Kadmiumtartalmú szennyvíz fitoremediációja cianobaktériumokkal

Átírás

1 VÍZGAZDÁLKODÁS ÉS SZENNYVIZEK 3.5 Kadmiumtartalmú szennyvíz fitoremediációja cianobaktériumokkal Tárgyszavak: cianobaktérium; kadmium; bioszorpció; fitoremediáció. A szennyvízből nehézfémek eltávolítására alkalmas biológiai tisztítóeljárások akkor a leghatékonyabbak, ha a szennyeződés koncentrációja 100 mg/l felett van. Egyéb módszerek (elektrodialízis, kicsapás, fordított ozmózis) költségesek és nehezen kivitelezhetők 100 mg/l fémkoncentráció alatt. A mikrobasejteket alkalmazó fitoremediáció (méregtelenítés növények segítségével) fontos szerepet játszhat nehézfémtartalmú szennyvizek kezelésében, még a környezetben jelentős 100 mg/l alatti koncentráció esetében is. A mikrobákból álló biomassza képes adszorbeálni fémionokat vizes oldatból akkor is, ha a sejtek már elpusztultak ben közölték, hogy 100 mg/l-nél kevesebb fémszennyezést tartalmazó szennyvíz kezelhető rögzített élesztővel. A most leírt vizsgálatok során a kadmium bioszorpciójával és toxicitásával foglalkoztak Spirulina platensis cianobaktérium tenyészetében. Oldatban levő fémionok eltávolítására háromféle biológiai folyamat alkalmas: a bioszorpció (adszorpció) során a fémionok a mikroorganizmusok felületén kötődnek meg; fémionok intracelluláris felvétele; fémionok kémiai átalakulása mikroorganizmusok hatására. Mivel a megfigyelések szerint a bioszorpció a leggyorsabb mechanizmus, ezért ennek van legnagyobb szerepe a szennyvízből történő fémszorpcióban. A bioszorpció kifejezés fémeknek élő vagy holt biomasszához való kötődésének passzív, nem anyagcsere által közvetített folyamatára utal. Sok mikroorganizmus (pl. cianobaktérium) sejtfelszíne poliszacharidokból, fehérjékből és lipidekből áll, amelyek a nehézfémek alapvető kötési helyét képezik. Ezek a funkcionális csoportok a sejtfalban (amino-, karboxil-, szulf-hidril-, foszfát- és tiolcsoportok) meg tudják kötni a fémeket. Egyesek szerint a karboxilcsoportok alkotják a legfontosabb kötési helyet Gram-pozitív baktériumok sejtfalában. Nagy eltérés van az adszorpció hatékonysága szempontjából a mikroorganizmusok különböző típusainál, mivel a szorpció a sejtfal jellegétől és összetételétől függ.

2 Anyagok és módszerek A S. platensis (TISTR 8217) cianobaktériumot Zarrouk-táptalajra oltották és hideg, fehér fényt adó fénycső alatt inkubálták. A sejtszaporodást az optikai sűrűség alapján 560 nm-nél mérték. 12 nap múlva a tenyészetek lineáris szaporodási fázisban voltak. A baktériumsejteket összegyűjtötték, ionmentes vízzel mosták, és így használták a kadmiumszorpciós kísérletekhez. A szaporodásgátlási vizsgálatokat úgy végezték, hogy log fázisban levő sejteket adtak ml tápoldathoz, amelyek különböző mennyiségű kadmiumot tartalmaztak (2, 4, 8, 16, 32 mg/l). A szaporodási sebességet 24 óránként meghatározták és a gátlókoncentrációt (IC 50 ) probit-elemzéssel állapították meg. A kétféle kadmiumkoncentrációnak (IC 50, 18,35 és 14,68 mg/l) kitett sejtmintákat transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgálták az expozíció után 24, 48 és 96 órával. A sejteket ezután mosták foszfátpufferrel (ph = 7,8), fixálták 2,5%-os glutáraldehiddel 48 órán át, majd 2 óráig 2%-os KMnO 4 -tal kezelték. Újabb mosás után 3%-os agaroldatot adtak hozzá. Megszilárdulás után a sejteket kis darabokra vágták, szárították acetonoldattal és beágyazták aralditba. Gyémántkéssel metszeteket készítettek, uranil-acetáttal és ólomcitráttal kettős festést végeztek, majd elektronmikroszkóppal vizsgálták. A kadmiumtörzsoldatokat úgy készítették, hogy CdCl 2 H 2 O-t oldottak ionmentes vízben. A szorpciós kísérletek során 4 g (száraztömeg sejthez 50 ml Cd-oldatot adtak, majd 26±2 C-on rázták. a ph-t 0,1 M salétromsavval vagy 0,1 M nátrium-hidroxiddal 4 8 közé állították be. A kísérleteket egy C-os inkubátorban végezték. A fémszorpcióhoz alkalmazott időközök: 5, 10, 20, 30, 45 és 60 perc. Az eluáló oldatot membránszűrővel (0,45 µm) választották el a biomasszától, majd a szűrlet ph-ját 2-re állították, és elemezték atomabszorpciós spektrofotométerrel. A bioszorpciós izoterma vizsgálatához a száraz sejttömeget konstansan tartották, míg a kiindulási kadmiumkoncentráció mintánként változott. Adatelemzés A szorpciós izotermák szerkesztéséhez a fémfelvételt (q) a következőképpen határozták meg: q = (C i C f ) V/W ahol: C i és C f a kezdeti, ill. végső kadmiumkoncentráció (mg/l), V a mintaoldat térfogata és W a hozzáadott biomassza száraztömege (g). A szorpciós adatokat beillesztették a Langmuir-izoterma modellbe: Q = q m bc f /(1 + C f ) ahol: q a fémfelvétel (mg/g), b a kötési állandó (mg/l).

3 A Langmuir-egyenlet linearizált formája: C/q = C f /q m + b/q m. Eredmények Szaporodási sebesség A 4, 8 és 16 mg/l kadmiumkoncentráció alig befolyásolta a sejtszaporodást (1. ábra). 32 mg/l kadmiumkoncentráció a kísérlet kezdetétől fogva teljesen gátolta a szaporodást. Bár az összes, vizsgált kadmiumkoncentráció sejtkárosodást váltott ki, de az egyes koncentrációk különböző hatásokat okoztak. Kis kadmiumkoncentráció hatására ( 8 mg/l) az első 48 órában kevés károsodott sejtet (duzzadt és töredezett) észleltek. Nagyobb koncentráció súlyos sejