába (génjeibe) bele is tudunk nyúlni, kisebb módosításokat régóta végeznek rajta a kutatók. Ennek köszönhetően a biotechnológiai ipar sok mindenre felhasználja: inzulint, növekedési hormont, táplálékkiegészítőket, vakcinákat, sőt műanyagokat készíttetnek az E. colival. Ilyen célra eddig a természetből kölcsönvett baktériumot használták, amelyen csupán kisebb, a kívánt anyag termelését lehetővé tevő speciális genetikai módosításokat alkalmaztak. Mi viszont azzal próbálkoztunk, hogy a kólibaktériumon egy általános nagyjavítást végezzünk, és tervszerű átalakítással (elsősorban egyszerűsítéssel) még hasznosabbá tegyük. Tévedés lenne azt gondolni, hogy ez a baktérium egy primitív, ősi élőlény. Kétségtelenül sokkal egyszerűbb, mint egy állati vagy növényi szervezet, de ugyanúgy többmilliárd éves evolúció van mögötte, és ugyan másféle stratégiával, de hatékonyan működik, és változatos környezeti hatások között is rendkívüli túlélési képességeket mutat. Éppen ez a természetben szükséges sokoldalúság az oka, hogy még ez az egyszerű sejt is sok szempontból túlságosan bonyolult a kutatók számára. Bár a genetikai tervrajzát betűről betűre kiolvasták már, még mindig sok az ismeretlen funkciójú részlet, a váratlan reakció, és a baktériumsejt sokszor nem akarja azt csinálni, amire késztetni szeretnénk. Mivel a lombikban nincsen szükség a sokoldalúságra, felmerült, hogy a nem létfontosságú genetikai komponensek kiszerelésével egy jobban kezelhető, az erőforrásokat fölösleges folyamatokra nem pazarló sejtet készíthetünk. Kóli-lomtalanítás A kólibaktérium működéséhez szükséges információ egyetlen hosszú DNS-molekulában kromoszómában van kódolva; a kódolási egységek a gének. A sejt élete során újra meg újra lemásolja ezt a kromoszómát, és eközben kijavítja az esetleges sérüléseket. Korábbi munkáink során olyan eljárásokat dolgoztuk ki, amelyekben pontosan tervezett, szintetikus DNS-darabkákat juttatunk a sejtbe. Ezek aztán a sejt saját javító-másoló mechanizmusaival együttműködve elvágják, majd összeragasztják a kromoszómát, kiejtve közben a megcélzott géneket. Sokszor ismételve a folyamatot újabb és újabb géneket lehet eliminálni a kromoszómából. A sejt ezek után már a rövidített kromoszómát fogja másolni. Nem triviális feladat meghatározni, hogy a kólibaktérium mintegy 4500 génjéből melyeket lehet eltávolítani anélkül, hogy a sejt működése sérülne. Az ezredforduló táján már három kóliváltozat teljes genetikai tervrajza rendelkezésünkre állt. Ezek összehasonlításakor szembeötlő volt, hogy a variánsok más-más génkészlettel rendelkeznek. A gének egy része mindegyikben gyakorlatilag azonos formában megtalálható, más gének viszont csak az egyik vagy másik variánsban fordulnak elő. Az volt a hipotézisünk, hogy a közös gének bizonyára az alapvető életfolyamatokhoz kellenek, azaz nem nélkülözhetők, a többi viszont csak az illető variáns speciális életkörülményei között jut szerephez. Az alapjáraton, lombikban működő sejt tehát csupán a közös kóligéneket igényli. Ennek alapján mintegy 1000 gént büntetlenül el lehetne távolítani a sejtből. Ezek közé tartoznak a legtöbb sejtben nagy számban megtalálható ugráló gének, amelyek képesek a kromoszóma egyik pontjáról a másikra átugrani. Ha ezek a mozgékony genetikai elemek egy működő génbe ugranak bele, megzavarhatják a kód leolvasását, vagyis a gén működését. A kólisejtben 44 ilyen ugráló gén volt, ezektől mind megszabadítottuk a sejtet. A megtisztított sejt segítségével kimutattuk, hogy az ugráló géneknek nagy szerepe van a sejt genetikai változékonyságában. Ez a változási képesség jól jöhet a természetben, ahol folyton különféle környezeti kihívásoknak van kitéve a sejt. A lombikban vagy ipari fermentorban azonban az ugráló gének okozta változások kellemetlenek lehetnek: a fáradságos munkával létrehozott, idegen géneket hordozó, és ezáltal például gyógyszeralapanyagot termelő baktériumban elronthatják a termelés szempontjából fontos géneket, leállítva a kívánt termék gyártását. Az ugráló gének kiiktatásával ez a veszély megszűnt. A többéves munka eredményeként 740 gént töröltünk a kólibaktérium genetikai tervrajzából. Ehhez Biokémia 71

72 Biokémia 43 kisebb-nagyobb kromoszómarészletet távolítottunk el, vagyis ennyiszer kellett ismételni a DNSkivágás folyamatát. Bár a baktériumok bajnokai a gyors átalakulásnak (mutálódásnak), ennyi változás természetes körülmények között igen hosszú időt venne igénybe. Azt mondhatjuk, hogy 5 millió évnyi evolúciót valósítottunk meg 5 év alatt, ráadásul irányítottan, precíz tervezés alapján. Miniatűr sejtgyár Persze minden egyes lépés után ellenőrizni kellett, jól működik-e még a sejt. Ugyanis akármennyire ismerjük a kólibaktériumot, nem lehetett pontosan megjósolni, hogyan viselkedik majd a módosított sejt. Várakozásaink végül beigazolódtak: az egyszerűsített sejt éppen olyan jól szaporodik, mint az eredeti. Ráadásul bizonyos hasznos tulajdonságokban túl is tesz rajta: egyes felszíni struktúráinak eltávolítása miatt könnyebben felveszi a genetikai módosításokhoz szükséges DNS-darabokat, mutációs képességeinek megnyirbálása miatt kevésbé változékony, és jobban tolerálja, ha idegen anyagokat akarunk termeltetni vele. Az egyszerűsített kólisejtet máris több biotechnológiai cég használja termékei gyártásához. S bár nyilván nem lesz egyformán alkalmas minden feladatra, jónéhány esetben már most igencsak jók a tapasztalatok. Egy DNS-vakcinákat gyártó cég például a korábban alkalmazott kólibaktériumnál mintegy tízszer hatékonyabbnak találta egyszerűsített sejtünket. A laboratóriumban tovább folytatjuk a génkiejtési munkát. Célunk, hogy egy szinte minden alkotórészében, minden működési folyamatában ismert mesterséges sejtet alkossunk. Ennek viselkedését egészen pontosan lehetne tervezni, programozni, így a sejt egy olcsó és környezetbarát, miniatűr sejtgyárként működhetne. Variánsaival hatékonyan lehetne ipari alapanyagokat készíttetni, környezetszennyező anyagokat lebontatni, energiahordozókat termeltetni. Sőt, a mesterséges sejtet számítógépen modellezve egy virtuális sejtet építhetünk, amely aztán a drága és lassú valódi kísérlet helyett akár egy gyógyszer virtuális tesztelésére is bevethető. A kólisejtet leíró számítógépes modellek már ma is léteznek, ám a sejt bonyolultsága miatt egyelőre csupán a folyamatok részleges leírására alkalmasak; a kólibaktérium 4500 génjéből alig 1000-et vesznek figyelembe. Miközben a bioinformatikusok, rendszerbiológusok egyre több gént építenek a modelljükbe, mi egyre több gént ejtünk ki az eredeti baktériumból. A kétféle megközelítés félúton találkozhat, s akkor megszülethet a teljes, élethű virtuális sejt, melynek számítógépen kalkulált tulajdonságait mindjárt tesztelhetjük is a valódi sejten. A munka nemzetközi együttműködés eredménye. Szegeden, az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Biokémiai Intézetében Pósfai György csoportja (Szalkanovics Ágnes, Fehér Tamás, Umenhoffer Kinga, Vitaliy Kolisnychenko, Karcagi Ildikó, Balikó Gabriella, Győrfy Zsuzsa, Draskovits Gábor, Csörgő Bálint, Tímár Edit) végzi a sejtegyszerűsítési munkát, amelyhez amerikai partnereik (Frederick Blattner és munkatársai) főként bioinformatikai segítséget nyújtanak. Pósfai György 72

73 Genomika, rendszerbiológia és evolúció Evolúciós Rendszerbiológiai Csoport Web: Biokémia Bevezetés A géntérképezési eljárások automatizálásának és az internetes adatbázisok megjelenésének köszönhetően hatalmas mennyiségű molekuláris információ vált elérhetővé a biológusok számára. Különösen sokat köszönhet e tudományos forradalomnak az evolúcióbiológia. A molekuláris adatok hagyományos alkalmazása elsősorban populációgenetikai elméletek ellenőrzését és törzsfák szerkesztését jelentette egy-egy gén alapján, de ma már teljes genomok elemzésére és összehasonlítására is lehetőség nyílt. Ennek hatása kettős. Egyrészt számos korábbi kérdés vizsgálata kifinomultabbá válhatott. Például az új, nagy számú génen alapuló törzsfák megbízhatóbbak a korábbi, egyedi génen alapuló rekonstrukcióknál. Több szekvencia birtokában szintén mélyebb betekintést nyerhetünk olyan klasszikus problémákba, mint az adaptív és neutrális evolúció viszonya vagy az új gének születése. Másrészt a frissen feltárt, korábban kevéssé ismert genomi jellegek evolúciós magyarázatot kívánnak: vajon véletlen folyamatok vagy a természetes szelekció formálja a genom olyan tulajdonságait, mint a gének egymáshoz viszonyított elhelyezkedése, a kodonhasználat, a mutációs gyakoriság genomon belüli eloszlása vagy éppen az intronok mérete? Az evolúcióbiológia nem csupán passzív befogadója a hirtelen elérhetővé vált genomi adatoknak, ugyanis az evolúciós mintázatok vizsgálata a genetikai elemek funkciójáról is felvilágosítást adhat. Jó példa erre az az eljárás, amely közeli fajok genomjának összehasonlításával, fiziológiai információ felhasználása nélkül képes megjósolni gének és genetikai szabályozó elemek jelenlétét. A genomikai és poszt-genomikai forradalom hatása az evolúcióbiológiára Az elmúlt években nem csupán a genomikai adatok mennyisége öltött ipari méreteket. A laboratóriumi technikák automatizálása és új eljárások felfedezése eredményeként ma már lehetőség van számos molekuláris biológiai és biokémiai vizsgálat nagyléptékű elvégzésére is. A teljesség igénye nélkül felsorolunk néhányat ezen új vizsgálatok közül: génexpresszió mérése az mrns szintjén génexpresszió mérése a fehérjék szintjén fehérjék sejten belüli lokalizációja fehérje-fehérje (fizikai) kölcsönhatások listája genetikai interakciók listája génkiütés sejtnövekedésre gyakorolt hatása A nagyléptékű kísérletek mellett új elméleti megközelítések is születtek. Ugyan egy teljes sejt működésének dinamikus modellezése még várat magára, de ma már lehetőség van az anyagcsere mint alrendszer realisztikus szimulációjára. A modellek sikeresen jósolják meg különböző genetikai manipulációk, mutációk és környezeti változások hatásait. Kiemelten fontos, hogy hasonló modellek lehetőséget adnak arra is, hogy az evolúciós adaptáció hátterét megértsük. Nemrégiben az Escherichia coli baktérium anyagcseréjét vizsgálták egy olyan környezeti feltétel mellett, amelyhez az élőlény evolúciós múltja során nem adaptálódott megfelelően. A modell előrejelzést tett arra vonatkozóan, hogy a hálózat milyen evolúciós végállapotba jut el pontmutációk révén az új környezethez történő alkalmazkodás során. Az elmélet előrejelzéseit szelekciós kísérletekkel in vivo is alátámasztották. Hasonló megközelítések segítségével remélhetőleg mélyebb betekintést nyerhetünk majd az adaptív evolúció mechanizmusába, és az adaptáció során fellépő történeti esetlegességek viszonylagos szerepébe. A következő néhány példa segítségével azt szeretnénk illusztrálni, hogy a DNS-szekvencián túlmutató poszt-genomi adatok milyen lehetőséget kínálnak és egyben milyen új kihívást jelentenek az evolúcióbiológia számára. 73

74 Biokémia 74 Klasszikus evolúciós problémák új köntösben Ugyan a legtöbb funkcionális genomikai adat csak néhány jól kutatott élőlény esetében hozzáférhető, de a metabolikus útvonalak rekonstrukcióját több tucat fajra elvégezték már. Ez lehetőséget biztosít arra, hogy összehasonlíthassuk nagyobb élőlénycsoportok anyagcsere-hálózatának szerveződését. Klasszikus kérdés, hogy hogyan alakulnak ki új funkciójú gének az evolúció során. A funkcionális genomikai adatok birtokában ma már a gének duplikációt követő működésbeli elkülönülése sokkal közvetlenebbül vizsgálható. Például fény derült arra, hogy a duplikálódott gének kifejeződési mintázata jelentősen eltér, ami alátámasztja azt a nézetet, hogy számos evolúciós újítás nem a gének szerkezetbeli, hanem regulációs változásaira vezethető vissza. Szintén régóta próbálják megérteni a biológusok az élőlények komplexitásában mutatkozó különbségeket. A genomok feltérképezése és a gének működésének megismerése nyomán új oldalát is vizsgálhatjuk e régi problémának: Összefügg-e a biológiai komplexitás a gének számával? Egyre inkább úgy tűnik, hogy a komplexitás sem a genom méretével, sem a működő gének számával nem korrelál, hanem sokkal inkább függ a gének közötti funkcionális kapcsolatok menynyiségétől. Neutrális kontra darwini evolúció Számos élőlényben ismerjük, hogy a gének mely kromoszómán, mely más gének közelében helyezkednek el, hogy hány példányban vannak jelen. Tudjuk azt is, hogy a gének, nem kódoló régiók (pl. intronok), mobilis genetikai elemek elhelyezkedése, mérete vagy evolúciós tempója nagy változatosságot mutat különböző élőlények adott genomrégióiban vagy akár egy adott genom különböző régióiban. E tudás birtokában érdemes feltenni a kérdést: mik az evolúciós mozgatórugói ennek a változatosságnak. Döntően a véletlenszerű folyamatok a neutrális evolúció, vagy a darwini szelekciós folyamatok felelősek-e az észlelt mintázatok kialakulásáért? Darwin elméletét hagyományosan olyan morfológiai, fiziológiai és viselkedéstani jegyekre alkalmazták sikerrel, melyeket viszonylag könnyű megfigyelni. Az elmélet kiválóan magyarázza, hogyan és miért alakulnak ki másodlagos szexuális jegyek (pl. a pávatoll), milyen esetben várunk eltérést az 1:1 ivari aránytól, vagy mikor lehet őszinte az állati kommunikáció. Ezzel szemben többen úgy vélik, hogy a genom anatómiáját döntően neutrális folyamatok irányítják. Három érv hangzik el leggyakrabban: a) a genom legtöbb anatómiai jellegzetességének nincs adaptív jelentősége. b) Még ha van is, a szelekciós előny túl kicsi ahhoz, hogy hatékonyan befolyásolja a mintázatot. c) Ha a szelekció hatékony lenne is, a variánsok csekély száma miatt az adaptív evolúció limitált. Valóban, a legtöbb fiziológiai és anatómiai bélyeggel összehasonlítva a genom anatómiája esetén nincs egyértelmű indítékunk feltételezni, hogy az adaptív evolúció terméke. Miért kellene például egyes géneknek egyik vagy másik kromoszómán, esetleg egymáshoz közel elhelyezkedniük? Hogy kizárhassuk a neutrális evolúció szerepét (melyet minden esetben célszerű nullhipotézisként kezelni), olyan statisztikai eljárásokat kell kidolgozni, melyekkel mérhető a random változásoktól való eltérés mértéke, és így közvetve a szelekció jelentősége is. A fenti érvelést a kodonhasználaton keresztül mutatjuk be. A genetikai kód egyik alapvető sajátsága, hogy több rokon kodon is ugyanazt az aminosavat kódolja. Ennek megfelelően egyes mutációk kodont igen, ám a kódolt aminosavat nem változtatják meg. Ezeknek az ún. szinonim mutációknak látszólag nincs adaptív jelentőségük, minthogy a kódolt fehérje sajátságai változatlanok maradnak. Ám ez nincs teljesen így. Az adott aminosavat a fehérjeszintézis helyére szállító trns-ek különböző mennyiségben vannak jelen a sejtben. Ahhoz, hogy a transzlációs folyamat gyorsabban és talán pontosabban menjen végbe, a szelekció előnyben részesíti azokat a kodonokat, melyekhez tartozó trns nagy mennyiségben van jelen. Ám érezhető, hogy egyetlen kodont érintő szinonim mutáció milyen kis mértékben befolyásolja csak az adott gén transzlációját. Ezért érvelhet valaki úgy, hogy az így biztosított szelekciós előny túl kicsi, és így a populáció allélgyakoriságát érintő véletlenszerű folyamatok pl. a genetikai sodródás hatását nem képes ellensúlyozni. Több bizonyítékunk van arra, hogy ez nincs mindig így. Gyakran tapasztalni, hogy azon gének esetében, melyekről igen sok fehérje képződik, a

75 kodonhasználat sokkal jobban eltér a véletlenszerű mintázattól, mint a kevésbé kifejeződő gének esetében. Ez összhangban van a szelekciós értelmezéssel, hiszen a transzláció hatékonysága és pontossága elsősorban az erősen expresszálódó gének esetén fontos tényező. Továbbá a nem véletlenszerű kodonhasználat elsősorban olyan fajok esetén figyelhető meg, ahol a populáció mérete igen nagy. Így szabadon élő egysejtűeknél (pl. az élesztő) vagy rovaroknál (pl. ecetmuslica) gyakori, ám emlősökben igen ritka a kodonpreferencia. Mindez a szelekciós érvelést látszik megerősíteni. Nagy populációméret esetén a variánsok véletlenszerű terjedése jóval lassabb, míg a szelekció jóval hatékonyabb, mint kis populációméret esetén Új kérdések Míg a genomkorszak előtt az új gének eredetét főleg meglévő gének duplikációjával magyarázták, ma már széles körben elfogadott, hogy a baktériális genomok között gyakori a gének utazása, azaz a horizontális génátvitel. Ez természetesen újabb kérdések sokaságához vezet: hogyan és milyen fajok között történhet génátvitel? Mi lesz az átadott gének sorsa? Hogyan függ az átvitel sikeressége az egyes gének funkcionális sajátosságaitól? A legfrissebb vizsgálatok azt mutatják, hogy a horizontális átvitelre leginkább fogékony gének csak néhány, speciális környezetben szükségesek a baktérium túléléséhez, ami egyben azt is megmagyarázza, miért veszhetnek el könnyedén egyes fajokból. Miért vannak nélkülözhetőnek tűnő gének a genomban? A genomban nem csak a nem kódoló régiók szerepének megértése tartogat még kihívásokat a biológusok számára. A genetikai állomány feltérképezése az első lépés egy élőlény génjeinek megismerésében. Egy általánosan bevett stratégia az ismeretlen funkciójú gének elemzésére a génkiütéses kísérletek: a kísérletező egy adott gén kiütéséből eredő fenotípusos változásokból próbál meg következtetni a gén szerepére. Már a legelső szisztematikus vizsgálat meghökkentő eredménnyel járt: az élesztőgomba III-as kromoszómájának feltérképezése során felfedezett új gének többsége mindenféle szembetűnő következmény nélkül törölhető volt a genomból. Fontos megjegyezni, hogy ezekben a kísérletekben egyszerre mindig csak egy gént inaktiválnak, miközben a genom többi része érintetlen 1. A későbbi szisztematikus laboratóriumi vizsgálatok nemcsak élesztőben, hanem más modell élőlényben is alátámasztották a kezdeti megfigyeléseket: a genomban kódolt gének többsége nem esszenciális az élőlény túlélése szempontjából (lásd 1. táblázat). E felfedezések számos izgalmas kérdést vetettek fel az elmúlt években. Mi az oka az eldobható gének jelenlétének? És miért van ilyen sok belőlük? Jelentheti ez azt, hogy az élőlények robusztusak az őket érő genetikai mutációkra? Ha igen, akkor ez a fajta robusztusság miért alakult ki az evolúció során? Folyhatott-e közvetlenül szelekció erre a tulajdonságra, vagy ez csupán mellékterméke valamely más evolúciós folyamatnak? Faj Esszenciális gének aránya Saccharomyces cerevisiae 19% Escherichia coli 16,5% Bacillus subtilis 6,6% Caenorhabditis elegans 7% Haemophilus influenzae 38 47% 1. táblázat. Esszenciális gének aránya genomléptékű tanulmányok alapján. Három fő elképzelés született a nagy számú nélkülözhető gén jelenlétének magyarázatára: a) az élőlények különféle mechanizmusok segítségével kompenzálni tudják egy-egy gén elvesztését, b) a nélkülözhetőnek tűnő gének valójában hozzájárulnak az élőlény túléléséhez, de hatásuk csekély, nehezen mérhető, c) egy adott gén valóban nélkülözhető lehet a vizsgált laboratóriumi környezetben, de más környezetben már nélkülözhetetlen. 1 Lehetlen előállítani pl. olyan élesztőtörzset, amely csak a 19%-nyi esszenciális gént tartalmazza. Ennek egyik oka, hogy a gének egy része csak akkor üthető ki súlyos következmények nélkül, ha más szintén nem esszenciális gének jelen vannak a genomban (kompenzatív genetikai kölcsönhatások vannak bizonyos gének között). A másik ok, hogy a nem esszenciális gének egy részének van parányi fitnesz-hozzájárulása, vagyis kiütésük valamelyest csökkenti a fitneszt. Nyilvánvalóan sok ilyen gén együttes kiütése már jelentősen csökkentheti a fitneszt, még akkor is, ha hatásuk független. Biokémia 75

76 Biokémia Az eddigi kísérleti és összehasonlító elemzések mindhárom magyarázatra találtak több-kevesebb bizonyítékot: a) a több példányszámban jelenlévő gének ritkábban esszenciálisak, b) néhány példa arra utal, hogy a génkiütött törzsek gyakran mutatnak enyhe fitnesz-csökkenést, és c) a vizsgált törzsek némelyike speciális környezeti feltételek mellett nem tudott növekedni. A problémát a közelmúltban alaposabb vizsgálat alá vetettük, és az élesztőgomba anyagcseremodelljére támaszkodva próbáltuk megbecsülni a környezetfüggőség és genetikai robusztusság viszonylagos fontosságát. Úgy tűnik, hogy a legfontosabb magyarázat egyben a legkézenfekvőbb is: a standard laboratóriumi körülmények között nélkülözhető enzimek több mint feléről kiderült, hogy ettől eltérő környezetek valamelyikében már szükségessé válnak, és a kompenzációs mechanizmusok ehhez képest csak másodlagos szerepűek a látszólagos nélkülözhetőség kialakításában. Ez arra utal, hogy a genom mutációkkal szembeni robusztussága elsősorban annak a jelenségnek lehet a műterméke, hogy számos gén csak igen kevés környezetben járul hozzá a fenotípushoz. Utószó Mint azt a nélkülözhetőség problémaköre is szemléltette, az evolúciós genomtan korántsem merül ki a már meglévő populációgenetikai modellek ellenőrzésében. A genom jellegzetességeinek evolúciós megértéséhez egyre nagyobb igény jelentkezik a génműködés formális leírására és általánosságban a genotípus fenotípus leképezés realisztikus modellezésére. Ezen igény kielégítését szolgálhatja a rendszerbiológiai módszerek bevezetése az evolúcióbiológia tudományterületére. Papp Balázs és Pál Csaba 76

77 SZBK Enzimológia Enzimológiai Intézet 1113 Budapest, Karolina út 29. H-1518 Budapest, Pf

78 Enzimológia 78 SEJTARCHITEKTÚRA CSOPORT Ovádi Judit, a Sejtarchitektúra Csoport vezetője, okleveles vegyészként 1967-ben szerzett diplomát az Eötletes és elméleti munkákat, és azok eredményeként hosszú időre meghatározta a csoportban folyó kísérvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Karán. Diplomamunkáját a Magyar Tudományos tották az enzimek ultrastrukturális szerveződésé- megjelent számos nemzetközi publikációt. Bizonyí- Akadémia Enzimológiai (az akkori Biokémiai) Intézetében készítette, akkori munkájából született publi- annak bizonyításához, hogy a kézikönyvek adataival nek funkcionális jelentőségét, ami végül is elvezetett káció Citation Classic lett, az országban az egyetlen, ellentétben a glükózmetabolizmus kulcsenzimei nem amely hazai műhelyből került ki. Még ebben az évben homogén módon oszlanak el a sejt citoplazmájában, felvételt nyert a Straub professzor által irányított hanem dinamikus önszerveződésük révén funkcionális szereppel bíró mikrokompartmentumokat hoznak Karolina úti intézetbe, ahol jelenleg is dolgozik mint habilitált kutató professzor, tudományos tanácsadó. A létre, amelyek révén hatékonyabb katalízisre és regulációra válnak képessé. A jelenség makroszkopikus neves intézet akkori profiljának megfelelően kezdeti munkái elsősorban a glikolitikus enzimek szerkezetfunkció kutatására irányultak. Keleti Tamás munka- mechanizmus felderítésére és kvantitatív leírására. tanulmányozása lehetőséget teremtett a channeling csoportjában lehetősége nyílott az enzimkinetika és Ezek a kutatási eredmények képezték tárgyát a biológiai tudományok doktora disszertációjának, melyet termodinamika alapvető törvényszerűségeinek megismerésére, az azokkal kapcsolatos kutatásokban részt 1985-ben védett meg. Kutatási eredményeinek nemzetközi elismerését jelzi, hogy Ovádi Judit felké- venni, aminek eredményeképpen számos, az anyagcsere-szabályozással kapcsolatos törvényszerűség rést kapott többek között egy provokatív összefoglaló megírására, melyet mintegy 30 hírneves szerző kidolgozásában meghatározó szerepet játszott. E téma képezte kandidátusi disszertációjának alapját, melyet kritikai írása követett: Physiological significance of 1973-ban sikeresen védett meg. intermediate channelling J. Theor. Biol. (1991) 152, 1973/74-ben UNESCO ösztöndíjjal a Római E munkára hivatkozva került az 1997-es kiadású Orvostudományi Egyetemen Fasella professzor laboratóriumában dolgozott, ahol a mitochondriális metabolite channeling mint a glikolízis egyik fon- Lehninger: Principle of Biochemistry kézikönyvébe a enzimek egy új szabályozási mechanizmusának, a tos szabályozási mechanizmusa. Felkérést kapott egy metabolite channeling -nek a vizsgálatába kapcsolódott be. Ez akkor egy kevéssé kutatott, később igen (Ovádi, J. Cell architecture and metabolite channeling). monográfia megírására is, amely 1995-ben jelent meg ellentmondásos kutatási irány volt, aminek fiziológiai relevanciáját több laboratórium vitatta. Ez egy váz egyik fontos komponense, a mikrotubuláris rend- A Sejtarchitektúra Csoport a 80-as években a sejt- enzimrendszerszintű szabályozási forma, ami az szer ultrastruktúráinak és sokrétű funkciójának intermedier metabolitoknak a szekvenciális enzimreakciót katalizáló enzimek kölcsönhatásán, a repének megismerésére, azok molekuláris és rend- fiziológiás és patológiás folyamatokban betöltött sze- metabolitok enzimről enzimre történő közvetlen szerszintű jellemzésére jött létre. A mikrotubuláris továbbításán alapul. Ezek a kutatások már magukban rendszer kutatásához kapcsolódóan, miután annak hordozták a mára divatossá vált System Biology kutatási irány alapjait. zedes kollaborációs kapcsolat alakult ki a kutatócso- alapvető szerepe van a sejtosztódásban, mintegy évti- Hazatérése után 1975-től a glikolitikus enzimek port és a Richter Gedeon gyógyszergyár biszindolkutatással foglalkozó osztálya között. Mint ismeretes, szerveződését vizsgálta, és ennek molekuláris hatásait az energiametabolizmusban kulcsszerepet játszó a mikrotubuláris rendszer által vezérelt mitotikus glikolitikus folyamatokra, valamint az enzimkölcsönhatások szerepét a metabolizmus szabályozásában. Ez szik a tumorgenezisben, a rákos sejtek burjánzá- folyamat szabályozatlan volta alapvető szerepet ját- a téma a Keleti-csoport fő kutatási irányává vált, és sában. E kutatások vezették őket arra a felisme-

79 résre, hogy az anti-mikrotubuláris aktivitással bíró biszindol-molekulák nem kívánt mellékhatásának egyik forrása más intracelluláris fehérjékkel, így pl. a kalmodulinnal való kölcsönhatásuk, s azok funkciójának elvesztése. A kalmodulinnal kapcsolatos kutatásaikat nagymértékben motiválta a Chinoin gyógyszergyárral való, az anti-kalmodulin aktivitással bíró gyógyszermolekulákkal összefüggő kollaborációs kapcsolatuk. A két gyógyszergyári kollaboráció kialakításában és a többéves együttműködés sikerében kulcsszerepet játszott Dr. Keve Tibor (Richter) és Dr. Gaál József (Chinoin). A alap- és gyógyszerkutatás egyik nagy kihívása annak a kérdésnek a megválaszolása volt, hogy a kalmodulin hogyan képes bioszenzorként működve szerteágazó funkcióit, mint kalcium receptor fehérje, szelektíven ellátni. Két különböző kémiai szerkezetű antagonista, egy arilalkilamin (AAA, Chinoin) és egy biszindol (KAR-2, Richter) származék kalmodulinnal alkotott komplexeinek térszerkezetét meghatározták, hatásmechanizmusukat azonosították. Atomi és molekuláris szintű kutatási eredményeik alapján értelmezhetővé vált a KAR-2 komplex rendszerekben kifejtett, csekély mellékhatással párosuló antimitotikus hatása, következésképpen új irányt jelöltek ki az kalmodulinantagonista kutatásában. E kutatásokba kapcsolódott be már diplomamunkásként 1981-ben Orosz Ferenc, ami az első lépést jelentette az önálló munkacsoport megalakulásához. A csoporthoz csatlakozott néhány év múlva Vértessy Beáta, aki a Keleti Tamás vezette csoportban kezdett dolgozni az Intézetbe kerülésekor, valamint néhány külföldi doktorandusz illetve ITC-s hallgató. E periódusban számos jelentős publikáció, valamint szabadalom született a csoportban, melyek elsősorban a mikrotubuláris rendszerek többek között gyógyszerjelölt molekulák által előidézett ultrastruktúráinak molekuláris szintű megismerését célozták. Ezen a területeken elért eredmények képezték tárgyát két MTA doktori disszertációnak: 2001-ben Vértessy Beáta és 2004-ben Orosz Ferenc szerezte meg az MTA doktori címet. A multifunkcionális mikrotubuláris rendszer komplex szerkezeti és funkcionális sajátságainak különböző organizációs szinteken történő vizsgálata napjainkig egyik kiemelt projektje a Sejtarchitektúra Csoportnak. A tubulinalegységek, melyek a mikrotubuláris rendszereket építik fel, igen konzervatív szerkezetűek. A speciális funkciók ellátásához szükséges ultrastruktúrákat, valamint azok dinamikus szerveződését más-más struktúrfehérjékkel, enzimekkel vagy ligandumokkal alkotott kölcsönhatásaik határozzák meg. Így pl. bár mikrotubulusok a fő építőelemei mind az axonoknak és a sejtek differenciációja során kialakult nyúlványoknak, mind a mitotikus orsónak, mégis e mikrotubuláris ultrastruktúrák alapvetően különböző funkciók ellátására képesek. E funkciókhoz intenzív glikolitikus tevékenységre, a sejtek bioenergetikájában kiemelkedő szerepet játszó ATP-szintézisre van szükség, amiben a glikolitikus enzimek közvetlen kölcsönhatása, mikrokompartmentációja alapvető szerepet játszik. A munkacsoport számos kísérletes bizonyítékot szolgáltatott arra vonatkozólag, hogy glikolitikus enzimek a katalitikus aktivitásukon túlmenően struktúrfehérjékként képesek befolyásolni a mikrotubuláris rendszer dinamikáját és ultrastruktúráját, ugyankkor a kölcsönhatás következménye bizonyos glikolitikus enzim katalitikus hatékonyságának megváltozása, ami a sejtek energiaállapotát befolyásolni képes. Ma már elfogadott nézet, hogy a glikolitikus enzimek örökletes mutációja általában nem párosul komoly klinikai kórképpel. A triózfoszfátizomerázdeficiencia az egyetlen olyan glikolitikus enzimopátia, amely neurológiai elváltozásokkal és általában gyermekkori halállal jár. Magyar és angol betegek vérsejtjeivel kapott kísérleteik megmutatták a mutáns enzim fokozott tapadósságát a mikrotubulusokhoz, ami a mutáns izomeráz aktivitásának további csökkenését eredményezi. Megmutatták, hogy ez a hatás azonban nem okoz glikolízis-deficienciát, hanem fokozott metilglioxál-képződéshez vezet, ami végül is nemkívánatos másodlagos fehérjemódosulásokat, pl. glikációt okoz. A munkacsoport eredményei egy új kutatási irány alapjait megteremtve bizonyították, hogy a triózfoszfátizomeráz-deficiencia nem tekinthető metabolikus betegségnek, mivel annak hátterében nem a metabolizmusban bekövetkezett defektus áll, hiszen a mutáns enzim csökkent aktivitása rendszerszinten kompenzálódik, hanem a mutáns misfolded enzim fokozott aggregációs készsége, a Enzimológia 79

80 Enzimológia 80 toxikus fehérjeaggregátumok kialakulása, az ami szerepet játszhat egyes neuroncsoportok pusztulásában. A Sejtarchitektúra Csoport stratégiát dolgozott ki komplex biológiai folyamatok matematikai modellezésére, amiben meghatározó szerepe volt Oláh Juditnak, aki a munkacsoportban készítette el diplomamunkáját, majd 2005-ben szerzett PhD fokozatot. Kutatási kvalitását fémjelzik azok a tények, hogy jelenleg OTKA posztdoktori, valamint Bolyai Ösztöndíjban részesül. Az anyagcsere-folyamatok rendszerszintű molekuláris szintű leírására kidolgozott új stratégia révén lehetővé vált a kísérleti adatok fiziológiás, illetve patológiás viszonyokra való konvertálása, bioszimulálása, rendszerszinten releváns kontrollpontok azonosítása, illetve betegségek esetében a patomechanizmus azonosítása. A kísérleti adatokat humán sejtek, valamint transzgenikus egerek agyszöveteinek analízise szolgáltatta, amelyeket matematikai modellekbe beépítve bioszimulációval sikerült bizonyítani, hogy a toxikus fehérjaggregátumok, a zárványtestek képződése nem feltétlenül eredményez ATP-deficitet, ellentétben a korábbi nézetekkel, hanem éppen ellenkezőleg, a sejtek energiametabolizmusa a sejthalált megelőzően aktiválódik, mintegy jelezve a toxikus fehérjeaggregáció fokozódását. A Sejtarchitektúra Kutatócsoport 2004-ben felkérést kapott az egyik legnagyobb Európai Uniós Network of Excellence projektben (FP LIFESCIHEALTH-I: Bio-Sim) való részvételre, amelyet 10 uniós ország 32 akadémiai/egyetemi, valamint 10 ipari partnere hozott létre. A BioSim ( Biosimulation A New Tool in Drug Development ) célja egy új kutatási irány bevezetése, a legmodernebb alapkutatási eredményeken alapuló matematikai modellek megalkotása és alkalmazásuk új típusú és hatékony gyógyszermolekulák tervezésére és kifejlesztésére. A projekt innovatív célja, hogy a kidolgozott modellrendszerek ipari bevezetése csökkentse a gyógyszerkutatásban alkalmazott állatkísérletek számát, és ezáltal, valamint gazdasági és hatékonysági szempontokat is figyelembe véve elősegítse a nagy kompetíciónak kitett európai gyógyszeripar versenyképességének növelését. A projekt elnyerését követően két alfejezet koordinálására kaptak megbízást, melyek egyrészt a KAR-2 farmakológiai, valamint farmakokinetikai sajátságainak meghatározását tűzték ki célul, másrészt annak vizsgálatát, hogy a metabolikus mikrokompartmentumok mennyiben jelenhetnek meg potenciális gyógyszercélpontként. Az új kutatási irány kiterjedt a központi idegrendszeri betegségek rendszerszintű vizsgálatára, valamint kialakulásuk patomechanizmusára, különös tekintettel a szerkezet nélküli fehérjék által létrehozott toxikus fehérjeaggregátumok szerepére. A munkacsoportnak a projektben nyújtott kiemelkedő teljesítményét jelzi, hogy az első év után a projekt 5 tagú igazgatótanácsa Ovádi Juditot tagjai közé választotta, ahol a projekt további időtartama alatt (2010 májusáig) a háromhavonta tartott tanácskozásokon, a munkacsoportok beszámoltatásának aktív részese volt. A Sejtarchitektúra Kutatócsoport, melynek jelenleg 4 doktoradusz is aktív részese, egyik legfontosabb tudományos eredménye már a posztgenom korszakra esik. Az általuk reverz proteomikának nevezett stratégia segítségével szarvasmarhaagyból izoláltak és azonosítottak egy új agyspecifikus fehérjét, amelyet in vitro funkciója alapján Tubulin Polymerization Promoting Proteinnek (TPPP/p25) neveztek el, ami ma már az adatbázisokban ( data/hgnc_data.php?hgnc_id=24164), nemzetközi publikációkban ezen a néven szerepel. A különböző komplexitású és szervezettségű (atomi, molekuláris, sejt-és szövetszintű) rendszerekben végzett vizsgálataik világossá tették, hogy a fehérje igen rendhagyó és izgalmas sajátságokkal rendelkezik, ami elsődlegesen szerkezet nélküli karakterének köszönhető. Az izolált fehérje egy új fehérjecsalád első tagja, homológjait (TPPP2/p18 és TPPP3/p20) a közelmúltban molekuláris és sejtszinten jellemezték. Bizonyították, hogy a három homológ fehérje mind szerkezeti, mind funkcionális sajátságokban jelentős eltéréseket mutat, ami arra enged következtetni, hogy fiziológiás és patológiás funkcióik is eltérők lehetnek. E kérdések tisztázása a közeljövő feladata. A Sejtarchitektúra Csoport munkatársa, Lehotzky Attila a Richter Gedeon Nyrt.-ban töltött több éves ipari kutatás után visszatért a csoportba, létrehozta az intézetben az első, emlős sejtvonalakkal dolgozó labort, és ezzel elindította a csoportban is a sejtszintű kutatásokat, mint például humán sejtek fluoreszcens fúziós fehérjékkel való transzfektálását. Ezáltal lehetővé vált a TPPP fehérjék intracelluláris lokalizáció-

81 jának és annak hatásainak sejtszintű monitorozása fluoreszcens mikroszkópiával, akár élő sejtekben is. A TPPP/p25 vonatkozásában számos jelentős felismerést, megállapítást tettek, ami mind a hazai, mind a külföldi kutatók érdeklődését felkeltette a fehérje iránt, és számos vonatkozásban vizsgálni kezdték, több esetben a kutatócsoporttal kollaborálva. Mindezek a tényezők, valamint az, hogy a központi idegrendszeri betegségek egyre erőteljesebben népbetegséggé váltak az emberi kor növekedésével, ami komoly szociális-gazdasági problémát jelent, ezirányú kutatásaiknak komoly hangsúlyt adnak. Következésképpen a Sejtarchitektúra Csoport érdeklődése az utóbbi évtizedben a neurodegeneratív rendellenségek, ezen belül kifejezetten az ún. konformációs betegségek molekuláris alapjainak megismerése felé fordult. Bár a betegségek kialakulásának patomechanizmusa máig sem tisztázott, kialakulásukért elsődlegesen a nem megfelelő szerkezetű (intrinsically unstructured vagy misfolded) fehérjék (α-synuclein, tau és a mutáns huntingtin fehérje) a felelősek, melyek nem képesek élettani funkciójukat ellátni, aberráns kölcsönhatásaik révén fokozott aggregációs képességet mutatnak, ami zárványtestek képződéséhez, majd neuroncsoportok pusztulásához vezet. Bizonyították, hogy a TPPP/p25 szelektíven a Parkinson-kór és más szinukleinopátiák esetén a gliális, illetve neuronális zárványtestekben halmozódik fel. Mivel a konformációs betegségek patomechanizmusának megismerése a modern kutatások egyik fontos célpontja, aminek fontos részét képezi új szereplők azonosítása, szerkezeti és funkcionális sajátságaik, kölcsönhatásaik molekuláris és sejtszintű jellemzése, így jelen kutatásaik fókuszában a TPPP/p25 fiziológiás és patológiás funkcióinak jellemzése és az utóbbi folyamatok szelektív befolyásolása áll. A Sejtarchitektúra Csoportban szerkezeti és rekombináns technikákkal, fehérjék fluoreszcens jelölésével és egyedi humán sejtekben nagyfelbontású mikroszkóppal való monitorozásával, valamint humán patológiás agyszöveti minták ultrastrukturális és rendszerszintű vizsgálatával bizonyították, hogy a térszerkezettel nem rendelkező, rendkívül flexibilis fehérje fiziológiás célpontja a mikrotubuláris rendszer, melynek dinamikáját és stabilitását a TPPP/p25 bundling (keresztkötő), valamint tubulinacetilációt stimuláló aktivitásai révén szabályozni képes. Funkcióját specifikus proteinkinázok által foszforilált, a másodlagos szerkezettel sem rendelkező N-terminális szegmens (szignálszekvencia) határozza meg. A fehérje kifejeződése poszt-transzkripciós szinten egy ún. nem kódoló RNS (a mir-206), fehérjeszinten a proteoszómarendszer által szabályozódik. A TPPP/p25 normális agyban a neuronok funkcióját biztosító mielinhüvelyt alkotó differenciált oligodendrocitákban fejeződik ki, és fejti ki a mikrotubulusok dinamikáját meghatározó funkcióját, ami az oligodendrociták differenciációjához szükséges. Következésképpen javasolták, hogy a fehérje diszfunkciója a mielinhüvely károsodása révén a szklerózis multiplex kialakulásában játszhat szerepet. Molekuláris biológiai, sejtszintű, ultrastrukturális valamint rendszerbiológiai vizsgálatokkal sikerült bizonyítaniuk, hogy egyes betegségek esetében az idegrendszer neurológiai károsodásában jelentős szerepet játszik a TPPP/p25. A fehérje patológiás felhalmozódása mind neuronokban, mind a gliasejtekben jellemző kórképe a Parkinson-kórnak és más szinukleinopátiáknak. Immunhisztokémiai vizsgálataik post mortem humán agyszöveti mintákon azt mutatják, hogy a TPPP/p25 potenciális biomarker, illetve potenciális gyógyszercélpont lehet különböző CNS betegségek korai stádiumban való kimutatására, illetve kezelésére. E projekttel kapcsolatos kutatásaik is részét képezik az EU BioSim projektnek. Nemzetközi folyóiratokban, könyvekben megjelent publikációiknak száma 166, melyeknek mintegy 80%-a a csoport munkájának eredménye; kumulatív impakt faktoruk mintegy 400, idézeteiknek száma Enzimológia 81

82 Enzimológia meghaladja a 2700-at. Szabadalmaiknak száma 6. A Springer kiadó felkérésre egy angol nyelvű tudományos könyv és egy általuk szerkesztett könyv, valamint több angol nyelvű könyvfejezetük került publikálásra. Akadémiai Díjban Ovádi Judit (1986), Akadémiai Ifjúsági Díjban 5 munkatárs részesült. Tudományok doktora fokozatot 3 csoporttag (Ovádi, Orosz, Vértessy), kandidátusi illetve PhD fokozatot mintegy 10 hazai és külföldi munkatárs szerzett, TDK-s illetve diplomamunkások rendszeresen részt vesznek a csoport munkájában, többen díjazottak lettek. A csoport egykori tagjai közül Vértessy Beáta és Liliom Károly ma már saját csoporttal rendelkeznek. Ovádi Judit vendégprofesszorként dolgozott az Oklahomai, a Barcelonai és a Római Egyetemen ben habilitált a Pécsi Orvostudományi Egyetemen, mint egyetemi magántanár, 1999-ben Széchényi professzori ösztöndíjat, 2004-ben Charles Simonyi ösztöndíjat nyert el ben Oláh Judit Bólyai ösztöndíjban részesült. A csoportvezetőt a nagy presztizsű Gordon Konferencia a Macromolecular Associations and Cell Function című konferencia társelnökségével bízta meg, melyet 2004-ben igen sikeresen szervezett meg. További 5 nemzetközi konferencia szervezője illetve társszervezője volt, mint pl. a 4th EU BioSim Conference, mely Budapesten került megrendezésre 2008-ban. Évek óta két nemzetközi tudományos folyóirat, a FEBS Letters és a IUBMB Life szerkesztője ben a Magyar Köztársaság Lovagrendje kitüntetést nyerte el ban az év kutatójaként az SZBK akadémikusi testülete neki ítélte a Straub-plakettet. Kutatócsoportjában jelenleg 4 PhD hallgató témavezetője. Ovádi Judit 82

83 44 év az SZBK kötelékében Pályakezdőként, 1967 szeptemberében nyertem felvételt az MTA Karolina úti Biokémiai Intézetébe, sünk elindítójának tekinthető, az argininoldalláncok a fehérjeevolúció törvényszerűségei iránti érdeklődé- az akkor még csak tervekben létező Szegedi Biológiai Központ alkalmazottjaként. Munkahelyem fehérje szerkezet-funkció összefüggések vizsgálatának fehérjékben betöltött szerepének vizsgálata pedig a azonban a Semmelweis Orvostudományi Egyetem kiindulópontja volt. Orvosvegytani Intézetében, Dénes Géza csoportjában volt 1971-ig, az SZBK első blokkjának elkészülmányi ismeretek jobb hasznosítása érdekében Straub A posztdoktori munka során szerzett fehérjetudotéig ben először a Karolina úti intézetben, F. Brunó, az SZBK főigazgatója támogatta, hogy hazatérésem után munkámat a fehérjekutatások számára majd az MTA SZBK, immár Szegeden lévő, Biokémiai intézetében dolgoztam (a budapesti Karolina úti intézet ekkor változtatta nevét Enzimológiai Intézetre). Intézetben folytathassam. Mint e tárgyban jobb feltételeket biztosító budapesti Enzimológiai Ebben a költözésekkel terhelt es periódusban május 2-án kelt levelében írta: itt mindenki örül, ha a hisztidin operon szabályozását tanulmányoztam idejön. Escherichia coli-ban, mikrobiológiai és enzimológiai Az 1974-ben az Enzimológiai Intézetben megalakult egyszemélyes csoportom kezdetben az módszerekkel ben Straub F. Brunó akadémikus ajánlása argininmódosítás technikáját alkalmazta fehérjék szerkezet-funkció összefüggéseinek vizsgálatára, alapján a UCLA (University of California, Los Angeles) Biológiai Kémia Intézetében, Emil L. Smith laboratóriumában kaptam posztdoktori ösztöndíjat, Intézetben nagy mennyiségben hozzáférhető kísérleti objektumként elsősorban az Enzimológiai ahol 1974-ig folytattam fehérjekémiai kutatásokat. A glikolitikus enzimeket használtam. A különböző Los Angeles-i tanulmányutam során bekapcsolódtam a hisztonfehérjék aminosavsorrendjének meg- az általános következtetést, hogy a fehérjék pozitív fehérjéken nyert eredményekből le lehetett vonni azt határozásába. Különböző növény- és állatfajokból töltésű argininoldalláncai kitüntetett szerepet játszanak szubsztrátok, ligandok negatív töltésű csoportja- származó hisztonok aminosavsorrendjének meghatározása alapján kimutattam, hogy a hisztonok rendkívül konzervatív fehérjék, az evolúció során nagyon Az argininoldalláncok funkcionális szerepének inak kötésében. keveset változott a szerkezetük. Ez a megállapítás tisztázását célzó kutatások közben azonban igyekeztem olyan fehérjeobjektumokat (kutatási témát) azért volt érdekes, mert a fehérjék evolúciós viselkedése sokat elárul biológiai szerepükről, funkciójukról is. Az a megfigyelés, hogy az állatok és növések, így a kutatómunka eredményei nemcsak elméleti, találni, amelyek orvosbiológiai szempontból is érdekenyek hisztonfehérjéi szinte azonosak, arra utalt, hanem gyakorlati szempontból is fontosak lehetnek. hogy a hisztonoknak a kromatinszerveződésben játszott szerepe keveset változott az evolúció során. molekuláris szintű megértése még nagyrészt fehér Az 1970-es évek közepéig a tumorok kialakulásának Los Angeles-i munkám során módszert dolgoztam területnek számított, ezért nagy feltűnést keltettek azok a vizsgálatok, melyek kimutatták, hogy egy ki a fehérjék argininoldalláncainak szelektív kémiai módositására is. Ez a módszer megkönnyítette a sejtfelszíni fehérje (Large External Transformation fehérjék aminosavsorrendjének meghatározását, igazi Sensitive Protein, másnéven Fibroblast Surface karrierjét azonban a fehérjék szerkezet-funkció összefüggéseinek vizsgálatában futotta be. A tanulmányút keztében eltűnik a transzformált sejtek felszíné- Antigen) a fibrinolitikus proteázok aktivitása követ- során szerzett szakmai tapasztalatok, a Los Angelesben folytatott munka eredményei jelentős hatással fibrinolitikus proteázok fontos szerepet játszanak a ről, valószínűvé téve, hogy a LETS fehérje és a voltak későbbi munkámra, az általam vezetett csoport témaválasztásaira. A hisztonokon végzett munka nek a hatására döntöttem úgy 1977-ben, hogy malignus transzformációban. Ezeknek a felfedezések- kísér- Enzimológia 83

84 Enzimológia 84 leti objektumként az akkor még ismeretlen primér szerkezetű fibrinolitikus proteázok (plazminogén, urokináz- és szöveti típusú plazminogén aktivátor) és az időközben fibronektinre átkeresztelt LETS fehérje szerkezet-funkció összefüggéseit tanulmányozom. Az új kutatási téma fontossága több okból is nyilvánvaló volt. A plazminogén-aktivátorok és a plazmin felelős ugyanis a véralvadás során képződő fibrinalvadék feloldásáért, a fibrinolízisért, és működésük zavarai vezetnek a vérrögképződéshez, a trombózis és az infarktus kialakulásához. Ezért nyilvánvalónak tűnt, hogy a fibrinolitikus rendszer különböző komponensei felhasználhatóak a véralvadás bizonyos rendellenességeinek (trombózis, infarktus, stroke) kezelésére. A 70-es évekre tehető az a felismerés is, hogy a metasztázis során (amikor a tumorsejtek szövethatárokon, sejten kivüli állományon hatolnak keresztül) fehérjebontó enzimek vágnak utat a tumorsejtek számára, és ebben a folyamatban fontos szerepet játszik a plazmin, amely a tumorsejtek által termelt plazminogén-aktivátor hatására keletkezik a plazminogénből. A fibrinolitikus rendszernek a malignus transzformációban, tumormetasztázisban játszott szerepe alapján ezért remélhető volt, hogy sikerül olyan terápiás eljárásokat kidolgozni, melyekkel gátolni lehet a metasztázist. Az általam elindított kutatási téma vonzónak bizonyult az Enzimológiai Intézet több (más kutatócsoportban dolgozó) fiatal kutatója számára, ezért valamint az érintett csoportvezetők (Dévényi Tibor, Sajgó Mihály, Závodszky Péter) és az intézet vezetése megértő támogatásának köszönhetően a csoport 1978-tól több új fiatal munkatárssal (Váradi András, 1978, Váli Zsófia 1979, Bányai László 1980) és diplomamunkással (Trexler Mária, 1980) bővülhetett: megalakult a tervek megvalósítására alkalmas méretű Fibrinolízis Csoport. A csoport kísérleti munkáját nagyban elősegítette az, hogy az Enzimológiai Intézet szomszédságában lévő Országos Haematológiai és Vértranszfúziós Intézettől könnyen be lehetett szerezni a plazminogén, fibrinogén és fibronektin izolálásához szükséges emberi plazmát: ez a tény jelentős versenyelőnyt jelentett külföldi kutatócsoportokkal szemben, ahol az emberi vérkészítmények kevésbé álltak rendelkezésre kutatási célokra. Lényegesen könnyítette a munkát az is, hogy időközben egyre több információ látott napvilágot a vizsgált plazmafehérjék primér szerkezetére vonatkozóan, elsősorban Staffan Magnusson (Aarhus University, Aarhus, Dánia) csoportjának köszönhetően. Ezekből a munkákból világossá vált, hogy mind a plazminogén, mind a fibronektin ismétlődő egységeket tartalmaz: a plazminogénben található öt ismétlődő egységet a dán perechez való hasonlósága alapján kringle-nek, a fibronektinben található háromféle ismétlődő egységet I., II. és III. típusú doménnek nevezte el Magnusson. A plazminogén és fibronektin doménszerkezetének ismeretében lehetségessé vált kisebb (egy vagy több domént tartalmazó) fragmentumok proteolízissel történő előállítása, és azoknak a nagy méretű fehérje egészétől független vizsgálata. Mindezeknek a kedvező körülményeknek és a fiatal, a csoporthoz saját kezdeményezésből csatlakozó kutatók lelkesedésének köszönhetően viszonylag hamar jelentős, nagy nemzetközi visszhangot kiváltó eredményeket értünk el a plazminogén szerkezet-funkció összefüggéseinek vizsgálata területén: azonosítottuk az egyes kringle-doméneken található kötőhelyeket, melyek a plazminogén és fehérjepartnerei közötti specifikus kötést biztosítják, valamint a plazminogén konformációvátozásait és aktiválását szabályozzák. A plazminogénen végzett munka során az is világossá vált, hogy a kringle-domének nagyfokú szerkezeti és funkcionális autonómiával rendelkeznek: a molekula feldarabolása után az izolált kringledomének megőrzik a plazminogén egy-egy részfunkcióját: mintegy önálló életre képesek. Felmerült a gyanú, hogy ezek a kis fehérjerészek valamikor önálló molekulák lehettek és a plazminogén valójában ilyen független elemek összekapcsolódásával keletkezett. Formálódni kezdett az a hipotézis, hogy a véralvadási és fibrinolitikus rendszer különböző enzimeinek eltérő doménszerkezete is azzal magyarázható, hogy az evolúció során más és más építőelemek, modulok más és más kombinációban kapcsolódtak össze ben csoportunk szerkezet-funkció vizsgálati módszerei egy lényeges új megközelítéssel bővültek: R.J.P. Williams professzor (Oxford University, Oxford, UK) kereste meg a csoportot azzal, hogy szívesen

85 együttműködne a plazminogén kringle-doménjeinek NMR spektroszkópiai szerkezetvizsgálatában. Ezzel az együttműködéssel a csoport egy máig vezető úton indult el: különböző fehérjedomének szerkezet-funkció összefüggéseinek vizsgálatánál jelentős mértékben támaszkodunk vezető külföldi NMR spektroszkópiai laboratóriumokkal történő együttműködésre. A kringle-típusú domének NMR spektroszkópiai vizsgálatába 1984-től a Miguel Llinás által vezetett NMR spektroszkópiai csoport (Carnegie Mellon University, Pittsburgh, USA) is bekapcsolódott, a csoport egyéb projektjeinek NMR vizsgálataiban pedig Gottfried Otting (Canberra Universty, Canberra, Australia) vesz részt. A kringle-domének első NMR szerkezetvizsgálatai és kémiai módosításokkal történő szerkezet-funkció vizsgálata egy lényeges, ma már triviálisnak tűnő összefüggés felismerésére vezette csoportunkat: a kringle-doménekre jellemző térszerkezet fenntartásában kulcsszerepet játszó aminosavak valamennyi kringle-ben konzerválódnak, az eltérő kötőfunkciót meghatározó aminosavak azonban nem. Ebből levonhattuk azt a (későbbiek szempontjából fontos) következtetést, hogy egy-egy térszerkezettípusra vonalkódként jellemző a konzervatív aminosavpozíciók mintázata, lehetővé téve távoli rokonok esetén is annak eldöntését, hogy egy adott aminosav-szekvencia mutatja-e vagy sem az adott térszerkezetre jellemző mintázatot, vagyis az adott családba tartozik-e vagy sem. Mint említettem, a csoport kísérletes plazminogénkutatásai sikerének, nemzetközi versenyképességének alapja az volt, hogy a vizsgálati objektumot viszonylag könnyen, nagy mennyiségben lehetett előállítani könnyen hozzáférhető természetes forrásból. Ez az út azonban nem bizonyult járhatónak az urokináz és a szöveti plazminogén-aktivátor esetén (ezek a fehérjék csak rendkívül kis mennyiségben fordulnak elő a szövetekben), így hamar világossá vált, hogy ha ezeket a fehérjéket is vizsgálni kívánjuk szerkezeti biológiai módszerekkel, akkor az egyetlen lehetőség az, ha a fehérjéket a rekombináns DNS technika segítségével állítjuk elő. Magyarországon azonban, a 80-as évek elején megfelelő génsebészeti szakértelemmel, felszereltséggel csak az SZBK Biokémiai Intézetében működő, Venetianer Pál által vezetett csoport rendelkezett, ezért 1981-ben együttműködést kezdeményeztem a szöveti plazminogén-aktivátor rekombináns úton történő előállítására. Bár a Venetianer-csoport támogatta ezt a kezdeményezést, az mégis meghiúsult: felsőbb utasításra a szegedi csoport arra kényszerült, hogy (a plazminogén-aktivátor helyett) az inzulint állítsák elő. Mint Venetianer Pál egy interjúben elmondta: Az ipar képviselői ragaszkodtak az inzulinhoz, amiről akkor már tudható volt, hogy az USAban hamarosan már termelésbe is kerül. Minthogy Magyarország egyetlen felkészült génsebészeti labotratóriumának kapacitását lekötötte az inzulinprogram, nyilvánvalóvá vált, hogy csak úgy tudnánk kutatási terveinket megvalósítani, ha kellő pénzügyi támogatás segítségével magunk szerezhetjük be a génsebészeti munkához szükséges berendezéseket és magunk végezzük el a meglehetősen költségigényes génsebészeti munkát ben felcsillant a remény, hogy csoportunk kaphat pénzügyi támogatást terveink megvalósításához: Straub F. Brunó arról tájékoztatott, hogy az OKKFT A/15 programja jelentős összeget (1982-es 430 mft!) szán az Orvosbiológiai diagnosztikus és terápiás készítmények kutatása, előállítása és bevezetése című program megvalósítására (összehasonlításként: az ös ötéves periódusban az MTA költségvetéséből összesen 2 mft állt csoportunk rendelkezésére). Mivel az OKKFT A/15 programjában fő szerephez jutott a vérkészítmények, plazmafehérjék kutatása, előállítása és bevezetése, Straub F. Brunó kezdeményezte, hogy nyújtsuk be a fibrinolitikus proteázokkal kapcsolatos kutatási terveinket. Bár a programban való részvételre vonatkozó kutatási tervet maga Straub F. Brunó küldte el Hollán Zsuzsának, az OHVI igazgatójának, az OKKFT A/15 programmegbízottjának, nem kaptunk támogatást a programra szánt pénzből. Keserűen vettük tudomásul, hogy nemzetközi sikereink ellenére projektünk nem részesülhet egy olyan forrásból, melyből a program deklarált céljai alapján véleményünk szerint éppen az ilyen kutatásokat kellett volna finanszírozni. Az elutasítást követően Straub F. Brunó közvetítésével és támogatásával több gyógyszergyárral is tárgyaltunk kutatási terveink támogatása éredekében, sajnálatos módon azonban ezek a próbálkozások is kudarcba fulladtak. Enzimológia 85

86 Enzimológia 86 Szűkös pénzügyi forrásaink következtében így egyelőre le kellett tennünk a plazminogén-aktivátor rekombináns DNS technika útján történő előállításáról, a rekombináns DNS technikák alkalmazásáról. Ez azért is sajnálatos volt, mert emiatt a szerkezet-funkció összefüggések vizsgálatánál sem tudtuk a kémiai módosítás technikáját az irányított mutagenezis technikájával kiegészíteni, ezáltal versenyhátrányba kezdtünk kerülni a korszerűbben felszerelt külföldi csoportokkal szemben. A 80-as évek közepére az Enzimológiai Intézet vezetése is kezdte belátni, hogy a rekombináns DNS technika meghonosítása nélkül lehetetlenné válik a fehérjekutatás, ezért 1985-ben a génsebészetben jártas Sain Bélát és Erdei Sárát hívták meg az Enzimológiai Intézetbe (a szegedi Venetianer-csoportból). Megfelelő infrastruktúra és pénzügyi fedezet hiányában azonban a génsebészeti módszerek alkalmazása csak lassan, a 90-es évektől vált lehetővé az Enzimológiai Intézetben. Munkánkat hátráltatta az is, hogy a humán plazma beszerzése (az OHVI-ből) lehetetlenné vált. Ennek hatását ideig-óráig azzal mérsékeltük, hogy állati eredetű (csirke, sertés, marha) plazmából izoláltuk a plazminogént, fibronektint. A szükségből megpróbáltunk erényt kovácsolni: az emberi és különböző állati eredetű kringle-domének szekvenciabeli eltérései segítették az egyes aminosavakhoz tartozó NMR spektroszkópiai jelek azonosítását, és így megkönnyítették a kringle-domén tészerkezetének pontos meghatározását. Az, hogy a fokozódó versenyhátrány következtében csoportunk mégsem került ki a fibrinolízis kutatás élvonalából, annak köszönhető, hogy a kísérleti munkát sújtó felszereltségbeli, kutatástámogatási hiányosságokat és egyéb akadályokat képesek voltunk elméleti munkával (és sok szerencsével) ellensúlyozni. Mint említettem, a kringle-domének nagyfokú autonómiája alapján feltételeztük, hogy a véralvadási és fibrinolitikus rendszer különböző enzimeinek eltérő szerkezete azzal magyarázható, hogy az evolúció során más és más domének kapcsolódtak össze. Ennek a később moduláris fehérjeevolúció néven összefoglalt hipotézisünknek a tesztelésére kitűnő alkalom nyílt 1983-ban, amikor egy, a San Franciscó-i Genentech köré szerveződött kutatócsoport meghatározta a szöveti plazminogén-aktivátor aminosavsorrendjét. Bár a szekvenciahasonlóság alapján a közlemény szerzői felismerték a szöveti aktivátor két kringle-doménjét és proteáz doménjét, a szekvencia egy jelentős részének rokonsági viszonyai tisztázatlanok maradtak. A moduláris fehérjeevolúcióra vonatkozó (formálódó) hipotézisünk értelmében tehát a kérdést így lehetett feltenni: honnét származik, mivel mutat rokonságot a szöveti plazminogén-aktivátor ismeretlen eredetű része? A kérdés megválaszolását ismét csak a kringle-doméneken szerzett tapasztalatok segítették: ennek alapján úgy lehetett a kérdést átfogalmazni: mutat-e az ismeretlen eredetű rész olyan szekvenciamintázatot, mely jellemző valamely ismert domén típusra? Ezzel a szemmel (először valóban szemmel) vizsgálva a szöveti aktivátor szekvenciáját, arra az eredményre jutottunk, hogy a szöveti plazminogénaktivátor aminosavsorrendjének ismeretlen eredetű részlete kielégíti a fibronektin I. típusú doménjére jellemző konzervatív aminosav-mintázatot. Nyilvánvaló, hogy a felismerésben nagy szerephez jutott a szerencse, hiszen ekkor még nem állt rendelkezésre a mintázat felismerésére alkalmas számítógépes keresési program, vagy éppen a doméncsaládokra jellemző szekvenciamintázatok teljeskörű gyűjteménye, mely lehetővé tette volna a homológiai viszonyok szisztematikus, számítógépes tisztázását. A szerencse az volt, hogy egyidejűleg folytattunk kutatásokat a fibrinolitikus proteázokon és a fibronektinen, így rendelkezésünkre álltak a fibronektin különböző doméntípusaira jellemző szekvenciamintázatok is. A szerencsének köszönhető felfedezés lényege tehát az volt, hogy egy fibrinolitikus proteáz, a szöveti plazminogén-aktivátor egyik doménje rokon egy nem enzimatikus strukturális fehérje, a fibronektin egyik doméntípusával, vagyis a két multidomén (sok doménből álló) fehérje rokonsága egyetlen doménre korlátozódik. A felfedezés a moduláris fehérjeevolúció első, látványos bizonyítékát szolgáltatta, ugyanakkor azt is igazolta, hogy a konzervatív aminosavak mintázata alkalmas távoli rokonságok, homológiák kimutatására. A várakozásnak megfelelően eredményünk nagy feltűnést keltett és rendkívül kedvező visszhangot kapott.

87 Tisztában lévén a moduláris fehérjeevolúció felismerésének jelentőségével, igyekeztem megfelelelő PR tevékenységgel is népszerűsíteni azt. Ennek a szándéknak kedvezett, hogy 1984-ben Straub F. Brunó segítségével lehetőséget kaptam arra, hogy egy UNESCO workshop-ot szervezzek Budapesten. A workshop témájaként a Multidomain Proteins -t adtam meg (tudomásom szerint ez volt az első tudományos értekezlet ebben a témakörben), és meghívóleveleket küldtünk a terület legnevesebb művelőinek. A téma időszerűségét és a csoport eredményeinek elismerését jelzi az, hogy a neves meghívottak (pl. Walter Gilbert, Jürgen Engel, Staffan Magnusson, Rupert Timpl) elfogadták a meghívást. A moduláris fehérjeevolúció elméletnek jelentős publicitást adott az is, hogy az annak részletes kifejtését tartalmazó, összefoglaló cikket 1985-ben a nagy tekintélyű Cell közölte. A szöveti plazminogén-aktivátor domén szerkezetének tisztázása a szöveti plaz mi nogén-akti vátor tromboli tikus gyógyszerré fejlesztését célzó kutatásokra is nagy hatással volt: a második generációs plazminogén-aktivátorok tervezése a csoport által meghatározott doménszerkezet alapján indulhatott meg. A munka visszhangját, munkánk elimerését jelzi az is, hogy a San Franciscó-i Genentech a szöveti plazminogén-aktivátor projekt tudományos tanácsadójának kért fel. A Genentech által előállított szöveti plazminogénaktivátor gyógyászati alkalmazását a Food and Drug Admi nist ration 1987-ben engedélyezte. A hírre Magyar országon furcsa módon reagáltak: néhány, korábban a csoport projektje iránt érdeklődést nem mutató gyógyszergyári szakember most azzal keresett meg, hogy vegyünk részt egy magyar szöveti plazminogén-aktivátor projektben (a magyar inzulin analógiájára...). A válasz természetesen az volt, hogy ezzel pár évet késtek, most már semmi értelme egy ilyen projekt elindításának. A szöveti aktivátor gyógyszerként történő 1987-es bejegyzését követően érzékelhetővé vált az is, hogy a fibrinolízis területén végzett felfedező kutatás hőskora végéhez közeledik, a hangsúly az alkalmazott kutatás (pl. a második generációs aktivátorok előállítása) felé tolódik el. Nyilvánvaló volt, hogy ezen a téren a csoport (és a magyar gyógyszeripar) versenyképtelen, ezért esedékessé vált annak eldöntése, hogy a jövőben milyen területeken folytathatunk nemzetközi érdeklődésre méltó kutatást. A későbbi témaválasztásoknál a korábban sikeresnek bizonyult megfontolások vezettek: rendre olyan témákat kerestünk, melyek nemcsak elméleti, hanem gyakorlati szempontból is fontosak lehetnek. A kísérleti tervek megvalósítását azonban jelentősen hátráltatta az a körülmény, hogy 1986-ban elkezdődött az Enzimológiai Intézet többéves kiköltözéssel járó felújítása. A csoport (akkor tizenegy fő!) munkahelyéül a Karolina úti intézet műhelyépületének egyetlen földszinti helyisége szolgált (1. ábra). 1. ábra. A csoport 1988-ban a Karolina úti intézet műhelyépülete előtt, amely az intézet átépítése alatt kutatólaboratóriumként funkcionált. Ülnek: Sípos György, Gyenes Marianne, Hlavanda Emilia, Bányai László. Állnak: Patthy László, Moravecz Tamara, Trexler Mária, Koncz Sándor, Wodzinszky Katalin Az elméleti jellegű kutatások kevésbé szenvedték meg az Intézet több évig tartó átépítése miatti nehézségeket (ezeket a kis költség- és helyigényű kutatásokat otthon is folytatni lehetett). A távoli homológiák detektálására a 80-as évek elején kidolgozott egyedülálló bioinformatikai módszerünk (melynek algoritmusát csak 1987-ben közöltük) hosszú évekig rendkívül hasznosnak bizonyult: alkalmazásával számos új doméntípust definiáltunk, számos multidomén fehérje doménszerkezetét, rokonsági viszonyait jellemeztük, ezzel elősegítve különböző multidomén fehérjék szerkezet-funkció összefüggéseinek megismerését. Néhány, biológiai (és orvosbiológiai) szempontból érdekesebb új doméntípus és multidomén fehérje bioinformatikai jellemzését követően a predikciókat kísérletesen is ellenőriztük, így a bioinformatikai eredményeink kísérleti projektek kiindulópontjaiként Enzimológia 87

88 Enzimológia is szolgáltak. Az általunk kidolgozott/alkalmazott bioinformatikai módszerek megbízhatóságát azzal is illusztrálhatjuk, hogy a felhasználásával detektált távoli homológiák alapján tett predikcióink helyességét a későbbi kísérletes vizsgálatok rendre visszaigazolták. A távoli homológiák detektálására alkalmas módszerünk egyik másik fontos hozadéka az volt, hogy segítségével feltárhatóvá vált a multidomén fehérjék evolúciós története, bizonyíthatóvá vált a moduláris fehérjeevolúció elmélete. Mint említettem, ennek első meggyőző bizonyítékait a véralvadás és fibrinolízis proteázainak vizsgálata szolgáltatta, szisztematikus számítógépes szekvenciaelemzéseink azonban kimutatták, hogy a moduláris evolúció a fehérjeevolúció általános elve. A multidomén fehérjék doménszerkezetének és génjeik szerkezetének összevetése során a csoport egy további, lényeges megállapításra jutott: a multidomén fehérjék (pl. a véralvadási és fibrinolitikus protázok, fibronektin) doménszerkezete visszatükröződik génjeik exon-intron szerkezetében, elsőként bizonyítva azt a (Walter Gilbert által 1978-ban megfogalmazott) hipotézist, hogy az exonok cseréje (exon-shuffling) szerepet játszhat új gének más gének darabjaiból történő összeszerelésében. A bizonyíthatóan exonshuffling útján keletkezett fehérjék génjeinek vizsgálata alapján pedig az exon-shuffling evolúcióbiológiai jelentőségét befolyásoló alapvető törvényszerűségek felismerése vált lehetségessé. Az exon-shuffling révén keletkezett multidomén fehérjék kitüntetett evolúcióbiológiai jelentősége miatt változatlanul a csoport egyik prioritása az exon-shuffling még nyitott kérdéseinek tisztázása. Hogy milyen tanulságokkal szolgált számomra az SZBK kötelékében végzett kutatásaink története? Talán azzal, hogy szerencsés, ha a kísérleti munkát végző kutató a (Magyarországon rendre visszatérő) kutatásfinanszírozási problémák idején kis költségigényű elméleti munkába tud menekülni, így néha még a szükségből is erényt tud kovácsolni. És azzal a tanulsággal, hogy az elméleti munka sikerének előfeltétele, hogy közvetlen kapcsolatban maradjon a kísérleti munkával, minthogy ez az a terület, ahol az elméleti kérdések megfogalmazódnak és ahol a válaszok ellenőrizhetőek. Patthy László 88

89 Simon István és csoportja, a Fehérjeszerkezet Kutatócsoport Enzimológia Pályafutásom lényegében egybeesik az SZBK történetével. Pályakezdőként az Enzimológiai Intézet jogelődjébe, az MTA Biokémiai Kutatóintézetébe, Elődi Pál csoportjába vettek fel tudományos gyakornoknak 1969-ben azzal a deklarált céllal, hogy az akkor építés alatt álló SZBK számára képeznek ki. Egy akkor még Magyarországon nem használt módszerrel, fehérjék kisszögű röntgenszórásos vizsgálatával kezdtem dolgozni. Csoportvezetőm sokat tett azért, hogy belőlem, aki szilárdtest fizikai diplomamunkával szerzett oklevelet, biofizikust faragjon. Első cikkeim ben jelentek meg rangos nemzetközi folyóiratokban. Ezek egyszerzős cikkek voltak. Később persze írtunk közösen cikkeket Elődi Pállal is. Az egyik ilyen 1974 ben írt cikk még 2010-ben is kapott két hivatkozást. A kisszögű röntgenszórásos vizsgálatokból írt értekezésemmel 1975-ben szereztem kandidátusi fokozatot. Az értekezés benyújtása és megvédése között, 1974 őszén, Elődi Pál a Debreceni Orvosegyetemre távozott, és a csoport vezetését a rangidős Závodszky Péter vette át. Az ő irányítása alatt álló csoportban még további tizenhárom évig dolgoztam, bár ebből néhány évet Amerikában a Minnesotai Egyetemen és a Cornell Egyetemen töltöttem. Mind Amerikában, mind itthon kísérletes és elméleti munkákat is végeztem. Ennek az időszaknak a legnagyobb visszhangot kiváltó, több mint háromszáz hivatkozást kapott cikke kísérletes témáról, a fehérjék dinamikus sajátosságairól és az ennek vizsgálatára szolgáló H-D kicserélődés elemzéséről szólt. Érdeklődésem súlypontja mégis az elméleti munkák irányába tolódott el ben a biológia tudomány doktora fokozatot elméleti munkákból készült értekezésem alapján kaptam, majd megalapítottam saját elméleti csoportomat, a Fehérjeszerkezet Kutatócsoportot. Alapításakor csoportom belőlem és egyetlen fiatal munkatársból, Cserző Miklósból állt. Ő mint számítógépes munkák iránt érdeklődő kutató került át az intézet egy másik csoportjából. Pár évvel később, 1990-ben Tüdős Éva mint pályakezdő csatlakozott a csoporthoz. Fiser András 1991-ben, Tusnády Gábor 1992-ben, Dosztányi Zsuzsanna 1994-ben kezdtek itt pályakezdőként dolgozni, miután mindhárman szakdolgozatos hallgatóként előtte másfél évet már eltöltöttek a csoportban. Magyar Csaba 1999-ben Závodszky Péter irányításával szerzett PhD fokozatot és posztdoktorként került a csoportba. Fuxreiter Mónika 2000-ben négyéves amerikai posztdoktori gyakorlattal csatlakozott csoporthoz. Mészáros Bálint itt írta diplomamunkáját, majd 2007-ben mint doktorandusz kezdett a csoportban dolgozni. Végül a legfiatalabb, de már állásban lévő doktorandusz, Kozma Dániel 2009 őszétől dolgozik itt. Az előbbi munkáját Dosztányi Zsuzsanna, az utóbbiét Tusnády Gábor irányítja. Nem intézeti állományban, hanem doktori ösztöndíjasként készítette itt PhD munkáját Mones Letif és Solt Iván Fuxreiter Mónika irányításával. Cserző Miklós elvben több mint másfél évtizedig volt a csoport dolgozója, de idejének döntő többségét külföldi laborokban töltötte. Keveset volt itthon, de itthoni munkájából kiváló cikkeket írtunk. Jelenleg a SOTE-n dolgozik. Fiser András 1997-ben kandidátusi fokozatot szerzett itt a csoportban, azután a Rockefeller egyetemre ment posztdoktornak. Jelenleg a new yorki Albert Einstein Medical School profeszszora. Amerikai tartózkodása alatt is több cikket írt a csoporttal, és 2010-ben megszerezte a MTA doktora fokozatot. A fehérje-bioinformatika elismert kiválósága lett. A többiek jelenleg is a csoportban dolgoznak. A fentieken kívül számos egyetemi hallgató, külföldi vendégkutató dolgozott, illetve dolgozik a csoportban, akik jelentősen hozzájárultak a csoport eredményeihez. A csoport publikációiban közülük Petr Kulhanek, Simon Ágnes, Szirtes Gábor és Tóth- Petróczy Ágnes szerepelnek társszerzőként. A kutatócsoport programjának középpontjában a fehérjeszerkezetek szerveződését meghatározó alapelvek feltárása és a felismert elveknek a szerkezetkutatásban történő felhasználása áll. Az elmúlt két évtizedben eredményeket értünk el a fehérjeszerkezet szerveződésének, a szerkezeti stabilitás és flexibilitás fizikai hátterének felderítésében. Ezek a vizsgála- 89

90 Enzimológia tok átfogják a fehérjeszerkezetek teljes spektrumát a vizes közegben oldódó globuláris fehérjéktől a transzmembrán fehérjéken át a rendezetlen fehérjékig, és kiterjednek a fehérjék stabilitását biztosító kovalens és nem kovalens keresztkötésekre is. A feltárt, ma már számos tankönyvben is megtalálható összefüggésekből rövid idő alatt a tudományos közösség és az alkalmazott kutatást, illetve fejlesztő tevékenységet végzők számára is hasznos számítógépes becslő módszereket dolgoztunk ki. A nyolcvanas évek végén már rendelkezésre állt a statisztikus vizsgálatokhoz elegendő fehérjeszekvencia- és térszerkezeti adat, ami lehetővé tette a ma bioinformatika néven ismert tudományterület művelését. Ezek a vizsgálatok az akkor ismert fehérjék legalább 95%-át kitevő, vizes közegben oldódó, stabil globuláris fehérjékre vonatkoztak. Becslő módszert dolgoztunk ki például aminosavak helyettesíthetőségére és diszulfid hidat képező ciszteinek becslésére. Ezeket a módszereket a kilencvenes évek közepe óta elterjedő, a világhálón működő szerverek, beleértve az általunk telepítetteket is, fokozatosan felváltják. Ilyen például a ciszteinek kovalens állapotát becslő szerverünk, a CYSREDOX. A fehérjék kovalens keresztkötései, a diszulfid-hidak mellett intenzíven vizsgáltuk a fehérjékben található, nem kovalens kölcsönhatásokból kialakuló stabil klasztereket is. Bevezettük a ma már elterjedt stabilizációs centrum fogalmát a klaszterek egy jól definiált részhalmazára. Szervereket készítettünk és telepítettünk a világhálóra (SCide, SCpred, SRide) az ilyen klasztereket alkotó aminosavak térszerkezetből történő azonosítására és szekvenciából történő becslésére. A stabilizációs centrumok azonosításával magyarázatot találtunk többek között az MHC fehérjék funkció vezérelte stabilitására és a TIM barrel térszerkezeti elem kiemelt stabilitásának köszönhető gyakori előfordulására. Ezek a centrumok szolgáltattak bizonyítékot a PD-(D/E)XK restrikciós enzimek divergens evolúciójára. A statisztikus vizsgálatokkal párhuzamosan számos fehérje szerkezeti sajátosságát tártuk fel molekulamechanikai és molekuladinamikai eszközökkel. Ilyenek voltak az MHC fehérjék peptidkötési sajátosságai, a prolil oligopeptidáz enzim működéséhez tartozó dinamikus sajátosságok leírása, a dutpáz enzim működésének és gátlásának in silico vizsgálata, a hidrátburok szerepének felderítése a fehérje-dns kölcsönhatások felismerési mechanizmusában, valamint a fémionok szerepének vizsgálata az endonukleázok működésében, stb. Piros, sárga és zöld színnel jelölt, különböző típusú stabilizációs centrumelemek egy MHC-peptid komplexben 90 A prolil peptidáz aktív centrumához vezető, molekuladinamikával megtalálható útvonal a cikket közlő folyóirat címlapján A kilencvenes évek közepétől a globuláris fehérjék mellett elkezdtünk transzmembrán fehérjékkel is foglalkozni. Egy évtizeden keresztül ezen a területen születtek a legfontosabb eredmények. Legnagyobb visszhangot a transzmembrán fehérjék szerkezeti szerveződésének alapelveit feltáró cikkek, illetve az ezen alapelvekre épített topológia-becslő algoritmusokat bemutató cikkek váltották ki. Az ebben a témakörben megjelent cikkeink közül három kapott egyenként hatszáz feletti hivatkozást. Az említett becslő módszerek alkalmazásával jelentős érdeklődést kiváltó cikket közöltünk a PNAS-ben a prionfehérjék speciális sajátosságainak lehetséges eredetéről. A topológiabecslő és térszerkezet-elemző szerverek, DAS, DAS-TM-filter HMMTOP, HMMTOP2,

91 PSORT-b és TMDET mellett igen népszerűek a legkorszerűbb algoritmusokkal és keresőmotorokkal felszerelt adatbázisszerverek is. A hetente, lényegében automatikusan frissülő PDBTM az egyetlen nyilvánosan elérhető adatbázis, amely teljes körű és up to date térszerkezeti információt szolgáltat a meghatározott térszerkezetű transzmembrán fehérjékről. Az intenzív használat azt mutatja, hogy hasonlóan hasznos a másik két transzmembrán fehérje adatbázis, a TOPDB és a TOPDOM is. Enzimológia A fehérjemolekula membránhoz viszonyított helyzetének meghatározása a TMDET algoritmussal A HMMTOP transzmembrán fehérje topológiát becslő algoritmus: a különböző térrészekben található láncszakaszoknak maximálisan el kell térniük egymástól Az elmúlt évtized legnagyobb visszhangot kiváltó eredményei a fehérjék egy a közelmúltban felismert új nagy családjához, az úgynevezett rendezetlen fehérjékhez kötődnek. Ezek a fehérjék önmagukban fiziológiás körülmények között nem vesznek fel időben állandó, stabil térszerkezetet. A legfontosabb eredmény a rendezetlenség termodinamikai hátterének felderítése volt. Ez lehetővé tette egy termodinamikai elvekre épülő rendezetlenségbecslő módszer, az IUPred kidolgozását. A szervert eddig negyedmillió alkalommal látogatták és több mint négy és fél millió szekvenciavizsgálatot végeztek. A szervert bemutató cikkre több mint kétszázszor hivatkoztak. Az IUPred, a becslő módszerek összevetésére szolgáló CASP versenyek alapján is az egyik legjobbnak értékelt és világszerte használt eljárás. A termodinamikai háttér felismerése tette lehetővé a rendezetlen fehérjékben található fehérje-kötőhelyek becslését a szekvenciából. Az általunk kidolgozott eljárás, az ANCHOR jelenleg az egyetlen ilyen célra használható módszer. Az IUPred rendezetlenségbecslő módszer elvi alapja: a rendezett és a rendezetlen fehérjeszegmensek becsült energiatartalmuk alapján elkülöníthetőek A kilencvenes évek közepére ismerté váltak az első teljes genomszekvenciák. Hirtelen megnőtt az igény az ezek számítógépes analízisére szolgáló algoritmusok, illetve a szerkezetbecslő módszerek iránt. A csoport publikációs aktivitása is jelentősen megnövekedett. Az 1996 és 2010 között eltelt tizenöt évben a csoportból 92 cikk jelent meg, 428-as összesített impakt faktorú folyóiratokban. Ezek több mint négyezer független hivatkozást kaptak ISI referálta folyóiratokban és több, mint négyszázat a világhálón is elérhető könyvekben. Ez idő alatt tizenhat szerkezetbecslő, szerkezetelemző, illetve adatbázisszervert telepítettünk a világhálóra. A felhasználók több, mint egy millió belépéssel, mintegy tizennégy millió szekvenciát illetve szerkezetet vizsgáltak meg. 91

92 Enzimológia Részt veszünk az oktatásban és a tudományos közéletben. Egyetemi magántanárként, illetve felkért oktatóként és témavezetőként oktatunk, szakdolgozókat és doktoranduszokat irányítunk. A csoportban öten szereztek kandidátusi, illetve PhD fokozatot. Végül, de nem utolsósorban, főleg az ezredforduló óta, a csoport több nemzetközi és hazai alkalmazott kutatási projektben is részt vett, melyek anyagi támogatása jelentősen hozzájárult működőképességünk fenntartásához. A fehérje-fehérje kölcsönhatásokban résztvevő lineáris motívumok (ELM-ek) környezete jellegzetes rendezetlenségi profilt mutat Simon István 92

93 Tompa Péter munkacsoportja: negyed század az Enzimológiai Intézetben Enzimológia Az ELTE TTK vegyész szakán végeztem 1983-ban, az Enzimológiai Intézetbe 1982-ben kerültem szakdolgozatosként. Sok más évfolyamtársammal ellentétben én szerencsésnek éreztem magam, hogy bejutottam a tudomány fellegvárába, mai napig is azt érzem és gondolom, hogy pályám egyik kiemelkedő és meghatározó momentuma, hogy a molekuláris élettudomány egyik legjelentősebb hazai műhelyében kezdtem a munkámat. A szakdolgozatot követően TMB ösztöndíjasként (a PhD programok elődje volt) is itt maradtam, és azóta is folyamatosan az intézet állományában vagyok. Az intézetben Keleti Tamás nagyobb csoportján belül Batke József irányításával kezdtem dolgozni. Bár ekkor még nem tudtam, az intézetben akkortájt teljesedett ki, és egy kicsit a végéhez is közeledett a Szörényi Imre, majd Straub F. Brunó nevével fémjelzett klasszikus korszak, amelyet a különböző izolált fehérjék, elsősorban glikolitikus enzimek szerkezet-funkció összefüggéseinek megértését célzó kutatások jellemeztek. Több csoport is a témaváltás-témakeresés fázisában volt, a Keleti csoport például ekkortájt kezdett a fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatába, ebbe kapcsolódtam be én is. A glikolitikus és citrátköri enzimek kölcsönhatásainak vizsgálata során nagyon sok érdekes és fontos fehérjekémiai technikával ismerkedtem meg, két évet ( ) Amerikában is eltöltöttem, ami alapvetően járult hozzá kutatóvá válásomhoz ben szereztem meg PhD (akkor kandidátusi) fokozatomat, és határoztam el, hogy valami nagyobb kihívást jelentő témát kezdek el. Épp jókor jött Friedrich Péter megkeresése, akinek rendkívül érdekes személyisége és újonnan induló nagyon érdekes témája (a memóriajelenségek molekuláris alapjainak kutatása) annyira magával ragadott, hogy hívására szinte gondolkodás nélkül igent mondtam. Bár a memória molekuláris mechanizmusának tényleges vizsgálata messze meghaladta az itthoni lehetőségeket, és csak a legkiválóbb amerikai laboratóriumokban volt lehetséges, a terület két kevéssé vizsgált részterületéhez fehérjerendszerek vizsgálatával mi is érdekes és fontos hozzájárulást tettünk, amelyek későbbi pályám szempontjából meghatározónak bizonyultak. A mikrotubuláris rendszer átalakulásai a neuronok memóriafolyamatokban szerepet játszó tartós morfológiai átrendeződéseivel hozhatók kapcsolatba, itt a mikrotubulus-asszociált fehérje 2 (MAP2) foszforilációjának részletes elemzését folytattuk. Figyelmünk nagy része azonban a kalciumaktivált intracelluláris proteázra (kalpain) irányult, elsősorban egy évi Nature cikk hatására, amelyben az a felvetés szerepelt, hogy ezt az enzimet az emléknyom kialakulásában kulcsszerepet játszó kalciumszignál aktiválja, és célzott proteolitikus aktivitása, például a MAP2 specifikus hasítása révén, meghatározza a szinapszis tartós morfológiai átrendeződéseit. A kalpain aktiválódásának különleges és érdekes vonásairól mintegy 20 közleményt publikáltunk, legnagyobb visszhangot azok a munkáink váltottak ki, amelyekben az autoaktiválódás (autolízis) mechanizmusának kérdéseit boncolgattuk, vagy éppen rámutattunk, hogy a különböző kalpainok egymást aktiváló kaszkádba (kalpain-kaszkád) rendeződhetnek. További pályám szempontjából talán legnagyobb jelentősége annak a vizsgálatsorozatnak volt, amelyben a kalpain rejtélyes szubsztrátspecifitását vizsgáltuk. A kalpain más proteázoktól (pl. tripszin, kimotripszin) eltérően nem egy jól felismerhető szekvenciamotívumon belül hasítja szubsztrátjait, hanem egy lazán definiált szekvencia-prefrencia és egyéb globális jelek kombinációját ismeri fel. Utólag könnyű felismerni, hogy a megállapított szekvenciamotívumok sajátosságai nagyban magukon hordozták későbbi sikertémámnak, a fehérjék rendezetlenségének jeleit. A memória molekuláris mechanizmusának vizsgálata egy további, nagyon érdekes ötlethez is elvezetett: a világon elsőként vetettük fel, hogy a prionok autokatalitikus szerkezetváltozása nemcsak patológiás folyamatokban játszhat szerepet, hanem fiziológiás jelentősége is lehet, molekuláris információtárolásra való alkalmassága miatt szélső esetben akár 93

94 Enzimológia 94 a memórianyom kialakulásának mechanizmusa is lehet azóta ezt a Nobel-díjas Eric Kandel a tengeri csiga (Aplysia californica) memóriamechanizmusainak vizsgálatával igazolta is. A fehérjék szerkezeti rendezetlenségének felismerésében még nagyobb szerepet játszott, hogy a kalpain-vizsgálatokban szoros együttműködést alakítottunk ki a kalpainológia egyik atyjával, Koiichi Suzuki professzorral, akinek a meghívásra 2000-ben három hónapot töltöttem Japánban, a Tokiói Egyetemen. A tanulmányút során a humán kalpain III. doménjének jellemzésén dolgoztam, és kimutattam, hogy az enzimnek ez a régiója részt vesz a kalcium kötésében és az enzim kalcium általi aktivációjában. Sokkal fontosabb megfigyelést tettem azonban, amikor a kalpain inhibitorának (kalpasztatin) a génjét kerestem az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) genomjában. A genom szekvenciáját egy évvel korábban publikálták, és ennek alapján tudtuk, hogy furcsa módon az enzimnek (kalpain) négy génje is van a genomban, az inhibitornak (kalpasztatin) azonban egy sem. Mivel a távoli homológiát kereső módszerek sem tudtak kimutatni kalpasztatin gént a genomban, megpróbáltam a nagyon távoli hasonlóságok keresésére alkalmas aminosav-összetételi mintázatokat elemezni. A munka eredménye az a váratlan felismerés lett, hogy a kalpasztatin aminosav-összetétele rendkívül szokatlan, a fehérje szinte alig tartalmaz hidrofób aminosavakat, ugyanakkor szokatlanul töltött és sok prolin figyelhető meg benne. Mivel a kalpasztatinról mindig tudtuk, hogy szokatlan, az enzimek denaturált állapotára hasonlító random-coil szerkezete van, és a megfigyelt aminosav-összetétel annyira szokatlan volt, ezen kapcsolat felismerésének a hatására elhatároztam, hogy ezzel a jelenséggel fogok foglalkozni. Ebben az elhatározásban megerősített az általam akkor már részletesen vizsgált másik fehérje, a MAP2, amely ugyanilyen szokatlan tulajdonságokat mutatott. Budapestre hazatérve belevetettem magam az irodalom olvasásába, és megpróbáltam összeszedni minden erre vonatkozó megfigyelést ennek eredménye lett az éppen akkor születő terület, a rendezetlen fehérjék egyik alapműve ( Intrinsically unstructured proteins, Tompa 2002, TiBS 27, ), amely azóta több mint 600 hivatkozást kapott. Rendezetlenség és funkcionális promiszkuitás (moonlighting), a TiBS címlapján, 2005 A fehérjék rendezetlenségének felismerése alapvetően változtatta meg tudományos karrieremet, ennek és az ezt követő munkáknak a hatására 2002-ben elnyertem a Wellcome Trust International Senior Research Fellowship -jét, ami öt évig kiemelt kutatási támogatásról gondoskodott, és lehetővé tette, hogy önálló csoportot alapítsak. A csoportalapítás Friedrich Péterrel való kiemelkedőn jó kapcsolatom következtében nem jelentett szétválást, sokkal inkább még jó darabig szorosan együttműködve dolgoztunk, és a téma hangsúlyának fokozott eltolódása révén a csoport az évek során lassan az én csoportommá vált. A kalpainnal kapcsolatos kutatásokról még évekig publikáltunk közösen, és 2006-ban is ebben a témában írt dolgozatommal nyertem el az MTA doktora címet, amikor a fehérjék rendezetlenségének témája már nagy hangsúlyt kapva folyt a laboratóriumban. A Tompa-laborban jelenleg mintegy 15-en dolgoznak, az évek során gyakran 4-5 posztdoktor és 5-6 diák is dolgozott a rendezetlenség témáján, ami az elmúlt években az Enzimológiai Intézet egyik sikertémája lett. Ebben az is közrejátszott, hogy kiderült: a szerkezeti rendezetlenség általánosan elterjedt az eukarióta proteomokban (az emberi fehérjék csaknem felében van legalább egy hosszú rendezetlen szakasz, és mintegy 10 százalékuk teljesen rendezetlen), és domináns funkcionális szerepet játszik szabályozó és jelátviteli fehérjékben, például jelátviteli állványfehérjékben és transzkripciós faktorokban. A rendezetlenség megismerése, részletes szerkezeti-funkcionális analízise így a molekuláris sejtbiológia és fehérjekémia egyik kiemelkedő területe lett az elmúlt évtizedben. A jelátviteli folyamatokban játszott fontossága miatt kiemel-

95 kedő szerepet játszik betegségekben is, mivel a rákban (p53, cmyc) vagy éppen neurodegeneratív betegségekben (alfa-szinuklein, tau fehérje) meghatározó fehérjékben is nagyon magas a rendezetlenség aránya. Mivel a jelenség felismerésében kulcsszerepet játszottunk, és az elsők között kezdtünk hozzá a szisztematikus elemzéséhez, vizsgálataink alapvetően járultak hozzá a rendezetlenség fontosságának elismeréséhez és megismerhetőségének általános elfogadásához. Az elmúlt évtized során laboratóriumunk kiemelkedő szerepet játszott és játszik a rendezetlen fehérjék vizsgálatában, kutatásaink során elsősorban három területre koncentrálunk. Mivel a rendezetlenség ellentmond a hagyományos szerkezet-funkció összefüggésnek, számos munkánk irányult a rendezetlen fehérjék funkciói általános szabályszerűségeinek megállapítására, egyfajta új szerkezet-funkció paradigma megfogalmazására. Ennek keretében alapvető felismeréseket tettünk, például lefektettük a rendezetlen fehérjék funkcionális osztályozásának alapjait, megalkottuk a funkcionális sokféleség (funkcionális promiszkuitás, moonlighting), a rendezetlen domének, valamint a kötött állapotban is megfigyelhető rendezetlenség (bolyhosság, fuzziness) koncepcióját. Eredményeink általában jelentős hivatkozási visszhangot hoztak, és többször is rákerültek a közlő folyóiratok címlapjára, például a moonlighting, fuzziness vagy a domén koncepció kiterjesztésével ben felkérésre én írtam meg a terület első monográfiáját ( Structure and function of intrinsically disordered proteins, 2009, Taylor and Francis). Sok és jelentős felismerést értünk el bio infor matikai megközelítések alkalmazásával is. Az Enzi mológiai Intézet a bioinformatikai kutatások egyik hazai központja, ahol korábban számos eredeti felismerés történt a moduláris fehérjeevolúció és transzmembrán fehérjék területén. Csoportom Simon István csoportjával együttműködve számos érdekes vizsgálatot folytatott, amelyekben fontos általános kérdésekre kerestük a választ. Ezek közül is kiemelkedik a rendezetlenség predikciójára szolgáló algoritmus (IUPred) és szerver kidolgozása, a rendezetlenség és felismerő funkciók közötti kapcsolat megállapítása, az előre kialakuló tranziens szerkezeti elemek ( preformed structural elements ) felismerő funkciójának megállapítása, valamint a rendezetlen fehérjék repeat-expanzióval történő evolúciójának megfigyelése. További fontos eredményünk volt annak felismerése, hogy a rendezetlen fehérjék életideje élő sejtben átlagosan nem rövidebb, mint a rendezett globuláris fehérjéké, és a sejtben nincs szükségük dajkafehérjék (chaperonok) védelmére. Kimutattuk továbbá azt is, hogy a rendezetlen fehérjék átlagosan nagyobb számú fehérje-fehérje kölcsönhatásban vesznek részt, és gyakran kulcsszerepet játszanak nagy komplexek szervezésében. Egyik legérdekesebb megfigyelésünk, hogy a genom azon szakaszai, amelyek alternatív splicing következtében kettős kódolást mutatnak, az egyik leolvasási keretben ( reading frame ) csaknem kizárólag teljesen rendezetlen szakaszt kódolnak. Ez a megfigyelés alapvető fontosságú lehet a rendezetlenség eukariótákban való hirtelen megjelenésének evolúciós magyarázata szempontjából. Enzimológia Rendezetlenség kötött állapotban (bolyhosság, fuzziness ) a TiBS címlapján, 2008 A rendezetlen fehérjék területének első monográfiája (Taylor and Francis, 2009) 95

96 Enzimológia A rendezetlen fehérjék felismerését követően a legfontosabb koncepcionális áttörést annak felismerése jelentette, hogy a rendezetlenség szerkezetileg és funkcionálisan is részletesen jellemezhető, vagyis a hagyományos szerkezet-funkció paradigma kiterjeszthető. Ez természetesen részletes kísérletes szerkezeti vizsgálatokat igényel, új megközelítések segítségével vagy a már ismert szerkezeti technikák újszerű alkalmazásával. Egy ilyen lehetséges kutatási projekt mintája azon vizsgálatsorozatunk, amely során a rendezetlenség és chaperone-funkció kapcsolatát tettük részletes vizsgálatok tárgyává. A kérdésfelvetés alapja az az általunk tett megállapítás volt, hogy hagyományos chaperonokban gyakran találhatók a funkció szempontjából fontos rendezetlen szakaszok, és gyakran teljesen rendezetlen fehérjék is hatékony chaperon hatást mutatnak. A jelenség magyarázatára modellt dolgoztunk ki (entrópia-transzfer), majd ennek ellenőrzésére részletes vizsgálatokat folytattunk rendezetlen növényi stresszfehérjékkel. Ezen vizsgálatok megkoronázása annak élő sejtekben történő NMR (in-cell NMR) megközelítéssel való kimutatása, hogy ezek a fehérjék in vivo is rendezetlenek, és ennek a rendezetlenségnek fontos szerepe van chaperone-funkciójukban. Kísérletes erőfeszítéseink további fontos eredménye egy új 2D elektroforézis-technika kidolgozása is, amely alkalmas a rendezetlen fehérjék elválasztására és új rendezetlen fehérjék sejtkivonatból történő azonosítására. Az új módszer lehetővé tette az első adatbázis, a DisProt ( adatokkal való feltöltését is. A rendezetlenség felismerése alapvetően változtatja meg és terjeszti ki a fehérjékről alkotott nézeteinket. A területen játszott alapvető szerepünket és meghatározó hozzájárulásunkat sokféle elismerés is megerősítette, például állandóan meghívott előadóként szerepelek fehérjekémiai konferenciákon (évente 5-10 alkalommal), illetve vendégprofesszorként előadásokat tartottam mintegy 50 egyetemen. EMBO támogatással sikerült megszervezni az első, teljesen ennek a témának szentelt konferenciát (EMBO- SPINE2 workshop Intrinsically unfolded proteins: from structure to function, május, Budapest). Egyik fő szervezője (vice-chair) voltam a rendezetlen fehérjékkel foglalkozó első Gordon konferenciának ( Intrinsically Disordered Proteins, július, Davidson, NC, USA), illetve elnöke leszek a második ilyen Gordon konferenciának (2012. július, West Dover, VT, USA). A tudományos kutatások és előadások mellett az oktatásból is aktívan kivesszük a részünket, PhD kurzusokat tartottam az ELTE-n (2005 és 2010), a St. Jude Kórházban (Memphis, USA, 2004), a Weizmann Intézetben (Rehovot, Izrael, 2006) és az ECUST Egyetemen (Sanghaj, Kína, 2008), a laboratóriumban az elmúlt években 8 PhD dolgozat készült, vagy van készülőben. Kutatási eredményeimből eddig összesen mintegy 100 cikk, 10 könyvfejezetet, valamint 1 könyv jelent meg, ezekre összesen több mint 3000 hivatkozást érkezett. Kutatásaimért 1993-ban Akadémiai Ifjúsági Díjban, 1999-ben és 2003-ban Bolyai János kutatási ösztöndíjban, 2010-ben Akadémiai Díjban, illetve Straub Plakettben részesültem. Kutatómunkámon kívül fontosnak tartom, hogy a tudományos közéletből is kivegyem a részem, többféle tudománypolitikai szerepet is vállaltam és vállalok, az Enzimológiai Intézet tudományos titkára, az MTA Biokémiai és Molekuláris Biológiai Bizottsága titkára, majd elnöke, az OTKA Infraindividuális I szakzsűri tagja, majd az OTKA Molekuláris Biológia (MOLBI) szakzsűri elnöke voltam, illetve vagyok. Tompa Péter 96

97 40 éves az SZBK Závodszky Péter visszaemlékezései Enzimológia 40 éves lett az SZBK, s most, amikor nekiültem, hogy erről az időszakról és annak tudományos terméséről írjak egy rövid jubileumi összefoglalót, magam is elgondolkoztam ezen a gyorsan elszállt négy évtizeden. Bár általában az SZBK-t nevezték a budapesti Enzimológiai Intézet anyaintézményének, a tényállás fordított. Az SZBK a Karolina úton és a SOTE Orvosi Vegytani Intézetében született. Straub F. Brúnó a hatvanas évek közepétől törekedett arra, hogy létrejöjjön Magyarországon egy korszerű, molekuláris orientációjú biológiai kutatóközpont. Miután a vidékfejlesztés érdekében elvetették a zugligeti változatot és döntés született a szegedi intézet létrehozásáról, megkezdődött az előkészítő munka. Engem fizikus lévén Straub F. Brúnó elsősorban a biofizikai intézet tervezésébe és szervezésének előkészítésébe vont be. A hatvanas években járunk, amikor a fehérjék térszerkezetének röntgenkrisztallográfiás meghatározása új fejezetet nyitott a szerkezeti biokémiában. Érthető és természetes, hogy az intézet egyik fő profiljának Straub ezt a területet szánta. Az volt a szándéka, hogy engem Londonba küld tanulmányútra, a Birkbeck College Biomolekuláris Kutató Laboratóriumába, John Bernal környezetébe, hogy ott sajátítsam el a fehérje-röntgenkrisztallográfia tudományát; itt dolgozott ekkor többek között Max Perutz, a friss Nobel-díjas. Az akkori politikai viszonyok között ez nem sikerült. A Külügyminisztérium nem adott kiutazási engedélyt a kommunista Bernal meghívólevele ellenére. Így kerültem azután Leningrádba 1964-ben, a Nagymolekulájú Vegyületek Intézetébe, Bresler és Volkenstein laboratóriumába, ami intellektuális szempontból jó hely volt, sokat tanultam, s megtanultam oroszul is, de a röntgenkrisztallográfiás tanulmányok ekkor elmaradtak. Hazatértem után ismertetett össze Straub Keszt helyi Lajossal, aki akkor a KFKI-ban dolgozott, és akit a szegedi Biofizikai Intézet leendő igazgatójának szemelt ki. Rendszeresen sokat beszélgettünk és tervezgettünk a majdani intézet tudományos és műszaki kialakításáról. Ezek a beszélgetések nagyon tanulságosak voltak számomra. Akkor néhány éve már egy biokémikus közösségben éltem mindennapjaimat, így beszéltem mind a fizikusok, mind a biokémikusok nyelvét, és igyekeztem Keszthelyi Lajost is bevezetni ebbe a kultúrába, ugyanakkor rám frissítően hatott az ő egyszerűen világos és logikus fizikusi gondolkodásmódja ben azután lehetőség nyílt, hogy ha némi késéssel is, de megkezdjem röntgenkrisztallográfiás tanulmányaimat. Straub közbenjárására elnyertem egy MTA/NSF ösztöndíjat és elindulhattam Pasadenába, hogy a California Institute of Technology Gates and Crellin Laboratóriumában, Richard A. Dickerson mellett dolgozhassak. A citokróm C szerkezetén dolgoztak akkor, ebbe a munkába kapcsolódtam be. Nagyon igyekeztem mindent megismerni, és főként a műszeres infrastruktúrára figyeltem. Elkészítettük Richard Dickerson és Joseph Kraut (La Jolla) segítségével egy korszerű fehérje-röntgenkrisztallográfiás laboratórium berendezési és beruházási tervét. Lelkesen tértem haza 1973-ban, azzal, hogy megyek Szegedre és munkához látok. Straub azzal fogadott, hogy időközben változott a helyzet, nem Keszthelyi Lajos, hanem Garay András lesz a Biofizikai Intézet igazgatója, s nem lesz röntgendiffrakciós laboratórium sem, mivel az erre félretett keretet egy spinpolarizátor építésére fordítják. Maradtam tehát Budapesten, folytattam ott, ahol abbahagytam: az enzimek működésének és a konformációs dinamika kapcsolatának igazolására és leírására kerestem kísérleti megközelítést. Folytatódott a tevékenységem a MOM analitikai ultracentrifuga további fejlesztésében is. A röntgendiffrakciós módszerhez csak mintegy három évtized elteltével kanyarodtam viszsza molekuláris immunológiai kutatásaink kapcsán, és azóta 5 komplementfehérje térszerkezetét határoztuk meg zimogén és aktív formában, valamint egy módosítási trükkel sikerült a C1 inhibitort kristályosítani és a rég óhajtott szerkezetet meghatározni. Szegeddel összefüggő adalék, hogy Szalontai Balázs nálunk kezdte kutatói pályafutását, szegedi státuszra a Biofizikai Intézetbe került, de csak az épület elkészülte után foglalta el állomáshelyét, addig együtt dolgoztunk, s barátságunk erre az időre vezethető vissza. 97

98 Enzimológia 98 E rövid történeti visszapillantás után kísérletet teszek arra, hogy magam és kutatócsoportom szakmai történetét és tudományos eredményeit is felvázoljam. E történet 1962-ben kezdődik, jelezvén, hogy volt élet már a szegedi intézet megalakulása előtt is. A hatvanas évek elején a biokémiában jelentős szemléleti, koncepcionális és technikai változások kezdődtek. Straub F. Brúnó felismerte ezt, és fizikust keresett a Karolina útra. Én is felismertem a lehetőséget, mind a molekuláris biológiai témában, mind Straub szuggesztív személyiségében, és döntöttem, biofizikus leszek. Straub első perctől egyenrangú partnerként kezelt, és rendszeresen kezdeményezett elmélyült szakmai beszélgetéseket. Arra volt kíváncsi, hogy egy fizikus miként képzeli el annak az atomhalmaznak a viselkedését, amit fehérjemolekulának nevezünk. Különösen a térbeli és energiabeli fluktuációk kérdése és azok statisztikus fizikai kezelésének lehetősége érdekelte. Ezek a beszélgetések is hozzájárultak azután az akkor forradalmi és ma már nyilvánvaló fluktuációs fit elmélet megfogalmazásához (Straub, 1964). Én, ezekben az években amellett, hogy készültem egy majdani szegedi röntgendiffrakciós laboratórium megalapítására azzal foglalkoztam, hogy egyrészt a dinamikus enzimműködés statisztikus fizikai leírását, másrészt a jelenség kísérleti bizonyításának lehetőségét megtaláljam. Az előbbit most is keresem, mivel a heterogén rendszerek statisztikus fizikája nem kínált elfogadható megoldást. A kísérleti munkában szerencsésebb voltam, a hidrogén-deutérium izotópkicserélődés sebességének infravörös spektroszkópia útján történő követése alkalmas módszert kínált, és ennek segítségével már 1966-ban sikerült a konformációs dinamika alapján nyugvó leírást adnunk az enzimek, szubsztrátumok által indukált konformációváltozásainak mechanizmusára. Ez a koncepció azóta is jelen van kutatócsoportunk kísérleti munkáinak értelmezésében. A későbbiek során elsősorban az allosztérikus jeltovábbítás mechanizmusának leírására törekedtünk számos, több alegységből álló enzim esetén ben újoncként, Elődi Pál laboratóriumába kerültem. Elődi - biológus létére nagy érdeklődést és fogékonyságot mutatott a fizikai megközelítés és a szerkezeti biokémia iránt. Fizikusi felkészültségemet és kísérletező beállítottságomat elsősorban a műszer- és módszerfejlesztésben igyekezett hasznosítani. Amikor a Karolina útra kerültem, alig volt komoly műszer az Intézetben: egy vizuális polariméterrel, sötét szobában mértünk optikai forgatást. Egyetlen kezdetleges spektrofotométer volt a házban. Fehérjemintáinkat magunk izoláltuk sertés- és rákizomból. A szubsztrátumokat magunk szintetizáltuk, tisztítottuk. Szinte semmit nem lehetett kellő minőségben megvásárolni. Deviza hiányban csak a hazai Reanal Finomvegyszer Gyárra számíthattunk no meg saját magunkra. Paradox módon, e nehéz és devizaszegény helyzetben, néhány év alatt megalapoztuk és felszereltük Straub Brúnó támogatásával az első hazai szerkezeti biokémiai laboratóriumot. Mai szemmel is imponáló és sokoldalú volt a fejlesztés, analitikai ultracentrifuga (PhyWe), Optikai Rotációs Diszperziós Spektrofotométer (Bellingham and Stanley), adiabatikus pásztázó mikrokaloriméter (DSC), akkor a világ legjobbja (DSzM4), Infravörös Spektrofotométer (Zeiss), kisszögű röntgen szórás (Shimadzu), fényszóródás és rotációs diffúziómérés (Brice-Phoenix), diffúziós készülék (saját építés), majd újabb analitikai ultracentrifuga (saját építés + MOM), hogy csak a fontosabb technikákat soroljam. Mindez néhány év alatt egyetlen laboratóriumban. A műszerépítés (akkor még volt 5 fős műhelye az Intézetnek) és módszerfejlesztés, valamint a szolgáltatás ebben az időszakban lekötötte csaknem minden energiámat. Az eredmény egy jól felszerelt laboratórium és egy gyenge publikációs lista az évtized végére. Ebben szerepe volt annak is, hogy belépésem után nem sokkal Elődi Pál Amerikába utazott, ami részére kivételes szerencse volt ebben az időben, de én a műszerépítési feladatokkal magamra maradtam. Jécsay Gyurkával ketten alkottuk a csoportot. Elődi hazatérve szakkönyvet (A globuláris fehérjék térszerkezet-vizsgálatának problémái és eredményei, Akadémiai kiadó, 1966) és könyvet (Levelek Tennessee-ből, Gondolat 1967) írt, valamint lexikont (Új magyar lexikon II. kiadás) szerkesztett. Ez nekem rengeteg technikai feladatot jelentett, ábrák rajzolása (nem volt még számítógép), irodalomjegyzék készítése, természettudományos szócikkek felülvizsgálata és korrigálása. Közben a csoporthoz csatlakozott Móra Zsuzsa, majd Libor Zsuzsa, akinek irányításával készült Ovádi (akkor még Kovács) Judit nagysikerű (lizinmódosítás) diplo-

99 mamunkája, 1969-ben Lakatos Zsuzsa és Simon István személyében két újabb fizikussal bővült a csoport. Elődi 1972-től már Debrecen felé orientálódott és a CalTech-ről való hazatérésem után fokozatosan megörököltem a csoport vezetését. Módszertani tárházunkat optikai (optikai rotációs diszperzió, cirkuláris dichroizmus, Fourier transz formált IR, UV- és fluoresz cencia spektroszkópia), hidrodinamikai (analitikai ultra centrifuga, fluoresz cencia depolarizáció, kisszögű röntgenszórás), energetikai (adiabatikus pásztázó mikro-kalorimetria, izotermális kalorimetria), immunológiai és enzimkinetikai, majd génsebészeti és fehérjeexpressziós módszerekkel bővítettük. A konformációs fluktuációk hőmérsékletfüggőek, de az enzimek marginális stabilitása folytán, egy-egy enzim csak meglehetősen behatárolt hőmérséklet tartományban vizsgálható, 1974-ben kiterjesztettük konformációs dinamikai vizsgálatainkat termofil mikroorganizmusokból izolált hőstabilis, majd később hidegtűrő mikroorganizmusokból izolált hidegtűrő enzimekre. Ennek kapcsán később három éven át ingáztam Budapest és Regensburg között, ahol Rainer Jaenickével, különböző hőstabilitású, homológ enzimsorokon végzett összehasonlító vizsgálataink alapján fektettük le a dinamikusan egyenértékű állapotok tételét, miszerint a különböző élettani hőmérsékleten működő enzimek térszerkezeti flexibilitása az evolúció során igazodott a működési hőmérséklethez, és igazoltuk számos esetben; erről a PNAS-ben megjelent, Kardos Józseffel közös közleményünket eddig több mint háromszázszor idézték, s a Nature News and Views rovatában Tunnel vision címmel érvként szolgált a hidridtranszfer-reakciók alagúteffektussal történő értelmezéséhez, kapcsolatot teremtve az enzimkinetika és a kvantummechanika között ben az akadémiai székfoglalóm címe is tükrözte a hatvanas évek óta bejárt utat: A merev fehérjemodellektől a kvantumenzimológiáig. Közben rendszerező tevékenységet is végeztünk Szilágyi Andrással a hőstabilis fehérjék világában, és a hőstabilitást meghatározó szerkezeti tényezőket foglaltuk rendszerbe az akkor rendelkezésre álló összes térszerkezet összehasonlító analízise útján; ez a munkánk a Science Editor s Choice rovatában Warm, hot and very hot címmel szerepelt. A kutatócsoport hagyományos témája fehérjék stabilitása, flexibilitása és működése közötti összefüggések feltárása. Ez a munka utat nyitott a fehérjék hőstabilitásának racionális tervezés útján történő megváltoztatásához. E munka egyik vonulata a fehérjék stabilitásának befolyásolása racionális tervezés, illetve irányított véletlen módszerek segítségével. A vizsgálatok elsősorban celluláz és xilanáz enzimekre irányultak. Kamondi Szilárddal ezen eredmények gyakorlati hasznosításának lehetőségeit is kerestük. A Papíripari Kutatóintézettel együttműködve környezetbarát technológiát dolgoztunk ki enzimes alapú cellulózfehérítésre. A hipertermofil xilanázon alapuló rendszer jól vizsgázott a lágyszárú növényekből készített cellulóz fehérítésében. Tovább folytatva ezt a munkát, a hőstabilitás szerkezeti hátterének elemzésére elkészített konstrukciókból megállapítottuk, hogy az enzimek terminális régiói, illetve az e régiók közötti kölcsönhatások fontos szerepet játszanak a szerkezet és a funkció stabilizálásában. A terminálisok szerepének alapos vizsgálatához kimérákat készítettünk. A hőstabilitás, a flexibilitás és az enzimaktivitás közötti összefüggések érvényességét többek között az IPMDH enzimen is vizsgáltuk. Svingor Ádámmal és Hajdú Istvánnal az enzim hidegtűrő, mezofil és termofil változatain kalorimetriás méréseket, valamint hidrogén-deutérium izotópkicserélődés segítségével hőmérsékletfüggő flexibilitásméréseket végeztünk ligandumok jelenlétében és távollétében. Megállapítottuk, hogy a két ligandum kötődése eltérő mértékben befolyásolja a stabilitást, illetve a flexibilitást, s ezt összefüggésbe hoztuk a ligandumkötés nyomán bekövetkező flexibilitásváltozásokkal. Ezek a mérések további adalékot jelentenek az enzimaktivitás nemarrheniusi viselkedésének értelmezéséhez. Ez a munka hozott össze Tairo Oshimával, akit azóta is barátomnak mondhatok, s aki a Japánban kötelező korai nyugdíjazása után, imponáló energiával szervezte meg a Tokiói Gyógyszerészeti (magán) Egyetem Molekuláris Biológiai Fakultását, ahol a fakultás hőskorában, 1996-ban, huzamosabb időt tölthettem. Vonderviszt Ferenc egyik meghatározó személyisége laboratóriumunknak, fizikusként nálunk kezdte tudományos pályafutását 1982-ben, és hosszabb japán kitérő után, ahol a baktériumok flagellumának szerkezetével és önszerveződésével foglalkozott, s két Nature Enzimológia 99

100 Enzimológia 100 címlap és egy Science cikk is fémjelzi ezt az időszakot, Feri hazatérése után újra csatlakozott hozzánk. Közben 2004-ben megszervezte Veszprémben önálló kutatócsoportját és a Nanotechnológiai Tanszéket, majd a Molekuláris és Nanotechnológiai Doktori Iskola vezetője lett 2006-ban. Közben továbbra is tagja maradt kutatócsoportunknak. Vezetésével sikeresen azonosítottuk a bakteriális flagellin sejten kívülre juttatását irányító exportszignált Salmonella baktériumban. Az exportszignált deléciós mutagenezissel és rekombináns fehérjeszekrécióval térképeztük fel Végh Barbarával. A térképezés végeredményeként egy 22 aminosavból álló szekvenciát (26-47 fragmentum) kaptunk, amely még képes volt a 8 kda molekulatömegű emberi C1r CCP2 rekombináns fehérjemodul sejten kívüli térbe juttatására. Megállapítottuk, hogy a korábban azonosított flagellinszegmens elégséges valamennyi tesztelt (6 db) fehérje exportjához, és feltehetően elégséges ahhoz is, hogy nemcsak a flagelláris fehérjék, hanem bármely fehérje kitekeredjen és unfolded állapotban átjusson a szűk (kb. 2 nm átmérőjű) csövön. Ennek a szekvenciának a további (akár az N-, akár a C-terminális oldal felőli) csonkítása teljesen meggátolta a szekréciót. Ez a szekvencia a flagellin fehérje rendezetlen, N-terminális részén található. A bakteriális flagellinnek ez a szakasza hajlamos amfipatikus helikális struktúrákba rendeződni. Elképzelhető, hogy ennek a tulajdonságának az exportfolyamat során is nagy szerepe van. Munkánk eredményeként nem csupán azonosítottuk az exportszignált, hanem megmutattuk azt is, hogy a szignál képes heterológ rekombináns fehérjéket a sejten kívüli térbe juttatni. Ez lehetőséget nyújt egy bakteriális alapú, rekombináns fehérjét a médiumba szekretáló expressziós rendszer kifejlesztésére. Ezzel kapcsolatban nemrégiben két szabadalmi bejelentésünk is született. A közelmúltban a csoport bioinformatikai részlege az 1998-ben nálunk PhD fokozatot szerző, majd az USA-ból hazatért Szilágyi András vezetésével ért el figyelemre méltó, önálló eredményeket, amellett, hogy modellező munkájukkal segítették az enzimológiai és immunológiai kutatómunkát. Kifejlesztettek, egyebek között, egy számítógépes eljárást, mellyel fehérjék DNS-kötő tulajdonsága jósolható a fehérje szerkezetéből (Cα pozíciók alapján), illetve pusztán szekvenciából is. Létrehoztunk egy internetes szervert is ( mely a fenti eljárással DNS-kötő tulajdonságot jósol a felhasználó által megadott térszerkezet, ill. szekvencia alapján. Elméleti modellek és bioinformatikai analízisek segítségével kimutattuk, hogy egy fehérje(részlet) rendezettsége a hidrofobicitás, a töltés és a fehérjeméret együttes függvénye. E paraméterek egy, a méret csökkenésével növekvő szélességű tartományában a fehérje(részlet) kontextusfüggő módon rendezett és rendezetlen is lehet. Ez az alapja a kapcsolt kötődés és felgombolyodás jelenségének. Megteremtettük az alapjait egy újfajta molekuladinamikai szimulációs eljárás, a diszkrét molekuladinamika (DMD) alkalmazásának is. Ez a módszer a hagyományos molekuladinamikához képest nagyságrendekkel gyorsabb, és különösen alkalmas peptidek és fehérjék felgombolyodásának, asszociációjának, illetve aggregációjának szimulálására. A program C nyelven írt forráskódja jelenleg mintegy 6000 sorból áll. A programmal sikeresen szimuláltuk dekahexa-alanin alfahélixbe tekeredését, illetve a hélix és a béta-hajtű konformáció közötti, hőmérsékletfüggő átmenetet, valamint 9 darab oktaalanin béta-lemez képződését, mely az amiloidképződés jó modellje. Folyamatban van kisebb fehérjék felgombolyodásának és amiloidképzésének szimulálása, kísérleti jellemzéssel párhuzamosan. A humán kallikrein-6 (hklk6) egy nemrégiben felfedezett, a központi idegrendszerben kifejeződő szerin proteáz enzim. A közelmúlt kutatásai alapján egyre nyilvánvalóbbá vált, hogy a humán KLK6 enzim rendellenes működése esetén részt vesz számos neurodegeneratív betegség (sclerosis multiplex, Alzheimer-kór, stroke) patogenezisében. Kézenfekvőnek látszik tehát, hogy a KLK6 proteáz egy ígéretes, új targetmolekula a neurodegeneratív betegségek elleni küzdelemben. Célkitűzésünk az volt, hogy hklk6 inhibitor keresésére in silico eljárást fejlesszünk ki és ezzel nagy méretű molekulakönyvtárat szűrjünk. Többféle dokkolási eljárás közül kiválasztottuk azt, amely a legmagasabb arányban dúsítja az ismert kallikrein inhibitorokat a gátló hatással nem rendelkező kis molekulák között. A kiválasztott eljárást alkalmaztuk egy kismolekulát tartalmazó könyvtárra. A harminc legjobb pontszámot kapott találat in vitro kísérleti ellenőrzése ígéretes ered-

101 ményeket adott. Az elmúlt évben bioinformatikai területen a csoport a fehérjeszerkezetek evolúciójának mechanizmusait is kutatta. Egy új fehérjecsaládot azonosított, melyben domének között szegmensek cseréje figyelhető meg, s ez árulkodik a szerkezet evolúciós történetéről. Egyszerűsített fehérjemodellek segítségével követtük a felgombolyodás és az asszociáció kapcsoltságát, továbbá egy új entrópiaszámítási módszert fejlesztettünk ki. Kutatócsoportunk az enzimek mellett kísérleti objektumként immunglobulinokkal is foglalkozott. Ezek a több doménből álló fehérjék jó objektumnak ígérkeztek a domének közötti allosztérikus jelátadás mechanizmusának felderítésére. Vizsgálataink azt igazolták, hogy a térben távoli antigén és a komplement kötőhelyek közötti jelátadásban a konformációs fluktuációknak a hapténkötés által történő áthangolása játszik szerepet. E téma kapcsán is elkalandoztunk a gyakorlati hasznosítás irányába és a Humán Rt.-vel együttműködésben a poliklonális IgG oldatok stabilitását megnövelő hidrofób aminosavak hatásmechanizmusában megállapítottuk a preferenciális hidratáció szerepét, amely eredmények új lehetőségeket kínálnak oldott antitestkészítmények stabilitásának növelésére. Az immunológiai téma kapcsán adódott lehetőségem arra, hogy Oxfordban, a Biokémiai Intézetben tölthessek egy évet a Nobel-díjas Rodney Porter laboratóriumában, ahol Raymond Dwekkel és Iain Campbellel dolgoztam együtt. Az MRC Immunkémiai Egységével (Robert Sim) a szakmai kapcsolat egészen az egység tavalyi feloszlatásáig fennmaradt, s kölcsönösen gyümölcsözőnek bizonyult. Az immunglobulinokkal végzett munka vezetett kutatócsoportunk egy másik, a mai napig sikerrel művelt kutatási irányához. A komplementrendszer aktiválási mechanizmusát kívánjuk felderíteni az abban részvevő proteázok szerkezetének alapján. Ezen a vonalon Verne Schumaker nevét kell említenem, meghívására 1985/86-ban egy évet töltöttem Los Angelesben a UCLA-n, ahol a komplementrendszer első komponensének, a C1-nek szerkezetét és működési mechanizmusát akartuk felderíteni. E tárgyban született összefoglalónk, amelyben egy funkcionális szerkezeti modellt posztuláltunk a C1 komplexre, az Annual Review of Immunologyban jelent meg 1987-ben, azóta is sokat idézik. Los Angeles és a UCLA azóta is része maradt az életemnek, ahol minden nyáron 1 quartert töltök munkával és kikapcsolódással, kiragadva magamat a hazai mindennapok sodrásából. Távol a napi feladatoktól nyugodtan lehet dolgozni, írni és főként gondolkodni. A komplementkutatás területén az tett bennünket versenyképessé, hogy bakulovírus-rovarsejt rendszerben elsőként tudtunk natív és áttervezett, emberi komplementproteázokat kifejezni (1988). Ez annak volt köszönhető, hogy Gál Pétert, aki egyetemi hallgatóként csatlakozott a csoporthoz 1984-ben, Venetianer Pálhoz delegáltam az SZBK-ba, Magyarországon ugyanis akkor csak ott rendelkeztek megfelelő szakértelemmel a rekombináns DNS technikában. Gál Péter hozta az új eszköztárat Szegedről, én pedig 1986-ban a bakulovírus alapú rovarsejtes expressziós rendszert Amerikából. Verne Schumaker barátom ekkor szánta rá magát, hogy 1 évig (sabbatical) nálunk dolgozzon a Karolina úton. Miután a C1q óriásmolekulájának expressziójával nem jutottunk előre, a komplementaktiválás klasszikus útjának proteázait állítottuk a munka középpontjába. Első lépésben a komplementaktiválás klasszikus, immunkomplexek segítségével történő aktiválásának mechanizmusára vonatkozóan tettünk új felismeréseket. Ennek alapjául szolgált, hogy sikerült röntgendiffrakciós módszerrel meghatározni a C1r térszerkezetét aktivált formában. Jelentős siker volt, amikor a világ számos laboratóriumában az utolsó 30 évben tett nagyszámú sikertelen próbálkozás után Beinrohr Lászlónak PhD munkája során sikerült a kissé áttervezett C1-inhibitor molekulát kristályosítani és annak térszerkezetét meghatározni. A C1-inhibitor csökkent működése vagy hiánya egy súlyos betegség, az örökletes angioödéma kialakulásához vezet, ezért működésének szerkezeti alapon történő megértése orvosi szempontból is nagy jelentőségű. Érdeklődésünk később kiterjedt a komplementaktiválás nemrégiben felfedezett lektin útjára is. A lektin-útvonalat nagyjából két évtizede fedezték fel, és mi a kezdetektől jelen vagyunk az útvonal molekuláris mechanizmusának feltárásában, és más élettani vagy patológiás folyamatokkal való kapcsolatainak kibogozásában. A mannánkötő lektinhez kötött szerin proteázok (MASP-1 és MASP-2) aktív, illetve proenzim formáinak szerkezetét meghatározva atomi szinten tudtuk Enzimológia 101

102 Enzimológia 102 értelmezni az aktiválás mechanizmusát. A lektinútvonal kutatásának kiteljesítésében meghatározó szerepe volt Gál Péternek, aki laboratóriumunkban a rekombináns DNS technikát e megközelítés hőskorában, 1986-ban meghonosította, s később a génsebészeti, szerkezeti biológiai és funkcionális szemlélet egyesítésével, a molekuláris modellezés bekapcsolásával, a komplementkutatás nemzetközileg meghatározó műhelyévé tette laboratóriumunkat. Része volt ebben Dobó Józsefnek, aki nálunk készítette doktori értekezését, majd az USA-ból új ismeretekkel felvértezve tért vissza a laboratóriumba. A molekuláris természetű munka sejtes rendszerekre való kiterjesztése Megyeri Márton érdeme, aki felismerte, hogy a PAR-4 receptorok útján a MASP-1 képes endotélsejteket aktiválni ben az ELTE Biokémiai Tanszékével együttműködésben egy új metodikát vezettünk be a komplement proteázok kutatásában: in vitro evolúciós módszert (fág-display) alkalmazva állítottunk elő olyan peptidmolekulákat, amelyek kötődnek a MASPok szubsztrátkötő felszínéhez és nagy specificitással gátolják az enzimaktivitást. Ha csak felsorolásszerűen is, érdemes megemlíteni néhány, e terület ismereteinek alakulásához meghatározóan hozzájáruló eredményünket az utolsó tíz évből: 2001: Meghatároztuk a C1r katalitikus régiójában elhelyezkedő három domén szerepét. A CCP1 domén feltétlenül szükséges a dimerizációhoz, míg a CCP2 modul a szubsztrát hatékony megkötésében játszik szerepet. Az autoaktiváció a szerin proteáz domén sajátsága. 2003: Tisztáztuk a MASP-1 és MASP-2 szubsztrátspecificitását. Bebizonyítottuk, hogy szemben az általánosan elterjedt tévhittel a MASP-1 nem képes aktív C3-at hasítani, csak annak hidrolizált formáját. Megmutattuk azt is, hogy meglepő módon, a MASP-1 sok vonatkozásban hasonlít a véralvadás kulcsenziméhez, a trombinhoz. 2004: Meghatároztuk az aktív MASP-2 enzim térszerkezetét. Megállapítottuk, hogy a MASP-2 eltérő módon köti a C2 és C4 szubsztrátokat, mint a hasonló specificitással rendelkező C1s. 2005: Meghatároztuk a MASP-2 zimogén formájának térszerkezetét. Az aktív és a zimogén szerkezet, valamint enzimológiai mérések segítségével modelleztük a MASP-2 autoaktiválódásának folyamatát, amely modell nagy valószínűséggel a többi autoaktivációra képes proteázra is érvényes. A MASP-2 autoaktivációs komplexe. A MASP-2 kristályokban a molekulák az autoaktivációra jellemző enzim-szubsztrát kölcsönhatást mutatják. Az egyik MASP-2 enzim aktivációs hurka (lila) a másik MASP-2 enzim aktivációs helyére (kék) illeszkedik be. A kristályrácsban minden MASP-2 molekula enzim és szubsztrát is egyben 2007: Meghatároztuk a C1-inhibitor eddig még nem ismert látens formájának térszerkezetét. A szerkezet segítségével értelmeztük a heparin C1-inhibitort moduláló hatásának molekuláris hátterét. A C1-inhibitor látens formájának térszerkezete. A reactive center loop (lila) hasadás nélkül inszertálódott a kékkel jelölt láncok által alkotott β-lemezes struktúrába tökéletes antiparallel szerkezetet hozva létre. Ezáltal a szerkezet stabilitása jelentősen megnövekedett és nem képes többé inhibitorként funkcionálni.

103 2008: Meghatároztuk a C1r autoaktivációs komplexének térszerkezetét. Ennek alapján továbbfejlesztettük a C1 komplex aktivációs modelljét. 2009: Felfedeztük, hogy a MASP-1 képes hasítani a proteázaktivált receptor-4-et (PAR4). A PAR4 hasítása révén a MASP-1 fontos proinflammatorikus útvonalakat indít be: képes endotélsejteket és leukocitákat aktiválni. Így egy új, közvetlen kapcsolatot találtunk a komplementaktiválás és a gyulladás folyamatai között. Meghatároztuk a MASP-1 katalitikus régiójának térszerkezetét. Ezzel magyarázatot tudtunk adni a MASP-1 proteáznak a többi rokon enziménél lazább szubsztrátspecificitására. A MASP-1 proteáz szubsztrátkötő árka. A MASP-1 proteáz szubsztrátkötő árka sokkal jobban hozzáférhető, mint a rokon komplement proteázok hasonló szerkezeti eleme. A C1r, C1s és MASP-2 esetében a szubsztrátkötést jelentősen gátolják a szubszrátkötő árkot leárnyékoló hurkok. Ez az oka annak, hogy a MASP-1 szubsztrátspecificitása sokkal lazább, mint a rokon komplement proteázoké. 2010: Szelektív inhibitorokat fejlesztettünk a MASP-1 és MASP-2 enzimek ellen. Megmutattuk, hogy a MASP-1 jelentősen hozzájárul a lektin-út aktiválásához. Felfedeztük, hogy a C1r CUB2-es doménje kalcium nélkül rendezetlen, flexibilis szerkezettel rendelkezik, ami kalciumion hatására rendeződik. A CUB2 domén flexibilitása döntő fontosságú lehet a C1 komplex aktiválódása során. A nyolcvanas évek végétől a csoport publikációs aktivitása és a publikációink visszhangja folyamatosan növekedett. Ezt annak tulajdonítom, hogy ekkor sikerült három módszertani területet (modellezés, rekombinánsfehérje-termelés, szerkezetmeghatározás) összekapcsolva, komplex módon kezelni a megoldandó kérdéseket. A csoporton belül birtokoljuk a géntechnológia, a fehérjeexpresszió, renaturálás és tisztítás, az enzimológia, a szerkezeti biofizika, a bioinformatika és molekuláris modellezés, a proteomika, valamint az immunológia eszköztárát. A problémák megfogalmazása mellett képesek vagyunk kísérleti anyagaink sajátkezű előállítására és ellenőrzésére. A szerkezeti és funkcionális vizsgálatok egy részét pedig az arra legjobban felkészült laboratóriumokkal kooperációban végezzük. Szoros munkakapcsolatban vagyunk az ELTE Biokémiai Tanszékével (Gráf László, Nyitray László, Pál Gábor, Kardos József), az ELTE Kémiai Intézettel (Náray- Szabó Gábor, Harmat Veronika, Perczel András, Láng András). Az endotélsejtek aktiválódását a SOTE III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratóriumának munkatársaival (Cervenák László, Prohászka Zoltán) együttműködve tanulmányozzuk. Inhibitorfejlesztés terén kooperálunk az ELTE Biokémiai Tanszékével (Pál Gábor). Nemrégiben kezdtünk egy együttműködést az ELTE Immunológiai Tanszékével (Erdei Anna, Bajtay Zsuzsa) a leukociták aktiválódásával kapcsolatban. Részt veszünk az ELTE biológus- és biofizikusképzésében, a Biológiai Doktori Iskola munkájában, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem informatika és bionika szakirányának képzésében (molekuláris biológia, biofizika, bioinformatika). A komplementrendszer kutatásában együttműködünk Robert Sim (Oxford, Dept. Pharmacology), Jens Jensenius és Steffen Thiel (University of Aarhus, Dánia) és Wilhelm Schwaeble (University of Leicester) kutatócsoportjával. A sikeres alapkutatási tevékenység során felhalmozott tapasztalatokat felhasználva számos alkalmazott kutatási program valósult meg a Richter Gedeon Rt., a CEVA Rt.-, valamint a TEVA (Humán) Rt.-vel történő együttműködésben. Tudományos irányításommal jött létre az MTA Enzimológiai Intézetében egy Kooperációs Kutató Központ, amely az ipari partnerek számára végez biotechnológiai tárgyú K+F feladatokat. A kutatási-fejlesztési projektek során az utóbbi öt évben öt szabadalom is benyújtásra került. Enzimológia 103

104 Enzimológia Verne Schumaker látogatása 1986-ban: A képen Gál Péter, Bíró Éva, Vonderviszt Ferenc, Simon István, Sárvári Miklós, Sápi Éva, Závodszky Péter, Verne Schumaker, Lakatos Zsuzsa és Csattos Irénke Tairo Oshima professzor látogatása 1992-ben: A képen Szilágyi András, Sárvári Miklós, Vonderviszt Ferenc, Svingor Ádám, Závodszky Péter, Hajós József, Tairo Oshima, Kulcsár Péter, Gál Péter, Szilágyi Katalin, Balczer Jánosné, Pataki Judit, Dobó József, Kardos József A kutatócsoport 2000-ben: Ambrus Géza, Závodszky Péter, Szilágyi András, Balczer Jánosné, Pataki Judit, Végh Barbara, Mató Tamás, Dobó József, Szilágyi Katalin, Lőrincz Zsolt, Gál Péter, Kamondi Szilárd, Kardos József, Diószeghy Zoltán, Hajdú István A kutatócsoport ma: Sebestyén Edina, Závodszky Péter, Végh Barbara, Beinrohr László, Németh Attila, Ambrus Géza, Kamondi Szilárd, Pataki Judit, Gál Péter, Gyimesi Gergely, Szilágyi Katalin, Cseh Sándor, Varga János, Kocsis Andrea, Lőrincz Zsolt, Figuli Andrea, Borbola Ildikó, Szavicskó István, Hajdú István, Major Balázs, Barna László 104 A visszaemlékezés végére elhelyeztem négy csoportképet, ami alkalmat ad arra, hogy név szerint megemlékezzek mindazokról, akik az elmúlt negyven évben társaim voltak a kutatómunkában. A neveket olvasva a képek alatt két dolog szembetűnő: a folytonosság és a változás. Folyamatosan csatlakoztak hozzánk diákok az évek során, akik doktori fokozatot szerezve, jobbára külföldön szereztek posztdoktori tapasztalatokat, majd hazatérve a csoportban, az intézetben vagy más helyen, de itthon folytatták szakmai pályafutásukat. A legelső csatlakozó Lakatos Zsuzsa volt 1968-ban, kandidátusként most laboratóriumvezető a Honvéd Kórházban, Simon István ban érkezett, ma a tudományok doktora, és 1987 óta sikeres elméleti kutatócsoportot vezet az Intézetben. Szalontai Balázs, a tudományok doktora, az SZBK Biofizikai intézetének jeles kutatója. Kilár Ferenc, a tudományok doktora tanszékvezető egyetemi tanár a Pécsi Tudományegyetemen, Váli Zsófia, PhD, ben Patthy Lászlóhoz átigazolt, majd az USA-ban volt posztdoktor. Vonderviszt Ferenc, a tudományok doktora, több éves tartózkodás után jött haza Japánból, megszervezte Veszprémben a Nanotechnológiai Tanszéket, fél lábbal, de teljes szívvel még mindig itt van a laborban, és közös témán dolgozunk. Neubauer József Kaliforniában a UCI kutatója. Gál Péter PhD, a UCLA-n töltött két évet, s visszatérte óta meghatározó tagja a csoportnak. Cseh Sándor PhD Franciaországban töltött posztdoktori évek után jött haza, és sikeres biotechnológiai vállalkozást vezet, Lőrincz Zsolt-

105 tal PhD, aki az USA-ból tért haza néhány éve. Sárvári Miklós PhD, az USA-ból visszatérve a Richter Gedeon NyRT kutatója lett. Dobó József Chicagóból tért viszsza és a csoport meghatározó szenior munkatársa. Szilágyi Katalin 1987 óta dolgozik velünk. Kardos József PhD és Németh Attila, PhD, japán kitérő után kerültek az ELTE Biokémiai Tanszékére, az utóbbi ma már egy biotechnológiai vállalat cégvezetője. Magyar Csaba, PhD, ma Simon István csoportjában dolgozik. Szilágyi András, PhD, Buffalóból jött vissza, hogy a csoport bioinformatikai munkáját vezesse. Diószeghy Zoltán, PhD, a pénzügyi világban csinált karriert, Bőthe Csaba a Magyar Telekom vezérkarában találta meg a helyét. Ambrus Géza La Jollában, a Scripps Intézetben töltött posztdoktori évek után, a Takeda Gyógyszer multi vezető kutatója Kaliforniában és haza készül. Végh Barbara, Hajdú István, Kamondi Szilárd, Beinrohr László nemrég doktoráltak és a csoportban dolgoznak. Kocsis Andrea és Gyimesi Gergely most nyújtja be PhD dolgozatát immunológiai, illetve bioinformatikai munkából. És vannak új ígéretes tehetségű doktoranduszok: Megyeri Márton, Major Balázs, Sajó Ráchel, Paréj Katalin, Győrffy Dániel. A csoportban az örökös megújuláshoz szükséges állandóságot amint a képek sorozatán is láthatjuk Gál Péter, Vonderviszt Ferenc, Dobó József, Szilágyi András, Szilágyi Katalin és Lőrincz Zsolt képviselik, és persze Pataki Judit és Balczer Júlia, akik nélkül a gépezet nem lenne működőképes. Befejezésül visszakanyarodnék az SZBK-hoz. Ez a keret sok vonatkozásban fontos az életünkben. Az a tudat, hogy mindig számíthatunk az ottani szellemi és műszeres infrastruktúrára, nagy versenyelőnyt jelent egy kis intézet számára, s talán még ennél is fontosabbak azok a találkozások a Straub Napok keretében, ahol a molekuláris biológiai kutatások széles spektrumának részleteibe nyerhetünk bepillantást, ahol a rokon területek jeles művelőivel konzultálhatunk. A személyes szakmai-baráti kapcsoltatok biztonságot és segítséget jelentenek a tudományos világban való eligazodásban. A Keszthelyi Lajossal négy évtizede folytatott beszélgetések alapozták meg későbbi baráti kapcsolatunkat, és ez szerencsésen átörökítődött a Biofizikai Intézetben Ormos Pálra, főigazgatói szinten pedig Dudits Dénesre. Ha az SZBK-ban járok, a Biofizikai Intézetet soha nem kerülöm el. Az SZBK, majd később a Straub Napok jó alkalmat adtak egy-egy hosszabb látogatásra és elmélyült beszélgetésekre. Ezt soha nem mulasztottam el, és az előadások hosszú sorát is figyelemmel végighallgattam. Az utóbbi években az Enzimológiai Intézet igazgatójaként sok segítséget kaptam az SZBK-tól és a rendszeres igazgatótanácsi értekezletek nagy hasznomra voltak az intézetvezetés technikájának finomításában. Mindig otthonosan éreztem magam Szegeden, remélem, hogy formális önállósodásunk ellenére a kapcsolat és az otthonosság érzése megmarad. Závodszky Péter Enzimológia 105

106 Genetika 106

107 SZBK Genetika Genetikai Intézet 6726 Szeged, Temesvári krt Szeged, Pf

108 Genetika A nitrogénkötő szimbiózis molekuláris folyamatainak felderítése: a baktérium és növény együttélésének titkai 108 A pillangósvirágú növények és Rhizobium baktériumok által kialakított nitrogénkötő endoszimbiózis vizsgálata az SZBK Genetikai Intézetében a kezdetektől jelen lévő téma. E kutatási terület magas szintű tanulmányozása és az elért eredmények évtizedek óta összeforrnak az intézet nevével Magyarországon és külföldön egyaránt. A kutatások folytonosságát mindig aktuális témaválasztás jellemzi, valamint folytonos megújulási képesség az új irányok kijelölésében, az alkalmazott megközelítésekben és az adott kori modern technikákban. Mindez a csoporttagok szorgalmas munkájával és kitartásával párosulva, a mindenkori témavezető irányításával vezetett a kimagasló eredményekhez, rangos közleményekhez és a nemzetközi tudományos életben kivívott elismertséghez. A fő csapásirány, a szimbiózis molekuláris alapjainak kutatását elősegítendő olyan kísérletek is folytak a laboratóriumban, melyek révén általános érvényű fontos eredmények is születtek, mint pl. a Rhizobium baktérium vagy a lucernanövény kapcsoltsági térképei, evolúciós genom-összehasonlító vizsgálatok stb. Természetesen e szerteágazó és több generáción átívelő munkásság bemutatásakor jelen keretek között lehetetlen a teljességre törekedni, de a főbb, meghatározó kísérletek, elgondolások, eredmények és modellek ismertetését, valamint az azokat létrehozó személyek kiemelését megkíséreljük az alábbiakban. A képeken balról jobbra: néhány hetes lucernanövény N-mentes táptalajon, mellette ugyanilyen növény a szimbionta Rhizobium partner jelenlétében növesztve; egy virágzó lucernanövény; a gyökérgümők kinagyított képe. Kiderül majd, hogy a technikák fejlődésével hogyan jutottunk el a baktériumok keresztezésétől a különböző jelmolekulák felderítéséig, a baktériumban és a növényi genomban megbúvó szimbiotikus génekig, valamint a DNS-chip alkalmazásán át a reverz genetikai módszerekkel azonosítandó, mezőgazdaságilag fontos génekig. A nitrogénkötő szimbiózis kialakulása igen izgalmas témakör: az, hogy két, egymástól filogenetikailag távol álló szervezet miképpen tud létrehozni egy ilyen specifikus, finoman hangolt együttélési formát, immár negyedik évtizede újabb és újabb felfedeznivalókkal szolgál a molekuláris biológusok számára. Magát a jelenséget még ennél is régebb óta vizsgálják, hiszen már a XIX. században beszámoltak a pillangósvirágúak gyökerén látható fura képződményekről, a gümőkről, és azok lakóiról, a baktériumokról. A makro- és mikroszkópos elemzésekkel szépen le lehetett írni a szimbiózis kialakulásának folyamatát: a gyökérszőrök görbülését, a baktériumok bejutását és infekciós fonálon belüli haladását a gyökér közepe felé, ahol már az osztódó kéregsejtek hozzák létre az új növényi szervet, a gümőt. A gümő belsejében a baktériumok az infekciós fonálból lefűződnek, elfoglalják a növényi sejteken belül a helyüket, és ún. bakteroidokká alakulnak. Ebben a formában válnak képessé a nitrogén megkötésére, vagyis ammóniává történő redukálására az ekkor már termelődő nitrogenáz enzimjük révén. A növény biztosítja a megfelelő környezetet és a szükséges energiát, cserébe a baktérium kellő mennyiségű kötött nitrogénnel látja el. Később a genetikai és molekuláris biológiai vizsgálatok segítségével, a mutánsok révén azonban már azt is megismerhettük, milyen összehangolt folyamatok eredményezik a látható átalakulásokat. Így derült fény arra, hogy a növények gyökerén fejlődő szimbiotikus gümők egy precízen szabályozott többlépcsős folyamat eredményeként jönnek létre. A lépcsőkön való továbbjutáshoz specifikus jelmolekulák, valamint

109 azok megfelelő érzékelése szükséges, s mindezek alapját a baktérium és a növény részéről is számos specifikus gén biztosítja. A képeken bal oldalon: a szimbiózis kezdeti folyamatai láthatók a növény gyökerében, a fenti képen a bejutott Rhizobiumok haladása a gyökérszőrben az infekciós fonálban, lent az infekciós fonál és a benne lévő baktériumok bejutása követhető nyomon a már kialakult gümőkezdeménybe (np). A baktériumok lacz riportergén segítségével lettek kékre festve. A jobb oldalon: a lucernanövény teljesen kifejlett gyökérgümőjének metszetében látható a gümő négy zónája, melyek közül a III. zónában történik a nitrogénkötés. Már az 1970-es években, amikor még csak a baktérium partner molekuláris vizsgálatának megkezdésére volt lehetőség, a kutatók szeme előtt az éppen aktuális megfejtendő tudományos kérdés mellett mindig ott lebegett a messze távoli cél: a folyamat részletes megismerésével egy nap talán majd sikerül kiterjeszteni a pillangósvirágú növények e páratlan képességét más növényfajokra is. Igen, első hallomásra ez olyan fikciónak tűnhet, melyen jó esetben csak elnézően mosolyognak az emberek sőt a biológusok többsége is. Ugyanakkor egyértelmű, hogy a nitrogénkötésnek e természetes formája a leghatékonyabb, és hatalmas előnyt jelent az élőlények számára. Jelenleg elsődlegesen csak a pillangósvirágú növényeknek biztosít megfelelő nitrogénellátást, a környezet számára közvetett a pozitív hatása azzal, hogy ezek termesztését követően a talaj is feldúsul a többi növény számára is hasznosítható nitrogénben. A fenntartható mezőgazdaság számára azonban mely a jövőben a túlnépesedett Földet lesz hivatott ellátni megfelelő minőségű és mennyiségű élelmiszerrel egyértelműen nagy segítséget jelentene, ha a szimbiotikus nitrogénkötés kiválthatná a nitrogéntartalmú műtrágyák alkalmazásának nagy részét, melynek nemcsak energiaigényes az előállítása, hanem nagymértékben szennyezi is a környezetet. Kutatásaink révén egyre közelebb jutunk a folyamat molekuláris alapjainak egyre teljesebb leírásához, a specifikus funkciókat irányító gének megismeréséhez, mely elengedhetetlen minden további tervezgetéshez. És pontosan a genetikai vizsgálatoknak, valamint az új genomikai módszereknek és genomprogramoknak köszönhetően derült fény arra, hogy a nitrogénkötő szimbiózist specifikusan irányító növényi gének egy része elengedhetetlen az ősibb és a növényvilágban széles körben elterjedt Mycorrhiza gombákkal kialakított szimbiózishoz is. E gének megfelelői feltételezhetően jelen vannak minden, a Mycorrhiza szimbiózisra képes növényben. Emellett újabb és újabb szimbiotikus génekről bizonyítják be, hogy más növényekből származó homológ géneket megfelelően kifejeztetve, azok képesek komplementálni a mutáns fenotípust a pillangósvirágú növényben, azaz ellátni egy adott szimbiotikus funkciót. A növényi szimbiotikus gének azonosításával párhuzamosan tehát azok evolúciós fejlődését és a homológ rokon géneket is konkrétan vizsgáljuk ma már, hogy közelebb kerüljünk a távoli cél eléréséhez. Elmondhatjuk, hogy a folyamat genetikai alapjairól származó egyre gyarapodó információ nemcsak hogy nem töri le a kutatók lendületét a távoli célok eléréséhez vezető úton, hanem épp bíztató jeleket küld, melyek nagy része ugyan még megfejtésre, ötletekre és elhivatott kutatómunkára vár, de érdemes folytatni azt a munkát, mely eddig is lelkiismeretesen folyt a szegedi csoportban. Az intézet indulásakor a Sík Tibor vezette kutatócsoport a Rhizobium baktérium bakteriofágját kutatta. Rövid időn belül azonban a szimbionta baktérium molekuláris vizsgálata felé nyitottak új irányt, melynek élére 1972-ben már Kondorosi Ádám állt, aki meghatározó alakja lett a szimbiotikus nitrogénkötés kutatásának először Szegeden, majd az egész világban. Kondorosiék, az intézet igazgatója, Alföldi Lajos professzor, valamint az akkoriban még sűrűn az intézetben vendégeskedő külső tanácsadó, Rollin Hotchkiss professzor tanácsára kezdtek hozzá a Rhizobium genetikai kutatásához. Első jelentős közleményük e témában Hotchkiss professzorral együtt- Genetika 109

110 Genetika működésben jelent meg a Nature egyik kiadványában 1973-ban, melyben mutáns baktériumok előállításával, szelekciójával és vizsgálatával igazolták, hogy a Rhizobium baktérium nitrát-reduktáz és nitrogenáz enzimeinek (ez utóbbi a biológiai nitrogénkötésre képes enzim) léteznek közös genetikai determinánsai is. Sorban kidolgozták, illetve optimalizálták a Rhizobium baktérium genetikai vizsgálatához szükséges eszközöket, a hatékony mutánsizolálási eljárást és a különböző génbeviteli módszereket (transzformáció, transzdukció, konjugáció). Ezek segítségével egyrészt dolgoztak egy mutánspark létrehozásán, másrészt meghatározták a vizsgált gének sorrendjét a Rhizobium meliloti baktérium kromoszómáján, s megalkották cirkuláris kapcsoltsági térképét. A Rhizobium genetikai térképének közlése volt az első olyan kiemelkedő publikáció, mely kizárólag a szegedi csoport kutatóinak munkájaként jelent meg a Nature folyóiratban 1977-ben Kondorosi Ádám, Kiss György Botond, Forrai Tamás, Vincze Éva és Bánfalvi Zsófia munkája nyomán. Ez az eredmény lehetőséget adott arra is, hogy később négy Rhizobium baktériumfaj genetikai térképeinek összehasonlító elemzésében is részt vegyenek nemzetközi együttműködésben. Rhizobium meliloti baktériumban. A 80-as évek elejére aztán kiderült, hogy a szimbiózis kialakításáért felelős gének többsége nem a kromoszómán helyezkedik el a Rhizobium meliloti baktériumban, hanem a baktériumban található két megaplazmid, a 140 Mdal (prme41a) és a több mint 300 Mdal (prme41b) egyike, a prme41b hordozza azokat. Kiderült ugyanis, hogy a Rhizobium baktériumok hőkezelése hatására a megaplazmidok vesztenek méretükből, vagyis a baktériumok deléciós származékokat hordoznak, és ezek között könnyen azonosíthatók voltak szimbiotikus mutánsok. A két fő mutánskategória az ún. Nod fenotípusú, a szimbiotikus gümő kialakítására (vagyis nodulációra) képtelen, illetve az ún. Fix mutáns, melynek adására a növény gyökerén ugyan megjelennek gümők, azonban a baktérium mutációjának következményeként a folyamat nem jut el addig, hogy a nitrogénkötés végül megvalósulhasson. A Fix mutánskategóriának aztán számos változatát lehetett azonosítani, kezdve attól a mutánstól, mely egyáltalán nem tudott behatolni a gümő szöveteibe, az infekciós fonálban elakadtakon át egészen azokig a mutánsokig, melyek, bár kényelmesen elhelyezkedtek a gümő sejtjeiben, mégsem tudták elvégezni feladatukat. 110 A Rhizobium meliloti 41 törzs kapcsoltsági térképe A Rhizobium mutánsgyűjtemény létrehozásával pedig megnyílt az út különböző típusú mutánsok izolálására és jellemzésére. Ilyenek voltak pl. a 70-es években az asszimilációs nitrát-reduktáz mutánsok, melyek genetikai és biokémiai elemzése több közleményt is hozott. További kutató-fejlesztő munka folyt a genetikai eszközök bővítésére, ennek egyik állomásaként pl. egy R-prime plazmidot állítottak elő A képeken baloldalon gyökérgümők fénymikroszkópos képe, vad típusú, illetve egy Fix mutáns Rhizobiummal szimbiózisban. Jobb oldalon elektronmikroszkópos képek mutatnak egy-egy gümősejtet baktériumokkal, a felső képen vad típusú, az alsón Fix mutáns baktériummal A 80-as években e bakteriális mutánsok és a mutációt szenvedett gének jellemzése állt a kutatások középpontjában, és a korábban említett kutatók mellé további kutatók és diákok (későbbi sikeres kutatók) sorakoztak fel, akik közül feltétlenül említést érdemel Sváb Zóra, Dusha Ilona, Bánfalvi Zsófia, Putnoky Péter, Györgypál Zoltán, Horváth Beatrix és a Bioké-

111 miai Intézetből Kondorosi Éva. A mutánsok elemzésekor először behatárolták, hogy melyik régió szükséges a gümő kiváltásához, és erről a régióról az is bebizonyosodott, hogy más Rhizobium fajok mutánsát is lehet a vad típusú szakasszal komplementálni, így ezeket elnevezték közös nodulációs géneknek. Ezek mellett azonosítottak olyan géneket is, melyek a megfelelő gazdaspecifikusan indukált gümőképzésért voltak felelősek. Elsőként közölték a közös nodulációs gének szekvenciáját, és hasonlították össze a párhuzamosan megjelenő publikáció másik Rhizobium fajában leírt gének szekvenciájával. S ha már történeti áttekintésről van szó, annak érzékeltetéseként, hogy mit is jelentett akkoriban több mint 3 kb. DNS-szakasz szekvenciáját meghatározni, álljon itt példaként az első megszekvenált gümőképzési (nodulációs) nod gének közleményéből egy részlet. Részlet a Rhizobium meliloti nod gének szekvenciájából a korabeli közlésnek megfelelő formában. Az aláhúzott nukleotidok megegyeznek a R. leguminosarum baktérium homológ génjében találhatókkal A nodulációs gének között akadt olyan is (nodd), melyről kiderült, hogy az általa kódolt fehérjerészt vesz a növény gyökerei által kibocsátott flavonoid típusú vegyületek gazdaspecifikus felismerésében, s egyúttal azok hatására indítja be a többi nod gén kifejeződését. Ezek funkcionális jellemzésével és evolúciós érdekességeivel is foglalkozott a csoport. Ugyanúgy, mint a gazdaspecifikus nodulációs (hsn) gének részletes vizsgálatával, melynek eredményeit a Cell folyóirat hasábjain közölték a kölni Max-Planck Intézet kutatóival együttműködésben. A kapcsolat Kondorosi Ádám csoportvezetőn keresztül valósult meg, aki maga is hosszabb időt töltött ott a 80-as évek második felében. A Nod mutánsok mellett a Fix mutánsok egy része is a prme41b megaplazmidon lokalizálódott. Ugyanakkor a csoportban újonnan bevezetett transzpozonos (Tn5) mutagenezis segítségével további Fix mutáns baktériumot izoláltak, melyek némelyike már a kromoszómához volt köthető, ezeket is kategorizálták és jellemezték, meghatározták a mutációt szenvedett géneket. Elmondhatjuk, hogy a 80-as évek végére az alkalmazott hatékony genetikai módszerekkel a Rhizobium baktériumoknak a szimbiózis kialakításához és működtetéséhez szükséges génjeinek nagy részét megtalálták, a mutánsokat jellemezték, és ebben a munkában a szegedi csoportnak meghatározó szerepe volt a nemzetközi tudományos életben. Hiányzott még ugyanakkor annak az ismerete, hogy e gének által kódolt fehérjéknek pontosan mi is lehet a szerepe. Vajon hogyan lehet összekötni az azonosított géneket azzal a megfigyeléssel, hogy a Rhizobium baktériumok exudátumának adása is hatásos a gazdanövény gyökerén, kiváltja a jellegzetes gyökérszőrdeformációt, és ún. üres gümők megjelenését is? Erre a kérdésre már a 90-es évek kutatásai adták meg a választ. Francia kutatók 1990-ben közölték eredményeiket, miszerint a Rhizobium baktériumok egy lipochitooligoszacharid típusú jelmolekulát termelnek, melyet Nod-faktornak neveztek el, és ennek van szimbiotikus válaszokat kiváltó, gazdaspecifikus hatása a pillangósvirágúak gyökerén. A közös nod génekről igazolták, hogy a Nod-faktor általános szerkezeti felépítésében résztvevő fehérjéket kódolnak, míg a hsn gének a gazdaspecifitásért felelős egyedi kémiai módosításokért felelősek. Ezzel tehát megoldódott az a rejtély, hogy a baktérium részéről mire van szükség a szimbiotikus gümő kiváltásához. A Fix mutánsok elemzésével pedig kiderült, hogy a baktériumok különböző felszíni poliszacharid-vegyületei is jelmolekulaként szolgálnak a szimbiózis folyamatában, melyeknek nagy szerepük van abban, hogy a megfelelő Rhizobiumok zavartalanul végig tudjanak haladni az infekciós fonálban és bejussanak a gümő sejtjeibe. A szegedi kutatások mutatták ki, hogy a mások által is leírt baktériumsejt-felszíni exopoliszacharid (EPS) és lipopoliszacharid (LPS) molekulákon kívül az ún. kapszuláris poliszacharid (KPS) molekulák is fontos jelmolekula-szereppel bírnak bizonyos Rhizobium fajok és gazdanövényeik szimbiotikus gümőjének Genetika 111

112 Genetika 112 elfoglalása során. Ebben a munkában a korábbi csoporttagok mellett újabb diákok, későbbi kutatók is részt vettek: Petrovics György, Kereszt Attila és Kiss Ernő. A kilencvenes években tehát a Rhizobium baktérium részéről a legtöbb jelentős szimbiotikus (Nod és Fix) gén szerepének jellemzése is megtörtént. Ekkor a csoport vezetője, Kondorosi Ádám már egy francia intézet igazgatója volt, így idejének csak elenyésző részét töltötte Szegeden, ám kapcsolata megmaradt az itthoniakkal. Szoros együttműködést (ikerlaboratóriumot) alakított ki a két intézet között, mellyel számos fiatal kutatónak is lehetőséget nyújtott rövidebb-hoszszabb tanulmányútra a francia intézetben. Szegeden a poliszacharid-jelmolekulákat vizsgáló csapat mellett Dusha Ilona egy újabb bakteriális altémával színesítette palettát: milyen hatással lehet a talaj kötött nitrogén-tartalma a Rhizobium szimbiotikus viselkedésére? Bár az már régóta ismert volt, hogy kötött nitrogén jelenlétében nem jön létre a szimbiózis, annak gátló hatását a növényen ismerték, a bakteriális nodulációs gének aktivitásának nitrogén általi regulációja viszont az újdonság erejével hatott. A szimbiózis növényi partnerének vizsgálata Kiss György Botond vezetésével indult a 80-as évek második felében. A baktériumnál sokkal bonyolultabb növényi genom vizsgálatához azonban első megközelítésben ki kellett dolgozni a megfelelő eszközöket a molekuláris genetikai vizsgálatokhoz. Ennek részeként lucernagénbankot állítottak elő, részt vettek e növény Agrobacterium tumefaciens baktérium által közvetített transzformációs módszerének kidolgozásában, valamint elkezdődött a lucerna kapcsoltsági térképének megszerkesztéséhez vezető genetikai munka is diploid egyedek keresztezésével és szegregáló populáció előállításával. Ezek a munkák először elsősorban Vincze Éva és Végh Zoltán közreműködésével készültek, majd Ökrész László, Kálmán Katalin, Csanádi Gyula, Kaló Péter és Endre Gabriella, még később Kevei Zoltán és Kereszt Attila is bekapcsolódott a lucerna molekuláris genetikai és genomikai kutatásokba. Az első időszakban a létrehozott cdns-génbankot kihasználva izoláltak a gyökérgümőben specifikusan kifejeződő lucernagéneket ún. differenciális hibridizációs technikával. A lucerna egyik leghemoglobin génje mellett egy másik gént is azonosítottak ily módon, mely a nodulin-25 (Nod-25 vagy N25) nevet kapta. E gének gümőspecifikus kifejeződése mellett igazolták a fehérje jelenlétét, illetve a promóterrégió specifikus aktivitását is a gümősejtekben. N25-GUS transgenic Lb N25 Az első szimbiotikus lucernagének azonosítása. A felső képeken differenciális és megerősítő hibridizációk, az alsón a promóteraktivitás és a fehérjekimutatás képei láthatók 1993-ra elkészült a lucerna kapcsoltsági térképe, és kezdetét vette az a kutatási folyamat, melynek kitűzött célja a szimbiotikus gének azonosítása volt genetikai térképezésen alapuló klónozással. A hagyományos genetikai megközelítési módszer alkalmazását nagyban alátámasztotta az az eredmény is, mely szerint a lucerna térképező populációból szegregáltak ki olyan egyedek, melyek null-mutáció következtében nem tartalmazták az ENOD12-nek nevezett szimbiotikus gént (melyet szintén differenciális hibridizációval találtak és írtak le egy másik laboratóriumban), és mégsem lehetett semmiféle hibás szimbiotikus fenotípust megfigyelni náluk. Amikor viszont egy mutáns növényből indulunk ki, mely nem képes szimbiózist kialakítani, tehát hibás valamelyik lépésben, akkor, ha sikerül azonosítani a mutációt szenvedett gént, biztosak lehetünk abban, hogy olyan gént izoláltunk, melynek funkciója elengedhetetlen az adott folyamatban. Mivel akkoriban még nem létezett genomprogram a pillangósokra, így célzott és nagyszabású mutánselőállítás sem, ezért erre a célra az irodalomban leírt s így egyedüliként elérhető

113 szimbiotikus lucernamutánsok (tetraploid növények) voltak alkalmasak. S bár nagy kihívás volt a tetraploid lucernamutánsból kiindulni a térképezésen alapuló génklónozás felé, a kiválasztott NN-1008 jelű Nod- mutánssal kezdetét vette a hosszadalmas munka. A megfelelő szegregáló populáció létrehozása és az egyedek szimbiotikus jellemzése után a mutációval kapcsoltságot mutató molekuláris markereket azonosítottak. Ez úgy történt, hogy a Nod és Nod + egyedek külön-külön elegyített genomi DNS-mintáját tesztelve RAPD marker-jelölteket kaptak, a valódi kapcsoltságot mutató markereket egyedi DNS-ekkel végzett reakciókban igazolták. E kapcsolt markerek térképhelyét kellett azután a diploid lucernatérképen is meghatározni, és ezáltal a régióba térképeződő további molekuláris markerek is rendelkezésre álltak, illetve célzottan lehetett telíteni még újabb markerekkel. A mutáció genetikai térképezésével sikerült a mutációhoz olyan szorosan kapcsolt molekuláris markereket azonosítani, melyekkel már át lehetett lépni a folyamat következő lépésére, a fizikai térképezésre és a genomsétára a mutációt szenvedett gén felé. Ennek technikai kivitelezéséhez azonban hiányzott még egy megfelelő génkönyvtár, szerencsére a texasi egyetemen Doug Cook laboratóriumában akkoriban végeztek a lucerna közeli rokona, a Medicago truncatula növény első genomi BAC könyvtárának elkészítésével. Együttműködésben jellemezték ezt a könyvtárat, s ezáltal 1998-ban már elérhetővé váltak a klónok és a reprezentatív filterek a vizsgált mutáció fizikai térképezéséhez, a genomsétához és a mutáns megismeréséhez. A kitartó munka végül meg is hozta kívánt gyümölcsét: sikerült azonosítani az első szimbiotikus receptor kináz gént lucernából, mely a Nodulációs Receptor Kináz (NORK) elnevezést kapta. S ez az úttörő jellegű eredmény meghozta a nitrogénkötés molekuláris genetikáját kutató csoport számára a második olyan Nature közleményt 2002-ben, mely kizárólag a szegedi csoport kutatóinak munkájának volt köszönhető. Emellett természetesen újabb és újabb molekuláris markerek elhelyezésével tovább folyt a lucerna genetikai térképének fejlesztése, finomítása, amely hathatós segítséget nyújtott a tudományos életben pillangósvirágú modellnövénynek választott Medicago truncatula genetikai térképének későbbi megszerkesztésében is. Ezáltal a szegedi csoport bekerült annak a nemzetközi genomprogramnak a vérkeringésébe, mely számos amerikai és európai laboratórium összefogásával folyt. A megfelelő mennyiségű génalapú marker helyének meghatározása megnyitotta az utat a genetikai térképek nagyléptékű összevetéséhez (ún. macrosynteny), majd a szekvenálási programok előrehaladása a rövidebb genomszakaszok részletekbe menő összehasonlítását is lehetővé tette (microsynteny). A szegedi csoport a már említett két Medicago faj genomjának összehasonlító elemzésén kívül a lucerna és a borsó genetikai térképének kolinearitását vizsgálta behatóbban. A NORK gén körüli genomi régió felépítésének tüzetes összevetése más növények genomjában megtalálható hasonló szakaszokkal (melyek genomszekvencia-információja adatbázisokban elérhető volt) pedig érdekes új evolúciós következtetésekhez vezetett. Genetika A lucerna és borsó genetikai térképének összehasonlító mátrixa közös, génalapú markerek térképhelyei alapján A Nodulációs Receptor Kináz (NORK) fehérje szerkezeti felépítése Az új évezred beköszöntével tehát elérkeztünk a genomika korszakába, mely a pillangósvirágúak vizsgálatában is fellendítette a kutatásokat. Az első receptorgén azonosítása óta sok új szimbiotikus növé- 113

114 Genetika 114 nyi gént izoláltak több külföldi laboratóriumban is, és ezekhez a munkákhoz számtalan esetben a szegedi csoportból származó kutatók is aktívan hozzájárultak. E szimbiotikus gének megismerésével körvonalazódik egyre élesebben, hogy miként érzékelik a növények a szimbionta baktérium által küldött jelmolekulákat, és milyen érzékelő és jelátviteli utak segítik a szimbiotikus folyamatok pontos és összehangolt előrehaladását. Az SZBK Genetikai Intézetében közben ismét cserélődött a csoport kutatói állománya. Kiss György Botond és Kaló Péter Gödöllőre történő távozását követően, az éppen hazatérő Endre Gabriella vezetésével a szintén hazatérő Kereszt Attila, Kiss Ernő és Oláh Boglárka kutatók vitték tovább a témát az elődökhöz méltó szellemben. Miközben a fő hangsúly továbbra is a szimbiotikus gének és azok funkciójának felderítése volt, a kornak megfelelően modern genomikai módszerek is bevetésre kerültek, és bekapcsolódtak a genomprogram új irányába, a modellnövény transzpozonos mutánsvonalainak létrehozásába is. A Medicago DNS-chip segítségével egyszerre több mint 6000 gén kifejeződésének változásait tudták nyomon követni a szimbiotikus folyamatban, és só-, illetve szárazságstressz hatására is. A különböző kísérletekből kapott génjelöltek feldolgozása még folyamatban van. Az egyik lucerna DNS-chip kísérletsorozat eredménye: számos indukálódó génjelöltet sikerült azonosítani különböző idejű sóstressz hatására a nem szimbiotikus és szimbiotikus gyökérben egyaránt. A szimbiotikus gének frontján közben a NORK gén és fehérje még részletesebb vizsgálata folyt, mely magában foglalta az esetlegesen kölcsönható gének, fehérjék keresését, majd azok jellemzését is. Ezzel a munkával egy újabb szereplőt sikerült azonosítani a szimbiózis növényi partnerében. Párhuzamosan folyt emellett egy másik szimbiózisban hibás növény, a lin vizsgálata, a mutáns gén térképezésen alapuló klónozása. Ebben a mutánsban egy kicsit későbbi lépésben, a baktérium inváziós folyamatában akadt el a szimbiózis. A baktériumok ugyan bejutottak, és kialakult az infekciós fonál is, ám ez csak a gyökérszőrök alapjáig jutott el, a belső szövetekbe nem jutott tovább. Sikerült ezt a gént is azonosítani, s így fény derült arra, hogy a LIN gén egy specifikus doménfelépítésű ubiquitin E3 ligázt kódol. A felső képen a LIN fehérje szerkezeti felépítése látható. Az alsó képeken a komplementációs kísérletek eredménye az izolált vad típusú LIN génnel a mutáns növényen kialakított transzgenikus gyökereken. A: Fluoreszcens GFP jel a transzgenikus gyökerekben. B: vad típusú szimbiotikus gümő megjelenése a transzgenikus gyökéren. C: elakadt szimbiotikus folyamat a mutáns gyökerén (negatív kontroll). Elérkeztünk végül napjainkig, amikor is tovább folyik a már említett, a csoportban azonosított szimbiotikus lucernagének és az általuk kódolt fehérjék vizsgálata, újabb kölcsönható fehérjepartnerek keresése és azok szerepének karakterizálása. Ugyanakkor részt veszünk még az előállított mutánsvonalak fenotipikus jellemzésében is, valamint előkészültünk a genomprogram következő lépésére is, amikor a modellnövény szekvenciájának meghatározását követően az asszociációs térképezés válik a génváltozatok felfedezésének fő eszközévé. Mindezek között azonban az egyik legérdekesebb kutatási téma annak nyomon követése, hogy a szimbiotikus géneknek mely növényekben milyen hasonlósági fokú homológjai léteznek, és azok vajon milyen funkcióval, milyen kifejeződési mintázatokkal rendelkeznek, lehetne-e rájuk számítani egy szimbiotikus folyamatban. Hisz a csoport legújabb eredményei alapján pl. a LIN gén szőlőben megtalálható homológ génjét a lin mutáns Medicago gyökerében kifejeztetve helyreáll a szimbiotikus fenotípus, tehát a transzgén képes elvégezni a szükséges LIN funkciót.

115 A kutatások továbbra is a fentebb bemutatott szellemben folynak, azaz a csoport minden tagja azon munkálkodik, hogy minél több felfedezéssel járulhasson hozzá a páratlan biológiai együttélés, a nitrogénkötő szimbiózis molekuláris hátterének feltárásához. Az eltelt négy évtized alatt a fentebb leírt kutatásokat végző csoportban számos kutató, diák és asszisztens dolgozott lelkiismeretesen, lelkesen és összetartóan. Hálás köszönet mindenkinek! Endre Gabriella Genetika 115

116 Genetika Kromoszómakutatás Szubjektív emlékképek tudományos tények 116 A Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetében a kromoszómakutatás kezdete a Belea Adonisz vezette Búza Evolúciógenetikai Csoporthoz köthető. Valós és feltételezett búza ősök változatos keresztezéséből származó hibridek tulajdonságai alapján tervezték megfejteni a termesztett búza akkor még ismeretlen származását. Nyilvánvaló volt, hogy megbízható eredményekhez elengedhetetlen a szülők és hibridek citogenetikai vizsgálata, ami gyakorlatilag kromoszómaszámok megállapítását és a kromoszómamorfológia alapján történő kariotípus-vizsgálatokat jelentette. Ezidőtájt Magyarországon a citogenetika nem volt része az egyetemi tananyagnak, a genetikai, sejtbiológiai tankönyvek is jószerével csak rajzolt képeken keresztül mutatták be a kromoszómákat. Így történhetett meg, hogy egy dunántúli mezőgazdasági termelőszövetkezet frissen végzett agrármérnök főállattenyésztője, Hadlaczky Gyula kapott meghívást, hogy legyen a Búza Evolúciógenetikai Csoport kromoszómanéző tudományos segédmunkatársa. A némileg szokatlan meghívás magyarázata az volt, hogy Hadlaczky Gyula 1972-ben egyetemi hallgatóként az Országos Diákköri Konferencián növényi kromoszómák vizsgálatáról szóló dolgozatával az MTA első díját nyerte, és erre valaki, valamilyen úton-módon emlékezett ban megkezdődött a búza, búza fajhibridek és egyéb fűfélék nagyüzemi kromoszómaszámolása. Több száz csíranövény több ezer gyökércsúcs-preparátumának monoton vizsgálatába szomorodva, egy késő esti beszélgetés csillantotta meg a menekülés halvány esélyét. Dudits Dénes, a Genetikai Intézet fiatal munkatársa vetette fel: van valami C-sáv festés (a kromoszómák heterokromatikus régióinak erős, sávszerű festődése), amivel elkülöníthetők az egyes kromoszómák, ki kéne próbálni, hátha igaz! Néhány hónapos próbálkozás után sikerült a módszert adaptálni a gabonafélék kromoszómáira és a Tritikáléban (búza-rozs hibrid) C-sáv festéssel egyértelműen azonosítani az egyes rozskromoszómákat. Ezt követte a búza evolúciógenetikai vizsgálatokban történő alkalmazása. A termesztett hexaploid búza (42 kromoszómás) egyik feltételezett őse, a kecskebúza (14 kromoszómás) kromoszómáinak C-sáv festése alapján kizárható volt, hogy ez a faj hozzájárult a termesztett búza kialakulásához. Ez az eredmény volt az SZBK első, nemzetközi folyóiratban megjelent, kromoszóma tárgyú közleménye. Itt érdemes egy rövid kitérőt tenni et írunk, a Genetikai Intézet kutatói szinte valamennyien 30 év alatti kezdők, egy Csapat. A kromoszómák sikeres C-sáv festésének nem volt szükségszerű előfeltétele a hibátlan angol tudás. Így történt, hogy a szedett-vedett, hibáktól hemzsegő angol mondatokból összeeszkábált kecskebúza-kromoszómás cikket Raskó István orvos, emlős sejtgenetikus tette szalonképessé, gyakorlatilag ő írta meg. Akkoriban a köszönetnyilvánítás még nem volt általános része a tudományos közleményeknek, így a történetet csak az emlékezet őrzi. A C-sáv festéses kutatások koronája a kukoricahibridek kromoszómavizsgálatának eredménye volt. Sikerült bizonyítani, hogy a kukorica vonalak kromoszómáinak hetero kroma tikus mintázata (C-sáv) egyszerű mendeli öröklésmenetet mutat, kukoricahibridekben a nagyszülői kromoszómák is azonosíthatók (1. kép). 1. ábra. A szülői (piros, zöld és kék színnel jelzett) és nagyszülői kromoszómák (piros és zöld színnel jelzett) azonosítása kukoricahibridekben a heterokromatikus mintázat alapján

117 Nyilvánvalóvá vált, hogy némi módosítással a kromoszómák C-sáv festése adaptálható a növényvilág mintegy leírt fajára, és ez egy életfogytig tartó megélhetést biztosíthat. A búza evolúciógenetikai csoporthoz kötöttség feloldásával, amely a Genetikai Intézet akkori igazgatójának, Alföldi Lajosnak volt köszönhető, lehetővé vált valami új irány keresése. Megkezdődött a kalandozások kora. Az 1970-es évek első fele a molekuláris genetika és a protoplaszt (sejtfaluktól megfosztott növényi és baktériumsejtek) nagy korszakának nyitánya volt a világban és egyidejűleg az Intézetben is. A baktériumsejtek protoplasztálása, fúziója, regenerálása baktériummá, növényi protoplasztok-sejtek regenerálása teljes növényekké, szomatikus faj- és nemzetséghibridek előállítása, növényi protoplasztok fúziója állati sejtekkel (2. kép) citológiai kincsesbánya volt. 2. ábra. Növényi protoplaszt (NP) és emlőssejt (ES) összeolvadásának pásztázó elektronmikroszkópos képe 3. ábra. Emberi kromoszómák elektronmikroszkópos képe A nemzetközi kromoszómakutatás nagy szenzációja a 70-es évek végén a kromoszóma váz elmélet (scaffold model) megszületése és kísérletes bemutatása volt. Az Egyesült Államokban Adolph W.K., Paulson J.R. és Laemmli. U.K. Cell és PNAS cikkekben közölték, hogy a kromoszómák végső szerkezeti eleme (részleges fehérjétlenítés és DNáz-kezelés után) egy folytonos fehérjeváz, amely mentén szerveződik a DNS hatalmas hurkokba. Egy Wellcome Trust ösztöndíjnak köszönhetően, az edinburgh-i MRC Klinikai és Populációs Citogenetikai Intézetben eltöltött egy év alatt sikerült kísérletesen bizonyítani, hogy a részlegesen fehérjétlenített és DNS-mentesített kromoszómák elektronmikroszkópos felvételein látható folytonos fehérjeváz valójában különálló fehérjerészecskék mesterségesen előidézett aggregációja (4. kép). Genetika Lehetőséget adott az elérhető vizsgálómódszerek megtanulására, és minden, ami fénymikroszkóppal, transzmissziós vagy pásztázó elektronmikroszkóppal nézhető-látható volt, annak a vizsgálata megtörtént. A Raskó István vezetésével dolgozó emlős szomatikus sejtgenetikai csoport sejthibridizációs kísérletei, az emlőssejtek kromoszómáinak könnyebb kezelhetősége, az intézeten belüli együttgondolkozások együttdolgozások természetessége és az amerikai Ernest J. DuPraw lenyűgöző elektronmikroszkópos kromoszómaképei alapvetően megváltoztatták a kromoszómakutatások irányát. A napi feladatokon túl, a DuPraw féle whole-mount elektronmikroszkópos technika autodidakta elsajátítása (3. kép) és a Raskó-csoport önzetlen sejtforrása lehetőséget adott az emlős sejtek kromoszómáinak legmodernebb eszközökkel történő vizsgálatára. 4. ábra. Kínai hörcsög kromoszómájának elektronmikroszkópos képe a kromoszómafehérjék részleges eltávolítása után. A legvégső felismerhető struktúra a centromer, a kromoszómakarokat a fehérjerészecskék eltérő sűrűsége rajzolja ki. Tehát ha létezik egy folytonos kromoszómaváz, akkor annak feltétlen tartozékai bizonyos szerkezeti szereppel bíró DNS-szakaszok. Nemzetközi szinten, 117

118 Genetika néhány hasonló következtetésre jutó kutató kivételével, a vázmodell rajongói tábora nem fogadta kitörő lelkesedéssel az eredményeket leíró közleményeket. Ennél fontosabb azonban, hogy ezek az eredmények alapozták meg a Biokémiai Intézet kitűnő biokémikusával, Udvardy Andorral (aki kromatinszerkezeti munkái alapján vázmodell szkeptikus ) a máig tartó együttműködést és barátságot. A 80-as évek elején a kutatók meghatározott forint fejpénzzel és évi 90 amerikai dollár import-vegyes (egy évvel előre megrendelt devizás vásárlásokra fordítható) ellátmánnyal rendelkeztek. A skóciai intézet ajándéka (mintegy angol font értékű vegyszer és eszköz) kivételes lehetőséget adott a kromoszómaszerkezeti munkák folytatására. Az egyfős kromoszóma csapat státuszproblémák miatt egy takarítónőnek álcázott technikussal és két növényi szövettenyésztős vendégmunkással megerősödve, nemzetközi szinten is egyedülálló eredményeket ért el. Kidolgozták a növényi kromoszómák és sejtmagok tömegizolálását, valamint a növényi kromoszómák biokémiai, immunológiai és szerkezetvizsgálatával igazolták, hogy a növényi és állati kromoszómák alapvető felépítése azonos. A kromoszómaszerkezeti vizsgálatokból kiderült, hogy a kromoszómák fokozatos leépítése (fehérjeés DNS-kivonás) során a legvégső szerkezeti elem a centromer. A centromer felépítésében több konzervált fehérje is részt vesz, amelyek ellen specifikus ellenanyagok találhatók bizonyos autoimmun betegek vérszérumában. Erre alapozva született meg 1985-ben annak a kísérleti programnak a gondolata, amelynek célja az emlős mesterséges kromoszóma előállítása volt (5. kép). Az elképzelés lényege az volt, hogy humán osztódó sejttenyészetből izolált kromoszómák részleges fehérjétlenítése és DNáz-kezelése után, anticentromer ellenanyagokkal elvileg kinyerhetők a centromerikus szakaszok, illetve az azokba zárt centro merikus DNS. E DNS-szakaszok klónozásával, vagy ezeket próbaként használva, humán DNS-bankból történő izolálással nagymennyiségű centromer- DNS állítható elő. A centromer-dns-t a kromoszómaműködés szükséges elemeivel (replikációs szakasz, telomer, jelzőgén) összeépítve és emlős sejtekbe juttatva esély van új kromoszómák létrehozására. Több száz magyar és svédországi autoimmun beteg szérumának vizsgálata során sikerült egy olyan nagytisztaságú specifikus anticentromer-savót találni, amelyben 5 különböző centromerfehérje elleni antitestek találhatók (lásd pl. 6, 7, 8. képeket). Az anti-centromer szérum első felhasználása annak a kísérletes bizonyítása volt, hogy az emlősök testi sejtjeinek magjában a kromoszómák nem véletlenszerűen, hanem meghatározott rendben helyezkednek el. Az anyai és apai homológ kromoszómák párba rendeződésén túl, a nem homológ kromoszómák tükörszimmetriát mutató csoportokat alkotnak (6. kép). 6. ábra. Az emlős kromoszómák nem véletlenszerű elrendeződésének bizonyítása nem osztódó emlős sejtek magjában, centromer elleni ellenanyagfestéssel. A kromoszómák elhelyezkedését a centromerek mutatják ábra. A mesterséges kromoszóma program indulása 1985-ben A kromoszómák nem véletlenszerű elrendeződése ennek a génexpresszióval, a genom működésével kapcsolatos összefüggése ma már tankönyvi adat. A Raskó-csoport sejttenyésztő infrastruktúráján élősködve és a DNS-munkákban jártas munka-

119 társának, Burg Kornélnak tudását használva, hoszszas próbálkozás és kudarcok sorozata után sikerült használható mennyiségű anti-centromer szérummal kitisztított DNS-t előállítani. E DNS szolgált próbaként egy feltételezett centromerikus DNS kihalászására egy humán DNS-könyvtárból. Bakteriofág szigetelő DNS-szakaszok és egy szelektálható jelzőgénnel történt összeépítés után megkezdődtek a DNSbeviteli kísérletek végén megszülettek azok a sejtvonalak, amelyekben a bevitt DNS-ből felépült új centromerek, illetve önálló minikromoszómák képződtek (7. kép). 7. ábra. Újonnan képződött minikromoszóma floureszcens mikroszkópos képe. Balról jobbra: a beépült DNS kimutatása hibridizációval, a centromerek kimutatása centromer immunfestéssel, a kromoszómák DNS-festése propidium-jodiddal történt A jelenség ismételhetőnek bizonyult és hamarosan a minikromoszómák méretét többszörösen meghaladó, új kromoszómát hordozó sejtvonalakat is sikerült előállítani olyan DNS bevitelével is, amely nem tartalmazott feltételezett centromerikus DNS-t (8. kép). Nyilvánvalóvá vált, hogy a centromer- és kromoszóma-képződés nem a bevitt DNS specifikus bázissorendjétől függ. 8. ábra. Bakteriofág DNS bevitelével létrejött új kromoszóma (v). Bal oldalon: fluoreszcens DNS-hibridizáció az új kromoszómán bakteriofág DNS-sel, jobb oldalon: a centromerek kimutatása centromer immunfestéssel Ezt az időszakot a töretlen lelkesedés és a pénzhiány jellemezte. A napi túlélésért folyó küzdelemben és a minikromoszóma megszületésében döntő szerepe volt az SZBK akkori főigazgatójának, Keszthelyi Lajosnak. Fizikus-biofizikusként a mesterséges kromoszóma program kezdetétől állandó érdeklődéssel követte a munkát, és az ínség időszakában személyes közbenjárására pályázaton kívül kapott mintegy 2 millió forint OMFB segély biztosította a túlélést. Az első eredmények közlése (2 PNAS cikk) jelentős nemzetközi érdeklődést váltott ki. A közlést és a további munkák pénzügyi hátterét a szerencse és a személyes kapcsolatok határozták meg ben két amerikai professzor (egyikük Szalay Aladár, az SZBK Növényélettani Intézetéből a 70-es években külföldre szakadt hazánkfia), hasznosítható alapkutatási eredményekre vadászva az SZBK-ban, úgy vélte, hogy ez a minikromoszóma egyike a lehetséges értékesíthető eredményeknek. Szalay Aladár kapcsolatai révén a kanadai Alberta tartományi kormány kutatástámogatása, majd egy amerikai óriásvállalat biztosította a kutatások részbeni finanszírozását, a kutatási eredmények szabadalmaztatási költségeit az esetleges, jövőbeni szabadalmak hasznosítási jogáért cserébe. Itthon, 1991-ben, az akkori földművelésügyi miniszterrel mint társpályázóval elnyert 3 éves OMFB pályázat keretében mintegy 20 millió forint biztosította a további munka pénzügyi hátterét. Így az amerikai és az OMFB kutatási támogatásnak köszönhetően az elkövetkező 4-5 év anyagi biztonsága lehetővé tette az aprólékos kísérleti munkát, amelynek eredményeként elsősorban egy nagyméretű, egérsejtekben előállított új kromoszóma révén kiderült, hogy a kromoszómaképződés egy, a sejt meghatározott kromoszómáinak centromer közeli szakaszába épült idegen DNS által előidézett megsokszorozódás eredménye (9. kép). Az újonnan képződő kromoszómák tehát az élő sejtben történt beavatkozás eredményei. Stabil fennmaradásukhoz és működésükhöz szükséges elemeket a természetes kromoszómák meghatározott szakaszainak megsokszorozódása révén szerzik meg, DNS-összetételük kevésbé komplex, elsősorban ismétlődő, azonos bázissorrendű szakaszokból épülnek fel, így jelentősen eltér a természetes kromoszómáktól. Ez a tény és az, hogy az újonnan képződött mesterséges kromoszómák genetikai tartalma a tandem ismétlődő riboszomális RNS-génektől eltekintve kizárólag a kívülről bevitt génekre korlátozódik, indokolja a mesterséges jelzőt. Genetika 119

120 Genetika ábra. Az új kromoszómák képződésének lépései A centromerközeli szakaszok döntően hetero kroma tinból (erősen becsomagolt, géneket nem hordozó, ismétlődő, ún. szatellit-dns-szakaszok) épülnek fel, így az újonnan képződött kromoszómák alapanyaga is főként szatellit DNS (10. kép). 10. ábra. Balról jobbra: A mesterséges kromoszóma heterokromatin kimutatására szolgáló festéssel, a megsokszorozódási egységek határán található idegen DNS-szakaszok kimutatása DNS-hibridizációval (lásd 9. kép), DNS-hibridizáció szatellit DNS-sel, az ismétlődő egységeken belül az ellentétes lefutású DNS-szálak kimutatása brómdezoxiuridin immunfestéssel, illetve speciális Giemsa festéssel. Ebből a tulajdonságukból adódóan a szatellit DNSalapú mesterséges kromoszómák (SATAC) gyakorlatilag 100%-os tisztaságban elválaszthatók a természetes kromoszómáktól kettős, lézervezérlésű áramlásos citometriával (11. kép). 11. ábra. A szatellit-dns-alapú mesterséges kromoszómák tisztítása citometriával. A képen minden pont egy-egy kromoszómát jelöl, az R1 jelű területről gyűjtött kromoszómák a 10. képen bemutatott nagyméretű mesterséges kromoszóma, míg az R2 területről gyűjtött egy 3 ismétlődő egységből álló, kisméretű szatellit-dns-alapú mesterséges kromoszóma. Erre az időszakra esett, hogy az amerikai támogatás (a mesterséges kromoszómáktól független okok miatt) megszűnt, viszont a munka folytatását célzó, nagyívű 4 éves kutatási pályázatra, a munkatervet változatlanul hagyva, az OTKA megadta a kért kutatási támogatás 5%-át, azaz évi Ft-ot. A teljes pályázati összeg éppen fedezte annak a két közleménynek a publikációs költségeit, amelyek a szatellit DNS-alapú mesterséges kromo szómák prototípusának leírását, illetve a kromoszómaképződés alapvető folyamatainak tisztázását és ezáltal az ismételhető kromoszóma építés módszerének kidolgozását írták le. Itt újra érdemes egy rövid kitérőt tenni, ami rávilágít az esélyegyenlőségre és a globális tudomány geográfiai és etikai fehér foltjaira. A fent említett két közlemény kétségkívül az első közlése volt emlős mesterséges kromoszómák ismételhető előállításának. Egy évvel később az Egyesült Államokban megjelent mesterséges kromoszóma előállítását leíró közleményt a média jelentős csinnadrattával mint világelső felfedezést ünnepelte. Joggal, hiszen a szerzők említést sem tettek az őket megelőző 4 Magyarországról származó munkáról. A dolog pikantériája az, hogy az amerikai szerzők a tudományos közleményük megjelenésével egyidőben benyújtott szabadalmukban oldalakon keresztül próbálják bizonygatni, hogy eljárásuk különbözik a 4 szegedi közleményben leírtaktól. A pénztelenségből fakadó lét-nemlét dilemma feloldása Kanadából érkezett. A mesterséges kromoszómák ismételt előállítását, illetve a mesterségeskromoszóma-tisztítás eredményeit ismerve, egy kanadai üzletember 1995 végén bejegyeztette a vancouveri székhelyű Chromos Molecular Systems nevű biotechnológiai vállalatot, amely a szatellit-dns-alapú mesterséges kromoszómák biotechnológiai alkalmazását, a SATAC technológia kifejlesztését tűzte ki célul. A Chromos 1996-ban kizárólagos hasznosítási licenszszerződést kötött a Szegedi Biológiai Központtal és hosszútávú kutatási szerződést írt alá az SZBK Genetikai Intézetével. E szerződések keretében vállalta évi rendszeres kutatási támogatás biztosítását, a kutatási eredmények szabadalmaztatási költségét, a technológia majdani hasznosításából származó bevételekből a nemzetközi normáknak megfelelő jogdíj fizetését. A Chromos létrehozta saját kutató-fejlesztő laboratóriumát, és 1997-ben megkezdődött

121 a közös kutatómunka és technológiafejlesztés. Ennek főbb eredményei voltak: Genetika a mesterséges kromoszómák ipari méretekben történő tisztítása, hasznos géneket hordozó mesterséges kromoszómák előállítása, humán szatellit-dns-alapú mesterséges kromoszóma prototípusának előállítása (12. kép), genetikailag módosított állat előállítása tisztított mesterséges kromoszómával (13. kép), genetikailag módosított állat előállítása szövetspecifikus génkifejeződést biztosító tisztított mesterséges kromoszómával, lipidekbe csomagolt tisztított mesterséges kromoszómák bevitele célsejtekbe, feltölthető, mesterséges kromoszóma expressziós rendszer létrehozása (14. kép), ipari fehérje-gyógyszeralapanyagot termelő mesterséges kromoszómák előállítása. 12. ábra. Emberi mesterséges kromoszóma prototípus (*) természetes társai között. DNS-hibridizáció humán szatellit-dns-sel (zöld és piros), illetve centromer immunfestés (kettős, világos pöttyök), a kromoszómák kék festődését egy DNS-specifikus floureszcens festék adja. 13. ábra. Az első, tisztított mesterséges kromoszómával létrehozott genetikailag módosított állat (Lucy) és egy fehérvérsejtjének kromoszómái a 41. mesterséges kromoszómával (*). 14. ábra. Feltölthető, mesterséges kromoszóma expressziós rendszer (ACE System). A bal oldali kromoszóma képen a piros szakaszok a többszörös fogadóhelyeket jelzik 2000-ben a Chromos a torontói tőzsdén nyílt részvénytársasággá vált, ettől kezdve a vállalati stratégiát, beleértve a kutatási-fejlesztési célokat, irányokat a befektetők rövid távú érdekei (gyors tőkemegtérülés) határozták meg ben a mesterséges kromoszóma expressziós rendszer létrehozásakor az elsődleges stratégiai irány a gyógyszeripari fehérjetermelés lett. Ez azt is jelentette, hogy a kutatás-fejlesztés kizárólagos iránya a gyógyszeripari fejlesztés, amelyet az elsődlegesen alapkutatást végző Genetikai Intézet Kromoszóma csoportja nem vállalhatott. A kutatási szerződés (és a kutatási támogatás) megszűntével, hazai pályázati forrásból és az utolsó, jelképes Chromos támogatásból 2005-ben elindult egy kísérletsorozat, amely a mesterséges kromoszóma és az őssejttechnológia ötvözésével a mesterséges kromoszómák génterápiai alkalmazhatóságát kívánta igazolni. Ennek szakmai hátterét, a meglévő kromoszóma-csapat tudása mellett, a 3 éves tanulmányútról hazatért és magát őssejtszakértővé kiképező Katona Róbert biztosította. A modellkísérlet egy ma még gyógyíthatatlan betegség (Krabbe betegség) egérmodelljének kezelése volt terápiás emlős mesterséges kromoszómát hordozó embrionális őssejtekkel. A hároméves kísérletsorozat eredményei igazolták, hogy a kombinált mesterséges kromoszóma-őssejt technológia alkalmas eszköze lehet az ex vivo génterápiának (15. kép) nyarán a Pfizer gyógyszeripari óriásvállalat nyilvánosságra hozta saját összehasonlító vizsgálatainak eredményét, miszerint a mesterséges kromoszómarendszerrel bioreaktorokban literenként 4 grammot meghaladó fehérje gyógyszeralapanyag-termelés érhető el, amely ötszörösen haladta meg a saját fehérjetermelő rendszerük teljesítményét. 121

122 Genetika 15. ábra. Terápiás mesterséges kromoszómákat (S1, S2) hordozó egér embrionális őssejt kromoszómái és egy gyógyíthatatlan betegség modellállatainak túlélése a terápiás mesterséges kromoszómával, illetve anélkül. A terápiás mesterséges kromoszóma jelenlétét sötét színű foltok jelzik a kísérleti állatokon. Ezek az eredmények döntő szerepet játszhattak abban, hogy a Pfizer legnagyobb versenytársa, a GlaxoSmithKline 2007 novemberében megvásárolta a mesterséges kromoszóma technológia fehérjetermelésben történő felhasználásának jogát a forráshiánnyal küszködő Chromostól. A technológia transzgenikus és génterápiai felhasználásának joga a Chromosnál maradt. A többéves közös munka és a Chromos vezetésével meglévő jó kapcsolatoknak köszönhetően a Chromos licenszszerződés keretében teljeskörű felhasználási jogot adott a Szegedi Biológiai Központ számára a mesterséges kromoszóma technológia magyarországi génterápiai, gyógyító célú felhasználására. A teljeskörű felhasználás kiterjed a 49 mesterséges kromoszóma tárgyú szabadalmaink hasznosítására, amelyek tulajdonosa a Szegedi Biológiai Központ, illetve magában foglalja a Chromos saját fejlesztéseit is. Az első modellkísérlet sikerére alapozva, hazai és Európai Uniós pályázatok keretében, jelenleg három mesterséges kromoszóma-őssejt technológiára alapozott preklinikai kutatási program folyik állatmodelleken, illetve sejtszinten. 1. Egy életmentő génterápiai kezelés súlyos mellékhatásának (a terápiás gént hordozó vektor által okozott leukémia) lehetséges kiküszö bölése mesterséges kromoszómavektorral. 2. Egy mesterséges kromoszómával két vagy több terápiás cél elérésének egyidejű megvalósíthatóságát igazoló daganatterápiás modellkísérletek. 3. Idegrendszeri betegségek lehetséges kezelési eljárásainak kidolgozása mesterséges kromoszómával genetikailag módosított terápiás őssejtekkel. Az elmúlt évek során a Genetikai Intézetben sikerült létrehozni egy olyan preklinikai egységet, amely elvileg alkalmas bármely, génterápiai szempontból releváns betegség állatmodelljének mesterséges kromoszóma-őssejt terápiával történő kezelésére. A szegedi kromoszóma csapat szűkebb és tágabb értelemben vett tagjaira vonatkozóan eligazítást adnak az intézeti publikációs lista szerzői névsorai. Azonban lehetetlen felsorolni mindazok nevét, akik az elmúlt közel négy évtized során, itthon és szerte a világban munkával, tanáccsal, kritikával, segítséggel, segítő szándékkal vagy csak jóindulatú érdeklődéssel hozzájárultak ahhoz, hogy a szegedi kromoszómakutatás eredményei nemzetközi szinten is tankönyvi adatokká válhattak és az alapkutatási eredményekből használható technológia született. Hadlaczky Gyula 122

123 Emlőssejtgenetikától a rákkutatásig Genetika Negyven év tudományos történetének megírása nem egyszerű feladat. Miután az olvasó nem ismert, úgy kellene megírni, hogy azt mindenki értse. Ez lehetetlen. Az eredmények felsorolása szubjektív, ráadásul az író lelki beállítottságának is függvénye. Miután elsősorban a tudományos eredményeket kellene felsorolni, óhatatlanul kimarad az eredmények születéséhez vezető viták, a műhelyek emberi légkörének érzékeltetése. Nagyrészt kimarad azoknak a személyeknek a névszerinti felsorolása is, akik nélkül az eredmények nem születhettek volna meg. Ezért a szakmai érdeklődésű olvasót az Intézet tudományos közleménylistájához irányítanám, az egyes kérdések jobb megismerése céljából. Az emlős szomatikus sejtgenetikai kutatások az SZBK Genetikai Intézetének megalakulásával, hazai hagyományok nélkül indultak Szegeden. A csoport Venetianer Anikó, Burg Kornél, Dallmann László, Raskó István kutatókból és Poór Gabriella valamint Dudás Mária asszisztensekből állt. A csoport két irányba indult. Venetianer Anikó a Szegedi Orvostudományi Egyetemmel egy ritka, de súlyos genetikai betegség egyszerű diagnózisán munkálkodott, amiből nagyon hamar megszületett az első nemzetközi közlemény, amely a Genetikai Intézet egyik első orvosi genetikai vonatkozású publikációja. A mukopoliszacharidózis egy ritka anyagcserebetegség-csoport, ahol a hosszú cukorláncok, poliszacharidok lebontása a bontóenzimek hiányában nem történik meg. Miután ezek az enzimek a sejtek egy bizonyos alkotórészében, a lizoszómákban működnek, a lebontatlan mukopoliszacharidok itt halmozódnak föl. Hatféle enzim végzi a lebontást és minden egyes enzim hiánya más orvosi genetikai tünetegyüttest okoz. Megállapították, hogy a betegekből származó limfociták másképpen építik be az izotóppal jelzett ként, mint az egészségesekből származó sejtek, és ez a jelenség a betegség kimutatását egyszerűbbé tette. A csoport másik törekvése a szomatikus sejtek hibridizációs technikájának kidolgozása volt. Az első kis hazai sikert az jelentette, amikor Burg Kornél frissen végzett biológusként, a 70-es évek elején, egy hazai rendezésű nemzetközi kongresszuson, beszámolt az első emberi és kínaihörcsög-sejt fúziójáról, aminek eredményeként olyan sejt keletkezett, amelyben mindkét sejt genetikai állománya jelen volt. (Jellemző a kor hazai viszonyaira, hogy a kongresszuson jelenlévő akkori sejtbiológus akadémikusok egyike kijelentette, hogy ő nem hiszi, hogy ilyen megtörténhet, pedig H. Harris már 1965-ben a Nature-ben közölte az első életképes, különböző fajokból származó sejtek indukált fúziójából keletkezett hibridsejtek előállítását ). A sejthibridizációs munka egyik érdekes eredménye Lima de Faria, híres portugál citogenetikus látogatása eredményeként született. Egy éjszakába nyúló beszélgetéskor, ahol a hazai vörösbor szolgált gondolatébresztőnek, a jelenlévők arról értekeztek, hogy mi a testi sejtek fúziójának a fajhatára. Az emlős és növényi sejtgenetikusok kollaborációjából született ennek a kérdésnek a megválaszolása, a világon elsőként létrehozott emberi és sárgarépa-hibridsejt. A sejtek némelyikében az emberi sejt és a sárgarépasejt magja összeolvadt, és a közös citoplazmát sejtfal vette körül. A magyar sejtgenetika akkori nemzetközi elfogadására jellemző, hogy az eredményt leíró közlemény publikálását mind a Nature, mind a Science elutasította; valószínűleg Lima de Faria nevének köszönhetően a Hereditas nagyon gyorsan megjelentette, egy időben Smith és munkatársainak hasonló eredményéről beszámoló Science cikkel. A két egymástól függetlenül, de egy időben született eredményről, mint tudományos szenzációról, a New York Times is beszámolt. Ez a közös közlemény képezte annak a kísérletsorozatnak az alapját, amelyben az Intézet növényi sejtgenetikusai bizonyították, hogy az emlős sejtek fehérjéi képesek a növényi sejtek kromatinját kondenzálni, azaz a két távoli faj alapfunkcióiban résztvevő mechanizmusok nagyon is hasonlóak. A hetvenes évek közepétől Venetianer Anikó önálló témacsoportot vezetett. Munkájuk első periódusában különböző emlős sejtek és sejthibridek glukokortikoid hormon érzékenységét, valamint a hormont kötő receptorok számát vizsgálták. Megállapították, hogy a specifikus receptorok, hor- 123

124 Genetika 124 monkötő sejtfelszíni fehérjék jelenléte a hormonok hatásának szükséges, de nem elégséges láncszeme a vizsgált egérsejtekben. Sikerült glukokortikoidra nem érzékeny, dexametazon-rezisztens egérsejteket előállítaniuk, és azt is megállapították, hogy egy hormonanalóggal, a dexametazonnal olyan sejteket lehet kiszelektálni, amelyek nagy számban hordoznak a mikroszkópban pontszerűnek látszó kromoszómákat. Vizsgálataikba májtumorsejteket, ún. hepatómasejteket is bevontak, ezek génkifejeződési mintázatának változását nézték a sejtdifferenciáció során a hosszú ideig tenyésztett sejtkultúrákban, illetve a dexametazonra rezisztens sejtekben. A dexametazon-rezisztens sejtek génkifejeződési mintázata megváltozott. Megállapították, hogy a dexametazon-rezisztencia sejthibridizációval kimutathatóan recesszív tulajdonság, valamint sikerült két rezisztens sejtvariáns fúziójával dexametazonérzékeny hibrid sejtet előállítaniuk. Venetianer egy Nature közleményben számolt be arról a megfigyelésükről, hogy differenciálódási képességét elvesztett, dexametazon-rezisztens hepatómasejtekben megszűnik a közepes méretű mikrofilamentumok felépítéséhez szükséges fehérjeszintézis, ami azt jelenti, hogy ezek a sejtek alapvető funkcióihoz, pl. a sejtosztódáshoz vagy a sejtnövekedéshez nem szükségesek, csak a sejtdifferenciációhoz kapcsolható speciális funkciókhoz köthetők. Azt is megállapították, hogy némely dexametazonra rezisztens hepatómasejt által meztelen egérben indukált tumorokban, a tumor kiváltására használt sejttípussal szemben, megjelennek bizonyos májdifferenciációra jellemző tulajdonságok. Ez azt mutatja, hogy a tumorképződés a nem differenciálódó hepatómasejtek differenciációját is elősegíti. A Venetianer-csoport kedvenc háziállata továbbra is a hepatómasejt maradt. A dexametazonra érzékeny, differenciálódott hepatómasejtek a májra jellemző módon albumint termelnek, de alfafötoproteint nem (az alfafötoprotein az egyedfejlődés bizonyos szakaszaiban és bizonyos rákos elváltozásokban termelődő fehérje, megemelkedett szintje számos rendellenesség jelzője lehet). A hoszszú ideig dexamethazonon tenyésztett, eredetileg alfafötoproteint nem termelő sejtek a tenyésztés során elkezdték ennek a fehérjének a szintézisét. Mind az albumint, mind az alfafötoproteint termelő sejtekben jellegzetes, egy DNS-t emésztő enzimre érzékeny kromatinrégiókat azonosítottak, amelyek metilációs, demetilációs helyeket is tartalmaztak. Ezek a helyek az aktuális gének átíródási kezdőpontjától távolabb helyezkednek el és fontos szerepük lehet az adott gén kifejeződésének epigenetikai szabályozásában. Vizsgálták a hepatómasejtek hőstresszválaszát a differenciálódás függvényében, valamint tumorterápiára jelölt vegyületek apoptózist (programozott sejthalál) indukáló hatását. Megállapították, hogy a dedifferenciálódott variánsokban a fő hősokkfehérjék szintje magasabb volt, tehát a hősokkválasz ezekben a sejtekben differenciációfüggő. A stabil hőrezisztens variánsokban nemcsak az egyes hősokkfehérjék mennyisége nőtt meg, hanem a funkcionális P-glikoprotein szintje is, aminek következtében ezek a variánsok multidrog-rezisztensekké is váltak. Kimutatták, hogy egy olyan hormonanalóg, amely gátolta a májtumorsejtek növekedését, mind kemoterápiás drogokra érzékeny, mind a multidrogrezisztens hepatómasejtekben képes volt az apoptózis mechanizmusát beindítani. A Raskó István által vezetett témacsoport a hetvenes években az emlős sejtek DNS-ében bekövetkező, a sejtek utódaiba öröklődő elváltozásokkal, a mutációkkal kezdett foglalkozni. Megállapították, hogy a sejthibridekből spontán módon bekövetkező, a hibrid sejtet alkotó egyik szülő kromoszómáit érintő kromoszómavesztés különböző mutagén hatású anyagokkal, az anyag természetétől függően különböző sebességre felgyorsítható. Ez a megfigyelés egy újszerű tesztrendszer megteremtését jelentette. Kidolgoztak egy sejtgenetikai módszert, amelyben a sejtek DNS-t szintetizáló, a sejtciklus S-fázisában adott, az újonnan szintetizálódó DNS-be beépülő mutagén hatású vegyület, a brómdezoxiuridin az adás pillanatában replikálódó génben mutációt okoz. Ezzel a módszerrel bizonyos gének S-fázisos replikációs ideje meghatározható lett. A csoport tevékenysége a későbbiekben kiterjedt a mutáció kialakulását kivédő rendszer, a DNShibajavítás, DNS-reparáció területére. Vizsgálataikat összekapcsolták a sejtek differenciációjával. Ez bizonyos sejteknek az a képessége, amikor egy nem differenciálódott, genetikailag teljesen más génkife-

125 jeződési mintázatot mutató sejtpopulációban spontán, vagy indukáló vegyületek hatására teljesen új funkciójú sejtek alakulnak ki. Megállapították, hogy a differenciálódott egérsejtek a nem differenciálódott populációval összehasonlítva jelentős csökkenést mutatnak az ultraibolya besugárzás által okozott DNS-károsodások kijavításában. A DNS-reparációval kapcsolatos az a megfigyelésük is, amit tízféle, rákos és normális emberi sejttenyészet vizsgálatából nyertek. A sejtek kromoszómáinak erősen összepakolt, heterokromatikus régiójában található hosszú DNSszakasz ultraibolya sugárzással kiváltott károsodásának javítása némelyik sejtvonalban igen aktív volt, míg másokban, köztük rákos sejtekben is a reparáció ezen a szakaszon nem működött. Ha ezekben a sejtekben a kromatint butirát-kezeléssel fellazították, a reparáció hatékonysága a genom többi részén megnőtt, de a vizsgált szekvencián változatlan maradt. A 90-es évek végén a csoport teljesen más irányba indult. A történet azzal a kérdéssel kezdődött, amely Keszthelyi Lajos akadémikus, a Biológiai Központ akkori főigazgatója és Raskó beszélgetése során fogalmazódott meg, hogy a DNS szintjén megnyilvánuló különbségek meghatározásával miként lehetne a honfoglaló magyarok genetikájáról többet megtudni. Mennyire volt genetikailag egységes a honfoglaló magyarság hazánk területére érkezésekor, és milyen arányban tartalmazott ázsiai, illetve európai típusú genetikai elemeket? Világos volt, hogy ezekre a kérdésekre csak az abból az időből származó csontokból izolált DNS vizsgálatával lehetne választ adni. Igen ám, de a csoport addig csak élő emberekből származó DNS-el dolgozott, tehát ki kellett munkálni a DNS kinyerésének módszerét a régészeti anyagból. Néhány hónapos próbálkozás után ismételhetően sikerült ugyanabból a csontból DNS-t izolálni és a módszert leközölni. A módszer hatékonyságát az is bizonyította, hogy segítségével egy ötezer éves őstulokcsontból is sikeresen izoláltak és jellemeztek DNS-t. Ezután a munka két vonalon indult. Egyrészt a Szegedi Múzeum régésze, Horváth Ferenc által feltárt kun leletanyag genetikai vizsgálatát végezték el, másrészt egy akkor elég szokatlan együttműködés az MTA Régészeti Intézetével elnyert sikeres közös pályázatnak köszönhetően kezdődött el. 1. ábra. Klasszikus honfoglaló sír Az elnyert pályázati támogatással egy teljesen új, fiatal csapat alakult, frissen végzett biológusokból. (Ma már mindannyian PhD fokozatot szereztek és önálló kutatómunkát végeznek.) A pályázatban megfogalmazott specifikus kérdések megválaszolására a sejtekben több száz, vagy ezer példányban is előforduló sejtrészecske, a mitokondrium DNS-e, valamint a férfi nemi kromoszóma, az Y kromoszóma vizsgálata adott lehetőséget. A mitokondrium csakis anyai ágon öröklődik, ezért kiválóan alkalmas a különböző embercsoportok anyai ági leszármazási vonalainak meghatározására. Az Y kromoszóma az apai vonalon generációról generációra, viszonylag változatlan formában öröklődik valamennyi fiú utódba. Megőrzi a szerkezeti jellegzetességeket a prehistorikus idők óta. Jelentős részén csak mutációval jöhet létre változás, ezen a DNS-szakaszon nem keveredik az anyai és az apai információ. Populációk apai ági leszármazási vonalát tehát ennek, a megtermékenyítés után anyai eredetű DNS-sel nem keveredő szakasznak a vizsgálatával követhetjük nyomon. Vizsgálataikba, a honfoglaláskori csontok mellett, ma élő magyar és a Korond környékén élő székely emberek DNS-ét is bevonták. A honfoglalás kori leletanyagot a régészeti mellékletek alapján két csoportba oszthatjuk. Az egyik csoportba azok a csontmaradványok kerültek, amelyeket a korra jel- Genetika 125

126 Genetika 126 lemző lovas temetkezéssel, gazdag régészeti leletanyaggal temettek el. A másik csoportot a 10. és 11. a századból származó, szegényes régészeti leletanyagú, úgynevezett köznépi sírokból származó csontleletek adták. Vizsgálataikkal megállapíthatták, hogy a gazdag leletanyagú sírok csontleletei olyan mitokondriális csoportokba tartoztak, amelyek legnagyobb gyakorisággal Ázsiában találhatóak. Az összes ilyen csontlelet összesen 23%-ban ázsiai típusú mitokondriális csoportokhoz tartozott. A köznépi temetők, valamint a ma élő magyar és székely emberek mintái azonban csak mintegy 5%-ban hordoztak ázsiai eredetű anyai vonalakat. Ha az egyedi leletek mitokondriális DNS építőköveinek sorrendjét statisztikai analízisnek vetették alá és egyenként összehasonlították több mint 7 000, Eurázsia különböző területein élő különböző népcsoportok tagjainak mitokondriális DNS-ével, akkor azt találták, hogy a ma élő magyar, illetve székely populációból származó minták halmaza a köznépi temetőkből származó mintákkal együtt az európai népcsoportok közé kerültek, azokhoz álltak genetikai rokonságuk szintjén a legközelebb. A gazdag leletanyagú honfoglaló sírok mintái pedig az ázsiai populációkkal mutattak genetikai rokonságot. Az apai ági genetikai rokonság meghatározása a régészeti leletanyagból sokkal nagyobb nehézségekbe ütközött, mint a mitokondriális DNS-t érintő vizsgálatok. Bár csak néhány gazdag leletanyagú sírban föllelt férfi csontból tudtak értékelhető DNS-t kinyerni, azt megállapíthatták, hogy a minták egy része egy olyan Y kromoszómás bélyeget hordozott, amely csak azon ma élő uráli népek férfi lakosságánál fordul elő nagy gyakorisággal, akiket a történészek és néprajzkutatók a magyarság ősi rokonainak tekintenek. Érdekes módon a ma élő magyar és székely férfiakban ez a bélyeg hiányzik, illetőleg csak nagyon ritkán fordul elő (több mint 200 férfi mintából csak egyetlen egy székelynél találták meg). Az anyai ági és az apai ági genetikai vizsgálatokból azt a következtetést vonhatták le, hogy a honfoglaláskori leletanyag nem volt genetikailag egységes: míg a köznépi temetők leletanyaga inkább a ma élő magyar nyelvű populációk európai jellegzetességeit hordozta, az úgynevezett klasszikus honfoglalók nagy gyakorisággal ázsiai eredetű apai ági, illetve anyai ági genetikai elemeket hordoztak. Ezek előfordulása a ma élő magyar és székely népcsoportban, valamint a honfoglaláskori köznépi temetők leletanyagában csak igen kis százalékban fordul elő. Későbbi vizsgálataikban egy másik tulajdonság genetikai meghatározóját is megvizsgálták. Ez a felnőttkori tejemésztés képességének a genetikai alapja. Ismeretes, hogy a tej emésztésében résztvevő fehérje bizonyos embereknél felnőtt korban hiányzik. A tejemésztés képessége legnagyobb gyakorisággal Európa északi területein marad meg az emberek felnőtt korában is. Ez a képesség délre haladva egyre ritkábban található meg. Az északi népek majdnem 100%-os tejemésztési képességéhez képest, a ma élő magyar lakosság 63%-a képes felnőtt korában is emészteni a tejet. Ez a tulajdonság az ázsiai népeknél hiányzik, vagy ritkán fordul elő. Ennek megfelelően a magyarokkal rokon népeknek tartott uráli nyenyeceknél, udmurtoknál, manysiknál a lakosság mintegy 70%-a képtelen a tejet emészteni. A honfoglaláskori DNS-mintákban meghatározták a tejemésztés képességének a gyakoriságát. Megállapították, hogy szemben a ma élő magyar népességgel a honfoglalók mintegy 70%-a felnőtt korában képtelen volt a tejet emészteni. Ez az adat nagyon hasonló az előbb említett uráli népeknél említett értékekhez, és ez is a honfoglalók ázsiai eredetét bizonyítja. Tekintetbe véve azonban azt a tényt, hogy a ma élő magyaroknál ez a képesség felnőtt korban is megmaradt, ez alátámasztja azt az előző feltevésüket, hogy a honfoglalók genetikai állománya felhígult az itt élő népekkel, valamint a későbbi történelmünk során idetelepült népcsoportok genetikai állományával, kialakítva a minden szempontból európai típusú tejemésztési genetikai mintázatot. Miután számos honfoglaláskori sírral lócsontokat is feltártak, adott volt a feladat; a honfoglalás kori lovak genetikai jellemzése és összehasonlítása régi és mai tenyésztésű egyedekkel. 31 avar és honfoglaláskori lómaradvány mitokondriális DNS-ének vizsgálata és ezek összehasonlítása 76 fajta 921 egyedével azt mutatta, hogy a honfoglaláskori lovak a ma is tenyésztett Akhal teke lovakhoz álltak genetikailag a legközelebb, és lényegesen különböztek az avar kor lovaitól. A csoport jelentős szerepet vállalt a humán molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek hazai

127 elterjesztésében is. Egyrészről a SZOTE Gyermekklinika szakembereivel együttműködve megteremtettek egy olyan klinikai molekuláris genetikai laboratóriumot, ahol a legkülönbözőbb genetikai betegségekben a molekuláris biológiai diagnózist megadhatják, vagy olyan esetekben, amikor új, molekuláris biológiai módszert közölnek egyes kórképek jellemzésére, akkor ezeket a vizsgálatokat beállíthatják, de szoros együttműködést alakítottak ki a Neurológiai és a Pszichiátriai Klinika orvosaival is. A genetikai betegségek molekuláris biológiai vizsgálatát a cystikus fibrózissal kezdték, majd az izomdystrophiákkal folytatták. A nyolcvanas évek végén kidolgozták egy, a populációban hordozói szinten viszonylag gyakran előforduló monogénes genetikai betegség, a cisztás fibrózis molekuláris genetikai diagnózisát, majd a Duchenne és Becker típusú izomsorvadásos magyar betegek mutációs spektrumát jellemezték, és kidolgoztak egy, a betegségokozó mutációt hordozók kimutatására alkalmas módszert. Molekuláris biológiai módszereket alkalmaztak a vesetranszplantáció donor-recipiens párjainak a szerológiai vizsgálatokat kiegészítő jellemzésére, valamint a HLA-régió DNS-polimorfizmusait alkalmazták juvenilis rheumatoid arthritiszes és coeliákiás betegek betegséghajlamának megállapítására. Meghatározták a Huntington kór hazai mutációs jellegzetességeit, és megállapították, hogy az ilyen betegek limfocitái ultraibolya fénnyel történt besugárzás után fokozott apoptózis hajlamot mutatnak. A kilencvenes években feltárták az időskori elbutulásra, az Alzheimer kórra hajlamosító apolipoprotein E allélek hazai megoszlását, és összefüggést találtak az apolipoprotein E4 és az időskori vasculáris demenciák előfordulási gyakoriságában. Comet assay alkalmazásával megemelkedett oxidatív DNS-károsodásokat találtak az Alzheimer kórban szenvedők limfocitáiban az egészséges kontrollokhoz képest. Napjaink vezető haláloka a rák. Élete során minden ember szervezetében elindul valamiféle rákos elfajulás, szerencsére az esetek többségében ez nem fejlődik betegséggé. Világszerte több ezer kutatócsoport vizsgálja a rák okait, kialakulását és gyógymódját. A feladatot megnehezíti, hogy a rák elnevezés valójában egymástól nagymértékben különböző betegségeket takar. Ismert, hogy egyetlen elrontott gén nagyon ritkán okoz rákot. Egy egészséges sejt daganatos sejtté alakulásához legalább öt-hat gén együttes mutációjára van szükség, de egy átlagos rákos sejt ennél is több mutációt hordoz. A rákos megbetegedéseknek csak kis hányada örökletes; ilyenkor egyetlen egy génben található hiba okozza a betegség kialakulását; de a rákos megbetegedések többsége az életkor előrehaladtával fokozatosan alakul ki, ebben az esetben a sejtek DNSében felhalmozódott hibák, károsodások a felelősek a folyamatért. A DNS számos, folyamatosan előforduló károsító hatásnak van kitéve, melyek többek között a napsugárzás, a dohányfüst, a kemikáliák és egyéb környezeti szennyező anyagok. A károsodások egy részét a sejtjeinkben található hibajavító mechanizmusok képesek kijavítani, de a fennmaradó kijavítatlan DNS-hibák a rákos folyamatok megindításában szerepelhetnek. A DNS-hibák javítása többféle mechanizmussal történhet. Maguk a mechanizmusok evolúciósan rendkívül konzerváltak, károsodástípusokra specializáltak, ugyanakkor bizonyos mértékig redundánsak is, vagyis egy hibát többféle mechanizmus is javíthat, előfordul, hogy egyes kulcsenzimek többféle mechanizmus működésében is közreműködnek. A Genetikai Intézet legfiatalabb témacsoportjaiban, a Haracska Lajos által vezetett Mutagenezis és Karcinogenezis, valamint Unk Ildikó DNS Károsodás Tolerancia laboratóriumaiban a fenti témákban vizsgálódnak. Azonosítottak és jellemeztek olyan géneket, melyek szerepet játszanak a DNS-hibák javításában és a DNS-ben kódolt információ megőrzésében. Vizsgálataikat emlős és élesztősejtekben végzik. Azonosították az élesztőből már ismert Rad5 fe hér je emberi megfelelőit, a HLTF és az SHPRH fehérjéket. Ezek a fehérjék több DNS-hibajavító útvonalban is részt vehetnek. Egyrészt más fehérjék transzláció utáni módosítását hajthatják végre, és ezáltal a hibajavítás egy speciális útvonalában vehetnek részt. Másrészt a DNS-en, mint helikázok, illetve a HLTF esetében, mint transzlokázok, képesek a DNS megkettőződés villaszerű struktúráját mozgatni, s így a templátváltás (vagy más néven villa megfordítás ) útvonalán keresztül biztosíthat- Genetika 127

128 Genetika ják a károsodott DNS-szakasz replikációját. Mindkét fehérje hiányát kimutatták különböző daganatos megbetegedések esetében. Az előző két fehérjéhez hasonlóan, élesztőben megtalálható fehérje alapján azonosították az emberi Ape2 fehérjét, mely kétféle módon is képes hasítani a DNS-szálat, illetve, ha a DNS-replikációban a DNSpolimeráz hibázik, ez a fehérje biztosítja, hogy hibás bázis beépítése esetén az adott DNS-szakasz lebontódjon és így a polimeráz a DNS-replikációját nagyobb hűséggel végezze. A daganatok és a DNS-hibajavító mechanizmusok kapcsolatának vizsgálata komoly gyakorlati jelentőséggel bír. A különböző daganatos megbetegedések kemoterápiás kezelésének során az osztódó sejtek DNS-ében megjelenő hibák felszaporodására, ezáltal az osztódás megszakítására, majd az ezt követő sejthalálra törekszenek. A daganatsejtek DNS-hibajavítóképessége, a hibajavításban szereplő fehérjék felszaporodása vagy hiánya jelentősen befolyásolhatja a daganatok különböző kemoterápiás ágensekkel szembeni érzékenységét. Feltételezésük szerint a hibamentes DNS-javításban szerepet játszó fehérjék hiányában a kemoterápiás ágensekkel kezelt sejtekben megnőhet a mutációk megjelenésének mértéke, ami a másodlagos malignitások kialakulásának veszélyét növelheti. Ha valamely DNS-hibajavító útvonalban szereplő kulcsfontosságú enzim hiányzik a sejtből, az érzékenyebbé válik a kemoterápiás ágensekre. Így az adott daganat molekuláris hátterének ismeretében hatékonyabb kemoterápiás protokollok alkalmazhatók, amelyek a daganatos sejtek hatékonyabb eliminálása mellett a beteg egészséges sejtjeit kevésbé károsítják. Az SZTE Pathológiai Intézetével részt vesznek különböző daganatok molekuláris genetikai jellemezésében, elősegítve az adott molekuláris háttérnek megfelelő, sikeres összetételű kemoterápiás eljárást. Munkájuk során az általuk már megismert fehérjékre csendesített sejtvonalakban vizsgálják a különböző kemoterápiás hatóanyagokat. További, a DNS-hibajavítás különböző útvonalaiban szerepet játszó fehérjék azonosítása és jellemezése céljából kidolgoztak egy humán sejtekben alkalmazható rendszert, amelynek segítségével mérni tudják a sejtekben bekövetkező homológ rekombinációs és nem homológ végek összekapcsolásával lejátszódó DNS-beépülések arányát, illetve azokat a tényezőket, amelyek ezeket megváltoztatják. A jövőben a rák kialakulásában és fenntartásában szerepet játszó gének további analízisét tervezik, amely végső soron új, molekuláris célpontokra irányított rákgyógyszerek, diagnosztikai és terápiás eljárások kifejlesztéséhez vezethet. 2. ábra. Különböző fehérjék lokalizációjának megjelenítése daganatos sejtvonalakban Raskó István 128

129 40 év immunológia az SZBK-ban Genetika Az immunológiai kutatások az SZBK-ban az első hazai szervátültetések idején kezdődtek azzal a céllal, hogy kísérleti állatokon, egereken vizsgáljuk a szervátültetések során fellépő immunológiai reakciókat, azaz a szöveti összeférhetőség genetikai hátterét és az átültetett szövetek ellen fellépő immunológiai reakciót. Négyfős Immungenetikai Csoport szerveződött, melynek tagjai a csoportvezető Fachet József orvos, Fodor András genetikus, Gál András orvos és jómagam, frissen végzett állatorvos voltunk. Az immunológia Magyarországon ekkor vált külön diszciplínává, és bár immunológiai oktatás általában a mikrobiológia vagy a járványtan keretében folyt, az antigén-ellenanyag reakció, a komplement működése és a szöveti antigénekkel szemben kialakuló transzplantációs immunitás a jelenség szintjén már ismert volt. A transzplantációs immunológia még gyermekcipőben járt, és bár az ellenanyagok szerkezetéről és a sejt közvetítette immunitásról már voltak ismereteink, az immunológiai reakciókban résztvevő sejtekről, a genetikai szabályozás folyamatáról igen keveset tudtunk. Mivel a szervátültetések technikai részét Szegeden és Budapesten sikerült megoldani, a kor igényének megfelelően itthon is megkezdődtek a transzplantációs immunológiai kutatások. A szöveti összeférhetőségért, más szóval, az átültetett szövetek kilökődéséért elsősorban felelős sejtfelszíni struktúrákat sikerült azonosítani, és érdekes felfedezés volt, hogy a szabályozó gének közelében találhatók az immunválaszért felelős gének, vagy éppenséggel maguk a szöveti összeférhetőségért felelős gének szabályozzák az immunválaszt. Az immunválaszt kiváltó komplex sejtfelszíni struktúrák sejtközvetítette és humorális immunválaszt egyaránt kiváltottak, ezért mi is terveztük a szöveti antigénekkel szemben kialakuló sejt közvetítette immunválasz és az ellenanyagtermelés genetikai szabályozásának a vizsgálatát. A kétféle immunválaszt egy viszonylag egyszerű, alacsony molekulasúlyú antigénnel, az ún. hapténnel modelleztük, azaz egy sejt közvetítette és humorális immunválaszt egyaránt kiváltó molekulával szemben kialakuló kétfajta immunválasz genetikai szabályozását vizsgáltuk. A kísérletek érdekes eredményt hoztak: a sejt közvetítette immunválasz és a humorális immunválasz genetikai szabályozása nagyfokú hasonlóságot mutatott egymással azok a beltenyésztett egértörzsek, melyek erős sejt közvetítette immunválasszal rendelkeztek, erős ellenanyagválaszt is produkáltak. Az immunválasz szabályozásáért felelős géneket a szöveti antigéneket kódoló gének közelébe térképeztük. Eredményeinket, melyek előrevetítették a sejt közvetítette és a humorális immunválasz később igazolt közös szabályozását, a tekintélyes Nature folyóiratban közöltük. Ezzel párhuzamosan megpróbáltuk izolálni a szöveti antigéneket, hogy kísérleti állatmodellen vizsgáljuk a kétféle immunválaszt, illetve specifikus válaszképtelenséget idézzünk elő. Reményeink szerint ezzel tudtuk volna fokozni a szervátültetések hatékonyságát, illetve jellemezni tudtuk volna a szöveti antigénekkel szemben kialakuló immunválaszt. Az előbbi, modell értékű kísérletek sikeresebbnek bizonyultak, mint az utóbbi, mai szemmel nézve is ambiciózus komplex megközelítés, nem is csoda, hogy a csoport hamar átszerveződött, azaz Fachet Józseffel ketten maradtunk, bár időnként egy-egy ösztöndíjas hosszabbrövidebb időre csatlakozott hozzánk. Ekkor jelentek meg az első, az immunreguláció folyamatait in vitro módszerekkel megközelítő közlemények. 129

130 Genetika 130 UNESCO ösztöndíjasként Angliába utaztam, hogy ezeket a módszereket elsajátítsam és megtanuljam a regulátorfaktorok, illetve sejtek izolálását és jellemzését in vitro, Nicholas Avrion Mitchison intézetében, Londonban, az Imperial Cancer Research Fund Tumor Immunológiai Intézetében. Fachet József Ábel Györggyel és Erdei Jánossal, későbbi munkatársaival a különböző eredetű, de elsősorban gombákból származó poliszacharidák tumorellenes hatását vizsgálta. A módszerek tanulása közben nem tudtam elszakadni az egyazon antigénnel szemben kialakuló sejt közvetítette és humorális immunválasz szabályozásban rejlő hasonlóságoktól és különbségektől. Ismert volt, éppen Olli Mäkelä és munkatársai kísérleteiből, hogy bizonyos genotípusú állatokban egy hapténnel szembeni immunválasz során, érdekes módon egy másik molekulával szemben képződnek magas affinitású ellenanyagok. Az volt a kérdés, hogy ez a T-sejtek vonatkozásában is így van-e. A T sejtek antigénfelismerő receptora ekkor még nem volt ismert, és különböző elméletek születtek a receptorok specifitásáról. Mi föltételeztük, hogy amennyiben a T- és a B-sejtek specifitását egyazon struktúrák szabják meg, a T-sejteknek is a B-sejtekhez hasonlóan kell viselkedni, azaz magasabb specifitást kell mutatni egy idegen antigénnel szemben, mint a kiváltóval. Itt kell köszönetet mondanom Nicholas Avrion Mitchisonnak, az Intézet igazgatójának, aki támogatta a haptén szintetizásálának kalandos lépéseit, amelyet a szerves kémiai intézetben végeztem el. Az érdeklődőknek csak megjegyzem, hogy ehhez benzolgyűrűs vegyületeket jódoztam, majd azoknak az azid származékát állítottam elő, és mivel ezek robbanásveszélyes vegyületek, néhányunknak a gyomrában gombóc képződött, amikor az állatorvos-immunológus betette a lábát a Szerves Kémiai Intézetbe. Talán nem véletlen, hogy a legnagyobb légterű teremben kaptam egy asztalt a haptének szintetizálására. Az eredmények azt mutatták, hogy a sejt közvetítette immunválasz specifitása nem egyezik meg a B-sejtek által termelt ellenanyagokéval, tehát a T- és a B-sejtek specifitásának a körét nagy valószínűséggel egymással nem átfedő specifitású receptorokat kódoló gének határozzák meg. Az alapvető in vitro módszerek elsajátítása mellett olyan szerencsés voltam, hogy megtanulhattam az akkor éppen kidolgozott hibridómatechnikát is, mely a későbbiekben hosszú időre biztosított muníciót. Hazatérésem után Fachet József, az Immungenetikai Csoport vezetője átvette a DOTE Kórélettani Intézetének az irányítását. A Genetikai Intézet Raskó István által vezetett csoportjához, az Emlőssejt Genetikai Csoporthoz csatlakozhattam, ahol szomatikus sejthibridekben vizsgálták az idegen genom expresszióját és a gének sérüléseinek helyreállítási folyamatát. Lehetőséget kaptam arra, hogy a Laboratóriumban folyó fő iránytól eltérően önállóan kutathassak. A hibridóma-technika alapvetően az immunológiai módszerekkel fűszerezett szomatikus sejthibridizáción alapul, ezért viszonylag könnyű volt az Angliában elsajátított módszert meghonosítani. Mivel Magyarországon elsőként alkalmaztam a nagy perspektívával kecsegtető módszert, sok, a módszer iránt érdeklődő hazai és külföldi kutatót fogadtunk a laboratóriumban. Az immunrendszer működésének a megismerése rengeteg kihívást tartogatott, és úgy láttuk, hogy az emberi immunrendszer működésének a mélyebb megértéséhez a komponensek molekuláris szintű megismerésén keresztül vezet az út, és a komponensek ilyen szintű megismeréséhez ideális a frissen bevezetett módszer. Elkezdtük az emberi fehérvérsejtekre jellemző markermolekulák azonosítását. Megmaradt azonban az elméleti kérdések iránti érdeklődésem és nem tudtam elszakadni a sejt közvetítette immunválasz specifitásának a vizsgálatától. Izgalmas kérdés volt számomra az, hogy a T-sejtek differenciálódását irányító csecsemőmiriggyel és funkcionális T-sejtekkel nem rendelkező egyedek hogyan maradhatnak életben? Arra gondoltam, hogy ezek az egyedek esetleg rendelkeznek éretlen T-sejtekkel, melyeknek differenciálódása a csecsemőmirigyen kívül is megtörténhet, csak egy lökés hiányzik a funkcionális T-sejtté válásukhoz. Megírtam az ötletemet Finnországba egy kollégámnak, Mikko Hurménak, aki furcsának tartotta az ötletet, de ugyanakkor hozzásegített egy egyhónapos ösztöndíjhoz, melynek keretében az ő laboratóriumában tesztelhettem az extravagánsnak tűnő elképzelésemet. Egy hónapi munka után egy kézirattal álltam elő, melyet az Intézet munkatársai érdemérmekkel jutalmaztak. Tudták, hogy szabad időmben horgászom, ezért vettek egy

131 marék horgot és a búcsúvacsoránál mindenki egyegy horgot tűzött az ünneplő ingem zsebére Horgokkal a mellemen fölsallangozva jöttem haza. A kézirat, melyet Mikkoval a Nature folyóiratba küldtünk, ugyancsak elnyerte jutalmát, azonnal elfogadták közlésre. Az eredmények fölhívták a figyelmet arra, hogy egyes T-sejtek a csecsemőmirigyen kívül is képesek differenciálódni. A váratlan eredmény megindította a tímuszon kívüli T-sejt differenciálódásának vizsgálatát, mely addig ismeretlen T-sejt alpopulációk azonosításához vezetett. Időközben itthon készültek a hibridómák. A pályázati rendszer Magyarországon a gyakorlati eredményeket hozó alapkutatásokat támogató KKP-2 programmal kezdődött, ahol nyertünk, és az Emlőssejt Genetikai Csoport támogatásával létrehoztunk egy immunológiai főprofillal rendelkező önálló laboratóriumot. Ezidőtájt csatlakozott hozzám egy szerződéses munka kapcsán Monostori Éva, a HUMÁN Oltóanyag Termelő Intézetből, akivel nemzetközi workshopokon is validált, az emberi immunrendszert elemeire bontó reagenspanelt hoztunk létre. Mivel itthon a termékeket piacképes, standardizált termékké fejlesztő, csomagoló, forgalmazó stb. partnert nem találtunk, külföldi partner keresése pedig akkoriban nehézkes volt, nem volt meglepő, hogy óriáscégek jelentkeztek a piacon a mieinkkel használhatóságában és minőségében megegyező, de komoly marketing háttérrel rendelkező termékekkel. Ennek ellenére egy angliai cég és több kisebb cég megkeresésére egyes klónokat (az aranytojást tojó tyúkokat) forgalmaztunk, és az így befolyó összeg nagy részét a laboratórium további fejlesztésére fordítottuk. A KKP-2 program más néven folytatódott, és a SZOTE Gyermekklinikáján dolgozó Szűcs Péterrel együttműködve a velőcsőzáródási rendellenességek születéselőtti diagnosztizálására alkalmas prenatális diagnosztikai rendszer fejlesztését tűztük ki célul. A magzat velőcsőzáródási rendellenességeinek esetében a magzatvízben és az anyai szérumban is már a terhesség korai szakaszában megemelkedik egy, a magzati máj által termelt fehérje, az alfa-foetoprotein (AFP) szintje. Az emelkedett AFPszint kimutatása diagnosztikai értékű lehet. A reagensek létrehozásához sem tisztított antigénünk, sem pedig specifikus ellenanyagunk nem volt. Létezett azonban egy diagnosztikai kit, melynek egyik összetevője a belső standardként használt AFP volt, amely azonban mindössze kb. 0,5% AFP tartalmazott, a többi 99,5% a hozzá szerkezetében nagyon hasonló szérumalbumin volt. Ezzel az AFP -vel indultunk neki a nagy kalandnak, és sok kacskaringóval tarkított úton előállítottuk az enzim-immunassay (ELISA) kithez szükséges ellenanyagokat. Ezek az ellenanyagok azonban nemcsak diagnosztikai célra voltak alkalmasak, hanem segítségükkel egy lépésben tudtunk magzatvízből analitikai tisztaságú AFP-t izolálni. Így végre összeállt a diagnosztikai kit. A technológiát és a reagenseket átadtuk az iparnak, így újból tudtunk labort fejleszteni. Miután a SZTE Igazságügyi Orvostani Intézetébe is eljutott a hír, hogy AFP-t tudunk kimutatni, együttműködésre kaptunk ajánlatot, melynek keretében különböző felületekről (bútor, textil, fém) terveztük az AFP kimutatását. Meglepődtünk, amikor borítékokba gondosan csomagolt gyanús kinézetű rongyok társaságában meg is jelent az Intézetből egy munkatárs, Kurucz Éva, azzal, hogy ezekről azt kéne kimutatni, hogy AFP vagy albumin van rajtuk, ugyanis a magzat terhére elkövetett bűncselekmények a magzati eredetű AFP-nek a helyszínen történő kimutatásával egyértelműen felderíthetővé váltak volna. Éva rengeteget próbálkozott, amíg a különböző, szinte kövesedésig száradt rongyokból és roncsolódott felületekről ki tudta vonni a fehérjét, és azt az ELISA segítségével ki tudta mutatni. A gyanús kinézetű textildarabokról kapta a módszer a rongyos ELIZA nevet. Az emberi immunrendszert elemeire bontó reagensek érdekes keresztreakciók révén háziállatok vérsejtjeinek a tipizálására is alkalmasnak bizonyultak, amire Vilmos Péter munkája hívta fel a figyelmet. Az egyik ellenanyagunkról pedig nemzetközi együttműködés keretében igazoltuk, hogy a HIV vírust kötő egyik járulékos sejtfelszíni molekulán egy olyan struktúrát ismer fel, melynek mutációja lehetetlenné teszi a vírusnak a sejtekhez történő kötődését és ezál- Genetika 131

132 Genetika 132 tal a sejtek fertőzését. Ezzel a reagenssel egy adott populációban megtalálhatók a mutáns fehérjét hordozó egyedek, akik a vírusfertőzés iránt kevésbé fogékonyak. Ezzel senkit sem akartunk életformaváltásra bíztatni, viszont egy értékes, a fertőzés szempontjából kitüntetett struktúrát azonosítottunk. A hibridómamódszer meghonosításáért és több területen történő sikeres alkalmazásáért és elterjesztéséért Monostori Évával közösen megosztott Akadémiai Díjban részesültünk. Az együttműködések színesítették a laboratórium életét és némelyik elég váratlanul alakult, de annál tartósabbnak és kellemesebbnek bizonyult. Ekkor alakult ki egy gyümölcsöző együttműködés az akkor a SOTE Anatómiai intézetében dolgozó Takács Lászlóval, aki élve a laboratóriumunk adta lehetőségekkel kórszövettani mintákon tesztelte a reagenseket. Az első hazai májátültetést követően kilökődött máj szövettani vizsgálata fontos diagnosztikai módszert hozott létre, mely talán mind a mai napig a legérzékenyebb módszer az átültetett májszövet ellen meginduló immunreakció felismerésére. A kilökődési reakció megindulásának első észlelhető jele az, hogy a máj epekapillárisain addig jelen nem lévő molekulák, a II. típusú szöveti antigének jelennek meg. Eredményeinket az Angliában megjelenő nagy presztízsű klinikai folyóiratban, a Lancet-ben fogadták el közlésre. Takács László fő érdeklődési területe azonban a csecsemőmirigyben zajló T-sejt differenciálódás szabályozása volt, és mivel a T-sejtek differenciálódását alapvetően a szerv hámjának szöveti antigénjei irányítják, megvizsgálta, hogy létezik-e molekuláris módszerekkel jellemezhető mikroheterogenitás, mely részt vehet a T-limfociták differenciálódásának az irányításban. Munkáját siker koronázta, és olyan molekuláris markereket azonosított, melyeknek segítségével jellemezhető volt a differenciálódó T-sejt kompartmentumok és a hámsejtek heterogenitásának a kapcsolata. Lővei Gábor is megkeresett bennünket (MTA Növényvédelmi Kutatóintézet) azzal, hogy ragadozó rovarokban szeretné a préda-rovarok fehérjéinek az emésztését nyomon követni. Ekkor kezdődtek komolyabban a környezetbarát technológiák fejlesztésére irányuló kutatások, és mivel a gazdasági növények szinte telítve voltak a rovarirtó szerekkel (DDT, HCH), olyan ragadozó rovarokat kerestek, melyekkel a kórokozók visszaszoríthatók. Így esett a választása a kukoricamolyra, mint kórokozóra, és annak egy természetes ellenségére, egy kis futóbogárra. Olyan enzim-immunassayt fejlesztettünk ki a szakterületen elsőként, melynek segítségével ragadozó rovarokban hosszú ideig nyomon tudtuk követni a zsákmány emésztésének a folyamatát. A módszer, melynek érzékenysége vetekszik az időközben kifejlesztett DNS-alapú módszerekével, jelenleg is használatos az áldozat fehérjéinek ragadozó rovarokban történő nyomon követésére. Időközben meghívást kaptam Londonba az Imperial Cancer Research Fund Humán Tumor Immunológiai Laboratóriumába, ahol a laboratóriumunkban létrehozott molekuláris markerek további jellemzését terveztem. A kísérleteket szinte el se kezdtem, amikor egy rutinteszt során észrevettem, hogy a daganatok képződését serkentő egyes vegyületek tumorpromóterek jellegzetesen megváltoztatják az immunválaszban résztvevő sejtek viselkedését. Ez az észlelés érdekesebbnek bizonyult, mint a markerek jellemzése, ezért úgy döntöttünk, hogy a további jellemzést az éppen meginduló Leukocita Workshopok keretében végezzük. Ettől kezdve reagenseinkkel rendszeresen részt vettünk a leukocita antigéneket (CD-ket) definiáló közös nemzetközi munkában. A fölszabadult időben a tumorpromóterek által kiváltott fenotípusváltozást jellemeztük T- és B-limfocitákban illetve Epstein- Barr vírussal transzformált B-sejtekben. A tumorpromóterek a T- és B-sejtekben egyaránt az antigén-specifikus receptorok eltűnését okozzák, és növekedési faktorokat kötő receptorok sejtfelszíni megnyilvánulását eredményezik, ami feltehetően szerepet játszik a tumorképződés folyamatában. A markerek használata a B-sejtdifferenciálódásának a vonatkozásában is új eredményeket hozott, amenynyiben megállapítottuk, hogy a molekuláris markerekkel jellemezhető B-sejt-érés kapcsolatban áll az Epstein-Barr vírus indukciójával, azaz molekuláris immunológiai módszerekkel megtaláltuk azokat a B-limfocitákat, melyek a vírust hordozó egyénekben termelik a vírust, és a vírus egészséges egyénekbe történő átvitelében, más szóval, a fertőzésben kulcsszerepet játszanak.

133 Hazatérésem után folytattuk az immunválaszban résztvevő sejtfelszíni struktúrák jellemzését, különös tekintettel a genetikai átrendeződést nem mutató receptorokra. Amikor Magyarország, EU-csatlakozását jóval megelőzően, megfigyelői szerepet kapott, nemzetközi (EU) pályázati lehetőségek is megnyíltak előttünk. René van Lierrel (Hollandia) és Vaclav Hořejší (Cseh Köztársaság) közösen benyújtott EU pályázatunkkal támogatást nyertünk genetikailag át nem rendezett sejtfelszíni immunreceptorok vizsgálatára, mely a laboratóriumban további komoly fejlesztéseket tett lehetővé. Az emberi sejtfelszíni antigének jellemzése rohamléptekben haladt előre, és a jelátviteli utak megismerése egyre részletgazdagabbá vált. Ekkor vetődött föl bennem az a gondolat, hogy itt az ideje a téma átstrukturálásának. A genetikailag át nem rendezett receptoroknak különleges szerepet tulajdonítottak a bakteriális mintázatok felismerésében. Az emlősök immunrendszere azonban olyan komplexnek bizonyult, hogy a mintázatfelismerő receptorok működését nehezen lehetett elválasztani a genetikailag átrendezett receptorok működésétől, azaz az antigén-specifikus immunválasztól függetlenül, és a genetikai rendszer kifejlesztése is bonyolultnak látszott. A rovarok nem rendelkeznek genetikailag átrendezett receptorokkal, viszont hatékonyan kebelezik be a mikrobákat, és egyes parazitákkal szemben is hatékonyan védekeznek. Rendelkezniük kell tehát genetikailag nem átrendezett, vagyis mintázatfelismerő receptorokkal, melyeknek működése önállóan is vizsgálható lenne. A Drosophila melanogaster genetikai rendszere, a hatalmas mutánspark megléte (melynek létrehozásában a Genetikai intézet Drosophila Genetikai Csoportja aktívan közreműködött) valamint a Csoport szaktudása kiváló hátteret látszott biztosítani az immunológiai vizsgálatokhoz, különösen úgy, hogy kilátásban volt a Drosophila genom teljes megismerése. Ismert volt annak idején az is, hogy a Drosophila hatékony humorális immunválasszal rendelkezik, azaz a mikrobákat nagy hatásfokkal elpusztító antimikrobiális peptideket termel. A Drosophila sejt közvetítette immunitásáról, a vérsejtekről és egyéb immunsejtekről azonban nagyon keveset tudtunk. Abban ugyan nem voltam biztos, hogy a Drosophila immunrendszerének a vizsgálata technikai okok miatt nem hiúsul-e meg, de mivel egyes mutáns törzsekben egy-egy sejttípus jellemzően felhalmozódott, arra gondoltam, hogy a különböző morfológiai sajátságokkal rendelkező sejtek immunológiai markerekkel is jellemezhetők és elkülöníthetők egymástól. Előkísérleteket végeztem, melyek igazolták a vérsejtek immunológiai markerekkel jellemezhető heterogenitását. Ekkor kapcsolódott a munkába Vilmos Péter, majd Kurucz Éva, akik mind a mai napig aktívan közreműködnek a téma kutatásában. A kezdeti eredményeken föllelkesülve nemzetközi együttműködő partnert kerestem és találtam a Drosophila vérsejtek szaktekintélyében, Elisabeth Gateffben, aki az első telefonbeszélgetésünket követően azonnal meghívott az általa vezetett Genetikai Intézetbe, Mainzba, és közös pályázat keretében végzendő együttműködést javasolt. A Volkswagen Alapítványtól kapott támogatás lehetővé tette a projekt folytatását és a csoport további bővítését. A Drosophila melanogaster sejt közvetítette immunitásának vizsgálatára és a sejtes elemek azonosítására és jellemzésére alkalmas molekuláris eszköztárat hoztunk létre, amellyel lehetővé vált a különböző sejttípusok és sejtpopulációk elkülönítése és szeparálása. Nyilvánvaló, hogy az egyes sejttípusokra jellemző molekuláris markerek az egyedekben nem markerszerepet töltenek be, ezért föltételeztük, hogy az azonosított molekulák fontos szerepet töltenek be az őket hordozó sejttípusra jellemző funkciókban. Megpró- Genetika 133

134 Genetika 134 báltuk a markereket a molekuláris genetika eszköztárával azonosítani. Kurucz Éva Udvardy Andorral karöltve vizsgált génkönyvtárakat, miközben meghívást kaptam vendégprofesszorként a Stockholmi Egyetem Wenner Gren Intézetébe Dan Hultmark laboratóriumába, ahol az itthon létrehozott eszköztár és módszerek adaptálására kértek fel. Két fiatal munkatársamat is meghívhattam a stockholmi laboratóriumba, akik elsajátíthatták a molekuláris genetika alapvető módszereit és itthon sikerrel folytatták a megkezdett kísérleteket. Az első eredmények a Dan Hult mark laboratóriumában felfedezett Relish transz kripciós faktor funkciójának meghatározásából születtek. Megállapítottuk, hogy a Relish az antimikrobiális peptidek termelésének szabályozásában vesz részt, nem pedig a sejt közvetítette immunválaszt szabályozza, azaz a humorális és a sejt közvetítette immunválaszt egymástól különböző genetikai faktorok szabályozzák. Miközben Stockholmban a Drosophila-immunitás projektet építettem, Monostori Éva kivált a csoportból és önállósult laboratóriumában folytatta munkatársaival az emberi limfocitákban zajló jelátviteli folyamatok vizsgálatát. Eredményei az irodalmi adatokat értékes részletekkel gazdagították és gazdagítják ma is. Stockholmban újabb markerpanelt hoztam létre, mely lehetőséget teremtett differenciálódási vonalak nyomon követésére, és a későbbiek során nagy segítségünkre volt az egyes sejtkomponensek izolálásában. Miután Dan intézet-igazgatói állást kapott az Umeai Egyetem Molekuláris Patológiai Intézetében, meghívott az új laboratóriumba, ahol a Stockholmban újonnan azonosított molekulák jellemzését folytattam. Aktív együttműködés alakult ki itthoni munkatársaim és az umeai laboratórium között, melynek részeként Kurucz Éva meghívást kapott Umeába a markerek molekuláris jellemzésére. Itt azonosította a Drosophila melanogaster első vérsejtspecifikus transzmembrán fehérjéjének (Hemese) a génjét; az eredményt az Amerikai Tudományos Akadémia folyóiratában (PNAS) közöltük. A gén regulátorrégiójának az izolálása és összekapcsolása meghajtó és meghajtott genetikai modulokkal lehetővé tette a vérsejtek in vivo történő megfigyelését, valamint egy irányított genetikai screen elvégzését, melynek eredményeként a vérsejtek differenciálódásában alapvetően fontos jelátviteli utakat azonosítottunk. Az eredményeket ugyancsak a PNAS-ben közöltük. Hazatérésem után pályázatokat nyújtottam be az Országos Tudományos Kutatási Alaphoz (OTKA). A kapott támogatás, valamint a Genetikai Intézettől kapott erkölcsi és anyagi segítség lehetővé tette az időközben minimálisra zsugorodott Immunológiai Csoport újraszervezését. Az umeai laboratóriummal végzett együttműködés folytatódott, ami az eredmények megbeszélését és kutatók rendszeres cseréjét biztosította. A közlemények és az Amerikai Drosophila Társaság kongresszusain elhangzott előadások nyomán az általunk kifejlesztett eszköztár népszerűvé vált és jelenleg nincs olyan, a Drosophila melanogaster immunitását vizsgáló, vagy a vérsejteknek a differenciálódásában betöltött szerepét tanulmányozó laboratórium, ahol a reagenseket ne használnák rutinszerűen a vérsejt-differenciálódás vizsgálatában, vagy a vérsejteknek a differenciálódásban betöltött szerepének elemzése során. Eddig több mint félezer mintát küldtünk a világ minden tájára, és nap mint nap érkeznek a rendszer használatára irányuló kérések-

135 kérdések. A munka eredményeit a szakterület fejlődésére gyakorolt hatását az SZBK-ban Straub plakettel ismerték el. Genetika A csoport ezt követően két fő irányban folytatta a kísérleteket. Az egyik irány a vérsejtek differenciálódásának a vizsgálata, a vérsejtképző szövetek jellemzése, a másik a sejttípus-specifikusan megnyilvánuló molekulák génjeinek azonosítása és jellemzése. A hemese-konstrukcióval végzett in vivo kísérletek végzése közben megfigyeltük, hogy immunindukciót követően addig nem jellemzett sejtcsoportok leváltak a testüreg faláról. A sejtek sorsát vizsgálva megállapítottuk, hogy a levált sejtek a nagyobb részecskéket elhatároló sejtek, az ún. lamellociták, melyekről föltételezték, hogy kizárólag a központi nyirokszervből származnak. Elsősorban Márkus Róbert szellemesen tervezett kísérleteinek köszönhetően megállapíthattuk, hogy az immunindukciót követően leváló sejtek egy funkcionálisan egységes szövetet képeznek, mely a lamellociták előalakjait tartalmazza. A váratlan eredmények alapvetően megváltoztatták a lamellociták eredetéről alkotott elképzeléseket, ami a közlés előtt hosszas szakmai vitát generált a különböző folyóiratok által kijelölt bírálókkal. Végül ezt a kéziratot is a PNASben fogadták el közlésre. Honti Viktor, majd Csordás Gábor új színt és erőteljes genetikai eszköztárat hozott a csoportba. Ötletekben gazdag kísérleteik eredményeként egy olyan sejtvonal-jelölő rendszert hoztak létre, melynek segítségével meghatározható a funkciójukban egymástól különböző vérsejtek embrionális eredete. Évtizedek óta küzdött egymással két tábor, melyek a különböző vérsejtvonalakat két, illetve három fő differenciálódási vonalként származtatják. Kísérleteik, melyek azóta több irányból megerősítést nyertek, rámutattak arra, hogy alapvetően két differenciálódási vonal létezik, a harmadik vonal minden bizonynyal az egyik, korábban végképpen elkötelezettnek gondolt sejttípusból alakul ki, a látszólag elkötelezett sejtpopuláció nagyfokú plaszticitásának köszönhetően. Ugyanakkor a korábban, Márkus Róbert és Kurucz Éva által kapott megfigyelésekkel kombinálva eredményeiket, a vérsejtkompartmentumok nagyfokú plaszticitására is felhívták a figyelmet. Tovább jellemeztük a sejttípus-specifikusan megnyilvánuló molekulákat, melynek eredményeként három, eddig nem vizsgált gént azonosítottunk a MALDI laboratórium hatéko ny közreműködésével. A munka oroszlánrészét Kurucz Éva végezte, aki expressziós génkönyvtárakat tesztelve, illetve a molekulákat izolálva lamellocita és plazmatocita markereket írt le munkatársaival, Laurinyecz Barbarával, Florentina Russal, valamint az umeai laborral szoros együttműködésben. 135

136 Genetika 136 Az azonosított gének, az Atilla és Nimród funkcionális vizsgálata is érdekes eredményeket hozott. A Nimród gén, mely a korábban említett hemese gén tőszomszédságában található, és a baktériumok bekebelezésében vesz részt, szerkezete alapján egy géncsaládot, sőt egy kromoszómarégiót definiál, mely számos, Nimródhoz szerkezetében hasonló, vagy funkciójában azt kiegészítő gént tartalmaz. Somogyi Kálmánnal, Sipos Botonddal és Pénzes Zsolttal együttműködve megállapítottuk, hogy a géncsoport több százmillió éves evolúció eredményeként jött létre, és a gének ősei már a törzsfejlődés korai stádiumában fizikailag is egy csoportként voltak jelen a genomban. Somogyi Kálmán elemzése nyomán feltételezzük, hogy a kromoszómarégió immunfunkcióval rendelkező géneket kódol, melyeknek egymással összehangolt működése révén valósul meg a sejt közvetítette immunválasz. Zsámboki János kísérletei a Nimród géncsalád tagjainak a funkcióit boncolgatják, és úgy tűnik, hogy hamarosan megismerjük a Nimród-fehérjének a bekebelezés szabályozásában betöltött szerepét. A csoport eddigi eredményeit a munkatársak beleértve két asszisztensünket, Kovalcsik Olgát és Tápai Szilviát is nagyfokú kreativitása, hivatástudata és a kutatói életpálya iránti elkötelezettsége tette lehetővé. A Laboratórium munkatársai immunológia tárgyú kurzusok tartásával korábban részt vettek és jelenleg is részt vesznek az egyetemi alapés posztgraduális képzésben. A laboratórium tagjai ismeretterjesztő cikkekkel és kiállítások szervezésével igyekeznek a kutatás eredményeit népszerűsíteni. Honti Viktor a Természet Világa című folyóiratba írt a genetikai szabályozásról szóló cikkeket, Márkus Róbert pedig a mikrovilág szépségeit tárja elénk. Témái elsősorban szakmai munkájához kapcsolódnak; több nemzetközi fotópályázaton első díjat nyert, többek között a Holland Tudományos Akadémia 200 éves fennállása alkalmával meghirdetett pályázaton nyert el első helyezést a kísérleteinkben használt modellszervezet, a Drosophila immunrendszerének sajátos és közérthető bemutatásával. Jómagam a több mint három évtizedes példaértékű tudományos munkáért, a rovarimmunitás kutatásában elért kimagasló eredményekért, továbbá tehetséges fiatalokból álló nemzetközi hírű kutatócsoport létrehozásáért a Magyar Köztársasági Érdemrend tisztikeresztjét vehettem át. Jelenleg a Drosophila immunrendszerének a vizsgálati stratégiája, új fejezetekkel bővítve, a korábbi stratégiánkat követi. Részben tovább jellemezzük a funkciójukban egymástól különböző vérsejtek molekuláris mintázatát, részben pedig tovább vizsgáljuk a vérsejtképző szövetek és differenciálódási vonalak kialakulását az egyedfejlődés és az immunválasz során. Az utóbbi időben egyéb Drosophila- és más rovarfajokra, valamint emberi fehérvérsejtekre is kiterjesztettük a vizsgálatokat, mert látni szeretnénk, hogy a Drosophila melanogaster-ben észlelt jelenségek mennyire általános érvényűek az rovarok világában és az emberben. Szeretnénk továbbá a kapott ismereteket olyan, gazdasági szempontból fontos rovarfajokban hasznosítani, mint pl. a mézelő méh, vagy olyan rovarfajokban, melyek széles tömegeket érintő parazitózisokban mint köztigazdák vesznek részt.

137 Genetika A további kísérleteket továbbra is a SZBK Genetikai Intézet Fejlődésgenetikai Csoportjaival szorosan együttműködve és a már kialakult és hasznos hazai és nemzetközi együttműködések keretében végezzük, reményeim szerint az elkövetkező negyven évben is, melyeknek eredményiről majd annak idején számolunk be. Andó István 137

138 Genetika A Fejlődésgenetikai Csoport 40 éve 138 Az SZBK Genetikai Intézetének Fejlődésgenetikai Csoportja az elsők között létesült 1971-ben Rovargenetikai Csoport néven, még az SZBK hivatalos megnyitása előtt. Abban az időben nagy reményeket fűztek a kártevő rovarok hormonalapú kontrolljához, különösen a juvenil-hormon (JH) hatású rovarirtó szerek kifejlesztéséhez. A csoport el is kezdett dolgozni ilyen irányban, egyrészt a szteroid természetű vedlési hormonnal (ekdizon), illetve ipari együttműködések keretében (Kőbányai Gyógyszergyár, Tisza vas vári Alkaloida Gyár) JH hatású kémiai analó gokkal. Ezekhez a kísérletekhez a klasszikus tesztfajokat (csótány, vándorsáska, bodobács stb.) használták. Az azonban nyilvánvaló volt, hogy a hormon hatásmechanizmusára irányuló igényes, genetikai jellegű munkára ezek a szervezetek alkalmatlanok. Önként adódott az ecetmuslica (Drosophila melanogaster), amely kétszárnyú (Diptera) rovar, ugyanakkor a magasabbrendűek között a legkidolgozottabb, legverzatilisebb genetikai modellrendszer. A Drosophila már kezdettől fogva jelen volt a csoportban Szidonya János révén, de ettől fogva a csoport többi tagja (Bencze Gábor, Fekete Éva, Fodor András, Gausz János, Kiss István, Maróy Péter, Szabad János, 1. és 2. ábra) is átállt a muslicára. 1. ábra. Rovaros csoportszeminárium, Balról jobbra: Gausz János, Gyurkovics Henrik, Szidonya János, Maróy Péter, Szabad János, Kiss István Irodalmi példák alapján 1972-ben Gausz János és Maróy Péter kezdeményezték az imágókorongok fejlődésében hibás mutánsok izolálását, ami a következő években sikeres projektté nőtte ki magát. Az imágókorongok vagy imaginális diszkuszok a teljes átalakulással fejlődő rovarok lárváiban növekvő kis diploid sejtcsoportok, amelyek a metamorfózis során differenciálódnak a felnőtt (adult) légy epidermális szerveivé (szem, csáp, láb, szárny, külső ivarszervek). 2. ábra. Rovarosok, Balról jobbra, első sor: Gausz János, Mráz Ildikó, Váradi Ágnes, Gönül Dörtlemez (török ITC), Pappné Mosonyi Andrea, hátsó sor: Túri Éva, Fekete Éva, Bencze Gábor, Szabad János, Molnár Ilona, Kürti Márta, Abdel Fattah Awad (egyiptomi ITC) Differenciálódásukat az ekdizon hormon indítja és szabályozza, így alkalmas modellrendszernek ígérkeztek az ekdizon hatásmechanizmusának tanulmányozásához. Ebből a munkából jelent meg a csoport legelső közleménye is. A kezdeti sikerek közül kiemelkedik a Maróy Péter által kifejlesztett ekdizon radioimmun meghatározás, amely az elsők között volt a világon, és nemzetközi figyelmet keltett. A 70-es és 80-as évek során a csoport tagjai vezető külföldi laboratóriumokban tettek hosszú, 1 2 éves tanulmányutakat, ahol Drosophila genetikát és technikát tanultak, és ahonnan további kutatási témákkal tértek haza. A csoport tudományos színvonalának emelésében nagy szerepe volt a Szegedre hívott külföldi kutatóknak: James Fristrom, a Kaliforniai Egyetem (Berkeley) professzora fél évet töltött a csoporttal a UNDP (United Nations Developmental Program) segítségével, és nagy szerepe volt a csoport tudományos profiljának kialakításában. Az ő ötletéből született az első komolyabb közlemény is, amely az egyik nembábozódó mutánsunk újszerű lárva-báb mozaikjait írta le. Hasonlóan nagy szerepe volt Jeanette Holden-nek, aki akkoriban a baseli Biocentrum

139 posztdoktora volt, és Gausz János hívására hónapokat töltött az SZBK-ban. Ő indította el a hsp70 hősokk fehérje genetikai analízisét Szegeden. A csoport nemzetközi (el)ismertségéhez nagymértékben hozzájárult az a Drosophila fejlődésgenetikai konferencia, amelyet a UNDP segítségével szerveztünk 1978-ban az SZBKban, és amelyen részt vett a korszak szinte minden neves európai Drosophila kutatója (M. Ashburner, D. Ish-Horowicz, P. Lawrence, P. Schedl, A. Tissieres, I. Zhimulev, a későbbi Nobel díjas C. Nüsslein-Volhard és E. Wieschaus és még sokan mások). Az 1980-as évektől kezdve a csoport a legnagyobb és tudományos szempontból is a legerősebb muslicás laboratóriummá vált Közép-Európában. Számos tehetséges egyetemi hallgató írta nálunk a diplomamunkáját vagy egyetemi doktori disszertációját. Közülük a későbbiekben többen csatlakoztak a csoporthoz, és jelenleg mint rangidős, érett kutatók a Fejlődésgenetikai Csoport gerincét képezik (Gyurkovics Henrik, Ádám Géza, Erdélyi Miklós, Mihály József és Sipos László). Az idők során az alapító tagok többsége elhagyta az SZBK-t, és máshol folytatta a munkát. Többen a Szegedi Tudományegyetemhez csatlakoztak: Maróy Péter 1990-től a Genetikai Tanszék, Szabad János 1993-tól az Orvosi Biológiai Intézet, Fekete Éva pedig 2004-től az Élettani, Szervezettani és Idegtudományi Tanszék professzora. Bencze Gábor az Állami Szabadalmi Hivatal munkatársa lett, Fodor András pedig az ELTE-re távozott. Az öregek többsége nyugdíjas vagy nyugdíj előtt áll. A Fejlődésgenetikai Csoportban a legutóbbi időkig Gausz János és Kiss István tartottak ki, immáron nyugdíjasként. Az alábbiakban röviden áttekintjük, hogy az idők során milyen témákat műveltek a csoport munkatársai, annál is inkább, mert a jelenlegi témák részben ezekből nőttek ki. A fentebb említett imágókorong-hibás mutánsaink között olyanok is voltak, amelyek normális lárvális fejlődés után nem, vagy csak késve és tökéletlenül bábozódtak ( non-pupariating, npr mutánsok). Mivel már ismert volt, hogy a pupáriumképzést és a bábozódást a szteroid természetű ekdizon (vedlési hormon) indukálja, kézenfekvő volt a feltételezés, hogy az npr mutáns az ekdizon hatásmechanizmusában hibás. Maróy Péter a radioimmun módszerrel kimutatta, hogy a mutáns lárvákban van ekdizontermelés, de bábozódásukat ekdizoninjekcióval sem sikerült indukálni, az npr mutánsok tehát érzéketlenek a hormonra. A későbbiekben kiderült, hogy az npr mutánsok egy nagy komplex génben, a Broad-Complex-ben (BR-C) hibásak, amely ugyan nem a keresett ekdizonreceptor, de egyike az ekdizon hatását közvetítő kezdeti géneknek. Maróy Péter mindmáig dolgozik az ekdizonnal kapcsolatos témákon. A rovarok hormon koordinálta fejlődése mint fejlődési modell került az érdeklődés középpontjába. A hormon mennyiségi mérésének a rovarokra mint kistermetű élőlényekre alkalmas módja az immunmeghatározás. Az egyik fő rovarhormon, az ekdizon mérésére radioimmunassay-t (RIA) dolgoztak ki. Mivel a páfrány rizómája nagy mennyiségben tartalmaz ekdizont (fitoekdizon), a hormont saját gyűjtésű páfránygyökérből vonták ki, tisztították és hordozó fehérjéhez kapcsolták, majd nagy affinitású ellenanyagot készítettek ellene. Elkészültekor a módszer a világon az elsők közé tartozott. Közben ismerté vált, hogy a szteroid hormonok hatását nukleáris receptorok közvetítik. A receptor a hormonkötő képességén keresztül azonosítható, ehhez jelzett ekdizon kell. A kereskedelmi forgalomban kapható tríciált ekdizon azonban nem bizonyult alkalmasnak a receptor kimutatására. Egy, a természetben előforduló antagonista hatású ekdizonszármazék, a ponaszterona (pona) erősen kötődik a receptorhoz. A pona tríciált változatával muslica szövettenyészeti sejtekben, a világon elsőként sikerült kimutatni és jellemezni az ekdizon receptorát (EcR). A receptorfehérjét azonban nem sikerült tisztán izolálni. Kiderült, hogy az EcR egy másik fehérjével (USP) heterodimer-komplexben képes csak hormont kötni. Később a szteroid receptorok konzervatív DNSkötő részét kódoló próbával sikerült az usp gén klónját azonosítani. Az Ecr szintjének változásait a muslica embrióés lárvaélete folyamán követték végig. Megfigyelték, hogy a receptor- és a hormonszint változása nem független egymástól, az emelkedő hormonszint indukálja az Ecr fokozott termelését. Igazolták, hogy az Ecr gén az egyik korai ekdizon-indukált gén, és az ekdizon hatáskaszkád korai kulcseleme. A muslica egyedfejlődése alatti ekdizon szint-vál tozás vizsgálatával megmutatták, hogy meglepő módon Genetika 139

140 Genetika 140 az embrióban is jelentős a hormontermelés, valamint igazolták, hogy az elvárásoknak megfelelően a lárva vedléseit is hormonszint-emelkedés előzi meg. Sikerült hormontermelésben hibás muslicamutánst a világon az elsők között azonosítaniuk. A hormonhiányt okozó mutáció különleges, domináns hőérzékeny fenotípust mutat. A mutáció ráadásul az ekdizon termelő endokrin mirigy jelentős megnagyobbodásával járt. Az SZTE Genetikai Tanszékén végzett munkák közül három dolgot kell megemlíteni. Egyrészt létrehoztak egy P transzpozon inszerciós mutánsgyűjteményt a 3. kromoszómán, amelynek mutánsait számos laboratórium használja. Másrészt részt vettek az EU által támogatott DrosDel projektben, amely a Drosophila teljes genomját lefedő, molekuláris szinten térképezett kromoszómális deléciósorozatot eredményezett. Végül létrehozták a Szegedi Drosophila Törzsközpontot, amely azóta is a P-inszerciós mutánsok világszerte ismert és használt gyűjteménye. Szabad János 20 évig dolgozott az SZBK muslicás csoportjában ( ). Széles körű érdeklődésének megfelelően e húsz év alatt sok mindennel foglalkozott, sikeresen. Tanulmányozta pl. a regeneráció és a kompartmentek kapcsolatát, az ősivarsejtek osztódásának mechanizmusát muslica nőstényekben, kombinált tesztrendszert dolgozott ki a környezeti mutagenezis-hatások kimutatására, Gunter Reuterrel (Halle), Gausz Jánossal, Bencze Gáborral és Gyurkovics Henrikkel együttműködve tanulmányozta az ún. pozíció-effektus variegáció jelenségét és annak genetikai mechanizmusát, ami betekintést adott a kromoszóma-inaktiváció mechanizmusába. Különösen sikeres volt az ún. anyai hatás genetikai boncolása, domináns nőstény-steril mutánsok izolálása és jellemzése. A tojással, petével szaporodó állatok, pl. a rovarok nőstényei a fejlődő petébe sokféle olyan anyagot raknak le, amely az embrió kezdeti fejlődésében létfontosságú. Az energiát szolgáltató tápanyagok mellett sokféle regulátorfehérje és mrns is lerakódik, gyakran a pete meghatározott helyeire, amelyek a fejlődés kezdetén kijelölik a fő testtengelyeket, a háti-hasi irányt, ill. a későbbi sejtosztódások, és általában a sejtműködés számára nélkülözhetetlen tartalékanyagok. Mivel a muslica embrionális fejlődésének első 3 órás szakaszában nincs saját génexpresszió, ebben az időszakban a fejlődést, pl. a 10 szinkron sejtmagosztódást kizárólag a tartalékanyagok teszik lehetővé. Az ilyen faktorok génjeinek mutációi anyai (maternális) hatásban nyilvánulnak meg: a mutáns nőstényegyed fejlődése normális, de az általa rakott petékben az embriók fejlődése változatos hibák miatt elakad. A hőskorban (kb ) komoly erőfeszítések történtek arra, hogy megismerjük az anyai eredetű géntermékek szerepét az utódok embriogenezisében. A folyamatban szerepet játszó anyai géneket a klaszszikus genetikai boncolás módszerével azonosították: recesszív nőstény-steril mutációkat (fs) indukáltak, vizsgálták az fs homozigóta nőstények embrióit, és klónoztak olyan érdekes géneket, mint a bicoid, az oskar, a dorsal, torso és a többi. A domináns nősteril (Fs) mutánsok egy további lehetséges megközelítést kínáltak. Ha az Fs domináns negatív természetű, P-elem mobilizálás során revertáltatható, a revertáns allél megmutatja az ép gén helyét, a funkcióvesztéses mutáns fenotípust, és belőle kiindulva az inverz PCR módszerével megklónozható a gén. Korábban létezett már egy Fs mutáció: az Fs(2)D, amely felhasználásával Eric Wieschaus kialakította az ún. domináns nősténysteril technikát, amellyel ki lehetett váltani a pole cell transzplantációt. Katia Komitolopou (Gif sur Yvette) izolált még három további domináns nősteril mutánst az X kromoszómán (köztük a fényes pályát bejárt ovo D1 -et). Szabad János és munkatársai, közöttük Erdélyi Miklós további 75 ilyen mutánst találtak a 2. és a 3. kromoszómán. (Ezek az Fs mutációk olyan magyar családok neveit kapták, amelyek a 14. század kezdetére kihaltak, ám nevük helységnevekben fennmaradt.) A follikuláris sejt életét befolyásoló Apc és Ugra tette lehetővé a domináns nőstény-steril technika kiterjesztését a follikuláris sejtekre. A test kialakulását befolyásolók közül a torso et ők közölték, a Toll, a Dorsal és az Easter Fs mutációkkal mások dolgoztak. A Szabad laboratórium elsősorban azokkal a mutánsokkal foglalkozott, amelyek az embriogenezis megindulását akadályozzák, illetve akasztják meg a kezdeti lépések során. Feltételezték, hogy az Fs-el azonosított génnek az embriogenezis elkezdődésében van szerepe. Az Fs mutációból kiindulva remélték megérteni az ép allél molekuláris funkcióját. A Ketel gént

141 az SZBK-ban, a többit már az SZTE Orvosi Biológiai Intézetében klónozták, és jellemezték molekuláris funkcióikat. A Laborc gén a citoplazmatikus dinein nehéz láncát kódolja. Ennek segítségével mutatták meg, hogy citoplazmatikus dinein teremt kapcsolatot a centroszóma és a kromoszóma ciklusok között, és szerepe van a centroszómák képződésében. A Ketel D Fs allelélokból kiindulva azonosították a muslica importin-β-t kódoló génjét. A Ketel D importin-β mutáns vizsgálata során jöttek rá arra, hogy az importin-β nemcsak a sejtmagi fehérje import receptoreleme, hanem funkciójára szükség van a mitotikus orsó szerveződése, valamint a sejtmaghártya összeszerelődése során is. Eredményeik alapján olyan modellt dolgoztak ki, amely leírja a sejtmaghártya-képződés mechanizmusát. Az importin-β hosszú életű molekula, és szerepe van a mitokondriumok biogenezisében is. A Tomaj D és a Kavar D Fs mutációk az αtubulin67c gént azonosítják, amely az ún. anyai eredetű α4-tubulin képződését kódolja. Megmutatták, hogy az α4-tubulin az interpoláris mikrotubulusok gyors növekedéséhez szükséges. Miközben növekednek, az interpoláris mikrotubulusok széttolják a leánycentroszómákat a sejtmaghártya felszínén, az átelleni pólusokba, hogy aztán a centroszómák megszervezzék a magorsó kialakulását. Mindeközben az interpoláris mikrotubulusok követik a sejtmaghártya görbületét, mert az α4-tubulin révén intim kapcsolatban vannak a sejtmaghártyával. A Kavar D allélokból kiindulva jellemezték a molekuláris motorfehérjék szerepét a mikrotubulusok mentén történő anyagszállításban, és leírták a sejtmag-pozicionálás addig ismeretlen mechanizmusát. A Horka D mutáció nagy gyakorisággal okoz kromoszómavesztést és nondiszjunkciót a meiotikus osztódások során, és a Horka D -t hordozó nőstények és hímek embrióiban is. Az instabil kromoszómák vesztése ún. haplo-mozaikok képződéséhez vezet, köztük az XX//X0, nőstény//hím mozaikokéhoz, melyeket gynandereknek neveznek (3. ábra). A Horka D -t eredményesen használják genetikai mozaikok generálására. Kimutatták, hogy a Horka D a lodestar gén mutáns allélja, amelynek terméke a helikáz-szerű fehérjék népes családjába tartozik. 3. ábra. Egy XX//X0 (nőstény//hím mozaik, (gynander) Drosophila képe. Amíg az X0 hím részek mutatják az X kromoszómához kapcsolt receszszív marker mutációk fenotípusát (yellow, sárga test; white, fehér szem, forked, villa alakú szőrök), a nőstény (XX) testtájakon nem látszanak a mutáns fenotípusok, mert az X kromoszóma hordozza a marker mutációk ép alléljait. (Egy muslica kb. 1 mm hosszú.) Erdélyi Miklós PhD hallgatóként Szabad Jánossal dolgozott a domináns anyai hatás vizsgálatában. Ezzel rokon a csoportjának jelenlegi kutatási területe, az ivari és a szomatikus sejtvonal elkülönülése. A soksejtű életforma szinte kizárólagos jellemzője, hogy a vegetatív és szaporodási funkciókat elkülönült sorsú sejtek, a testi és ivarsejtek végzik. A testi és ivarsejtfunkciók szétválását a soksejtű evolúció egyik kulcslépésének tekintik. A szóma-ivarsejt elkülönülés azonban nemcsak a soksejtű evolúciónak, hanem az egyedfejlődésnek is egyik legérdekesebb mozzanata. Az Erdélyi-laboratórium arra a kérdésre keresi a választ, hogy milyen faktorok hatására válik el az ivarsejtek és a testi sejtek sorsa az egyedfejlődés során. Kutatásaikat az ivarsejtvizsgálatok egyik legkedveltebb modellszervezetén, a Drosophila melanogasteren genetikai módszerekkel végzik, azaz ivarsejthiányos mutációkkal az embrionális ivarsejtek fejlődését irányító géneket azonosítanak és jellemeznek (4. ábra). Az utóbbi évtizedben az Erdélyi-csoport több ivar sejt hiányos mutánsgyűjteményt hozott létre. Klasszikus transz pozon-muta genezis során tropo miozin alléleket azonosítottak, és ivarsejthiányos fenotípusukkal megmutatták a nem izom típusú aktinkötő tropomiozin fehérje szerepét az ivarsejtkialakulás helyét megszabó morfogén lokalizációjában. Később új generációs transzpozonok Genetika 141

142 Genetika 142 alkalmazásával (hobo, P-elem alapú ún. géncsapdázó transzpozon) folytatták az ivarsejthiányos mutációk indukálását és analízisét, majd mozaikanalízisen alapuló, valamint érzékenyített genetikai háttereken végzett mutánsizolálási kísérleteket végeztek. Az új típusú mutagenezis-kísérletek során bizonyították, hogy a membrántranszport-folyamatokat irányító Rab fehérjecsalád egyik tagja részt vesz a polarizált mikrotubulus-rendszer fenntartásában, valamint áttételesen az ivarsejtkialakulás morfogénjének pontos lokalizációjában. A poirot gén ivarsejthiányos fenotípusának vizsgálatával felismerték, hogy az ivarsejt morfogént kódoló RNS, valamint maga a fehérjetermészetű morfogén két különböző mechanizmus segítségével lokalizálódik az ivarsejt-kialakulás helyén. Moezin mutáns allélekkel bizonyították, hogy az embrionális ivarsejtek keletkezésének helyét megszabó morfogén helybentartásáért a petesejt szubkortikális aktinváza a felelős. Az utóbbi időben az ivarsejtfejlődést funkcionális genomikai eszközökkel vizsgálják. A microarraykísérletek, valamint adatbázisok vizsgálatának segítségével több, mint ötszáz ivarsejt-specifikus RNS-t gyűjtöttek össze. Jelenleg e transzkriptumok szerepét vizsgálják az ivarsejtek fejlődése során. Géninterakciós adatbázisok felhasználásával az embrionális ivarsejt-meghatározásban szerepet játszó lehető legteljesebb genetikai hálózat felépítésén dolgoznak. A hálózat elemeit kettős szálú RNS géncsendesítésen alapuló fenotípus elemzéssel vizsgálják. 4. ábra (A és B). Vad típusú és pebble mutáns embrió. A pebble mutánsban az ivarsejtek vándorlása hibás. (C) Vad típusú lárvális petefészek. (D) Vad típusú lárvális here. (A-D) Piros szín az ivarsejteket, kék illetve zöld szín a különböző testi sejteket jelöli. A 70-es évek közepe táján Gausz János és Bencze Gábor, valamint a később csatlakozó Gyurkovics Henrik Jeanette J. Holdennel és David Ish-Horowiczcal együttműködve megkísérelték a legnagyobb mennyiségben szintetizálódó hősokkfehérjét, a HSP 70-t kódoló gén mutációinak izolálását. Ez volt a nagy telítési kísérletek, delécióizolálás és a citogenetika időszaka. Az eredeti cél elérése, amint az mások munkájából utóbb kiderült, eleve reménytelen volt, mert a HSP 70 génjei két lókuszban, legalább 5 redundáns példányban fordulnak elő a haploid genomban. A telítési kísérletek és a citogenetika eredményeként azonban számos letál-mutábilis gént azonosítottak és térképeztek, amelyek a következő évtizedekben számos laboratórium munkájának az alapját képezték. Ezeknek a kísérleteknek az egyik leágazásaként a későbbiekben Günther Reuterrel (Halle) együttműködve a 80-as évek második felében a pozíció-effektus variegációt (PEV) befolyásoló géneket azonosítottak. Ez volt Magyarországon az első epigenetikus szabályozó elemekkel végzett munka muslicában. Gausz János különösen sikeres időszakot töltött ebben az időben Genfben, Pierre Spiererrel és Günther Reuterrel együttműködve, ami többek között egy különleges szerkezetű fehérjét kódoló PEV szupresszor jellemzését eredményezte. Ebben az időben Gyurkovics Henrik is kitérőt tett David Ish-Horowitz laboratóriumában, ahol a fushi tarazu szegmentációs gén működését vizsgálták. Ma már alig lehet elhinni, hogy a D. Ish-Horowitz-cal folytatott közös munka mind a HSP 70 génjeinek citológiai térképezése, mind a fushi tarazu működésére vonatkozóan egy-egy Cell cikket eredményezett! A 90-es évek elejétől kezdődő korszakot a homeotikus bithorax-komplexszel való foglalkozás, és Francois Karch, majd később Paul Schedl csoportjával való együttműködés jellemzi. Ennek az időszaknak két kiemelkedő eredménye volt: egyfelől a muslicában az első, funkcionális kritériumok alapján azonosított kromatin boundary ( insulator ) elem azonosítása, másfelől az első, a nukleoszómák mozgatásában, illetve nukleoszóma-mentes kromatinszakaszok kialakításában kulcsszerepű fehérje, a GAGA faktor génjének azonosítása és funkciójának a feltárása. Az ezzel kapcsolatos egyik ábrájuk felkerült az EMBO Journal címlapjára is. A GAGA faktor génjének azo-

143 nosítását és jellemzését közlő cikk tudománymetriai szempontból a csoport legsikeresebb terméke volt, amennyiben pillanatnyilag 250 fölötti idézettséget tudhat magáénak. A 90-es évek végének egy további jelentős eredménye annak a felismerése volt, hogy a homeotikus abdominal-b gén távoli cisz-regulátor elemeit a gén promóteréhez egy nagyméretű, több kilobázis hosszú DNS-szakaszon elhelyezkedő, több részből álló elem pányvázza ki, amely ugyanakkor világosan elkülöníthető magától a promótertől. A 2000-es évek első felében a csoport háromfelé vált, és Gausz János csoportja mellett Sipos László és Gyurkovics Henrik is külön csoportot alakított. Míg Gausz János Dombrádi Viktorral és Friedrich Péterrel a protein foszfatázok és a kalpain genetikáján dolgozott tovább, a másik két csoport folytatta a homeotikus gének szabályozásának vizsgálatát, elsősorban epigenetikai szempontból. Az egyik eredménye ennek az időszaknak az, hogy felismerték a komplex egyik silencer elemének tanulmányozása során, hogy ezek az elemek is az enhanceosoma kialakulásához hasonló elvek szerint épülnek fel. Ebben az időszakban Mihály Józseffel (aki korábban hosszabb ideig dolgozott a Karch laboratóriumban) és Francois Karch csoportjával együtt transzgenikus vizsgálatok és nagyszámú deléció felhasználásával leírtak egy modellt a bithorax komplex működésének szabályozására vonatkozóan, ezzel mintegy keretbe foglalva az addigi eredményeket. A B C D Genetika Sipos László még Gausz János csoportjában, Gyurkovics Henrik irányításával kezdett el foglalkozni az ecetmuslica hátsó potrohszelvényeinek kialakulásáért felelős homeotikus Abd-B gén vizsgálatával. E munka során sikerült molekulárisan leszűkíteni az ún. Mcp boundary/határ szakaszt, amely az Abd-B upstream regulátorrégiójában két szabályozó szekvenciaelemet, az iab-4 és iab-5 cisz-regulátor régiókat választja el egymástól. Legfontosabb eredményünk egy több kilobázis hosszúságú pányvázó régió kimutatása volt, mely az Abd-B gén promóterétől upstream helyezkedik el, és fontos szerepet tölt be a távoli enhanszerek promóterhez történő rögzítésében. Az utóbbi években ezek az eredmények átkerültek a tudományos köztudatba, és több közlemény is építkezik rájuk. 5. ábra. A. A bithorax-komplex (BX-C) által szabályozott szelvények. Az egyes szelvények identitását a bekapcsolt regulátorelemek száma szabja meg. B. A BX-C működési modellje. C. Szárnyatlan, négybillérű muslica. A középtori szelvényt a homeotikus mutáns transzformációja útótori szelvénnyé, a szárnyat billérré alakította. D. A bxd PRE korlátozza a GFP markergén kifejeződését között Sipos László postdoc-ként dolgozott Welcome Bender laboratóriumában Bostonban, a Harvard Egyetemen. Welcome Bender töltötte meg molekuláris tartalommal a Nobel-díjas Ed Lewisnak a homeotikus bithorax-komplexre irányult genetikai munkásságát, ami a Science címlapjára is felkerült 1987-ben. Itt egy kicsit előre rukkolt a muslica hossztengelyén, és elsősorban az utótor és az első potrohszelvény kialakításáért felelős Ubx gén vizsgálatával kezdett foglalkozni, s ezt a munkát foly- 143

144 Genetika 144 tatja ma is. Welcome Benderrel azonban továbbra is együttműködésben áll. Hazatérése után, 2002-ben indított önálló laboratóriumot. Az ecetmuslica homeotikus Ultrabithorax (Ubx) génjének egyik szabályozó elemében (bithoraxoid, bxd) egy olyan speciális kromatin szerkezeti elem ( Polycomb Response Element, PRE) van, mely fontos szereppel bír az inaktív (zárt) kromatin szerkezet kialakításában és fenntartásában. Mind a homeotikus gének, mind a PRE-k működését szabályozó Polycomb-gének homológjai ismertek magasabbrendű élőlényekben, ahol azoknak hasonló funkciójuk van. Noha a PRE-król ismert, hogy egymással képesek kölcsönhatásba lépni, mégis szinte kizárólag a muslica genomba véletlenszerű helyekre beépült, transzgenikus konstrukciókban vizsgálták őket, elszigetelve ezáltal az eredeti helyükön elérhető PRE-któl, de kölcsönhatva a beépülés környezetében lévő, idegen PRE-kkal, ami hatásukat eltorzíthatja. Technikai korlátok miatt ugyanis a PRE-kat nem tudták az eredeti helyükön és környezetükben azonosítani, illetve tanulmányozni. Welcome Benderrel együttműködve a csoport kifejlesztett egy új típusú, sokrétűen felhasználható génkonverziós eljárást, amely egyedülálló módon lehetővé teszi, hogy a PRE-kat az eredeti helyükön módosíthassák. Módszerük segítségével kiejtették azt a teljes 3 kb-os régiót, amelyben kromatinimmunprecipitációval korábban három, bp méretű PRE-darabot azonosítottak. Megállapították, hogy csak a középső PRE-szakasz eltávolítása jár fenotípusos következménnyel, ami a kromatinszerkezet fellazulását és az Ubx gén ektopikus aktiválását eredményezi. A létrehozott kisméretű delé ciókkal sikerült 185 bp-ra szűkíteni és teljesen behatárolni a bxd PRE minimális, központi magját, amelynek eltávolítása a fenotípusos változásért felelős. Módszerüket továbbfejlesztve szabályozó fehérjék kötőhelyeit rontották el a 185 bp-os bxd PRE-magon belül, és megállapították, hogy a vizsgált 3 fehérje (GAGA, PHO és DSP1) közül az első kettő, egymással szorosan együttműködve, kulcsszerepet tölt be az inaktív kromatinszerkezet fenntartásában. Ezután a bxd PRE magját kicserélték a bithorax-komplex két másik PREmagjára (iab-7 és Mcp PRE-k), melyekben a GAGA és PHO fehérjék célszekvenciái a bxd PRE-hoz igen hasonló számban és eloszlásban fordulnak elő, Kiderült, hogy a két idegen PRE-szakasz teljes mértékben képes helyettesíteni a bxd PRE 185 bp darabját, és jelenlétük nem okoz ektopikus inaktivációt sem. Vagyis, a PRE-k nem hordoznak pozícionális információt, pusztán egyszerű inaktiváló ( silencer ) funkcióval rendelkeznek. A muslica- és az emlős genom epigenetikus represszorrendszere közötti funkcionális hasonlóság bizonyítására megpróbálják helyettesíteni a bxd PRE-t egérben, illetve emberben azonosított PRE-kkal. Vizsgálataik végső célja, hogy a molekuláris definiálás után mesterséges, funkcionális PRE-t hozzanak létre. Kísérleteik során arra a következtetésre jutottak, hogy a PREk az aktív kromatin szerkezetű doménokban is, noha csak kismértékben, de kifejtik negatív hatásukat: a promóterhez hurkolódva képesek arra, hogy moderálják a promóterrel fizikai közelségbe került enhanszerek hatását; ezáltal a PREk aktívan részt vesznek a homeotikus gének működésének szelvényspecifikus finomhangolásában. E precíz folyamat révén lehetővé válik, hogy egy homeotikus gén több, egymástól eltérő szelvényt legyen képes kialakítani azáltal, hogy a különböző szelvényekben eltérő mértékben fejeződik ki (5. ábra). Ez utóbbi munkánk során szorosan együttműködtek Gyurkovics Henrik csoportjával. E sikeres együttműködés vezetett oda, hogy Gyurkovics Henrik nyugdíjba menetelével a két csoport egyesült, és most Sipos László irányításával Henrik ötleteit és tanácsait felhasználva folytatja munkáját. Kiss István laboratóriuma a már említett npr mutánsok analízisével indult. A mutáns homozigóta egyedek normális lárvális fejlődés után nem tudtak pupáriumot (előbábot), ill. bábot képezni, és ezen az ekdizon vedlési hormon adása sem segített. A mutáció az X kromoszóma 2B5 régiójában egy ekdizon által indukált puffba (aktív transzkripciós helyre) lokalizálódott. Közben Igor Zhimulev (Novoszibirszk) csoportja a 2B5 puffot egy nagy komplex génnel (BR-C) azonosította, ennek egyik allél-csoportja lett az npr. A következő évek során Kiss István és munkatársai végezték el a BR-C genetikai és fenotípusos jellemzését együttműködésben Igor Zhimulev és Jim Fristrom (Berkeley) laboratóriumával.

145 A 80-as évek végén a csoport nagyléptékű P-elem inszerciós mutagenezist végzett a Drosophila kevésbé ismert 2. kromoszómáján (Tick Gabriella és Török Tibor). Ez abban az időben a világon a második ilyen méretű vállalkozás volt, és nemzetközi figyelmet keltett. Az eredeti cél tumoros túlnövekedést mutató mutánsok izolálása volt. Kb inszerció közül mintegy bizonyult homozigóta letálisnak, közülük pedig 16 mutatta a diploid szövetek, elsősorban az imágókorongok jellegzetes túlnövekedését. A fenotípusért felelős új géneket Bernard Mechler (Heidelberg) csoportjával együttműködve klónozták és jellemezték. Az inszerciós mutánsgyűjtemény felkeltette a Berkeley-ben folyó Drosophila Genom Projekt (BDGP) figyelmét is, mivel egyik (azóta is folyamatos) célkitűzésük a Drosophila összes génjének szisztematikus megjelölése transzpozon inszerciós tag - ekkel. A szegedi csoport meghívást kapott a Genom Projekthez való csatlakozásra, és az inszerciós gyűjtemény további jellemzése Gerald Rubin (Berkeley) laboratóriumával kooperációban történt (Szabó Kornélia). Jelenleg a Drosophila génjeinek több mint 70%-a jelzett P-inszercióval, de a 2. kromoszómán lévő inszerciók nagyobb része ma is szegedi származású. Ezzel párhuzamosan a 90-es évek során többen is screenelték a teljes gyűjteményt meghatározott fenotípust mutató mutánsok izolálása céljából, és sokan kérték egy-egy adott gén inszerciós mutánsait is. Mindent összevéve a szegedi projekt számottevően hozzájárult mind a BDGP sikeréhez, mind pedig a nemzetközi Drosophila közösség munkájához. Az egyik, Török István által Heidelbergben klónozott P-inszerció elsőként azonosította az importin-α2 gént, amelynek terméke a Szabad Jánosék által azonosított importin-β-val együtt alkotja a sejtmagba irányuló fehérjeimport receptorkomplexét. A Mechler laboratóriummal együttműködve elsőként írták le az importin-α2 citoplazmatikus szerepét az ovárium tojáskamráiban a dajkasejteket a növekvő petesejttel összekötő ún. gyűrűcsatornák képződésében (Ádám Géza és Gorjánácz Mátyás), valamint a korai embrionális sejtmag-osztódások során a mitotikus orsó ill. a sejtmaghártya felépülésében (Virágh Erika és Szlanka Tamás). Igazolták, hogy ezek az importin-α2 specifikus funkciói, amelyekben az -α2-t a másik két paralóg (-α1 és -α3) nem tudja helyettesíteni (6. ábra). 6. ábra. Az importin-α2 és importin-β/ketel gének közötti genetikai interakció hatása a mutáns nőstények által rakott petékben kialakuló mitotikus orsókra. (A) Vad típusú nőstények petéiben szabályos alakú mitotikus orsókat figyelhetünk meg. Az orsó két pólusán jól körülhatárolt kompakt centroszómák helyezkednek el, míg a kromoszómák az ún. metafázis lemezterületen vannak. (B-C) Az imp-α2 D14 /imp-β KetRE34 és az imp-alfa D14 /imp-β Ket0 ; P(imp-α2 NLSB ), nosgal4 VP16 genotípusú nőstények petéiben a mitotikus orsók számos rendellenességet mutatnak. (B) Az orsó kiszélesedik, egyik pólusáról hiányzik a centroszóma, a másik póluson lévő mérete megnövekedett és elvesztette kompaktságát, valamint a kromoszómák sem rendeződtek a metafázis lemezbe, hanem szétszóródtak az orsó területén. (C) Tripoláris orsó alakul ki, a centroszómák extra osztódáson mennek keresztül, így egy orsóhoz kapcsolódva három pár, azaz hat centroszóma található. A kromoszómák a tripoláris orsóban kialakuló három metafázis lemezterülete között oszlanak szét. (zöld jelöli a mikrotubulusokat, piros a centroszómákat és kék a kromoszómákat, cnn: centrosomin fehérje). A Kiss-laboratórium jelenleg egy neuropeptid hormon-csoport (FMRFamid, dromyosuppresszin és droszulfakinin) és receptoraik genetikai analízisével foglalkozik muslicában. Mivel a neurohormonokra vonatkozólag még nem végeztek szisztematikus genetikai analízist, a munka úttörő jellegű. Elsődleges céljuk az FMRFamid gén nyolcféle peptidet kódoló szakaszainak in situ, homológ rekombinációs módszerrel történő szisztematikus mutagenezise. A mutánsok fenotípus-analízisét Michal Zurovecz (Ceské- Budejovice) és Jozef Vanden Broeck (Leuven) csoportjával együttműködve végzik. Mihály József kutatócsoportja a kezdetekben a szöveti polarizálódás, vagy más szóval planáris sejtpolaritás (PCP) vizsgálatával foglalkozott. A természetben megfigyelhető sokféle polaritási minta között a síkbeli polarizálódásra egyaránt találunk példát alacsonyabb- és magasabbrendű állatokban is, külső és belső szervek esetében is. Közismert például, Genetika 145

146 Genetika 146 hogy a madarak tollai vagy a halak pikkelyei mindig rendezett módon állnak, csakúgy, mint a belsőfül érzékhámján elhelyezkedő sztereocíliumok, amelyek fontos szereppel bírnak a hangérzékelésben. A női petevezetéket vagy a légzőszervünket bélelő laphámsejtek csillói is rendezetten mozognak, elősegítve ezáltal, hogy a petesejtek mindig az anyaméh felé, míg a tüdőbe kerülő idegen anyagok a garat irányába továbbítódjanak. Az ecetmuslica esetében az epidermiszen található érzékszőrök mind hátrafelé, poszterior irányba mutatnak, a szárnylemezeket borító szőrök a disztális irányba néznek, míg az összetett szemben egy tükörszimmetrikus minta alakul ki. Molekuláris szintű vizsgálatok alapján a polarizálódás egyik kulcslépésében az ún. elsődleges polaritási fehérjék a sejtekben aszimmetrikus komplexeket alkotnak, és ily módon egy lokalizált jelátviteli központot hoznak létre, amely végrehajtó molekulákon keresztül szabályozza a sejtek viselkedését. Tekintve azonban, hogy sem az aszimmetrikus komplexek kialakulásának, sem az azt követő sejtválaszoknak nem ismeretesek a részletei, a csoport elhatározta, hogy új polaritási géneket azonosít nagyléptékű mutánsizolálási kísérletek folyamán. E kísérletekben kb. két tucat új polaritási mutánst azonosítottak, és elkezdték azok molekuláris és sejtbiológiai vizsgálatát annak érdekében, hogy megértsék, hogyan járulnak hozzá a szöveti polaritási minták kialakításához. Az egyik új polaritási mutáns a Drosophila Rab23 ortológ gént azonosította. Részletes vizsgálataik alapján a Rab23 gén szabályozza az adult epidermiszt borító trichómák sejtenkénti számát és orientációját. Kimutatták, hogy a Rab23 fehérje egy komplexben található a Prickle nevezetű elsődleges polaritási fehérjével, és a Rab23 mutánsok megzavarják az elsődleges PCP fehérjék sejten belüli aszimmetrikus eloszlását. Miután a Rab fehérjék családja a vezikulatranszport szabályozásában vesz részt, az eredmények arra utalnak, hogy a polarizált membrántranszport fontos szerepet játszik a PCP fehérjék aszimmetrikus felhalmozódásában. A csoport másik fontos tudományos érdeklődési területe egy formin típusú aktin sejtvázszabályozó fehérje funkcionális jellemzése. A forminok, így az általuk tanulmányozott DAAM alcsalád tagjai is olyan proteinek, amelyek aktin nukleáló és polimerizáló aktivitással rendelkeznek in vitro körülmények között, in vivo funkcióikról azonban viszonylag keveset tudnak. Ezért Drosophila DAAM mutánsokat (ddaam) állítottak elő és megvizsgálták ezek szerepét az egyedfejlődés során. A gén hiánya súlyos defektusokat okoz a légcsőrendszer belső felszínét borító kutikula fejlődésében. A trachea-kutikula kialakul ugyan, de a vad típusra jellemző bordázati minta összeomlik, ami súlyos elváltozásokat okoz a trachearendszer struktúrájában és működésében. Kísérleteik alapján a vad típusú kutikulamintázat kialakításához szükség van egy, a sejtekben apikálisan elhelyezkedő aktinvázra, amely direkt vagy indirekt módon kijelöli a strukturális szempontból fontos kutikulabordák helyét. 7. ábra. A ddaam kifejeződése és szerepe a Drosophila központi idegrendszerében. (A-B) A ddaam fehérje (B) felhalmozódik a hasi idegkötegben a fő idegpályák mentén, amiket a BP102 festés jelöl (A). (C-C ) Primer idegsejtkultúrából származó neuronban a ddaam fehérje (zöld) kimutatható a növekedési kúpban, ahol főként a filopódiumokban található (a mikrotubulusok kék színnel vannak jelölve). (D-D ) A ddaam mutáns primer idegsejtek (D ) jóval kevesebb aktinban gazdag filopódiumot növesztenek, mint vad típusú társaik (D) (zöld jelöli az aktin-filamentumokat, kék a mikrotubulosokat). (E) A ddaam fehérje kifejeződése az adult agyban. Az idegsejt-specifikus Elav a sejtmagokban halmozódik fel, míg a ddaam a neuropile-régióban található. További kísérleteik során azt is bebizonyították, hogy a ddaam meghatározó szerepet játszik mind az embrionális, mind pedig az adult központi idegrendszeri axonok növekedésében (7. ábra). Megmutatták, hogy sejtes szinten a ddaam fehérje a növekedési kúp perifériális régiójában elhelyezkedő filopódiumok képződését segíti elő, és tekintve, hogy a filopódiumok esszenciális szerepet játszanak a növekedési kúp előrehaladásában, ez jól magyarázza a teljes idegrendszer szintjén megfigyelhető axonnövekedési defektusokat. Biokémiai, genetikai interakciós és fehérje lokalizációs kísérleteik azt sugallják, hogy az Ena/ Profilin/dDAAM szabályozó modul kritikus szerepet játszik a filopódiális aktin sejtváz átrendeződések irányításában. Raskó István csoportjával közösen végzett kísérleteik feltárták, hogy az egér mdaam1, ill. a ddaam gének evolúciósan erősen konzervált idegrendszeri funkciókkal rendelkeznek, ami megmutatko-

147 zik a fehérjék sejten belüli lokalizációjában és abban a képességükben, hogy egymást nagymértékben helyettesíteni tudják. Legfontosabb következtetésük tehát az, hogy azonosították az axonnövekedés egyik fontos faktorát, és funkcionális bizonyítékokat gyűjtöttek arra nézve, hogy ez a DAAM alcsalád evolúciósan erősen konzervált funkciója lehet. A legutóbbi időkben a légzőszervi és az idegrendszeri funkciók jellemzésén túl azt is megállapították, hogy a DAAM formin alcsalád a harántcsíkolt izmok vékony filamentumainak kialakításában is részt vesz. A ddaam mutánsok súlyos szívizom- és vázizom-fejlődési defektusokat mutatnak, és adataik arra utalnak, hogy a DAAM formin azonos lehet a hosszú ideje keresett izomspecifikus aktinnukleáló molekulával (8. ábra). 8. ábra. A ddaam fehérje lokalizációja és szerepe az izomfejlődés során. (A-A ) Vad típusú lárvális testfalizmokban a ddaam fehérje (zöld az A, A paneleken) az M vonal két oldalán halmozódik fel (piros jelöli a Z-korongokat). (B-B ) A vad típusú indirekt repülőizmok rendkívül szabályosan ismétlődő szarkomer szerkezettel bírnak. (C-C ) A ddaam mutánsok röpképtelenek, repülőizmaik pedig rendezetlen szarkomer felépítéssel bírnak. A B-C paneleken zöld festés jelöli a Z-korongokat, piros az aktin-filamentumokat, DAPI festés (kék) a sejtmagokat. Ádám Géza laboratóriuma a bal-jobb aszimmetria genetikai meghatározottságát kutatja Drosophilában. Az állatvilágban általánosan előforduló bal-jobb (BJ) aszimmetria alapvetően meghatározza a belső szervek fejlődését és testen belüli elhelyezkedését, zavara szervfejlődési rendellenességek formájában jelentkezik. A BJ testtengely kialakulásának genetikai vizsgálata nemcsak a szervfejlődés molekuláris mechanizmusának megértése szempontjából fontos, de feltárja számos veleszületett fejlődési rendellenesség molekuláris hátterét is. Ezért a BJ aszimmetria molekuláris folyamatait intenzíven tanulmányozzák különböző gerinces állatmodelleken. A kísérleti adatok értelmezését azonban megnehezíti, hogy ezekben az állatokban nem könnyű sok génre kiterjedő, gyors és átfogó genetikai analízist végezni. Ez indokolja, hogy olyan gerinctelen modellrendszerekben is tanulmányozzuk a BJ aszimmetria kialakulását, amelyekben a génfunkciók vizsgálata lényegesen könnyebb. A Drosophila, mint az egyik legjobban kidolgozott gerinctelen genetikai modell, lehetővé teszi a BJ aszimmetria megnyilvánulásainak az egész genomra kiterjedő, hatékony tanulmányozását. Drosophilában a BJ aszimmetrikus fejlődésre számos példa ismert, de ezeket korábban nem tekintették valódi BJ aszimmetriának, mivel nem volt arra bizonyíték, hogy ezek iránya genetikai eszközökkel megfordítható. A hím genitális lemez jobbra irányuló forgását vizsgálva Ádám Géza és Stephane Noselli alapvető felfedezést tettek: azonosították a Myo31DF gént, melynek mutációi megfordítják a genitális lemez forgásának az irányát, és situs inversus fenotípust hoznak létre (9. ábra). A Myo31DF mutációja a többi BJ aszimmetria irányát is megfordítja, ami azt igazolja, hogy Drosophilában is létezik valódi BJ aszimmetria. Ezzel a felismeréssel megnyílt az út a BJ aszimmetria molekuláris genetikai vizsgálatához Drosophilában. A Myo31DF gén a nyolcadik abdominális (A8) szelvényben fejti ki funkcióját a genitális lemez forgása során. Az A8 szelvényre specifikus genetikai szűrés segítségével további olyan géneket azonosítottak, amelyek befolyásolják a genitális lemez forgását. Mivel a BJ aszimmetria sejtes mechanizmusa gerinces és gerinctelen állatokban is alig ismert, az újonnan azonosított gének fontosak ezen folyamatok megismerésében. Genetika 9. ábra. A Myo31DF gén funkcióvesztéses mutációja (KG ) megfordítja a hím genitális lemez forgását Drosophilában situs inversus fenotípust hozva létre. Az ábra a Spéder et al. Nature (2006) 440, 803. közleményből lett átvéve Kiss István 147

148 Növénybiológia 148

149 SZBK Növénybiológiai Intézet Növénybiológia 6726 Szeged, Temesvári krt Szeged, Pf

150 Növénybiológia 150 TENYÉSZTETT SEJTEK OSZTÓDÁSA, DIFFERENCIÁLÓDÁSA: ÚT AZ ÚJ GÉNKOMBINÁCIÓKAT HORDOZÓ NÖVÉNYEKHEZ 1. Rövid történeti visszapillantás Az ebben a fejezetben bemutatásra kerülő tematikák kezdetei az SZBK alapításának idejére vezethetők vissza. Az SZBK Genetikai Intézetében Maliga Pál és munkatársai folytatták a dohánymutánsok izolálásával kapcsolatos kutatásaikat, amelyeket még a budapesti Herman Ottó úti Genetikai Intézetben indítottak el. A sztreptomicin antibiotikummal szemben rezisztens dohánynövények előállítása szövettenyészetben úttörő eredmény volt a 70-es évek elején, és megalapozta a későbbi, citoplazmatikus öröklődéssel foglalkozó, több évtizedes tudományos programot. Ezek a kutatások a 80-as évek elejétől az Amerikai Egyesült Államokban folytatódtak. A kormányzati tudománypolitikai elvárások nyomásának engedve Alföldi Lajos, a Genetikai Intézet akkori igazgatója ragaszkodott a búza szövettenyésztési és sejtgenetikai témák elindításához. Így Dudits Dénes vezetésével megalakult a Növényi Szomatikus és Sejtgenetikai Csoport a búzanövények in vitro regenerációját biztosító módszerek kidolgozására. Maliga Pál tübingeni, Dudits Dénes saskatooni tanulmányútjával egy teljesen új szakasz vette kezdetét a szegedi növényi sejtgenetikai kutatások történetében azzal, hogy idehaza megkezdődött a sejtfal nélküli növényi sejtek, a protoplasztok felhasználása először sejthibridek, majd szomatikus hibrid növények előállításához. A SZBKban folyó kutatások első jelentős nemzetközi elismerését jelentette az 1976-ban megszervezett ICRO (International Cell Research Organisation) tanfolyam, amelynek kiadványát (Cell Genetics In Higher Plants) Dudits Dénes, Farkas L. Gábor és Maliga Pál szerkesztette, és az Akadémiai Kiadó (Budapest) adta ki. A protoplasztok és a belőlük származó testi sejtek napjainkig a legfontosabb kísérleti objektumok közé tartoznak akár a sejtosztódás, akár az embriogenezis tanulmányozásában. A növényi sejt- és szövettenyésztési háttér nélkülözhetetlen volt a génbeépítési, transzformációs kutatások hazai bevezetéséhez. A transzgenikus lucernanövények előállítását követően a GM növények egész sora született meg az SZBK laboratóriumaiban, gyakran növénynemesítő partnerek közreműködésével. A metodikai fejlesztések és a szomatikus embriogenezis mellett mind nagyobb szerepet kapott a sejtosztódási ciklust szabályzó gének és fehérjekomplexek, a foszforiláció-defoszforiláció szerepének tanulmányozása től a Növényélettani, később Növénybiológiai Intézetben (Növényi Sejtosztódási és Differenciálódási Csoport) folytak ezek a munkák. A 90-es évek elejétől a növényi sejtciklus szabályozásának vizsgálata kiemelt jelentőséget kapott nemzetközi szinten is, és a szegedi iskola számára fontos esemény volt 1995-ben az EMBO (European Molecular and Cell Biology Organization) konferencia megszervezése az SZBKban. A Portland Press kiadásában megjelent Plant Cell Division (szerk.: D. Francis, D. Dudits, D. Inzé) tanulmánykötet mélységében mutatta be az akkor vezető szerepet játszó laboratóriumok eredményeit. A csoport nemzetközi elismertségét erősítette az, hogy helyi szervezője lehetett az EPSO (European Plant Science Organisation) Visegrádon, 2006-ban megtartott konferenciájának, amelynek témája A növényi dinamizmus: molekuláktól az ökoszisztémákig volt. 2. A növények hihetetlen regenerációs képessége: hibrid növények és embriók testi sejtekből A növények rendkívüli élőlények. Legcsodálatosabb tulajdonságuk kétségkívül az, hogy képesek a napfény energiáját megkötve szervetlenből szerves anyagot előállítani. Ami azonban talán még különlegesebbé teszi őket, az egyedfejlődésük hihetetlen rugalmassága, ami helyhez kötött életmódjuk következménye. Egy növény egész élete alatt változik, új szerveket, ágakat, gyökereket fejleszt, és mindezt a környezetével teljes összhangban teszi. A növények fejlődésének rugalmassága a sejtek szintjén is tetten

151 érhető. A növényi sejtek átprogramozhatóak, olyannyira, hogy akár egyetlen testi sejtből regenerálható a teljes növény. Ez az állati sejtek esetében nem lehetséges. Miért van ez így, és hogyan lehet a növényeknek ezt a hihetetlen regenerációs képességét kihasználni? Ahhoz, hogy egy testi sejtből egy teljes növényt fel tudjunk nevelni, a sejtet (vagy szövetet) el kell választanunk az organizmustól, és megfelelő, mesterséges tápközegbe kell helyezni. Ekkor a sejtek elvesztik specializált (differenciált) funkcióikat (pl. fotoszintézisre való képesség) és visszanyerik osztódóképességüket. Ezt a folyamatot de-differenciálódásnak nevezzük (a sejtdifferenciációs folyamat visszafordítása). A de-differenciált osztódó szövet (melyet a növényi hegszövettel való lényegi azonossága miatt kallusznak nevezünk) in vitro körülmények között korlátlan ideig fenntartható, szaporítható és a tápközeg hormontartalmának (auxin, citokinin) megváltoztatásával hajtássá, gyökérré, vagy akár embriófejlődésen keresztül (testi sejtekből kiinduló vagy szomatikus embriogenezis) teljes növénnyé nevelhető. Az MTA SZBK Genetikai Intézetében folytatott vizsgálatok eredményeképpen a csoport kutatói már 1975-ben, a világon az elsők között beszámoltak az egyik legfontosabb gazdasági növény, a búza esetében egy regenerációra képes in vitro kallusztenyészet létrehozásáról. A protoplasztok sejtfaluktól megfosztott növényi sejtek, melyek megfelelő kémiai vagy fizikai behatásra képesek egymással összeolvadni (fúzió). Különböző fajok testi sejtjeiből származó protoplasztok fúziója révén lehetőség van hibrid sejtek létrehozására, amelyekből hibrid növények nevelhetőek fel (szomatikus hibridizáció). Európában elsőként az SZBK-ban alkalmazták sikeresen a polietilén-glikol (PEG) kezelésre alapozott technikát két sárgarépafaj hibridjének az előállítására. A módszer gyakorlati jelentősége abban rejlik, hogy az ivaros keresztezéssel szemben lehetővé teszi akár a különböző nemzetségbe tartozó fajok közötti génátvitelt is. Ezt a sárgarépa és a podagrafű hibridjének előállításával bizonyították a szegedi kutatók. A kísérletek során nyilvánvalóvá vált azonban, hogy ezekben az esetekben a két faj genetikai anyaga (genomja) nem teljes mértékben összeférhető, azaz az egyik vagy másik faj kromoszómái a hibridből véletlenszerűen elvesznek (szomatikus összeférhetetlenség). Azt, hogy a kromoszómavesztés ne legyen teljesen véletlenszerű, úgy sikerült elérni, hogy az egyik (donor) faj sejtjeit a fúzió előtt röntgensugárzásnak tették ki, azaz a genetikai állományát fragmentálták. Így a sejtfúziót követően a hibrid sejtekből a donor faj kromoszómái vesztek el, míg a másik (recipiens) faj genetikai állománya sértetlen maradt (aszimmetrikus szomatikus hibridizáció). Megfelelő szelekciós körülmények biztosításával azonban el lehetett érni, hogy a donor faj genetikai anyagának egy része fennmaradjon a hibrid sejtekben és a belőlük felnevelt növényekben (korlátozott genomátvitel). Sárgarépa (recipiens) és petrezselyem (donor) protoplasztokat fuzionáltatva a szegedi kutatók ezzel a módszerrel olyan sárgarépanövényeket hoztak létre, amelyek egyetlen plusz petrezselyem kromoszómát hordoztak. Még nagyobb genetikai távolságot sikerült áthidalni a sárgarépa (donor) és a dohány (recipiens) esetében, ahol bár teljes sárgarépa-kromoszóma nem volt jelen a protoplasztok fúzióját követően felnevelt növényekben, a sárgarépa egy rezisztenciagénjét mégis sikerült kimutatni bennük, ami arra utal, hogy a sárgarépagenom egy darabja beépült a dohány genetikai állományába. Az aszimmetrikus szomatikus hibridizációt a Szegeden történt kezdeményezés után számos laboratórium alkalmazta a világon. A transzformációs módszer meghatározó szerepe mellett napjainkban is jelennek meg közlemények, többek között kínai szerzőktől, a fúzióra alapozott génátvitelről. A fenti kutatási eredmények felvetették annak a lehetőségét, hogy a protoplasztfúzió módszerét a gyakorlati nemesítés szolgálatába is lehet állítani. A hagyományos növénynemesítésben azok a növények használhatóak, amelyek a nemesítendő növénnyel ivarosan keresztezhetőek. Így a hagyományos nemesítés számára nem, vagy csak nagyon nehezen érhetőek el azok a rendkívül értékes betegség-ellenállósági gének, amelyek a rokon vad fajokban megtalálhatók. Így van ez a burgonya esetében is. Az MTA SZBK Növényi Szomatikus Sejtgenetikai Csoportjában az 1980-as évek második felében kezdődtek azok a kutatások, melyek a Pannon Agrártudományi Egyetem Burgonyakutatási Osztályának és az MTA Növény- Növénybiológia 151

152 Növénybiológia védelmi Kutatóintézetének munkatársaival együttműködve burgonya szomatikus hibridek létrehozását tűzték ki célul. Ennek eredményeként sikerült olyan Solanum tuberosum L. x Solanum brevidens Phil. hibrideket létrehozni, melyek a két szülő közötti átmeneti fenotípust mutattak, ugyanakkor rendelkeztek a vad burgonyafajta nagyobb fagytűrőképességével és vírusrezisztenciájával (1. ábra) ábra. Vad (Solanum brevidens, BR, bal oldalon) és termesztett (Solanum tuberosum, GR, jobb oldalon) burgonyafajták és szomatikus hibridjeik (A 12, T 28, középen) fagytűrése (edzést követően -2 C-on két óra hosszáig történt a kezelés; a kép három hét múlva készült, amikorra a termesztett burgonyanövények elpusztultak, míg a vad faj és a szomatikus hibridek újra fejlődésnek indultak). Ezt követte a két faj aszimmetrikus szomatikus hibridjeinek létrehozása, melyekben sikerült csökkenteni a vad fajra jellemző nem kívánatos tulajdonságok (pl. gumótlanság) megnyilvánulását. A szomatikus hibridek bevonásra kerültek a hazai burgonyanemesítési programba. A szomatikus hibridizációval kapcsolatos kutatások mellett fejlődésbiológiai vizsgálatok is folytak, amelyek célja a növények szomatikus embriogenezisre való képességének a megértése volt. A növényi egyedfejlődés rugalmasságára talán a legjobb példa az ún. szomatikus (testi sejtekből kiinduló) embriogenezis. Állatok esetében csak a megtermékenyített petesejt rendelkezik azzal a képességgel, hogy elinduljon az embriófejlődés útján, és teljes egyeddé fejlődjön (totipotencia). Sok növényfaj, illetve fajta esetében azonban lehetőség van arra, hogy az in vitro, Petri-csészében tenyésztett testi sejtekben is elindítsuk az embriófejlődés programját. A kutatócsoport a lucernát használva modellnövényként (2. ábra) arra kereste a választ, hogy melyek ennek a folyamatnak az első lépései, milyen sejtbiológiai, fiziológiai és genetikai változások vezetnek el a totipotencia kialakulásához a testi sejtekben. 2. ábra. Embriófejlődés és növényfelnevelés lucerna levélsejtekből (ún. levél protoplasztokból ). A növényről leválasztott levelekből (a) a sejtfalakat megfelelő enzimkeverékkel elbontva kiszabadulnak az egyedi, sejtfal nélküli levélsejtek ( protoplasztok ); (b) Megfelelő folyékony tápközegbe helyezve a protoplasztok újraépítik sejtfalukat, és elkezdenek osztódni (c). Az osztódó sejtek olyan struktúrákat ( szomatikus embriók ) hoznak létre, amelyek rendkívül hasonlóak az ivaros megtermékenyítést követően a zigótából fejlődő embriókhoz, ideértve annak minden fejlődési állapotát ((d), gömb állapotú; (e), szív állapotú; (f), torpedó állapotú szomatikus embrió). A testi sejtekből származó (szomatikus) embriók teljes növénnyé fejlődnek (g, h). A kísérletek felvetették az első aszimmetrikus sejtosztódás alapvető szerepét a sejtek átprogramozódásában (de-, illetve re-differenciáció), illetve rámutattak arra, hogy a szomatikus sejtekben az embriogenezis indukcióját követően hasonló folyamatok játszódnak le, mint a petesejtben, a megtermékenyítést követően. Az embriófejlődésre képes (embriogén) sejtek kialakulásának körülményeit levélprotoplaszt-tenyészetben tanulmányozták részleteiben Fehér Attila és munkatársai, akik 2003-tól önálló kutatócsoportot hoztak létre (Funkcionális Sejtbiológiai Laboratórium). Kimutatták, hogy a tenyésztett sejtek embriogén képessége összefügg a sejtek morfológiájával, az első osztódásukig eltelt idővel, a belső auxin- és nitrogénmonoxid-tartalmuk alakulásával, és a tápközeg ph értékével. A kutatások igazolták a szegedi kutatóknak azt a korábbi hipotézisét is, hogy az auxin, mint fő növényi növekedésszabályozó mellett a sejteket érő stresszhatások is fontos szerepet játszanak a szomatikus embriófejlődés elindításában. Ezek alapján alkották meg a szomatikus embriogenezis indukciójával kapcsolatos elméletüket. A szomatikus embriogenezis a növények in vitro felszaporításának a leghatékonyabb módja. A módszer alkalmazása gazdasági növények esetében lehe-

153 tővé teheti a kedvező tulajdonságokkal rendelkező genotípusok gyors felszaporítását, másrészt lehetőséget nyújt a sejtszintű genetikai változások (mutáció, szomatikus hibridizáció, genetikai transzformáció) növényi szintre emelésére. Az MTA SZBK szoros együttműködést folytat ezen a területen a szegedi Gabonakutató Kft. munkatársaival. Az egyszikű növények esetében, mint amilyen a búza és a kukorica, a sejt- és szövettenyésztési módszerek alkalmazása sokszor nehézségekbe ütközik. A szegedi kutatóknak azonban sikerült mind a kukorica, mind a búza esetében hatékony növényregenerációs rendszert kifejleszteniük. A kukorica esetében a több éves nemesítési és szövettenyésztési munkával kifejlesztett rendszer szabadalmi védelmet nyert. Mindkét rendszer sikeresen használható volt transzgenikus növények előállítására is (lásd később). 3. Növényi gének kémcsőben és GM növények születése 3.1 A növényi géntechnológia hazai kezdetei A rekombináns DNS módszerek kidolgozása és alkalmazása a 70-es években teljesen új fejezetet nyitott az élettudományi kutatásokban, és lendületet adott a biotechnológiai fejlesztések egész sorának. Magyarországon Venetianer Pál az MTA Szegedi Biológiai Központ Biokémiai Intézetében kezdeményezte a restrikciós enzimek használatát, a bakteriális és emberi gének izolálását és szekvenálását. Csoportjának munkatársai közül Koncz Csabának Dudits Dénes ajánlott állást a Genetikai Intézet Növény Szomatikus és Sejtgenetikai Csoportjában, és ezzel megteremtődtek a szakmai feltételek a növényi gének izolálását és a génbeépítés módszerének kidolgozását célzó kutatási témák hazai elindításához. Első próbálkozásként a hímsteril kukorica mitokondriumában található plazmid klónozása történt meg abban a reményben, hogy ez a kör alakú DNS-molekula alapul szolgálhat génbeviteli rendszerek kifejlesztéséhez. Kálmán László kukoricanemesítővel együttműködve sikerült az S2 típusú plazmid szerkezetének jellemzése. Az eredményekről 1981-ben jelent meg közlemény. Ezekkel a kísérletekkel párhuzamosan világszerte az érdeklődés középpontjába került az Agrobacterium-fertőzésre alapozott génbeépítés, genetikai transzformáció. Ez a talajbaktérium, amikor fertőzi a növényeket, a Ti plazmidjának egy meghatározott szakaszát integrálja a növények genetikai állományába, a genomba. Az ilyen természetes génátvitel jó lehetőséget kínál a Ti plazmid transzformációs vektorként történő felhasználására, miután a tumor kialakulásáért felelős géneket eltávolították, és beklónozták a traszformálandó gént, amely elvileg bármilyen élő szervezetből származhat. A genetikailag módosított szervezet (GMO) létrehozásához szükség van a kifejeződést biztosító szabályzó ún. promóter, illetve terminátor szekvenciarészekre. A GM növény előállítása idegen gént hordozó sejtek szelekcióját és teljes értékű növények regenerációját feltételezi. Az első sikeres dohánykísérletekről 1984-ben jelentek meg közlemények, míg a lucernába történő bakteriális génbeépítésről 1986-ban elsőként szegedi kutatók számoltak be. Ezekkel a kísérletekkel indult meg az a napjainkig tartó kutatási irányzat, amely a géntechnológiát egyrészt sejt- és fejlődésbiológai jelenségek molekuláris hátterének megismerésére, másrészt a növénynemesítés módszereinek kibővítésére használja, többféle növény bevonásával. 3.2 GM növények sorozata alternatív génbeépítési módszerek alkalmazásával A kezdeti sikeres génbeviteli kísérleteket követően további széles körű kutatásra volt szükség az egyes fajok esetében alkalmazható transzformációs módszerek kidolgozásához. Lényegében három technológia nyert tartós létjogosultságot a es évek során, amelyek mindegyikét sikerrel alkalmazzák a szegedi kutatók. Az Agrobacteriumra alapozott módszerrel kerültek előállításra a korábban említett lucerna mellett transzgenikus dohány-, repce-, burgonya-, rizs- és árpanövények. Tekintettel a módszer megbízhatóságára, az így létrehozott GM növények segítségével lehetőség nyílt akár a génkifejeződést szabályzó DNS-szekvenciák promóterek jellemzésére, akár a gének biológiai hatásának értékelésére. A 3. ábra példaként bemutatja a β-glükuronidáz (GUS) enzim mint riporter működését dohány, illetve repcetranszformánsokban. Látható, hogy a dohánynö- Növénybiológia 153

154 Növénybiológia 154 vényekben a sejtosztódással kapcsolatos hisztongén promótere a merisztémaszövetekben aktív (3. ábra A, B). A GUS enzim kimutatása hisztokémiai módszerrel azt jelzi, hogy a vírus eredetű, CaMV35S promóter a repcenövény szárának különböző részein milyen erősen működik (3. ábra C). 3. ábra. A β glükuronidáz (GUS) riportergén kék festődéssel jelzi azokat a sejteket, szöveteket, amelyekben a promóter aktív. A. A hisztongén promóterének aktivitása a dohánynövény hajtásmerisztémájában B. A hisztongén promóterének aktivitása a dohánynövény gyökérmerisztémájában C. A virális promóter kifejeződése transzgenikus repce szárszöveteiben A gyakorlati alkalmazás lehetőségének irányába mutattak azok a kísérletek, amelyek során a burgonyavonalakba beépített vírus burokfehérjegén kifejeződése vírus ellenállóságot biztosított ezeknek a növényeknek. Napjainkban az Agrobacterium transzformációs rendszer már megbízható hatékonysággal alkalmazható egyszikű gabonanövények genetikai módosítására is. Így számos sejtciklus- és stresszadaptációs gén funkcionális jellemzése történik akár rizs-, akár árpatranszformánsok felhasználásával. A rizsnövényekben a rizs retinoblasztóma homológ génjének (OsRBR1) lecsendesítése érdekében a cdns fordított irányban került beépítésre, ami jelentős változásokat okozott a sejtek osztódási gyakoriságában, a növények külső bélyegeiben. A sejtfal nélküli növényi sejtek, az ún. protoplasztok membránján keresztül lehetséges a DNSmolekulák bejuttatása a sejtekbe, és a felvétel serkenthető kémiai (polietilén-glikol, PEG) vagy fizikai (elektroporáció) behatások alkalmazásával. A GM növények felnevelésének feltétele az, hogy a transzformált sejtek szelekciós előny révén felszaporodjanak, és az így kialakuló kalluszszövetekben elindítható legyen a hajtások vagy embriók differenciálódása. A növényregenerációs képesség genetikailag is meghatározott, ezért lehet nemesítési módszerekkel embriogén tenyészeteket létrehozni. A kukorica esetében ezt a többéves nemesítési munkát végezte el sikeresen Mórocz Sándor, a Gabonakutató Intézet (Szeged) munkatársa, és létrehozta a HE/89 genotípust, amelynek protoplasztjaiból fertilis kukoricanövényeket lehet felnevelni. Az ilyen egyedülálló tenyészanyag birtokában lehetőségünk nyílt jelentős bevételt hozó nemzetközi együttműködésekre, és izgalmas kutatási projektek megvalósítására. A kukorica-protoplasztok transzformációjához kapcsolódó szabadalom nemzetközi értékesítése révén kapott licencdíj a legnagyobb az SZBK negyvenéves története során. A gyomirtószer-rezisztens tenyészanyagok után még a évben is van licenc-bevétele együtt az SZBK-nak és a Gabonakutató Kft-nek. Ez a technológia számos érdekes biológiai kérdés kísérletes megközelítését is lehetővé tette. Így a methotrexát-rezisztencia kialakítása kukoricanövényekben, a mutáns egér dihidrofolát enzim génjének beépítésével példát szolgáltat arra, hogy a magasabbrendű eukarióta szervezetek alapvető anyagcsere-folyamatai hasonló biokémiai elveken nyugszanak, és az állati gének működőképesek növényekben. A 4. ábra a methotrexát-rezisztens kalluszokból regenerált kukoricanövényt mutatja be. 4. ábra. Az egér mutáns dihidrofolát génjének beépítése és működtetése kukoricában methotrexát-rezisztens növény felnevelését teszi lehetővé

155 A protoplasztokba történő közvetlen DNS-bevitelre épülő transzformáció segítségével több promóter működését is lehetett tanulmányozni akár a sejtek szintjén, akár a kukorica különböző szerveiben. Kukorica-transzformánsokban magas szintű génkifejeződést biztosító vektormolekulát lehetett kialakítani, ami hordozta a búza H3 hisztongén 720 bázispár hosszúságú promóterrégióját, és ennek a génnek a 850 bázispárból álló terminációs szakaszát. Ez a vektor az osztódó sejtekben gazdag szövetekben biztosított erőteljes génkifejeződést. Az egyszikű gabonafélék transzformálása hatékonyan megvalósítható részecskebelövéssel. Ezt a módszert a Gabonakutató Kft-ben sikerrel alkalmazzák Pauk János és munkatársai transzgenikus búzanövények előállítására. Így a velük folyatott többéves együttműködés során több lucernagén került beépítésre búzanövényekbe. Ezek a génkonstrukciók stressztűrést javító hatásuk folytán érdemelnek figyelmet. Napjainkban a politikai és társadalmi érdeklődés és gyakran a viták középpontjában vannak a géntechnológiával nemesített (GM) növények. A termesztésük moratóriumát követelők arra a veszélyre hivatkoznak, hogy a beépített gének kiszabadulva a vad fajok genetikai tisztaságát fenyegetik. Különösen az idegen beporzó növények esetében válhat indokolttá egy bizonyos izolációs távolság betartása, vagy puffervetéssel az átporzás akadályozása. A biztonsági feltételek korrekt megállapítása kísérletekkel lehetséges. Már között, évekkel megelőzve a kockázatelemzések általánossá válását, Dudits Dénes koordinálásával egy országos kiterjedésű vizsgálatra került sor, amit az Országos Műszaki Fejlesztési Bizottság a MEC számú pályázat keretében tett lehetővé. Hat kísérleti helyen, kukorica, repce, lucerna, burgonya, paradicsom, feketecsucsor és dohány bevonásával 10 kutató értékelte szabadföldi kísérletekben a transzgén terjedését (5. ábra). Egyik szántóföldi vizsgálat esetében sem jelentett biológiai katasztrófát a transzgenikus növény jelenléte. Bár a tények rendelkezésre álltak, mégis a magyar géntechnológiai törvény szakmaiatlan izolációs távolságokat határoz meg csak azért, hogy ezzel is ellehetetlenítse a GM fajták jövőbeni használatát Magyarországon. A pályázat során a repcekísérletekben kapott eredmények nemzetközi folyóiratban kerületek közlésre. 5. ábra. Az idegen beporzó repce GM virágporának terjedését vizsgáló biohazard kísérlet. 3.3 A növényi gének izolálására alapozott sejtbiológiai kutatások néhány eredménye A bemutatott transzformációs rendszerek kifejlesztésén és alkalmazásán túl a növényi gének genomikus, illetve cdns-klónjainak izolálása szerves elemévé vált sejtbiológiai, stresszfiziológiai és fejlődésélettani kutatásainknak. A lucerna és rizs H3 hisztongének molekuláris jellemzése elvezetett a sejtosztódási markerek alkalmazásához, ami feltételezte a promóterek működésének tanulmányozását (3A ábra). A lucerna H3 hiszton génvariánsok közül a H3-1 gén kifejeződése alapján DNS-szintézishez kötött változat, míg a H3-11 gén a sejtek osztódási ciklusának minden fázisában aktív, és erősen reagál a magas koncentrációban alkalmazott auxin (2,4-diklórfenoxi ecetsav) kezelésre, ami szomatikus embriók megjelenését eredményezi. A hiszton gének kutatása révén alakult ki hoszszabb gyümölcsöző együttműködés J. H. Waterborg csoportjával (Division of Cell Biology and Biophysics, University of Missouri-Kansas City, USA). A növényi foszfatázok kutatása hazai kollaborációval kezdődött, és napjainkban is közös pályázatok és közlemények jelzik a Dombrádi Viktor csoportjával (Orvos Biokémiai Intézet, Debreceni Egyetem) fennálló tudományos kapcsolat eredményességét. A stressz körülményei között szerepet játszó lucernagének közül említésre érdemes a nem szimbiotikus hemoglobin gén, amelyeknek cdns-klónját sikerült izolálni. Ez a gén magas expressziót mutat oxigénhiányos körülmények között, hypoxia esetén. Immunhisztokémiai vizsgálatok szerint ez a növényi hemoglobin elsődlegesen a sejtmagban található, mint azt a 6. ábra szemlélteti. Növénybiológia 155

156 Növénybiológia Meg vagyok győződve, hogy a sejtszaporodásért felelős sejtciklus tanulmányozása fontos, és rávilágít az élet természetére. Paul Nurse (Nobel-díj, 2001) A sejtosztódás szabályozása az elmúlt négy évtized biológiai kutatásainak egyik központi témája, és egyben az egyik legdinamikusabban fejlődő területe. Az élet megújulásának a sejtosztódás az alapja, szabályozásának megismerése ugyanakkor nemcsak az élet megértéséhez nyújt lehetőséget, hanem a rák gyógyításához is, amely korunk talán legsúlyosabb betegsége. Az élesztő-genetikai, valamint a karmos béka petesejtjén végzett biokémiai kutatásoknak köszönhetően az 1990-es évekre kiderült, hogy a mitotikus sejtosztódás szabályozása evolúciósan konzerválódott (Lee Hartwell, Paul Nurse és Tim Hunt munkásságát az ezen a területen elért kimagasló eredményeiért 2001-ben élettani Nobel-díjjal jutalmazták). A szabályozás központi molekulája egy kinázfehérje lett, amely a hasadó élesztő (fission yeast) mutációs analízise során a cdc2 (cell division cycle 2) nevet kapta. Ez a kinázmolekula foszforilációs változásokon keresztül képes szabályozni a sejtosztódási ciklus egyes lépéseit. A cdc2-molekula működése más szabályozóktól, a ciklin-fehérjéktől függ, melyek mennyisége a sejtosztódási ciklus során periodikusan változik, azaz ciklizál. Ezen tulajdonsága alapján a cdc2-molekulát ciklin-függő protein kináznak, CDK-nak nevezték el (az angol rövidítés alapján cyclin-dependent kinase). Az élesztő cdc2 az egyetlen CDK a gombasejtben (CDK1), amely különböző ciklinekkel komplexbe lépve a sejtosztódás két fontos pontját szabályozza; az osztódásba lépést (Start pont), valamint a kromoszómák szegregációját megelőző ún. G2/M tranzíciós pontot (7. ábra). 6. ábra. A hemoglobin immunlokalizációja a sejtmagban A növényi sejtosztódás szabályozása 7. ábra. Az élesztő sejtciklus-szabályozásában szerepet játszó egyetlen CDK-molekula (p34 cdc2 ) regulálja a DNS-szintetikus fázisba (S), mind pedig a mitotikus szakaszba (M) történő átmenetet. A cdc2 különböző ciklinmolekulákkal lép komplexbe az S- és az M-fázisokat megelőzően. Mutációkkal a két forma egymásba történő átalakulását gátolni lehet Az SZBK Növénybiológiai Intézetében a Sejtosztódási és Differenciálódási Csoport tagjai Heribert Hirt (Bécsi Egyetem) kutatóval kialakított együttműködésben elsőként mutatták ki, hogy a növények is rendelkeznek az élesztő cdc2 gén megfelelőjével, amely nemcsak nagyfokú hasonlóságot mutatott az élesztő cdc2 rokonnal (ez alapján izolálták), hanem képes volt a cdc2-hiányos mutáns élesztősejteket osztódásra bírni. 8. ábra. Az élesztő cdc2 mutáns sejteket osztódásra képessé lehetett tenni a lucerna cdc2 rokon gén beépítésével. A. A bal oldali képen láthatóak az osztódásra képtelen, megnyúlt élesztő cdc2 mutáns sejtek, míg B. a jobb oldalon a növényi cdc2 génnel transzformált cdc2-hiányos élesztősejtek visszanyerték osztódási képességüket, erre utal a lényegesen kisebb sejtméret Tehát a két organizmus között fennálló lényeges evolúciós távolság ellenére, a növényi cdc2 fehérje képes volt ellátni az élesztő cdc2 funkcióját (8. ábra). Ezek a kísérletek arra engedtek következtetni, hogy a cdc2 növényi megfelelője is a sejtosztódás szabályozásában vesz részt. Ezt a feltételezésüket tovább erősítette, hogy a növényi cdc2 gén kifejeződését a

157 sejtosztódás pozitív szabályozója, az auxin, amely egyben fontos növényi növekedési hormon is, indukálni képes. Az erről szóló eredményeiket 1991-ben a rangos nemzetközi folyóiratban, a PNAS-ban publikálták. A rákövetkező évben a csoport már növényi ciklin-rokon géneket izolált lucerna sejtkultúrából, amelyek a sejtosztódási ciklustól függő kifejeződést mutattak. Mindez tovább erősítette az univerzális sejtosztódási modell hitelességét. Biokémiai vizsgálatok segítségével kimutatták, hogy a növényi cdc2- és ciklinfehérjék, hasonlóan élesztő és állati megfelelőikhez, egymással komplexet formálnak. További biokémiai vizsgálatok révén megállapították, hogy a növényi CDK-kináznak a sejtosztódás során periodikusan változó aktivitása van. A CDK funkciónak a növényi sejtosztódási ciklus szabályozásában betöltött központi szerepére engedett következtetni, hogy az élesztő és az állati sejtciklusmodellekhez hasonlóan a két fő kontrollpontban G1/S és G2/M aktív CDKkomplexek működnek. Nyomon követve ezeket a CDK-kinázaktivitásokat, sikerült kimutatni növényi sejtkultúrában is a gyökérgümő fejlődésében szerepet játszó szignálmolekulák sejtosztódást serkentő hatását. A sejtcikluskutatások következő fontos állomását jelentette, amikor felfedezték, hogy bizonyos kontrollpontokban az élesztő- és az állati sejtciklus szabályozása eltér egymástól: az élesztő modellel szemben az emlős sejtek G1/S kontrollpontját több CDK-molekula regulálja. Ezeket az eredményeket azzal magyarázták, hogy a magasabb szerveződésű élőlények osztódásba lépését komplexebb folyamatok szabályozzák (pl. fejlődési program), mint amit az egysejtű élesztő esetében meg lehet figyelni. Az SZBK kutatói kimutatták, hogy a növények az állatokhoz hasonlóan több tagból álló CDK-kinázcsaláddal rendelkeznek. Megállapították, hogy közülük kettő növényekre jellemző tulajdonságokkal bír (ezeket később B-típusú CDK-fehérjéknek nevezték el). Elsőként fedezték fel, hogy ezek a kinázfehérjék a sejtciklus G2 fázisából az M fázisba haladás során játszanak szabályozó szerepet (9. ábra). Ezek az eredmények arra engedtek következtetni, hogy a növények G2/M kontrollpontja másképpen szabályozódik, mint azok, amelyek az élesztő és állati sejtekben működnek. Az egyik mitotikus CDK-kinázfehérjét (CdcMsF) olyan mikrotubuláris struktúrákon lehetett megfigyelni, amelyek csak a növényekre jellemzőek, és fontos szerepet játszanak az osztódás irányának a meghatározásában, valamint az új sejtek kialakulásában (pl. preprofázisos sáv és fragmoplaszt 10. ábra). Növénybiológia 9. ábra. A lucerna cdc2-rokon gének közül kettő, a cdc2msd és cdc2msf sejtciklustól függő módon a G2-M fázisokban fejeződik ki. A lucerna cdc2ms gének expressziós analízise (Northern-blot) szinkronizált növényi sejtkultúrában 10. ábra. A cdc2msf fehérje kimutatható a mitózisra specifikus mikrotubuláris struktúrákon. A cdc2msf immunlokalizációja A. a preprofázisos sávon, B. a profázisra jellemző struktúrán, C. a mitotikus orsón, valamint D. a fragmoplaszton. A fekete-fehér képek a sejtmagot mutatják 157

158 Növénybiológia A kinázokkal ellentétes funkciót töltenek be a foszfatázok: az SZBK kutatói egy specifikus foszfatázinhibitor endothall felhasználásával mitotikus abnormalitásokat detektáltak (11. ábra). A mitotikus CdcMsF kináz működése is megváltozott a kezelt sejtekben. Mindez arra utal, hogy a növényi CDKmolekulák működésével szemben specifikus foszfatáz molekulák játszanak szerepet a növényi sejtosztódási ciklus szabályozásában. Kiderítették, hogy az egyik távolabbi CDK rokon fehérjének (CDKC) nincs sejtciklusfüggő aktivitása és a ciklin T szabályozó fehérjével együtt a transzkripcionális szabályozásban szerepet játszó RNS-polimeráz II működését regulálja. eldöntik, hogy osztódnak vagy differenciálódnak. Az emlőssejtek esetében felfedezték, hogy a sejtek e döntési folyamataiban egy tumor szupresszor molekula, a retinoblasztóma (Rb) fehérje meghatározó szerepet játszik. Az SZBK-ban végzett kutatások igazolták, hogy az egyszikű és a kétszikű növényekben homológ (RBR) fehérjék RBR által történő szabályozása eltérhet egymástól: a kétszikűekkel szemben, ahol csak egyetlen RBR-molekula található, az egyszikűekben két Rbhomológ van. Bebizonyosodott, hogy az egyik rizs RBR gén kifejeződésének a változtatásával a sejtosztódás aktivitását is modulálni lehet: emelve az RBR mrns-szintet kevesebb sejt lépett az osztódásba, míg csökkentve az RBR mrns mennyiségét több osztódó sejtet lehetett megfigyelni (12. ábra). 12. ábra. A retinoblasztóma-homológ fehérje génjének aktiválása gátolja az S-fázisban lévő sejtek számának növekedését, míg a kifejeződés antiszensz génbeépítéssel előidézett gátlása növeli az S-fázisos sejtek gyakoriságát. Az utóbbi módosítás nagyobb sejttömeget eredményez sejtszuszpenziós kultúrában. Az S-fázisban lévő sejtek 5-etinil- 2-deoxyuridin beépüléssel mutathatók ki, amelyet a sárga fluoreszcencia jelez 11. ábra. Az osztódó növényi sejtek foszfatáz inhibitor (endothall-et) kezelés hatására mitotikus rendellenességeket mutatnak Az eukarióta sejtek osztódásba lépését komplex transzkripcionális szabályozási mechanizmusok regulálják. Egy normálisan működő sejtben ezek a folyamatok specifikus gének be-, illetve kikapcsolásához vezetnek, amelyeknek köszönhetően a sejtek A csoport jövőbeni terveiben változatlanul központi kutatási témaként jelenik meg a sejtciklus molekuláris alapjainak vizsgálata. Különösen izgalmas kérdések fogalmazódnak meg akkor, amikor meg akarjuk érteni a különböző fejlődési gének és fehérjék együttműködését a sejtciklust irányító apparátussal. Ebben a témakörben jelenik meg az a probléma, hogy miként befolyásolják a környezeti stresszhatások (vízhiány, ozmotikus stressz) a sejtosztódás folyamatát. Dudits Dénes, Fehér Attila és Magyar Zoltán 158

159 A FOTOSZINTETIKUS APPARÁTUS MŰKÖDÉSE ÉS FOTOOXIDATÍV KÁROSODÁSA A fotoszintézis a földi bioszféra meghatározó jellegű folyamata, ami a napenergia kémiai energiává alakítása révén csaknem az összes földi életforma alapjául szolgál. Az oxigéntermelő fotoszintetikus szervezetek (cianobaktériumok, algák és növények) az energiaátalakítási folyamat eredményeként létrehozott szerves anyagokba a vízből kivont elektronokat építik be. A vízbontási folyamat melléktermékeként keletkező oxigén a magasabb rendű életformák számára elengedhetetlen, így Földünkön az állatvilág, illetve az abból kifejlődött emberiség fotoszintézis nélkül nem létezhetne. Igen lényeges az is, hogy a Nap lényegében kimeríthetetlen energiájának legnagyobb kapacitású átalakítója földünkön a fotoszintézis folyamata. A globális fotoszintézis révén átalakított napenergia mennyiségére jellemző, hogy az csaknem tízszeresen haladja meg az emberiség jelenlegi teljes energiaigényét. Mindezek következtében a fotoszintetikus apparátus szerkezetének és működésének vizsgálata kiemelt fontosságú és nagy erőkkel kutatott tudományterület volt az elmúlt 3 4 évtized során. Az 1970-es évek elején kitört első olajválság megnövelte a megújuló energiahordozók iránt igényt, ami nagymértékben motiválta a fotoszintézis folyamatainak molekuláris szinten történő megértésére irányuló nemzetközi erőfeszítéseket. Ez a fontos kutatási irány a kezdetektől fogva lényeges eleme volt az SZBK Növénybiológiai Intézetében folytatott vizsgálatoknak. A kezdetek: Multidiszciplináris megközelítés a fotoszintéziskutatásban A fotoszintéziskutatások SZBK-beli kezdete a Faludiné Dániel Ágnes által vezetett Fotoszintézis Csoportban végzett, elsősorban biofizikai eszköztárt alkalmazó, fotoszintézis bioenergetikai vizsgálatokhoz köthető. A kezdeti kutatások a tilakoid membránokban található klorofillformák azonosítására és szerepének megértésére, valamint intakt kloroplasztiszok izolálására és vizsgálatára irányultak, amelyek megalapozták a csoport nemzetközi elismertségét. A 70-es években a fotoszintéziskutatások egyik fontos jellemzője a multidiszciplináris szemlélet térnyerése volt, amelynek eredményeként a fotoszintézis komplex folyamatait fiziológiai, biokémiai és biofizikai módszerek együttes alkalmazásával vizsgálták. A multidiszciplináris eszköztár egy évtizeddel később a molekuláris biológiai módszerekkel egészült ki. A fotoszintetikus funkciók precíz biofizikai módszerekkel történő vizsgálata a kezdetektől fogva a Fotoszintézis Csoport prioritása volt, ami kezdetben abszorpciós és cirkuláris dikroizmus spektroszkópiai vizsgálatokra koncentrált. Ennek az időszaknak jelentős eredménye volt Demeter Sándor részvétele a fotoszintetikus vízbontást végző ún. második fotokémiai rendszer (PSII) elsődleges elektronakceptoraként funkcionáló feofitin-molekula moszkvai kooperációban történő azonosításában. A termolumineszcencia alkalmazása PSII funkcióvizsgálatokra A biofizikai módszerek eszköztára a 70-es évek végén az ún. termo lumineszcenciás (TL) mérőmódszer hazai meghonosításával egészült ki, ami lehetővé tette a PSII működésének részletes vizsgálatát az egyes redox komponensek között végbemenő elektron transzport-lépések szintjén intakt és izolált rendszerekben egyaránt. Ennek az időszaknak jelentős eredménye volt a kereskedelmi forgalomban nem hozzáférhető termolumineszcenciaberendezés Demeter Sándor által irányított megépítése és különböző típusú kloroplasztiszok működésének vizsgálatára történő alkalmazása. Ezt követően a JATE Elméleti Fizikai tanszékén dolgozó Vass Imrével folytatott együttműködés keretében kidolgozták a fotoszintetikus TL elméleti leírását és ennek alapján a TL mérések analízisének módszerét, ami lehetővé tette az átfedő TL komponensek szétválasztását és a PSII elektrontranszport-folyamatok energetikai jellemzőinek Növénybiológia 159

160 Növénybiológia 160 meghatározását. Az ezt leíró publikáció a TL módszer mindmáig idézett alapcikke lett. A TL módszer alkalmazásával a 80-as évek folyamán jelentős eredményeket értek el a PSII-ben történő töltéstárolási és töltésrekombinációs folyamatok vizsgálatában. A TL módszert Horváth Gábor vezetésével az irodalomban elsőként alkalmazták a fotoszintézist gátló növényvédő szerek hatásmechanizmusának vizsgálatára. Ezt a jelentős nemzetközi figyelmet kiváltó megközelítést számos, a Fotoszintézis Csoport és külföldi kutatók által publikált munka követte. A TL módszert később kiterjesztették a herbicidkötőhelyet kialakító ún. D1 reakciócentrum fehérje spontán mutációinak eredményeként kialakuló herbicidrezisztencia mechanizmusának vizsgálatára is. 1. ábra. A TL keletkezésének sémája a PSII komplexben. Az ábrán látható komponensek a fénybegyűjtő (Chl) és reakciócentrum klorofillok (P680), az elsődleges feofitin elektronakceptor (Phe), valamint a stabil töltéstárolásban résztvevő donor- (D) és akceptor- (A) komponensek A TL módszer fotoszintetikus rendszerek vizsgálatában történő alkalmazásaiban az intézet munkatársai mindmáig nemzetközileg elismert és sok tekintetben meghatározó szerepet játszanak. A PSII-ben lejátszódó töltéstárolási és töltés rekom bi nációs folyamatok vizsgálatának a termolumi nesz cenciával szorosan összefüggő módszere az ún. késleltetett lumineszcencia. Az ezzel kapcsolatos vizsgálatokat Demeter Sándor vezetésével Hideg Éva kezdte meg az intézetben, amely technikának japán kooperációban történő továbbfejlesztésével bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a késleltetett lumi neszcencia jel közvetlenül a PSII-ből származik. A PSII működésének megértésére irányuló kutatások A PSII vízbontási funkciója révén nemcsak a fotoszintetikus apparátus kulcsfontosságú komponense, de egyben a természetben található egyik legbonyolultabb bioenergetikai rendszer is, amelynek működése részleteiben csak térszerkezeti információk alapján érthető meg. A tilakoid membránba ágyazott PSII komplex kristályosításának nehézségei miatt ez a feladat csak napjainkban, azaz a vizsgálatok megkezdése után több mint 25 évvel látszik megoldódni. A közbenső időszakban igen fontos szerepet játszottak a PSII működésének vizsgálatára használható biofizikai módszerek, pl. a már említett TL mellett a gyors oxigén polarográfia. E módszer segítségével sikerült kimutatni Deák Zsuzsannának a csoport munkatársaival együtt a vízbontó komplex és az ún. tirozin-d elektrondonor között fennálló töltésegyensúlyt. Mivel a PSII-vel nagymértékű homológiát mutató bíborbaktériumok részletes térszerkezete már a 80-as évek közepén rendelkezésre állt, a PSII szerkezet-funkció vizsgálatainak kézenfekvő megközelítése volt a PSII térszerkezetének homológia-alapú modellezése. Ebben a nagyjelentőségű munkában, ami a PSII-re vonatkozó szerkezeti információknak csaknem 15 évig volt elsődleges forrása, az intézetből Vass Imre vett részt egy nagyon sikeres stockholmi kooperáció keretében. A 90-es évek kezdetétől a fotoszintézis-, és ezen belül különösen a PSII-kutatásokon belül egyre nagyobb szerepet játszott a molekuláris biológiai módszerek térhódítása, ami lehetővé tette egyes gének által kódolt fehérjealegységek szelektív eltávolítását, valamint egyes fehérjék szerkezetének és tulajdonságainak irányított mutagenezissel történő célzott megváltoztatását. E lehetőségek kiaknázására a Molekuláris Stressz- és Fotobiológiai Csoport Vass Imre vezetésével igen gyümölcsöző együttműködést épített ki a londoni Imperial College James Barber által vezetett csoportjával, illetve a molekuláris munkákat irányító Peter Nixonnal, amelynek keretében számos PSII fehérjealegység és aminosav-komponens szerepét sikerült tisztázni a cianobakteriális modellrendszerben. A mindmáig tartó közös munka több mint 20 publikációt eredményezett rangos nemzetközi folyóiratokban.

161 A fotoszintetikus apparátus működését befolyásoló stresszhatások mechanizmusának vizsgálata A 80-as évek végétől a növénytudományi kutatások fontos prioritása lett a különböző környezeti stresszhatások által okozott károsító hatások mechanizmusának felderítése, amiben jelentős szerepet kapott a fotoszintetikus funkciók vizsgálata. Ennek oka egyrészt az, hogy számos stresszhatás közvetlenül a fotoszintetikus apparátust károsítja, másrészt pedig az, hogy a fotoszintézis-kutatásban rendelkezésre álltak hatékony szerkezet-funkció összefüggések feltárását lehetővé tevő multidiszciplináris módszerek, amelyekhez egyre nagyobb mértékben járult hozzá a molekuláris biológiai módszerek alkalmazása. A Növénybiológiai Intézetben 1988-ban indult meg a fotoszintézis szempontjából kiemelt fontosságú fénystressz mechanizmusának vizsgálata az intézethez japán tanulmányút után csatlakozott Vass Imre vezetésével. Ez a munka vezetett, egy svédországi kooperáció keretében, a PSII fénygátlásának mechanizmusát leíró modell kidolgozásához. A modell szerint a PSII elektrontranszport gátlását fényindukált szingulett oxigén ( 1 O 2 ) okozza, ami a redukált akceptor-oldali komponensek jelenlétében kialakuló triplett állapotú reakciócentrum klorofill ( 3 P680) és oxigén kölcsönhatásából keletkezik. Az eredményt leíró publikáció a fotoinhibíciós irodalom egyik legtöbbet idézett eredeti közleményévé vált. A 90-es évek közepétől a PSII fénygátlásának vizsgálatát kiterjesztették az ultraibolya spektrumtartományra is, és kimutatták, hogy az UV-B és UV-A sugárzás esetén a PSII károsításának alapvető mechanizmusa a vízbontó komplex Mn-komplexének foto-inaktivációja. Ezt követi a kinon és tirozin redox komponensek károsodása, majd pedig a reakciócentrum fehérjevázának lebomlása. Az UV sugárzás által okozott károsítást az intakt fotoszintetikus rendszerek a degradálódott D1 és D2 fehérjealegységek újraszintézise és PSII reakciócentrum újbóli összeszerelése révén képesek helyreállítani. Növénybiológia 3. ábra. A PSII UV-indukált károsításának és a károsodás helyreállításának sémája 2. ábra. Szingulett oxigén képződése (piros nyilak) és az ellene védő folyamatok (zöld nyilak) a PSII-ben A fénystresszel kapcsolatos vizsgálatokba a es évektől sikerrel bevonták a fotoszintézissel kapcsolatos gének szabályozásának tanulmányozását is. Cianobakteriális modellrendszerekben kimutatták, hogy a reakciócentrum D1 fehérjekomponensét kódoló gének egyes kópiái stresszgénként működnek és UV, illetve látható fény hatására történő kifejeződésük fokozott fénytoleranciát biztosító D1 formák képződését eredményezi. A jelenség molekuláris hátterének vizsgálata során Kós Péter, Deák Zsuzsanna és a doktorandusz Cser Krisztián részvételével kimutatták, hogy az alacsony és magas fényintenzitásokon keletkező D1 formák közötti legfontosabb különbség egy aminosav cseréjéhez köthető (D1-130GlnGlu), ami a sugárzás nélküli töltésrekombináció felgyorsításával biztosít védelmet a 3 P680 képződése ellen. Ezt a fontos felismerést pontmutánsok vizsgálatával, valamint egy német együttműködés keretében térszerkezeti modellezéssel is alátámasztották. 161

162 Növénybiológia ábra. A PSII térszerkezeti modellezése alacsony és magas fényintenzitások mellett. A zöld gömbök mutatják a fényintenzitástól függő módon kifejeződő D1 fehérjeformák közötti eltérések helyét A fény mellett számos egyéb környezeti tényező is károsítja a növényeket és azok fotoszintetikus apparátusát, amelyek közül kiemelt fontosságúak a nehézfémek és a vízhiány. A kezdeti vizsgálatokat a 80-as évek végén növényekből izolált tilakoidpreparátumokon végezték a nehézfémek (kobalt, nikkel, réz) által a PSII elektrontranszportjában okozott gátlási mechanizmus feltárására. Jelentős visszhangot kiváltó eredményük volt ezen a területen annak kimutatása, hogy a réz gátolja a kinon elektron akceptorok közötti elektronátadást. Újabban pedig sikerrel konstruáltak olyan cianobakteriális bioszenzorokat, amelyek nehézfémek, illetve arzén jelenlétére lumineszcencia fény kibocsátásával reagálnak. A növényeket érő talán legfontosabb stresszfaktor a vízhiány, ami az utóbbi időszak globális klímaváltozásai miatt Magyarországon is egyre gyakrabban okoz problémát. A Növénybiológiai Intézet egyik kiemelt kutatási területe a búza termésbiztonságának javítása, különös tekintettel a vízellátás nagymértékű változásai által okozott károk csökkentésére. Az intézet a között számos nagyléptékű hazai és nemzetközi kooperációs kutatási projektet koordinált Dudits Dénes vezetésével, amelyekben a Molekuláris Stresszés Fotobiológiai Csoport munkatársai a fotoszintetikus funkciók követését lehetővé tevő biofizikai módszerek alkalmazásával vettek részt. Ezekre a vizsgálatokra alapozva az utóbbi években a szegedi Gabona kutató Nonprofit Kft. munkatársaival folytatott kooperáció során a növények stresszfiziológiai állapotának monitorozását távérzékelési módszerekkel lehetővé tevő komplex stresszdiagnosztikai rendszer kifejlesztésén dolgoznak, amelyben meghatározó szerepe van a Sass László által végzett számítástechnikai fejlesztéseknek. Reaktív oxigénszármazékok szerepének vizsgálata növényi rendszerekben Az intézetben az 1990-es évek eleje óta folytatott fotoszintézis- és fénystresszmechanizmus-vizsgálatok egyik legfontosabb és a kutatások irányát hosszú távon meghatározó eredménye volt a reaktív oxigénszármazékok (ROS), elsősorban pedig a szingulett oxigén növényeket károsító szerepének felismerése. E vizsgálatok kezdetén nem álltak még rendelkezésre olyan módszerek, amelyekkel a különböző ROS-formák képződése és jelenléte növényi rendszerekben kimutatható lett volna. Ezért igen fontos kutatási irány volt a más területeken (humán, emlős) már sikerrel alkalmazott ROS-kimutatási módszerek adaptálása növényi és egyéb fotoszintetikus rendszerekre. A ROS-molekulák még intenzív stressz közben is rendkívül alacsony koncentrációban keletkeznek, és legtöbbjük keletkezésének helyén reagál a biológiai membrán különböző oxidálható komponenseivel vagy semlegesítődik a természetes antioxidánsok által. Így olyan riportermolekulákat kell a vizsgált mintákba juttatni, amelyek egyrészt eredményesen versenyeznek a fenti reakciókkal, elhalászva ezek elől a ROS egy részét, másrészt a ROS-sal reagálva jellegzetes, jól mérhető átalakulást szenvednek. Ez a munka a fénygátlásban feltételezett szerepű szingulett oxigén kimutatására alkalmazható ESR spincsapdázási módszer kifejlesztésével indult, amelynek során Hideg Éva a POTE munkatársaival együttműködve sikeresen adaptálta az orvosbiokémiai oxidatív stresszkutatás módszereit fotoszintetikusan aktív, izolált tilakoid membránok fotoinhibíciós stresszének vizsgálatára. A módszerek módosítására azért volt szükség, mert a kloroplasztisz membránok extrémebb redox, ph tartományban, magasabb oxigénkoncentráció mellett működnek, mint az állati szövetek, ami kedvezőtlenül befolyásolhatja a ROS-csapdák stabilitását. Gyökcsapdák segítségével, az ezekből ROS által képzett adduktok elektron spin rezonanciás (ESR) spektrumait mérve elsőként tudták igazolni azt a hipotézist, mely szerint az akceptor oldali fotoinhibíció során szingulett oxigén keletkezik a tilakoid membránokban. Ez a munka a növényi fotooxidatív stresszel foglalkozó kutatási terület meghatározó jelentőségű, sokat hivatkozott közleményévé vált. További, szintén izolált tilakoid membránokkal végzett kísérletekkel igazolták,

163 hogy a donor oldali fotoinhibíció, illetve a nm hullámhosszúságú ultraibolya (UV-B) sugárzás szintén ROS-formák által közvetített módon, ám az akceptor oldali fotoinhibícióétól eltérő mechanizmussal okoz oxidatív károsodást. Különböző ROS-specifikus csapdák alkalmazásával, ezek egymástól eltérő jellegzetes ESR válaszai alapján feltérképezték a különböző fénystressz-mechanizmusok ROS-lenyomatait. A fénystressz oxidatív hatásainak vizsgálatát az izolált membránok után in vivo, levélrendszerekre is kiterjesztették. Ez azért jelentett a korábbinál nagyobb kihívást, mert az ESR technikával kimutatható gyökcsapdák, illetve oxidált adduktjaik stabilitása a komplexebb mintákban túl kicsinek bizonyult ahhoz, hogy ezt a módszer alkalmazható legyen. A 90-es évek második felében, egy hazai együttműködés keretében a PTE ÁOK Szerves és Gyógyszerkémiai Intézet munkatársai által kifejlesztett szingulett oxigén specifikus fluoreszcens csapdát használták sikerrel a levelek fotoinhibíciójának vizsgálatában, és ennek segítségével elsőként adtak közvetlen kísérleti bizonyítékot a szingulett oxigén in vivo keletkezésére ezekben a mintákban. A laboratóriumi körülmények között végzett, az oxidatív stressz elsődleges lépéseit célzó alapkutatási kísérletek mellett a természetes környezeti körülményeket jobban megközelítő, a szabadföldi alkalmazások felé mutató vizsgálatokat is végeztek dohány-, árpa-, szőlő- és búzaleveleken. Azt tapasztalták, hogy a ROS védelmi utak természetes (különböző fajtákban kifejlődött), illetve mesterséges (transzgenikus növényekben elért) megerősítése jelentősen javíthatja a növény kedvezőtlen környezeti hatásokra adott válaszait. Legújabb kísérleteik a ROS károsító hatása mellett az alkalmazkodási, stresszvédelmi utak indukciójában játszott szerepét vizsgálják. A ROS stresszválaszokban játszott szerepe az 5. ábrán foglalható össze. A jelen és jövő kutatási irányai Az elmúlt 40 év során az itt összefoglalt témában a korábbi Fotoszintézis és a jelenlegi Molekuláris Stressz- és Fotobiológiai Csoport munkatársai 380 publikációt közöltek, túlnyomórészt nemzetközi tudományos folyóiratokban, amelyekre több mint 5200 független hivatkozást kaptak, ami egyértelműen mutatja az SZBK-ban a PSII szerkezet-funkcióval és a fotoszintézissel összefüggő növényi stresszel kapcsolatos kutatások nemzetközi súlyát és elismertségét. Ezt az elismertséget tükrözi az is, hogy ban Garab Győző vezetésével az intézet munkatársai szervezhették meg a több mint 1200 résztvevőt Budapestre vonzó Nemzetközi Fotoszintézis Konferenciát, amihez csatlakozóan a Molekuláris Stressz- és Fotobiológiai Csoport Szegeden egy fénystresszel foglalkozó szatellita konferenciát is szervezett. A fotoszintéziskutatások terén az utóbbi években hangsúlyosan előtérbe került a fotoszintetikus folyamatok hasznosítása megújuló energiatermelésre. Ennek a fontos problémának a vizsgálatába a Növénybiológiai Intézet számos csoportja bekapcsolódott. A Molekuláris Stressz- és Fotobiológiai Csoport ilyen irányú kutatásai elsősorban a hidrogéntermelésre képes cianobaktériumok fotoszintetikus és metabolikus folyamatainak összefüggésére, valamint a hidrogenáz enzim alegységeit kódoló hox gének oxigén- és fényfüggő szabályzásának vizsgálatára irányulnak. Megkezdték továbbá a fotoszintetikus és az azzal kölcsönhatásban álló respirációs elektrontranszport-folyamatok modellezését a bioinformatika és rendszerbiológia eszköztárának felhasználásával. E munka célja olyan virtuális fotoszintézis-modellek megalkotása, amelyek a már ismert jelenségek leírásán túl alkalmasak in silico fotoszintézis-kísérletek végzésére is, amelyek lehetővé teszik a gyakorlatban nehezen kivitelezhető és/vagy idő- és eszközigényesen megvalósítható kísérleti körülmények ellenőrzését. Növénybiológia 5. ábra. Reaktív oxigénszármazékok (ROS) és a keletkezésüket megelőző, ill. hatásaikat csökkentő védelmi utak egyensúlya (a), ennek felborulása (b, c) és lehetséges helyreállása (d) Vass Imre és Hideg Éva 163

164 Növénybiológia NÉGY ÉVTIZED A FOTOSZINTÉZIS-KUTATÁSBAN. MEMBRÁNOK ÉS PROTEINKOMPLEXEK ÖNSZERVEZŐDŐ RENDSZEREI 164 Miért fotoszintézis? A fotoszintézis mintegy három és fél milliárd éves története sikertörténet. A fényenergia-hasznosítás találmányára alapul a földi élet szinte valamenynyi ma ismert formája: közvetve vagy közvetlenül a fotoszintézis látja el táplálékkal a teljes élővilágot. A légköri széndioxidból, az elnyelt fény energiáját felhasználva, energiában gazdag szerves molekulák szintézise révén nemcsak a földi élet energetikai alapjait teremtette meg és tartja fönt ma is, de a fotoszintézisnek köszönhetjük az oxigénben dús légkör és így az ózonpajzs létét is. A fosszilis energiahordozók is fotoszintézis eredetűek ezek adják a ma felhasznált energia ~80 %-át. A fosszilis energia nagymértékű felhasználása, és így a széndioxid légkörbe bocsátása azonban környezeti katasztrófához vezethet. Ezért a fosszilis energiahordozókat nagy mennyiségben rendelkezésre álló, reális időtávon belül technológiailag elérhető, környezetkímélő energiahordozókkal kell kiváltani. Erre megfelelően átalakított fotoszintetikus szervezetek vagy azok bio-inspirált műszaki utánzatai tűnnek alkalmasnak, hiszen a megújuló energiaforrások közül a napfény energiája szinte korlátlan mennyiségben rendelkezésünkre áll. A fotoszintéziskutatások ezért a természetben lejátszódó folyamatok minél teljesebb megismerését és a mesterséges megvalósítás módjainak feltárását célozzák. A fotoszintézis folyamatainak tanulmányozása azonban ezeken túlmenően is több szempontból érdekes és különleges. A fotoszintetikus szervezetek mindenekelőtt színesek, a szó szoros értelmében. A fény elnyeléséért felelős pigmentek természetben előforduló sokfélesége és színei szemet gyönyörködtetőek, és persze különösen érdekesek és értékesek egy spektroszkópia iránt érdeklődő kutató számára, aki az élő anyag csodálatra méltó szerveződését szeretné megismerni és leírni a spektroszkópia eszköztárát felhasználva. Ha a fotoszintézis folyamatait időskálára vetítjük, szűken számolva is több mint 20 nagyságrendet kell áttekintenünk. A fotoszintézis a fény elnyelésével és az elnyelt gerjesztési energiából keletkező gerjesztési energia továbbításával kezdődik. Ezt egy (a molekuláris méretekhez mérten) kiterjedt fénybegyűjtő antennarendszer végzi, amelyen belül femto- és pikoszekundumos folyamatok révén jut el a gerjesztési energia a fényenergia átalakítására szakosodott fotokémiai reakciócentrumokba. Ezt a fotofizikai szakaszt még mindig nagyon gyors, a néhány pikoszekundumtól a néhány nanoszekundumig terjedő tartományban lejátszódó ún. fotokémiai folyamatok követik, amelynek során a fényenergia felhasználásával, a fotokémiai reakciócentrumokban töltésszétválasztásra kerül sor. Ezt mikro- és milliszekundumos időskálán lejátszódó kémiai (redox) folyamatok követik; ezek során szintetizálódnak az elsődleges termékek, a széndioxid redukciójához szükséges redukáló erőt, ill. az energiát hordozó két molekula, a NADPH, ill. az ATP, de ebben a szakaszban termelődik az oxigén is a víz enzimatikus hasításának következtében. Ezek a folyamatok kettősréteg szerkezetű lipid membránokban (vagy közvetlenül azokhoz kapcsoltan) játszódnak le. A tilakoid membránrendszer biztosítja a teljes, önszerveződő apparátus összehangolt működését. Az ezt követő, sokkal lassabb szakaszok sem kevésbé érdekesek és fontosak, hiszen ezekben a biokémiai és élettani szakaszokban szintetizálódnak a szerves anyagok és ezen az időskálán játszódnak le fontos anyagcserefolyamatok és a környezeti tényezők változásaira adott válaszreakciók. Ha valaki a fotoszintézis biogeokémiai ciklusaival és a bioszférára gyakorolt hatásaival foglalkozik, nagyságrendekkel kell bővítenie az időskálát, de ezekben is igaz, hogy a folyamatok megértéséhez ismerni kell az akár 30 nagyságrenddel gyorsabb reakciók természetét is.

165 Fotofizikai reakciók A fény abszorpciója, és a gerjesztési energia vándorlása ~ s komplexek A fotoszintézis blokkdiagramja Fotokémiai reakciók Töltésszétválasztás, redox reakciók, NADPH, ATP, O2 ~ s tilakoid membrán Biokémiai reakciók CO2 fixálás, jelátvitel, rövidtávú szabályozások ~ s kloroplasztisz Növényélettan Szintézis, önszerveződés, javítás, szállítás, szabályozás ~ s növény Egyedfejlődés Ökológia Evolúció ~ s ökosziszt., bioszféra Sematikus ábra a fotoszintézisben szerepet játszó legfontosabb alkotó elemek (lipid, fehérje és pigment molekulák) elhelyezkedéséről a tilakoid membránban (Ernst: Bevezetés a Biofizikába, Akadémiai Kiadó 1968) és négy évtizeddel (és többek között négy Nobel díjjal) később (irodalmi adatok alapján). A Fotoszintézis Munkacsoport kezdeti évei; az SZBK mikroklímája Feltételezhetően ilyen gondolatok vezethették Faludi-Dániel Ágnest 1971-ben arra, hogy az SZBKban elindítandó munkacsoportjában kiváló fiatal biológus munkatársa, Horváth Gábor és az akkor már a munkacsoportban dolgozó fiatal tehetséges fizikus, Demeter Sándor mellé még egy frissdiplomás fizikust, a jelen fejezet szerzőinek egyikét (GG) szerződtesse. Ez korántsem volt kockázatmentes egyik fél részéről sem, hiszen kezdetben legalábbis a közös nyelv megtalálása is gondot okozott, ti. a biológusok és a fizikusok közt. Egyik oldalról rendelkezésre állt egy rendkívül impulzív és sokoldalú tapasztalat a biológiai mintáról, de a problémafelvetés (a pályakezdő) fizikusok számára is érthető és megvalósíthatónak tűnő prezentálása nem volt könnyű, a másik oldalon pedig évek teltek el, amíg biológus szemmel is érdekes és fizikus kezekkel és fejjel (és a rendelkezésre álló viszonylag szűkös eszközökkel) megoldható problémák megoldásáig eljutottunk. Szerencsére Ágnes és Gábor nyitottsága a biofizikai módszerek iránt és a fokozatosan (és jelentős részben saját építés révén) bővülő műszerpark nagymértékben megkönnyítette az átállást, a közös nyelv, majd pedig a saját kutatási területek kialakítását. Az eredmények végül is igazolták a megközelítés helyességét és a türelmet. Növénybiológia A fotoszintézis-kutatások szépsége talán éppen ebben sokszínűségükben, több diszciplinát felölelő, sokfajta tudást igénylő, a legváltozatosabb módszereket igénybevevő jellegükben van. Egyáltalán nem tekinthető véletlennek az, és a fentiek tükrében könnyen érthető, hogy ezen a területen elméleti fizikusoktól méréstechnikai fejlesztő mérnökökig, molekuláris biológusoktól ökológusokig, lézerspektroszkópusoktól krisztallográfusokig, reakciókinetikai szakemberektől membránbiológusokig, mikrobiológusoktól oceanográfusokig, fotobiológusoktól agrárszakemberekig szinte minden területen találunk fotoszintézis-kutatással vagy azzal is foglalkozó szakembereket, akik és ez legalább annyira fontos számon tartják egymás munkáját, gyakran merítenek ötleteket egymás eredményeiből, együttműködnek egymással. Faludi-Dániel Ágnes Mindebben sokat segített az intézet érték- és teljesítményközpontú, szabad, alkotó légköre, amelynek kialakításában Straub F. Brunó, Farkas Gábor és Garay 165

166 Növénybiológia 166 András szerepe még korai távozásuk után is évtizedekre meghatározó volt. A légkör fenntartását a pályájukat lényegében vagy ténylegesen az SZBK-ban kezdő ambiciózus, egymás munkája után érdeklődő, egymás haladását segítő, egymást inspiráló fiatal kutatók nagy száma eleve biztosította első főigazgatónk, Straub F. Brunó által gyakorta emlegetett kritikus tömeg és szinergikus kölcsönhatások révén. Bár látszólag függetlenül működtek az egységek, a kutatócsoportok egymásra hatása sokkal jelentősebb volt és jelentősebb még ma is, mint azt bármilyen tudománymetriai módszerrel fel lehetne mérni. A molekuláris szemlélet igénye a kezdetektől a mai napig hat. A Biokémiai Intézetben folyó membránkutatások alapvetően meghatározták a tilakoid membránok kutatását és mai napig befolyásolják azt. A Biofizikai Intézet bioenergetikai munkái, az a sokoldalú méréstechnikai és elméleti fizikai ismerethalmaz és a kollégák segítőkészsége biztos hátteret adott és ad a fotoszintézis kutatásokhoz is. A teljesítményt elváró és az azt értékelő, a körülményeket biztosító vezetés, a folyamatos szemináriumi beszámoltatás rendszere, a külföldi konferenciákon való részvételek is fontosak voltak. A negyven évre visszatekintve, és az SZBK sikerének zálogát keresve meg kell említeni a kisegítő személyzet munkáját is. Legtöbben rangnak érezték, hogy ebben az intézetben dolgozhattak. A rajzok és poszterprezentációk igényes kiállítását Dusha Bélának köszönhetjük ő csak és kizárólag szép munkát volt hajlandó kiadni a kezéből. Fontos itt megemlíteni a Műhely szerepét: László Lajos, Gárgyán József, Ábrahám Tamás és Jókuti Ferenc elektronikai tervezései nélkül, és precíz, ügyes kezű technikusok, Nagypál György, Bonyecz István, Vass Sándor, Buda Sándor, Gazsó József, Imre Zoltán, Kasza György és Csepely Csaba közreműködése nélkül nagyon sok munka el sem kezdődhetett volna. Csak emlékeztetőül, a ma már ismeretlen devizás beszerzési, netán embargós korlátok miatt, a műszerépítéseknek és egyedi tervezéseknek sokkal nagyobb jelentősége volt az első közel két évtizedben, mint manapság. Ez persze sokszor versenyelőnyt is jelentett, leszámítva a műszerépítésre fordított időt és energiát. A pozitív légkört tovább erősítették a gyorsan kialakuló barátságok, közösségek. Ebben (persze erősen szubjektív véleményem szerint) fontos szerepet töltött be az SZBK élénk sportélete is, a saját (és jelentős részben saját magunk építette) kispályás focipályánkon a heti rendszerességgel folyó (komoly) derbik, az intézetek közti tornák, mérkőzések a kutatók és nem kutatók között, a sikeres szereplések az egyetemi bajnokságban, MTA és más országos kupákban, vérre menő pingpongcsaták, kiváló eredmények a sakktornákon. Voltak spontán szerveződő farsangok, Mikulás-bulik, rendszeres intézeti teák és úti beszámolók. Mindehhez társult egyfajta (a 70-es 80-as években fontos, az akkori viszonyokhoz illeszkedő) egzisztenciális biztonság (a kutatólakások biztosítása, a külföldi utak adta anyagi biztonság), a (magyar viszonyok közt) jelentős lehetőségek megnyílása. Kezdetben különösen a UNDP támogatásával valósultak meg a külföldi tanulmányutak és a külföldi szakemberek látogatása, az ITC hallgatók érkezése és a műszerbeszerzések és -építések. Mindezek eredményeként, az SZBK alig egy évtized alatt (ahogy ezt most utólag a mi generációnk is megállapíthatja) felkerült a térképre, és ezzel együtt az SZBK-ban folyó fotoszintézis-kutatások is fokozatosan ismertek, nemzetközileg is elismertek lettek. Ezeknek is, és a hazai kutatások fellendülésének is köszönhető, hogy a KGST munkaértekezletektől, az amerikai-magyar Fotoszintézis Konferenciát érintve, eljuthattunk a Nemzetközi Fotoszintézis Kongreszszus megrendezéséig, a részvételig az ESF Biophysics of Photosynthesis programjában és EU FP programokban, ESF és IUPAB iskolák rendezéséig - szinte mindegyik esetben elsőként vagy egyedüliként a régióból. A 70-es években elsősorban spektroszkópiai (cirkuláris dikroizmus, mélyhőmérsékletű fluoreszcencia, abszorpciós spektrometria és szelektív fényszórás) technikák segítségével, elektronmikroszkópiás és elektrontranszport mérési, valamint analitikai/biokémiai módszerekkel kiegészítve vizsgáltuk a pigmentrendszer és a tilakoid membránok felépítését. A membránrendszer kialakulása során követtük a spektroszkópiai és funkcionális jellemzők változásait különösen a zöldülés során az ún. C4-es növényekben (adott esetben kukorica csíranövények levelein). Ez a rendszer azért volt érdekes, mert ezekben a levelekben a kloroplasztiszok membránszerkezete eltér az ún. mezofill és hüvelyparenchima sejtállomány-

167 ban. A csoport ezen a területen elért eredményeit, amelyek elsősorban Faludi-Dániel Ágnes és Horváth Gábor nevéhez fűződnek, a szakma elfogadta, befogadta; több munkájukat/munkánkat ma is idézik. Köszönhető ez főként Gábor és Droppa Magdolna, Gábor felesége és közvetlen munkatársa szisztematikus munkájának a későbbi évek során is. Magdi a 70-es évek második felében csatlakozott a csoporthoz. Gábor később saját csoportot alakított, figyelme a fotoszintézis stresszfiziológiai aspektusaira irányult, majd a Kertészeti Egyetemen (ma Szent István Egyetem) megalapította és haláláig vezette a Növényélettani Tanszéket. Horváth Gábor Demeter Sándor A szerkezet és a funkció közötti összefüggés keresése kezdetektől fogva a mai napig foglalkoztat mindannyiónkat. A mezofill-hüvelyparenchima kloroplasztiszok különbsége ugyanazon levélen, egymástól néhány mikrométeres távolságban ezért is volt érdekfeszítő, és azért, mert a membránanatómiai különbséget nem a széndioxid-fixálás reakcióútjainak ismert különbsége, hanem a metabolikus utakat kiszolgáló fényreakciókhoz köthető különbségek magyarázzák, amint azt a csoport eredményei is bizonyították, nevezetesen, hogy ezek a kloroplasztiszok nem tartalmaznak aktív második fotokémiai rendszert. Ugyancsak fontosak voltak Ágnes azon munkái, amelyekben a karotinoidok membránstabilizáló hatásaira vonatkozóan tett máig érvényes, fontos megállapításokat. Ágnes akadémiai doktori értekezése Karotinoidmutáns kloroplasztiszok összehasonlító élettana (1973) is ezzel foglalkozott, és megállapította, hogy a karotinoid-deficiens plasztiszokban a 2. fotoszisztéma szerkezeti stabilitása alacsonyabb, mint a normális plasztiszokban. A karotinoid-összetétel rendellenessége az 1. fotoszisztéma szerkezeti stabilitását kevésbé érinti. Ezen következtetések pontosabb, molekuláris szintű megértése mára, a komplexek közel atomi felbontású szerkezetének ismeretében válik igazán mélyebben érthetővé, ahogy arra ugyanebben a fejezetben még visszatérünk. A 70-es évek végén kezdődtek meg a termolumineszcenciás munkák, amelyekben Sándor úttörő munkásságát kell kiemelni ezek többségét már saját munkacsoportjában végezte ben írt akadémiai doktori értekezésének címe, A kloroplasztiszok és kloroplasztisz membránok termolumineszcenciája is arról tanúskodik, hogy ezen a területen sokrétű és alapos munka folyt, ami nagyban hozzájárult ahhoz, hogy a termolumineszcencia ma a fotoszintézis-kutatások egyik rutin módszere. Az SZBK növekvő presztízsének és persze a UNDP támogatásnak is köszönhetően ebben az időben több olyan ITC hallgató is dolgozott itt, akik mára vezető kutatók, ill. egyetemi professzorok lettek: Grazyena Bialek (Poznani Műszaki Egyetem), Jirí Masojídek (Mikrobiológiai Intézet, Trebon, Cseh Köztársaság), Peter Knox (Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország), Fodorpataki László (Babes-Bolyai Egyetem, Kolozsvár), Turcsányi Gábor (Szent István Egyetem, Gödöllő). Az intézetben a 70-es években szinte mindenki használta a protoplaszt-izolálás technikáját, elsősorban növényregenerációs és molekuláris biológiai eszközként. Ágnes és Gábor kezdeményezésére ezzel a technikával sikerült intakt kloroplasztiszokat izolálni, amelyekben a fényindukált elektromos tér fel- Növénybiológia 167

168 Növénybiológia 168 épülésének pontosabb követése vált lehetővé. Ez az ún. transzmembrán elektromos tér a fényindukált töltésszétválasztás következménye, ill. az ATP- szintézishez szükséges energizált membránállapot fontos jellemzője a technikát, az akkor épített, közben némileg modernizált készüléket ma is használjuk. Az elektromos tranziens jelenségek mélyebb értelmezésére Zimányi László, fizikus diplomandusz majd doktorandusz vállalkozott. Laci később a Biofizikai Intézetben bontakoztathatta ki tehetségét. Ugyanezen technikák egy másik kombinációja révén Márton Lászlóval (ma a University of Carolina professzora) együttműködve ismertük föl, hogy a klororespiráció magasabbrendű növényekben is jelen van, és általában a légzési és a fotoszintetikus elektrontranszport-láncok szorosan együttműködnek a sejten belül. A jelenséget Claudia Büchellel együtt vizsgáltuk részleteiben, különböző algafajokon Claudia szegedi látogatásai során (hivatalosan, ITC hallgatóként). Claudia ma a Frankfurti Egyetem professzora. Ebben a munkában korábban egy másik ITC hallgató, Asim Kadiouglu, is részt vett, aki ma a Trabzoni Egyetem professzora. A csoport munkájára visszatekintve, érdekes látni, hogy egy-egy téma milyen hosszú ideig érlelődik, mire megoldódik (vagy megoldódni látszik), vagy hogy ugyanaz a kérdés újra és újra fölbukkan, esetleg más és más alakban vagy összefüggésben, és vezet újabb és újabb megoldandó feladatokhoz. Ezekből válogatunk az alábbiakban egy kicsit önkényesen. Az aszkorbát, mint a vízbontó enzimet helyettesítő elektrondonor Az elektrontranszport-vizsgálatok a munkacsoportban a 80-as évek után hosszú ideig szüneteltek, legalábbis a felfedező jellegű munkák. Egészen az utóbbi évekig, amikor is Tóth Szilvia Zita a hőstressz hatását vizsgálva fel nem tárta, hogy az oxigénfejlesztő apparátus eltávolítása után, hőkezelés hatására növényekben és zöld algákban az aszkorbát elektrondonorként viselkedik, ami egy korábban nem ismert növényi védekező mechanizmus része. Ez az aszkorbát szerepét is új megvilágításba helyezi. Aszkorbát, Rendezettség a tilakoid membránokban és a biológiában Régóta ismert tény, hogy a fotoszintetikus energiaátalakítás csak akkor lehet hatékony, ha a festék-, fehérje- és lipidmolekulák alkotta ún. antennarendszer képes arra, hogy a beérkező, általában alacsony energiasűrűségű, diffúz fény fotonjait begyűjtse, és a reakciócentrumokba irányítsa. Ez csak magasan szervezett molekuláris rendszerben, ill. a teljes energiaátalakító apparátust tartalmazó membránrendszer nagyfokú rendezettsége mellett képzelhető el. Lényegében a 70-es évek elején kezdődtek meg azok a szisztematikus vizsgálatok, amelyek arra a kérdésre keresték a választ, hogy a korábban leírt optikai polarizációs megfigyelések valós anizotróp molekuláris felépítésből vagy egyszerűen csak artefaktumokból származnak. A kérdés a 80-as évek közepére dőlt el, munkacsoportunk aktív és hatékony közreműködése mellett. Bizonyítható volt, hogy ez a tulajdonság, a pigmentmolekulák (pontosabban ezek emissziós és abszorpciós dipólusai) minden ismert fotoszintetikus szervezetben, membránban és pigment-protein komplexben nem véletlenszerűen, hanem jól meghatározott orientációs pozícióban helyezkednek el. Ez tehát egy univerzális tulajdonság amely megállapításhoz munkacsoportunk is jelentős eredményekkel járult hozzá (mások mellett az azóta az orvosi fizika területén is jó nevet kivívó Kiss József Géza diplomandusz majd doktorandusz közreműködésével és a Puscsinói Fotoszintézis Intézetből érkező, ma már a University of Michigan-ben dolgozó Alexander Ganago segítségével). A rendezettség élettani szerepe is jól ismert. A jellemzők több komplexben ma már krisztallográfiai adatokból is meghatározhatók ilyen rendezettség nélkül a gerjesztési energia vándorlásának hatékony-

169 sága és veszteség nélküli továbbítása nem lenne lehetséges; a paraméterek pontos ismerete az ultragyors folyamatok leírásához is nélkülözhetetlen. A molekuláris rendezettség meghatározásának a fotoszintetikus membránokban és komplexekben jól kidolgozott módszerei vannak az anizotróp felépítés meghatározása ma a fotoszintézis kutatások biofizikai módszereinek egyik standard módszere (pontosabban, módszeregyüttese), amelyet a mesterséges fotoszintézis-kutatások során is alkalmaznak és alkalmazunk. A molekuláris rendezettség feltehetőleg ugyanilyen általános érvényű lehet más biológiai mintákon. Annak megállapítása, hogy mekkora rend uralkodik egy sejtben, ill. sejtalkotókban és milyen rendezett struktúrák alakulnak ki különböző körülmények között, és azoknak mi az élettani szerepe, még várat magára. A kérdés megoldásához közelebb visz az a szabadalmaztatott és rangos innovációs kiállításokon több díjat nyert berendezés, a differenciál-polarizációs lézersugárpásztázó konfokális mikroszkóp (DP-LSM), amelyet főként spin-off cégekkel és kiváló fizikus kollégákkal, Pomozi Istvánnal és Steinbach Gáborral együtt építettünk. A DP-LSM több érdekes biológiai mintán, köztük kloroplasztiszokon, amiloidokon és más proteinaggregátumokon, limfocitamembránokon, aktinalapú struktúrákon, növényi sejtfalakon és izolált cellulózszerkezeteken, mesterséges fénybegyűjtő nanorudakon tárta föl az anizotrópia más módszerekkel nem mérhető, fontos szerkezeti jellemzőit. Az evolúció egy viszonylag kései, mindössze néhány száz millió éves, de rendkívül sikeres terméke a gránumos kloroplasztisz. Ez a szerkezet a bioszféra legelterjedtebb, de egyúttal talán az egyik legbonyolultabb háromdimenziós membránrendszere. Ennek megismerése alapvető fontosságú a fényenergia-hasznosítás mechanizmusainak megértéséhez. Annál is inkább lényegesnek tűnik ez, mert néhány fontos regulációs mechanizmus működése is kötődik a gránumos membránszerkezethez. A kérdéskör megoldása csak látszólag anatómiai és az sem egyszerű. Sorozatmetszeteken végzett és pásztázó elektronmikroszkópos munkáival Mustárdy László (aki 1974-ben csatlakozott a Fotoszintézis Csoporthoz) már ben alátámasztotta az akkor és még sokáig kétségekkel fogadott ún. helikális gránummodellt, de az irodalmat és a tankönyvek oldalait még több mint két évtizeddel később is az ettől alapjaiban eltérő, hibás modellek uralták. Az áttörést végül 2008-ban sikerült elérnünk: elektrontomográfiás vizsgálatok egyértelműen igazolták, később ezt mások is megerősítették, hogy a helikális membránmodell alapvetően helyesen írja le a membránszerveződést; természetesen a részleteket illetően ezek a felvételek számos pontban eltértek az egyszerűsített, idealizált modelltől. A gránumos szerkezetű kloroplasztisz és a gránum-sztróma tilakoid membránrendszer idealizált modellje Növénybiológia Növényi sejtfal fluoreszcencia-intenzitás és anizotrópiás (FDLD) konfokális képei A 3D membránszerkezet, domén-szerveződések A membránok ilyen különleges szerveződésének a megértéséhez segítségünkre sietett a cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia, ami különösen gránumos kloroplasztiszokban a 70-es évek óta rejtélyes tulajdonságokkal, magas intenzitású, anomális alakú és differenciális szórással kísért sávokkal vívta ki érdeklődésünket (és több neves spektroszkópus műtermékre gyanakodó ellenszenvét). A spektrumok talán legérdekesebb sajátsága nemadditív voltuk: az egész több mint a részeik összege. Ilyen komplex szerkezetek általában is érdeklődésre tartanak számot, hiszen egy magasabb szerveződésű struktúra létére is utalhatnak, ha az artefaktumok felléptét ki lehet zárni. Az áttöréshez itt is több mint egy 169

170 Növénybiológia évtizedre volt szükség. Sikerült bebizonyítani, hogy ezek a különleges tulajdonságok nem a fényszórás torzító hatásából származnak, hanem jól körülhatárolható fizikai tartalommal bírnak. Nevezetesen, ahogy azt az ilyen, ún. psi-típusú biológiai aggregátumokra (pl. kromoszómák, sejtmag) leírt elmélet értelmezte a 80-as évek végén, ezek a psi-típusú jelek néhány száz nanométer átmérőjű, nagy pigmentsűrűségű, királisan szervezett, kiterjedt aggregátumok jelenlétét bizonyítják (psi, polimer vagy sóindukált). Az elmélet egyik fontos feltevését is igazolva, sikerült értelmeznünk a rendhagyó CD jeleket, és összefüggésbe hozni alapvető regulációs és ultragyors fotofizikai folyamatokkal. Mindebben a tehetséges fizikus, Virgnijus Barzda, ITC majd PhD hallgató szerepét kell kiemelnünk, aki ma a Torontói Egyetem Fizikai Intézetének profeszszora. A psi-típusú CD spektroszkópia azóta újabb alkalmazási területeket talált különböző algacsaládokban és mutáns leveleken is (Kovács László jóvoltából), amely ismeretek hozzájárulnak a makroszerveződés jelentőségének és szabályainak megértéséhez. Mindazonáltal a psi-típusú CD elméleti leírásának pontosítása továbbra is fontos feladatunk marad. A makrodomén-szerveződés alapján lehetett megérteni azt, hogy miként és miért válik szét az egyébként összefüggő membrán rendszert alkotó gránum- és sztróma membránok között a két fotoszisztéma, amelyek ráadásul az elektron transzport láncon keresztül sorba vannak kapcsolva (szétválasztásuk ezért legalábbis nem triviális). A választ a domén képződés, a második fotokémiai rendszer, és különösen az azt borító fénybegyűjtő komplex (az LHCII) önaggre gációs képessége adja meg, ez a kulcsa a két fotoszisztéma laterális szétválasztásának, ami a grá nu mos membránszerveződés alapja. A szerkezeti flexibilitás új fizikai mechanizmusa A makrodomének szerkezetváltozásainak vizsgálata és a folyadékkristályok irodalmából vett analóg jelenség vezetett el egy korábban nem ismert effektus, ill. a biológiai termo-optikai mechanizmus fölfedezéséhez, amiben Virgisen kívül diplomandusz/doktorandusz hallgatóként Cseh Zoltán, ITC hallgatóként Rajagopal Subrimanian (ma a Hyderabadi Egyetem professzora), valamint Ilian Simidjiev aspiráns (az iparban dolgozik) vállaltak kulcsszerepet. A termooptikai mechanizmus során a fotoszintézisben nem hasznosuló gerjesztési energia disszipációjából eredő ultragyors, lokális hőcsomagok elemi szerkezetváltozásokat okoznak a disszipáció közvetlen közelében található beépített termikusan instabil szerkezeti elemekben. Ilyen szerkezetváltozások részt vesznek a növények fény- és hőmérsékleti adaptációs folyamataiban, és amint azt más laboratóriumokban megállapították fontos enzimatikus (foszforilációs és proteolitikus) regulációkat is befolyásolnak. A fizikai mechanizmus részleteinek feltárása ultragyors (fs-ps) folyamatok követésével válik lehetővé. Ebben Petar Lambrev és Yuliya Miloslavina ezirányú szakértelmére és együttműködő partnereink segítségére számíthatunk. A membránszerkezet meglepően nagyfokú flexibilitását pedig európai nagyműszereken (szinkrotronokon, neutronos mérőberendezéseken) követjük egy fiatal tehetséges fizikus doktorandusz, Nagy Gergely közreműködésével. 170

171 A nem-kettősréteg lipidek szerepe a kettősréteg-szerkezetű tilakoid membránokban A kloroplasztiszok tilakoid membránjai, csakúgy mint az energiakonvertáló biológiai membránok, legnagyobb koncentrációban olyan lipideket tartalmaznak, amelyek vízben spontán nem képesek kettősrétegekbe szerveződni. Ezeknek az ún. nem-kettősréteg lipideknek a szerepe azért különösen érdekes és ellentmondásos, mert jól ismert, hogy ezek a lipidek is, a lamellaképző lipidekkel együtt, a kettősréteg-szerkezetű membránok alkotórészei; továbbá a kettősréteg-szerkezet hiányában az energiakonverzió sem képzelhető el. Ezeknek a lipideknek a szerepére a kettősréteg-szerkezetű biológiai membránokban azt a hipotézist állítottuk föl, hogy ezek éppen szegregációs képességüknek köszönhetően képesek szabályozni a membránok proteintartalmát. Ugyanis a lipidek magas nemlamellaképző hajlama, azaz a felesleges lipidek nagyfokú szegregációs készsége akadályozza meg a membránok kihígulását. Ugyanakkor, mivel a proteinek révén lehetséges további lipidek beépülése a membránba, feltételezhető az is, hogy ily módon ezek a lipidek a membránnal asszociálódva egyfajta transzmembrán irányú dinamikát biztosítanak a rendszernek. Az utóbbi években, elsősorban Sashka Krumova szisztematikus munkájának köszönhetően, sikerült bizonyítékokat találnunk ennek a hipotézisnek az alátámasztására. (Sashka ITC hallgató, majd doktorandusz volt az SZBKban, ma a Szófiai Biofizikai Intézet munkatársa). A lipidfázisok természetének és élettani szerepének tisztázása további kutatások tárgya. A Növénybiológiai, korábban Növényélettani Intézetben Farkas Gábor vezetésével, Ruzicska Péterrel kezdtük el a dohánymozaik-vírus (TMV) membránokra kifejtett hatását vizsgálni. Megállapítottuk, hogy a vírus hatására bekövetkező nekrotikus tünetek hátterében a membránok lipid- és zsírsavösszetételének megváltozása áll, amely változások elvezethetnek a sejthalál állapotához. TMV okozta nekrotikus tünetek dohánylevélen A cianobakteriális fénybegyűjtés tanulmányozása A fotoszintetikus membránok szerkezetének tanulmányozásához modellrendszerként cianobaktériumsejteket választottunk, melyekből elkészíthettük a számunkra szükséges mutánsokat. A mutánsok előállításához főként a Synechocystis sp. PCC6803 transzformálható sejtvonalat használtuk. Növénybiológia Környezeti stressz hatása fotoszintetikus membránokra A fotoszintetikus szervezetekben a fotoszintetikus folyamatokért felelős apparátus membránokba ágyazva található. A membránokat fehérjék, lipidek, karotinoidok és más, elsősorban hidrofób molekulák alkotják. E molekulák szerkezete és kölcsönhatásaik meghatározzák a membránok szerepét, és a sejtnek a külső környezeti stresszekkel szembeni ellenállóképességét. Egy Synechocystis sejt elektronmikroszkópos képe A cianobaktériumok fénybegyűjtő komplexe a fikobiliszóma, amely fikobiliproteinekből épül fel. A fikobiliszómák a fotoszintetikus membrán felszínéhez tapadva helyezkednek el, működésük felderítéséhez járult hozzá Csatorday Károly munkássága. 171

172 Növénybiológia A Synechocystis fikobiliszómájának sematikus szerkezete Későbbiekben a Biofizikai Intézetben dolgozó Szalontai Balázzsal együttműködésben kidolgoztunk egy, a Raman rezonancia spektroszkópiát felhasználó módszert, amellyel a fikobiliproteinek kémiai szerkezetét tanulmányoztuk. Ezzel az eljárással az akkor még ismeretlen finomszerkezetű fikobilin kromofór molekulák szerkezetét derítettük fel. növényekre, melyekben a foszfatidil-glicerin deszaturáltsága szabályozza az alacsony hőmérsékleti streszszel szembeni védelmet. A fotoszintetikus membránokban jelenlévő lipidek között az egyetlen foszfolipid a foszfatidil-glicerin (FG). Az elmúlt években ennek a lipidnek a strukturális és funkcionális szerepe került kutatásaink középpontjába. Sikerült több foszfolipid-hiányos mutánst előállítani. Ezeknek a mutánsoknak a segítségével igazoltuk, hogy mind az egyes (PSI), mind pedig a kettes (PSII) fotokémiai rendszer összeszerelésében a foszfatidil-glicerinnek meghatározó szerepe van. Igazoltuk, hogy a cianobaktériumokban található PSI trimer szerkezetek kialakításában az FG molekuláknak meghatározó szerepe van. 172 A lipidek és karotinoidok szerepe a működő fotoszintetikus membránok szerkezetének kialakításában A figyelmünk ezután a membránszerkezetet alkotó lipidek, és a lipidekben a glicerinvázhoz észterkötéssel kapcsolódó zsírsavak felé fordult. A kutatásokat a Növényi Lipid Funkció és Szerkezet csoport keretében végeztük Kis Mihály, Domonkos Ildikó és Ughy Bettina társaságában. A csoport munkájához jelentős mértékben hozzájárult két korábbi PhD hallgató, Laczkó-Dobos Hajnalka és Özge Sözer is. Egy japán kutatócsoporttal, Norio Murata irányítása alatt Hajime Wadával együttműködésben izoláltuk és azonosítottuk az első acil-lipid-deszaturázt kódoló gént Synechocystis cianobaktériumban, mely elindította a hasonló gének növényekből történő azonosítását. Miután az ismert, hogy a növények fagy- és hidegérzékenységét a membránjaikban lévő lipidek telítetlensége, deszaturáltsági állapota határozza meg, a növényi acil-lipid-deszaturázok génszintű megismerése lehetővé tette és teszi hidegtűrő transzgenikus növények létrehozását. A hidegtűrésen kívül fontos ismereteket szereztünk a lipidek szerepéről az alacsony hőmérsékleten jelentkező fotoinhibícióval szembeni védelemben is. A cianobakteriális modellel kapott eredményeinket átvittük magasabbrendű A PSI trimer és monomer szerkezete az FG jelenlétében és hiányában Az FG a PSII szerkezetében a reakciócentrum és a CP43 kötődését segíti elő. fg a CP43 kötődése FG Dimerizáció Az FG szerepe a PSII reakciócentrum összeszerelődésében

173 A karotinoidoknak jelentős szerepe van a fotoszintetikus membránok szerkezetének kialakításában, a fénybegyűjtésben, valamint a fotoszintetikus apparátus funkcióiban és ennek védelmében. Vizsgáltuk a karotinoidok mennyiségének és összetételének változását cianobaktérium-sejtekben különböző környezeti stresszek hatására. Megállapítottuk, hogy magas fényintenzitáson nevelt, illetve nitrogénéheztetett cianobaktériumokban a zeaxantin menynyisége megemelkedett, míg az alacsony hőmérsékleten nevelt sejtekben a xantofil mennyisége nőtt. A membrán lipidösszetételének megváltozása is hatással van a karotinoidok felhalmozódására. A mixoxantofil és az echinenon megnövekedett menynyisége az FG-hiányos sejtekben arra utal, hogy az FG szerepet játszik a karotinoidszintézis szabályozásában. Létrehoztuk az első karotinoidmentes oxigénfejlesztő prokarióta mutánst. A lenti ábrán mutatjuk be a cianobakteriális karotinoidok bioszintézisét. A β-karotin molekulák elhelyezkedése a PSII reakciócentrumban A PSI centrumokban is fontos szerkezeti elemek a karotinoidok, melyek hozzájárulnak a reakciócentrum működéséhez. A PSI komplexben elhelyezkedő karotinoidmolekulákat a lenti ábrán mutatjuk be. Növénybiológia Karotinoidok a PSI trimerképző doménjében A cianobakteriális karotinoidok bioszintézise. Az ábrán kék színű vonallal jelöltük a bioszintézis-út gátlását a mutánsban. A működőképes PSII szerkezetének kialakításában a karotinoidoknak fontos szerepük van. A karotinmentes törzs rendkívül fényérzékeny, és nem található benne működőképes PSII reakciócentrum, valamint az ehhez szükséges fehérjék szintézise is gátolt. Garab Győző és Gombos Zoltán 173

174 Növénybiológia A NÖVÉNYI STRESSZTŰRÉS MOLEKULÁRIS HÁTTERE ÉS NÖVELÉSÉNEK BIOTECHNOLÓGIAI LEHETŐSÉGEI A növényi stresszválasz kapcsolata a fejlődési folyamatokkal A vízhiány okozta génexpressziós változások a növényekben 174 A növények stresszválaszai és az egyedfejlődésük közötti kapcsolatokra világított rá az intézet számos kutatási eredménye. A 80-as évek második felében Dudits Dénes és kutatócsoportja vizsgálni kezdte a növényi sejtek úgynevezett totipotenciáját, amely a gyakorlatban széleskörűen alkalmazott növényregenerálás alapjait is adja. Ez a totipotencia megnyilvánul abban, hogy a differenciált testi sejtek visszanyerhetik osztódó képességüket, és újrainduló egyedfejlődési programjuk révén képesek szomatikus embriókat formálni. Míg az állatvilágban egyes őssejtekre korlátozódik ez a képesség, a magasabbrendű növények körében ez egy általános jellemző. A kutatók a szomatikus embriogenezis molekuláris alapjainak vizsgálatával igyekeztek közelebb jutni mind a totipotencia, mind az embriogenezis a korai egyedfejlődés folyamatainak megértéséhez. Így azonosítottak számos olyan gént, melyek az embriogenezis hormonális indukciója során aktiválódnak lucerna sejttenyészetben. A gének DNS-szekvenciájának meghatározása során meglepve tapasztalták, hogy közöttük számos hősokkfehérje található. Az egyik, úgynevezett kis hősokkfehérje (MsHSP18) génjéről 1991-ben közölt eredmény cikkét azóta is idézik. Ez egyike volt az első cikkeknek, melyek leírták, hogy a növényekben az embriogenezis során molekuláris chaperonok, melyek közé a hősokkfehérjék is tartoznak, aktiválódnak. Ezeknek a hősokkfehérjéknek a génjeit a növényi szövettenyészetekben használt hormonkezelések sok esetben indukálták, jelezve, hogy in vitro a növényi sejteket stressz éri. A stressz és az embriogenezis kapcsolatát tovább vizsgálva megállapították, hogy az egyedfejlődési program újraindulása egyfajta stresszválasz a növényi testi sejtek esetében. Fehér Attila és munkatársai bizonyították, hogy bizonyos mértékig a sejteket ért hormonhatás akár oxidatív stresszel is helyettesíthető lehet. A növények abiotikus azaz élettelen környezeti tényezők által kiváltott stresszválaszainak vizsgálata a 2000-es évek elején újra előtérbe került. A klímaváltozási előrejelzések, a szélsőséges időjárási helyzetek rámutattak arra, hogy az alapvető élelmiszereinket és haszonállataink takarmányát adó gabonafélék jövőbeni termőképességének stabilitásához szükség van arra, hogy termesztett gabonáink hazánkban elsősorban a búza környezeti stresszekhez való alkalmazkodását jobban megértsük és remélhetőleg a jövőben javíthassuk. Ennek érdekében jött létre Dudits Dénes vezetésével a Búzakonzorcium, melynek egyik kitűzött célja volt a jobb alkalmazkodási képességű fajták létrehozása. Az egyik kiindulópont a környezeti stresszekhez ebben az esetben a vízhiányhoz alkalmazkodni képes fajtákban aktiválódó gének megismerése. E gének megtalálásához nyújt segítséget a funkcionális genomika egyik ága, a transzkriptomika, mely lehetővé teszi, hogy egyszerre meghatározzuk több ezer gén kifejeződési mintázatát. A kifejeződési mintázat alapján megtalálhatók azok a gének, melyek jó szárazságadaptációjú fajtákban másképp működnek, mint a vízhiányra érzékenyen reagálókban. 1. ábra. Eltérő módon adaptálódó búzák gyökérfejlődése korlátozott (40%) és normális vízellátás (80%) mellett

175 Ezért választottak ki összehasonlításra a Búzakonzorciumban együttműködő kutatók olyan fajtákat, melyek az aszálystresszre eltérően reagálnak. Az aszályt jól toleráló Plainsman és a vészreakciókkal válaszoló Kobomugi fajták összehasonlítása során kiderült, hogy e két genotípus már gyökérfejlődésében is eltérően viselkedik vízhiány során, közülük csak a Plainsman képes arra, hogy korlátozott vízellátás mellett is fenntartsa a gyökér növekedését (1. ábra). A két fajta génkifejeződési mintázatának összevetése során kiderült, hogy sok száz gén működése változik eltérően a két fajtában négy hetes vízkorlátozás során. Ebből mutat néhány példát a 2. ábra. 2. ábra. Különböző, jellegzetesen eltérő kifejeződési mintázatot mutató búzagének a vízhiányra intenzíven reagáló Kobomugi, és a vízhiányt jól toleráló Plainsman fajtában, négyhetes korlátozott vízellátás során. Az y-tengelyen az egyes gének relatív kifejeződési szintjének változása látható a kiindulási mintához viszonyítva. A kísérletek során fény derült arra, hogy egy négyhetes mérsékelt vízhiány során a megemelkedett működésű gének között sok olyan található, mely a Kobomugi fajta gyökerében csak átmeneti expressziónövekedést mutat, míg a Plainsman gyökereiben folyamatosan magas szinten működnek. Ezek a gének különböző funkciójú fehérjéket kódolnak, melyek transzportfolyamatokban, fehérjeanyagcserében, ozmotikusan védő vegyületek szintézisében, a sejtfalképződésben és a méregtelenítésben vesznek részt, de vannak közöttük szabályozó fehérjék is. Oxidoreduktázok, peroxidázok és sejtfalhoz kapcsolódó fehérjék génjei a Plainsmanban aktiválódtak szignifikáns mértékben, míg stresszés védekezés-specifikus gének jellemzően a Kobomugiban aktiválódtak. A környezeti stresszválaszt szabályozó gének azonosítása és jellemzése A növényt károsító környezeti hatások kivédéséhez számos gén koordinált működésére van szükség. Egy nemzetközi kooperáció keretében Szabados László csoportja olyan genetikai rendszerek kidolgozásában vett részt, amelyek lehetővé tették a stresszválasz szabályozásában résztvevő gének azonosítását, jellemzését. A módszerek egyike a T-DNS inszerciós mutagenezis volt. Az Agrobacterium által közvetített transzformáció során a több ezer bázispár hosszú transzfer DNS (T-DNS) stabil módon beépül a növényi kromoszómális DNS-be. Amennyiben a T-DNS egy növényi génbe épül be, tönkreteszi annak struktúráját, és így mutációt hoz létre. A T-DNS inszerció a gént nemcsak inaktiválja, hanem molekuláris szempontból meg is jelöli, ami az adott gén gyors azonosítását teszi lehetővé. A T-DNS inszerciós mutagenezis koncepcióját és technikai alapjait Koncz Csaba dolgozta ki több mint húsz évvel ezelőtt. A kölni Max-Planck Intézetben Koncz és munkatársai létrehozták a ppcv vektorrendszert, amely alkalmas volt az inszerciós mutagenezis program megvalósítására. A Koncz laborral együttműködve Szabados László csoportjában egy Arabidopsis T-DNS inszerciós mutagenezis programot valósítottak meg, ami számos gén esetében lehetővé tette az inszerciós mutánsok azonosítását. Kidolgozták a luciferáz riportergént alkalmazó promótercsapda-rendszert, amelynek segítségével stressz által indukált géneket lehetett azonosítani. Munkájuk eredményeként több olyan Arabidopsis gén funkcionális analíziséhez tudtak mutánst izolálni, amelyek a környezeti stresszválaszt vagy az ahhoz kapcsolódó abszcizinsav (ABS) jelátvitelt szabályozzák. A mitokondriális PPR40 fehérjét kódoló gént is a mutáns növény abszcizinsav-érzékenysége alapján azonosították. A PPR40 gén jellemzése során kiderült, hogy a kódolt fehérje a mitokondriális elektrontranszportot befolyásolja. Hiánya az elektrontranszport károsodásával, a reaktív oxigén fajták (ROS) felhalmozódásával jár, ami érzékennyé teszi a növényt a különböző stresszhatásokra. A PPR40 gén túltermelése ugyanakkor alkalmas a sóstresszel szembeni ellenálló képesség fokozására is, mivel korlátozni Növénybiológia 175

176 Növénybiológia tudja a mitokondriumban keletkező ROS felhalmozódását és ezáltal csökkenti a sejt károsodását. A Koncz Csaba kölni laboratóriumával való együttműködés eredményeképpen Szabados László laboratóriumában kidolgoztak egy új génazonosítási rendszert, amely a gének véletlenszerű transzformációján és túltermelésén alapul. Egy indukálható promóterrel vezérelt expressziós kazettát tartalmazó növényi transzformációs vektorban olyan cdns-könyvtárat készítettek, amely lehetővé teszi nagyszámú gén véletlenszerű bejuttatását és túltermeltetését. Több tízezer transzgenikus Arabidopsis csíranövényt hoztak létre és vizsgáltak többféle szempont szerint. Az egyik kísérletsorozatban megnövekedett sótoleranciát mutató növényeket azonosítottak, amelyekben a beépített cdns túltermelése volt felelős az ellenálló képesség javulásáért (3. ábra). Többféle olyan gént azonosítottak és klónoztak ezzel a módszerrel, amelyek a stresszválasz transzkripciós szintű szabályozásában, a reaktívoxigén-fajták eltávolításában, semlegesítésében, vagy a fehérjestruktúrák stabilizálásában vesznek részt. A cdns-könyvtár transzfer fajok között is lehetséges, így a halofita növényfajokból ezen az úton magasabb szintű toleranciáért felelős gének is azonosíthatók. Ezért az Arabidopsis közeli rokonának számító, de sótoleráns Thellungiella fajból cdns-könyvtárat hoztak létre. Az Arabidopsis transzformáció valamint szűrés után több olyan vonalat azonosítottak, amelyek megnövekedett sótoleranciát mutattak. Ezzel a stratégiával várhatóan olyan gének felkutatása is lehetővé válik, amelyek nem csak a túltermelés révén, hanem az eltérő szerkezet, illetve funkció alapján képesek az ellenálló képesség javítására. Az eredmények által nemcsak a stresszválasz szabályozásában fontos gének tulajdonságait, a jelátviteli mechanizmusokat sikerül jobban megismerni, hanem remélhetőleg olyan stratégiákat is ki lehet dolgozni, amelyek a gyakorlati felhasználás szempontjából is fontosak lehetnek. A megnövekedett stressztoleranciát mutató vonalakból származó gének egy része várhatóan nemcsak Arabidopsis esetében képes az ellenálló képességet javítani, hanem más, esetleg termesztett növényfajoknál is hasonló hatást tudnak elérni (4. ábra). Mivel az abiotikus stresszel szembeni ellenálló képességet sok gén befolyásolja, nem várjuk, hogy egy gén drasztikus javulást tud okozni. Ugyanakkor az ellenálló képesség korlátozott, de szignifikáns javulása is nagyobb termésbiztonságot és megnövekedett hozamot jelenthet szuboptimális körülmények között, például aszály esetén ábra. Egy megnövekedett sótoleranciát mutató Arabidopsis vonal azonosítása és tesztelése. A felső ábra a magas sótartalmú táptalajon történő szűrést mutatja be. Látható, hogy egy növény kivételével az öszszes növény elhal. Az alsó ábrán a kiszelektált növény utódainak tesztelése látható. Mind csírázáskor, mind a növények növekedése során megfigyelhető a megemelkedett sótolerancia 4. ábra. A sótűrő képesség azonosítása és termesztett növényekbe történő átvitele céljából kidolgozott genetikai stratégia vázlata. A halofita Thellungiella növényből a cdns-transzfer és genetikai szűrés segítségével azonosítják a toleranciáért felelős géneket (1), amelyeket Arabidopsisban történő genetikai és molekuláris jellemzés után termesztett növényekben, például repcében is lehet tesztelni (2) A növények védelme az oxidatív stressz hatásaival szemben A környezeti stresszhatások nagymértékben megzavarhatják az asszimilációs és oxidatív folyamatok közti egyensúlyt, ami gyakran káros reaktív vegyü-

177 letek felhalmozódását eredményezi. Első lépésben oxigéntartalmú szabad gyökök és más nagy reakcióképességű molekulák (úgynevezett reaktív oxigén spécieszek, ROS-ok) keletkezhetnek, melyek könynyen reagálhatnak a sejtek fő alkotórészeivel (lipidek, fehérjék, DNS és RNS), károsítva azok szerkezetét és biokémiai funkcióját. Ezt a folyamatot nevezzük oxidatív stressznek, melynek jellemzője, hogy minden káros környezeti hatás (legyen az biotikus vagy abiotikus) következményeként fellép. Mivel a kedvezőtlen környezet és a kártevők az átlagos termést az elérhető maximális mennyiség harmadára-negyedére csökkentik, ezért a növényi biotechnológia elsőrendű feladatai közé tartozik a stressztűrő gazdasági haszonnövények előállítása. A növényi géntechnológia eszközei kiegészítik és kibővítik a hagyományos nemesítés eszköztárát, lehetővé téve azt is, hogy egyes gének hatását a laboratóriumi-üvegházi környezetben jól fenntartható modellnövényeken vizsgáljuk. Ez jelentette az alapját a Növénybiológiai Intézetben több mint két évtizede megkezdődött, az oxidatív stresszel szembeni ellenálló képesség megnövelését célul tűző munkának. Ennek keretében került sor először a növényi ferritint túltermelő dohánynövények előállítására és vizsgálatára. A ferritin a vas biztonságos tárolására szolgáló fehérje, enélkül a sejten belül felhalmozódó szabad vas katalizátorként működne a hidroxilgyököket képző kémiai reakciókban. A legreakcióképesebb ROS, a hidroxilgyök képződése a stresszhatások során megnövekedhet, érthető tehát, hogy a növényekben a ferritin termelése is felgyorsul. Olyan transzgenikus dohánynövények előállításával, melyek a ferritint nagy mennyiségben termelik, bebizonyították, hogy a kloroplasztiszban felhalmozódott fehérje növeli a növények ellenálló képességét az oxidatív stresszt okozó hatásokkal szemben. A növényi kórokozók támadása is jelentősen megnöveli a ROS-képződést, az oxidatív stressz következtében kialakuló sejtelhalás támadási felületet és tápanyagforrást biztosít a nekrotróf patogének számára. A túltermelt ferritin által biztosított védelem lassította a vírus-, baktériumés gombakártevők szaporodását és terjedését (5. ábra). A transzgenikus dohányok megnövekedett hidegtűrése is azt mutatja, hogy az oxidatív komponens számos, egymástól nagyon különböző hatású környezeti stressz velejárója. A ferritin túltermelésén alapuló stratégia tesztelése gazdasági haszonnövényekben jelenleg is folyik. 5. ábra. Az Alternaria alternata gombafertőzés súlyosabb tüneteket okoz a kontroll dohányon (SR1), mint a lucerna ferritint termelő transzgenikus növényeken (RubF2, RubF8). Ennek első eredménye a transzgenikus szőlő előállítása, mely a ferritin túltermelése következtében megnövekedett oxidatív stresszel szembeni toleranciával bír. A kutatás folyamán előállított növények jól példázzák azt, hogy a reaktív oxigénfajták keletkezésének meggátlása és azok sejtből történő eltávolítása milyen fontos a stressztűrés növelése szempontjából. A sok éves transzgenikus munka érdekes következményei (6. ábra) pedig jól mutatják, hogy az alkalmazott technológia váratlan eredményekre vezethet, így a már bevált stratégiák új növényekbe történő átvitele sem tekinthető rutinfeladatnak. 6. ábra. A ferritin sejten belüli felhalmozódása eredményezhet megnövekedett stressztűrést, de törpeséget is. Balról jobbra a nem transzformált szőlő (Richter-101), a lucerna ferritint a kloroplasztiszban és a citoszolban felhalmozó transzgenikus növények láthatók. Bár a citoszolban történő ferritin-felhalmozódás törpeséghez vezet, e növények fotoszintetikus paraméterei normálisak Növénybiológia 177

178 Növénybiológia 178 A reaktív oxigénfajták keletkezése mellett, sokszor ennek következményeként, a reaktív aldehidek képződése is minden élőlényben előfordul, menynyiségük a különböző stresszhatásoknak kitett organizmusokban megnő. A növényekben ilyen vegyületek keletkeznek a lipid-peroxidáció termékeként, vagy enzimatikus, illetve spontán módon a cukorlebontás közti termékeként. Mivel ezek a vegyületek is citotoxikus hatásúak és képesek számos fontos biomolekulával (fehérje-fehérje és fehérje-dns keresztkötéseket létrehozva) reakcióba lépni, ezért az ezeket elimináló méregtelenítő folyamatok alapvető fontosságúak minden élő szervezetben. A Növénybiológiai Intézetben Horváth V. Gábor és csoportja által folytatott kutatás egyik fő célpontja az az enzimcsalád, melynek tagjait széles spektrumú aktivitás jellemez, és egyes enzimei felelősek a reaktív aldehidmolekulák átalakításáért. Az aldo-keto reduktáz (AKR) családba tartozó enzimek védőhatása többszörös funkciójukból ered. Részint a telítetlen és oxoaldehidek alkohollá történő redukciója csökkenti a toxikus anyagok koncentrációját a különböző stresszhatásoknak kitett növényekben, részint a cukoralkoholok (pl. szorbitol és mannitol) szintézisével gyökfogó és nagy koncentrációban kompatibilis ozmotikumként ható vegyületeket állítanak elő. Ennek fényében érthető a lucernából származó MsALR aldo-keto reduktázt termelő dohánynövények széles körű (szárazság, UV-B, hideg, nehézfém) stresszrezisztenciája, és ez indokolta a gén felhasználására tett kísérleteket búzában is. Ezek a kutatások szoros együttműködésben folytak és folynak a Gabonakutató Non-Profit Kft. munkatársaival, ahol Pauk János vezetésével történik a búzatranszformánsok előállítása és vizsgálata. Mint azt az eredmények bizonyítják, az MsALR génnel transzformált búzanövények az elméletileg elvárt toleranciát mutatták toxikus aldehid- (metilglioxál) kezeléssel szemben, és ellenállóbbak voltak a vízmegvonás hatásával is. A teljes genomok nukleotidsorrendjének meghatározása lehetővé tette, hogy bioinformatikai eszközök felhasználásával megkeressük a rizs összes aldo-keto reduktázt kódoló génjét és összehasonlítsuk ezeket az eddig már jellemzett enzimeket kódoló szekvenciákkal. Mivel a gének szabályozórégiói (promóterei) is ismertté váltak, így ezekben is megkereshettük azokat a konzervált elemeket, melyek a gén stresszkörülmények közötti fokozott átírásáért felelősek. A keresésre kidolgozott új algoritmus megbízhatóan jósolta meg az egyes AKR gének stresszválaszában jelentkező különbségeket, a génátíródás stressz-specifikus jellemzőivel együtt. A számítógépes elemzés jó alapot nyújtott a detoxifikáló folyamatokban résztvevő gének-fehérjék kiválasztásához. Egy ilyen rizs AKR (az OsAKR1) részletes elemzését elvégezve Horváth V. Gábor és munkatársai azt állapították meg, hogy az enzim jó hatásfokkal képes redukálni mind a lipid-peroxidációs folyamatok, mind a glikolízis során keletkező reaktív aldehideket, így ez a növényi sejt általános védekező mechanizmusaiban tölt be fontos szerepet. A fehérje védőfunkciójának konzervatív voltát jól mutatja, hogy a reaktív aldehidekkel szemben védelmet nyújt mind Escherichia coli sejtekben, mind transzformált növényekben. Az OsAKR1 enzimet termelő transzgenikus dohánynövények ellenállóbbnak bizonyultak mind a közvetlen oxidatív stressz hatásaival szemben, mind a magas hőmérséklet által okozott károsodások tekintetében. A pozitív hatások ismeretében kezdődött meg a gén átvitele olyan fontos gazdasági haszonnövényekbe, mint az árpa és a búza. A prolin metabolizmusa és a környezeti stressz Szabados László kutatócsoportjának másik fő érdeklődési területe az utóbbi két évtizedben a környezeti stresszválaszt befolyásoló molekuláris mechanizmusok vizsgálata, jellemzése volt. Munkájuk során egyrészt a stressz során megváltozó prolin-metabolizmust vizsgáltak, másrészt új genetikai módszerek kifejlesztésével és alkalmazásával olyan géneket azonosítottak és jellemeztek, amelyek a stresszválaszt szabályozzák. A szárazság, a talaj magas sótartalma és a hideg olyan ozmotikus stresszt okoz a növényekben, ami hasonló élettani hatásokkal jár. Az ilyen stressz hatások egyik jellemző következménye a prolin aminosav felhalmozódása, ami a legtöbb növényfajban megfigyelhető. Annak ellenére, hogy a jelenséget már több mint fél évszázada leírták, a prolinfelhalmozódás szerepe, illetve szabályozása még mindig nem teljesen ismert. A prolinnak általában ozmoprotektív, védő funkciót tulajdonítanak, ami hozzájárulhat a növények ellenálló képességéhez. Több növényfajban egyértelmű

179 összefüggést sikerült kimutatni a szárazságtűrés és a prolinfelhalmozódás mértéke között. Ugyanakkor ezzel ellentétes példákat is lehet találni, ami arra utal, hogy a prolinfelhalmozódás nem minden esetben, illetve növényfajban járul hozzá az ellenálló képességhez. Szabados László és munkatársai először a prolin bioszintézisét szabályozó gének azonosítását, jellemzését kezdték meg. Németországi és izraeli kutatókkal együttműködve az Arabidopsis modellnövényből klónozták és jellemezték a prolin-bioszintézis első lépését szabályozó, és az egész folyamatot ellenőrző delta- 5-pirrolin-karboxiláz enzimet kódoló géneket (P5CS1, P5CS2). Habár a kódolt enzimek aminosavsorrendje nagyon hasonló, a két gén expressziós mintázata teljesen eltérő, ami arra utal, hogy a gének funkciója is különböző. A P5CS1 gén aktivitása optimális körülmények között nagyon alacsony, de szárazság- vagy sóstressz esetében sokszorosára emelkedik. A P5CS2 gén az osztódó szövetekben folyamatosan működik, amit csak kis mértékben befolyásol a környezet változása. Érdekes megfigyelés volt, hogy prolin felhal mozó dást sikerült kimutatni bizonyos patogén baktériumok fertőzése után is. Az avirulens Pseudomonas baktérium fertőzése hiperszenzitív reakciót (HR) idéz elő, ami a P5CS2 gén aktiválódásával és lokális prolinfelhalmozódással járt együtt. A két gén szövetspecifikus működését és a fehérjék sejten belüli lokalizációját olyan génfúziók segítségével tanulmányozták, amelyekben a génekhez zöld fluoreszcens proteint kódoló szekvenciát kapcsoltak. A mikroszkópos vizsgálatok egyértelműen bizonyították, hogy a két gén, illetve fehérje eltérő sejtekben aktív (7. ábra). A prolin szerepét olyan mutánsok segítségével tanulmányozták, amelyekben egy T-DNS inszerció a P5CS1 gént inaktiválta, ezáltal meggátolta a stressz által kiváltott prolinfelhalmozódást. A p5cs1 mutáns jóval érzékenyebb volt a sóstresszre, ami egyértelműen bizonyította, hogy a prolinfelhalmozódás fontos része a növények ellenálló képességének (8. ábra). A p5cs2 mutáns embrióletalitást mutatott, ami megerősítette, hogy a P5CS2 gén a sejtek létfenntartásához, például a fehérjeszintézishez biztosítja a prolint, és ezért működése elengedhetetlen a növények egyedfejlődéséhez. Növénybiológia 8. ábra. Vad típusú (Col-0) és p5cs1 mutáns növények sóellenálló képességének összehasonlítása. Látható, hogy a prolinhiányos p5cs1 mutáns jóval érzékenyebb a sókezelésre, mint a vad típusú Col-0 növény 7. ábra. A P5CS1-GFP és P5CS2-GFP kifejeződésének mintázata csíranövényekben, hajtáscsúcsban, virágban és portokokban. A zöld fluoreszcencia mintázata alapján látható, hogy a két gén eltérő szövetekben, sejttípusokban aktív. Míg a P5CS2-GFP fehérje osztódó szövetekben mutatható ki, addig a P5CS1-GFP a portokokban, azon belül a pollenszemcsékben van jelen Szabados László munkatársainak és más kutatócsoportok publikációinak alapján elmondható, hogy a prolin egy többfunkciós aminosav, ami nemcsak a fehérjeszintézishez szükséges, de fontos a növények egyedfejlődéséhez, a káros biotikus és abiotikus környezeti hatások semlegesítéséhez, és szerepe van a metabolizmus szabályozásában, a stresszel szembeni ellenálló képesség kialakításában is. 179

180 Növénybiológia A Növénybiológiai Intézetben folyó, a növények stressztűrésével kapcsolatos kutatások biztosítják azt, hogy a gyors ütemben változó világ kihívásainak megfelelő új növényfajtákat hozzanak létre, felhasználva a növényi molekuláris biológia, a biokémia és a fajta-fenotipizálás modern eszköztárát, együttműködésben a hagyományos nemesítés bevált, de a molekuláris technikák segítségével megújuló módszereivel. Györgyey János, Horváth V. Gábor és Szabados László 180

181 A FÉNY, A BIOLÓGIAI ÓRA ÉS A HORMONOK ÁLTAL SZABÁLYOZOTT JELÁTVITELI HÁLÓZATOK MOLEKULÁRIS ALAPJAI NÖVÉNYEKBEN Növénybiológia A Foto- és Kronobiológiai Csoport kutatási tevékenysége az elmúlt 15 év során a növények fény füg gő növekedését és fejlődését szabályozó mechanizmusok molekuláris szintű jellemzésére, a szinte minden organizmusban, így a növényekben is ketyegő belső biológiai óra működését biztosító molekuláris történések azonosítására és egy, a közelmúltban felfedezett növényi hormon, a brasszinoszteroid hatásmechanizmusának és szintézisének megértésére koncentrálódott. Ezek a kutatási témák, bár ez első pillantásra nem nyilvánvaló, szervesen kapcsolódnak egymáshoz. Kiderült, hogy ezek a jelátviteli láncok egy összetett, komplex szabályozási hálózat elemeit képezik és számos helyen kapcsolódnak egymáshoz, így működésük, azaz az adott jelátviteli láncok aktuális aktivitása egymástól függ. Ez egyszerűsített módon úgy értelmezhető, hogy a változó fényviszonyok hatására bekövetkezett válaszok szintje és mértéke a fotoreceptorokon túlmenően függ a cirkadián óra fázisától, a brasszinoszteroid hormon szintjétől és az ún. sunscreen funkcióval bíró metabolitok aktuális koncentrációjától. Természetesen ez fordítva is igaz, például a cirkadián óra periódushosszát, fázisát a fényviszonyokban bekövetkezett változások szintén befolyásolják. A belső biológiai óra (cirkadián óra) működésének vizsgálata A biológiai óra egy olyan, élő szervezetekben működő időzítő mechanizmus, amely képes napi (kb. 24 órás) oszcillációk létrehozására. A 24 órás periódushossz miatt nevezzük a biológiai órát cirkadián órának is, a latin circa diem (= kb. egy nap) kifejezés alapján. A biológiai óra molekuláris óra: fogaskerekeit gének és az általuk kódolt fehérjék alkotják, amelyek egymás működését szabályozva hozzák létre a 24 órás alapritmust, ami elsődlegesen az óraelemek ritmikusan változó szintjében jelenik meg. Az óra működését napi rendszerességű környezeti változások (fény/sötét, meleg/hideg) szinkronizálják a külső, valós időhöz. Az óra által kialakított alapritmus az Arabidopsis- genom 25%-ának kifejeződését és ezáltal számos életfolyamat megjelenését szabályozza olyan módon, hogy azok az arra legmegfelelőbb napszakban történjenek. Meglepő, de az óra által szabályozott folyamat például a fotoszintetikus aktivitás ( oxigéntermelés ), amely folyamatos megvilágítás esetén sem mutat állandó szintet, hanem szabályos ~24 órás periódusa van. A jelenség hátterében valószínűleg a fotoszintetikus apparátus fontos fehérjekomponenseit kódoló gének kifejeződésének erőteljes cirkadián ritmusa áll. Természetes körülmények között ezek a gének a nap(pal) közepén fejeződnek ki a legmagasabb szinten, így a felhalmozódó fehérjék (pl. a klorofill a/b-kötő fehérjék, CAB) lehetővé teszik a fényenergia maximális hasznosítását. A CAB gének óraregulált kifejeződését az 1980-as évek végén figyelték meg először, de már sokkal korábban ismert volt, hogy e gének transzkripciója erősen fényindukált. Mivel ezt a fényválaszt a vörös fényt elnyelő fitokróm fotoreceptorok közvetítik, a CAB gének kifejeződését már részletesen vizsgáltuk a fitokrómindukált jelátviteli láncokkal kapcsolatos kísérleteink során. Annak felfedezése, hogy az általunk fényindukált jelzőgénként használt CAB gén kifejeződése cirkadián ritmust is mutat, irányította figyelmünket a biológiai óra irányába az 1990-es évek elején, az alapvető fotobiológiai szemlélet megtartása mellett. Ezért az órával kapcsolatos kutatásaink jelentős része a cirkadián oszcillátor és a fényindukált jelátviteli rendszerek funkcionális kölcsönhatását vizsgálta és vizsgálja ma is. Első kísérleteink során kimutattuk, hogy az egyedfejlődés korai fázisában (a csírázást követő 3. napig) két cirkadián oszcillátor működik egyidejűleg a növényi sejtekben, amelyek közül csak az egyik működése érzékeny fényre. A fejlődés későbbi szakaszában már csak egy, fénnyel szinkronizálható oszcillátor műkö- 181

182 Növénybiológia 182 dését lehet felfedezni. A következő évek jelentős eredménye annak felfedezése volt, hogy a fitokróm B (PhyB) receptort kódoló gén kifejeződését az óra ritmikusan szabályozza. Ezzel elsőként igazoltuk növényekben, hogy az oszcillátor visszahat a szinkronizáló fényjeleket továbbító receptorok egyikére, ami a beállítás hatékonyságának növelése által erőteljesebb ritmusok kialakítását eredményezheti. Kimutattuk, hogy az óra nemcsak a PhyB, hanem valamennyi fitokróm gén működését modulálja, ami a szabályozás általános jellegére utal. Az óra szabályozó funkciójának, vagy épp fénnyel történő beállíthatóságának megértését nagyban hátráltatta az a tény, hogy a növényi oszcillátort felépítő gének és fehérjék ismeretlenek voltak. Ezért Andrew Millar professzor (Edinburgh-i Egyetem) csoportjával együttműködve egy nagyléptékű mutáns-szűrési projektet indítottunk 2001-ben, amelynek célja a növényi cirkadián óra új komponenseinek azonosítása volt. A szűrés technikai hátterét a luciferáz riportergén és az Andrew Millar által kifejlesztett valós idejű in vivo lumineszcencia-meghatározás jelentette, amelynek segítségével hetente 4000 egyedi csíranövényben ellenőrizhettük a cirkadián ritmusok (így az óra funkciójának) esetleges megváltozását. A technológiát sikeresen honosítottuk intézetünkben, jelenleg már két nagy érzékenységű kamera és két automata luminométer segítségével mérjük a ritmikus lumineszcenciajeleket. A munka során számos olyan mutáns Arabidopsisvonalat azonosítottunk, amelyekben a cirkadián óra működése megváltozott. A mutáns vonalak egyikében meghatároztuk a mutációt hordozó gént, amely egy ún. kis GTP-kötő fehérjét kódol. Kimutattuk, hogy az azonosított fehérje az egyik fő órakomponens szabályozásán keresztül fejti ki hatását az óra működésére. Bár több mutáns esetében az érintett gén azonosítása még folyamatban van, eredményeink már nagyban hozzájárultak annak megértéséhez, hogy a növényi óra fogaskerekei milyen módon kapaszkodnak egymásba a 24 órás periódus kialakítása érdekében. Az újonnan azonosított mutánsokat felhasználtuk annak kimutatására, hogy különböző növényi életfolyamatok, legfőképpen a fotoszintézis precíz időzítése a megfelelő napszakra valóban nagy jelentőséggel bír a növények optimális fejlődése szempontjából. Különböző (nem 24 órás) periódushosszt mutató mutánsok analízisével igazoltuk, hogy az óra által jelzett időnek a valós időtől történő mindössze néhány órás eltérése a fotoszintetikus aktivitás és a zöld biomassza-termelés mintegy 50%-os csökkenését okozza. A valós időtől történő eltérés nemcsak az óra központi részének hibás működése miatt, hanem a külső környezetből származó szinkronizáló jeleket szállító jelátviteli rendszerek helytelen működése miatt is kialakulhat. Ezért kutatásaink legújabb vonala azokat a mechanizmusokat vizsgálja molekuláris szinten, amelyek révén a környezeti jelek (elsősorban a fény) beállítja a növényi biológiai órát. A PhyB receptor órára gyakorolt hatását részletesen is vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a receptor sejtmagi elhelyezkedése alapvető az órát szabályozó fényjelek közvetítése szempontjából, és meghatároztuk a receptor azon részeit, amelyek szükségesek és elégségesek a vörös fényjelek közvetítéséhez az óra irányába, illetve, amelyek által a PhyB receptor képes a kriptokróm fotoreceptoroktól induló, kék fénnyel kiváltott jelátvitel gátlására. A természetes fény egyik fontos komponense az UV-B, de az UV-B és az óra által szabályozott jelátviteli folyamatok kölcsönhatását még nem vizsgálták részletesen. Elsőként sikerült kimutatnunk, hogy az UV-B fény a látható fényhez hasonlóan hatásos az óra beállításában. Ezen túlmenően kimutattuk, hogy a cirkadián óra ritmikusan gátolja az arra érzékeny gének UV-B indukcióját. A legtöbb általunk vizsgált gén, amelyek termékei az UV-elnyelő védőpigmentek termeléséhez szükségesek, a nappal kezdetén, ill. első felében mutat magas szintű UV-B indukciót, míg a szubjektív éjszaka során szinte érzéketlenek az UV-B pulzusokra. A megfigyelt jelenség az óra élettani jelentőségének egy újabb fontos bizonyítéka: az UV-protektív színanyagok termelődését az óra arra a napszakra időzíti, amikor arra leginkább szükség van. Az ultraibolya sugárzás (UV-B) érzékelésében és az UV-B sugárzás által kiváltott jelátviteli láncok működésében meghatározó funkcióval bíró gének azonosítása A napfény az emberi szem által is érzékelhető és a növények számára fontos kék, vörös és távoli vörös fény mellett tartalmazza a rövidebb hullámhosszú (λ<340 nm) ultraibolya fényt is. Természetes körül-

183 mények között a sztratoszféra ózonrétege a nagyon rövid hullámhosszú UV-C (λ<280 nm) sugárzást elnyeli, így a Föld felszínét elérő ultraibolya sugárzás hullámhossza alapján megkülönböztetünk UV-B (λ= nm) és UV-A (λ = nm) fényt. Az UV-B sugárzásról régóta tudjuk, hogy biológiailag káros: még a viszonylag alacsony intenzitású UV-B sugárzás is képes a DNS-láncot alkotó bázisokat specifikusan módosítva jelentősen megnövelni a mutációk gyakoriságát. A magasabb intenzitású UV-B sugárzás (stressz) emellett többek között direkt módon képes károsítani a fehérjék és membránok térszerkezetét, amelyek így képtelenek optimális hatékonysággal ellátni élettani funkciójukat. A többi organizmushoz hasonlóan az UV-B sugárzás a növényekre is kifejezetten káros. További hasonlóságként megemlíthető, hogy azok a különböző molekuláris folyamatok, amelyek segítségével a károsodott DNSláncok kijavítása (repair) történik, a növényekben is viszonylag jól ismertek. Arról viszont, hogy növényekben vagy más organizmusban létezik-e egy olyan fotoreceptor(család), amely az UV-B sugárzást specifikusan érzékelve képes speciális védekezési reakciók beindítására, sem a növénybiológusoknak, sem a más organizmusokat tanulmányozó kutatóknak nem voltak konkrét ismeretei egészen a közelmúltig ben a Freiburgi Egyetemen dolgozó Dr. Roman Ulm vezette kutatócsoporttal egy olyan közös kutatási programot indítottunk el, amely a korábbi növényélettani kutatások alapján feltételezett, az UV-B sugárzást speciálisan érzékelni képes fotoreceptor azonosítására irányult. Abból a feltevésből indultunk ki, hogy a növények számára az UV-B nem pusztán károsodást okozó környezeti tényező, hanem a látható fényhez hasonló környezeti inger, amelyre a növény anyagcseréjének, növekedésének megváltoztatásával válaszol. Ennek alapján nem a korábban használt UV-B sugárzásnak ellenálló mutánsok izolálásán alapuló megközelítést választottuk (a specifikus és stresszválaszok elválasztása nagyon nehezen valósítható meg, ezért a korábbi próbálkozások kivétel nélkül a hibák kijavításában szerepet játszó géneket azonosították). Az általunk alkalmazott megközelítés lényege az volt, hogy microarray-analízissel azonosítottunk olyan géneket, amelyek expressziója rövid idejű, alacsony intenzitású és hosszú hullámhosszú UV-B (kevésbé okoz károsodást) kezelés hatására jellegzetesen megemelkedett. 1. ábra. Vad típusú, uvr8 mutáns és UVR8 túltermelő növényeket nem letális dózisú UV-B kezelésnek tettük ki. Látható, hogy UVR8 hiányában a növények elpusztultak a kezelést követően, míg az UVR8 fehérjét magas szinten termelő növények a vad típusnál jobban tolerálták a besugárzást Meglepetésünkre az általunk azonosított gének között számos olyan gént találtunk, amelyekről ismert volt, hogy fontos szerepet játszanak a kék vagy a vörös-távoli vörös fényfüggő jelátviteli láncokban. Az UV-B indukálta géneket vizsgálva meghatároztunk egy olyan cisz-szabályozó elemet, amely fontos szerepet játszik az UV-B indukcióban. Előállítottunk olyan transzgenikus növényeket, amelyekben a HY5 gén promótere vezérelte a luciferáz (Luc) riporter kifejeződését. A luciferáz enzim aktivitásának in vivo mérésével (a luciferáz fényemisszióján alapuló nagy áteresztőképességű, nem károsító szűrés) azonosítottunk olyan mutánsokat, amelyekben a luciferáz aktivitása nem emelkedett meg UV-B kezelés hatására. A mutánsokat vizsgálva kimutattuk, hogy az UV-B indukálta jelátviteli lánc legfontosabb tagjai a HY5- HYH transzkripciós faktorok, a COP1 fehérje (egy E3 típusú ubikvitin ligáz), amelyről tudott volt, hogy a látható fény szabályozta fotomorfogenezis negatív szabályozója, valamint egy a Ran-GEF géncsaládba sorolható gén, amely az UVR8 fehérjét kódolja. Bizonyítottuk, hogy az UVR8 és COP1 fehérjék az UV-B indukálta jelátviteli lánc nagyon korai lépéseiért felelősek, képesek egymással UV-B indukálta módon kölcsönhatásba lépni in planta, és hogy az UVR8 fehérje over-expressziója megemelkedett szintű UV-B Növénybiológia 183

184 Növénybiológia rezisztenciát okoz. A növényi UVR8 és COP1 fehérjéket élesztő- és humán sejtekben kifejezve kimutattuk, hogy a kölcsönhatás létrejöttének szükséges előfeltétele az UVR8 fehérje alkotta homodimerek monomerizálódása. Az UVR8 egy β-propeller szerkezetű fehérje, amelyről bizonyítottuk, hogy a 285. triptofán aminosav kulcsszerepet játszik az UVR8 UV-B okozta specifikus konformációváltozásában. Összességében ezekkel a kísérletekkel bizonyítottuk, hogy az UVR8 az első olyan fotoreceptor, amely az UV-B sugárzást specifikusan érzékelni képes. Az UVR8 specifikus vonása, hogy ellentétben a látható fényben működő fotoreceptorokkal, az UVR8 nem tartalmaz a fényt hullámhossztól függően elnyelő specifikus kromofórt. A fitokróm fotoreceptorok szabályozta fényfüggő egyedfejlődés molekuláris jellemzése A növények fényfüggő egyedfejlődését a napfény vörös-távoli vörös tartományát érzékelő fitokróm fotoreceptorok a növények teljes életciklusán át, a csírázástól a virágzásig szabályozzák. A fitokrómot az 1950-es évek elején fedezték fel. citoplazmában szintetizálódnak és vörös fény hatására átalakulnak a biológiailag aktív Pfr (távoli vörös fényt elnyelő konformer, λ max= 720 nm) formába. A távoli vörös fénykezelés a fitokrómokat visszaalakítja a biológiailag inaktív Pr formába, és ez az elnyelt fény hullámhossza által szabályozott konformációváltozás teszi lehetővé, hogy a fitokrómok a növényekben egy, a fény által szabályozott biológiai kapcsolóként működjenek. A molekuláris biológia modellnövényében, az Arabidopsis thaliana-ban (lúdfű) a fitokróm apoproteinjét 5 gén, a PHYA-E gének kódolják. A phya-phye fotoreceptorok egymástól részben független jelátviteli láncok révén szabályozzák mintegy 3000 gén expresszióját, azaz a növények fényfüggő egyedfejlődését, fotomorfogenezisét. A fitokrómok in vivo homo- vagy heterodimerként léteznek és a fotoreceptor Pr-Pfr konformáció változása a fitokrómok által szabályozott jelátviteli kaszkádok aktiválásának első lépése. A fitokrómokról egészen az 1990-es évek végéig azt tudtuk, hogy a Pr-Pfr konformerek egyaránt a citoplazmában vagy a sejtmembránhoz kötődve mutathatók ki. Munkacsoportunk a Freiburgi Egyetem Dr. Eberhard Schäfer vezette kutatócsoportjával végzett kollaboráció keretén belül bizonyította, hogy a phyaphye fotoreceptorok Pfr formájának sejten belüli kompartmentalizációja a fény intenzitásától és hullámhosszától függő módon változik. 2. ábra. A fitokrómok fényindukált sejtmagi importja. A PhyA (A-B) és PhyB (C-D) receptorokat zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) jelöltük meg és Arabidopsis növényekben fejeztettük ki. A növényeket sötétben neveltük (A, C) majd vörös fénykezeléssel indukáltuk a receptorok sejtmagi importját. nu: sejtmag 184 A fitokrómok fényelnyelését az apoproteinhez kovalensen kötődő kromofór, a tetrapirrol oldallánc biztosítja. A fitokrómok sötétben a biológiailag inaktív Pr (vörös fényt elnyelő konformer) formájában a 3. ábra. A PhyA-GFP fehérje fény hatására a sejmagba vándorol, ahol sejtmagi testek felépítésében vesz részt (A panel). Olyan mutáns növényekben, amelyekből hiányzik a PhyA importját szabályozó egyik fehérje, a sejtmagi import nem következik be (B panel). n: sejtmag, pl: plasztisz, nb: sejtmagi testek

185 Megállapítottuk, hogy egyrészt a fény indukálja e fotoreceptorok Pfr formájának a sejtmagba irányuló importját, másrészt demonstráltuk, hogy a sejtmagban kimutatható phya-phye fotoreceptor-molekulák a fény intenzitásától függő módon sejtmagi komplexekben, ún. sejtmagi testecskékben lokalizálódnak. Ezt követően e sejtmagi komplex alkotórészeit vizsgálva kimutattuk, hogy ezek a komplexek a phyaphye fotoreceptorok mellett, jól definiálható körülmények között, tranziensen tartalmazzák a fitokróm fotoreceptorok Pfr formájával kölcsönhatni képes PIF transzkripciós faktorokat. További vizsgálatokkal tisztáztuk, hogy a PIF típusú transzkripciós faktorok fény hatására gyorsan degradálódnak, és ezt a fényindukált proteolízist a phya, phyb, phyd fitokrómok szabályozzák. A rendelkezésünkre álló transzgenikus vonalak részletes élettani és molekuláris analízisével bizonyítottuk, hogy a PIF típusú transzkripciós faktorok a fotomorfogenezist negatívan szabályozzák, de ugyanakkor fontos szerepet játszanak a csíranövények ún. szkotomorfogenikus (fénytől független) fejlődésében. Összességében ezek a következtetések radikálisan átalakították a fitokrómok általi szabályozásról alkotott elképzeléseket, és mára általánosan elfogadottá vált, hogy a fitokrómok Pfr formájának gyors sejtmagi importja, majd ezt követően a negatív regulátorok inaktivációja a fotomorfogenezis nagyon korai és meghatározó szerepet játszó történései. A későbbiekben felderítettük a phya receptor sejtmagi importjához szükséges molekuláris mechanizmust, azonosítottuk ennek legfontosabb komponenseit, és ezeket irányított módon kifejezve kimutattuk, hogy ez a speciális celluláris mechanizmus működik más eukarióta sejtekben is. A phyb molekulák sejtmagi importját vizsgálva, amelynek a kinetikai paraméterei jelentősen eltérnek a phya-étól, kimutattuk, hogy ezt egy, a fentitől eltérő, attól független molekuláris mechanizmus szabályozza. A brasszinoszteroidok élettani szerepének és bioszintézisének megismerése A növények növekedésének és fejlődésének szabályozásában fontos szerepet játszanak a brasszinoszteroidok (BR-ok, növényi szteroid hormonok). Bár szármegnyúlást serkentő hatásuk és kémiai szerkezetük már korábban ismert volt, egészen az 1990-es évek közepéig tisztázatlan maradt, hogy e hormonok hiánya a növényekben milyen élettani következményekkel jár. Koncz Csaba munkacsoportjával (Max-Planck- Intézet, Köln) együttműködve laboratóriumunk ekkor jellemezte az első BR-hiányos Arabidopsis mutánsok egyikét (cpd), felderítve, hogy a hormonhiány törpeséget, rendellenes szervfejlődést, továbbá csökkent termékenységet és ellenálló képességet okoz. Kimutattuk, hogy a cpd mutánskomplex fenotípusát a citokróm P450 fehérjék egy addig ismeretlen alcsaládjába tartozó CYP90A1 enzim funkcióvesztése okozza. 4. ábra. A BR hormon hiánya miatt törpe növésű cpd mutáns (bal oldalt) vad típusú Arabidopsis növény mellett Az általunk leírt mutáns a későbbiekben jelentősen hozzájárult számos BR-regulált gén azonosításához, valamint az ezek kifejeződését meghatározó szabályozó elemek felderítéséhez. További vizsgálataink fényt derítettek arra is, hogy a BR szintézisút kulcsenzimét kódoló CPD gén működését a szteroid hormon negatívan regulálja, lehetővé téve ezáltal a BR szintézis hormonszinttől függő önszabályozását. Kimutattuk, hogy ez a visszacsatolásos kontrollmechanizmus az Arabidopsis BR bioszintézis valamennyi, időközben ismertté vált P450 génjének működését meghatározza. E gének szabályozó régióinak vizsgálata alapján lehetett azonosítani azt a regulatív szekvenciaelemet, amely a BR-kontrollált gének repressziójáért felelős. Az első bioszintetikus és érzékelési mutánsok megismerését követően világszerte jelentősen felgyorsultak a BR-okkal kapcsolatos kutatások, aminek követ- Növénybiológia 185

186 Növénybiológia keztében mára ezek a szteroidok a növényi hormonok egyik legjobban jellemzett csoportjává váltak. Érzékelésük és szabályozó mechanizmusuk molekuláris hátterének felderítésével párhuzamosan tisztázódott azt is, hogy hatásukat elsősorban közvetlenül szintézisük helyén fejtik ki. 5. ábra. A biológiailag aktív BR formák létrehozásáért közvetlenül felelős CYP85A2 enzimet kódoló gén kifejeződése Arabidopsis növényben. Az erős génaktivitást a piros, fehér és sárga színek jelzik Ez utóbbi jelenség kapcsán kimutattuk, hogy a BR-ok szintéziséért felelős gének működése egyedi szervspecifikus reguláció alatt áll. Ezen belül a korai szintetikus aktivitást befolyásoló CPD/CYP90A1, valamint a biológiailag aktív BR formák létrehozásáért közvetlenül felelős CYP85A2 enzimek génjeinek kifejeződési szintje elsősorban a kialakulóban lévő szervekben magas, és ezeken a helyeken a hormonszint jelentős emelkedését idézi elő. A BR-ok befolyásolják a növények fényfüggő fejlődését is. Munkánk során megállapítottuk, hogy a szteroid hormon szintézisének kulcsenzimeit kódoló CPD és CYP85A2 gének működése fény hatására indukálódik, és bizonyítottuk, hogy ez a hatás a fitokróm fotoreceptorok közvetítésével érvényesül. A fényszabályozás, valamint cirkadián kifejeződési ciklusuk következtében ezek a gének kifejeződése jellegzetes, reggeli maximumot mutató napszakos ingadozást mutat, ami a fényszakasz közepén nagyfokú hormonfelhalmozódást eredményez. A bioszintetikus gének működésének napi ingadozásaival kapcsolatos eredményeink bizonyítékot szolgáltattak arra is, hogy a BR-hatás sötétben tapasztalható felerősödése nem a hormonszint emelkedésének, hanem elsősorban a növény megnövekedett hormonérzékenységnek tulajdonítható. Masaharu Mizutani (Kyotói Egyetem) és Takao Yokota (Teikyo Egyetem) munkacsoportjaival együttműködve meghatároztuk az Arabidopsis BR szintézisében résztvevő CYP90C1 és CYP90D1 enzimek funkcióját. Enzimkinetikai vizsgálataink kimutatták, hogy ezek többféle BR intermedier oldalláncának hidroxilációját is katalizálhatják, de ezek közül azokat részesítik előnyben, amelyek ezen átalakulás révén rövidített reakcióúton alakulhatnak aktív hormonná. A BR szintézis ismert enzimeinek intermedier-preferenciái alapján olyan rövidített, és a reakciók valószínűségére épülő új anyagcsereút-modellt állítottunk fel, amely összhangban áll a korábbi in vivo vizsgálatok eredményeivel. Nagy Ferenc, Kozma-Bognár László és Szekeres Miklós 186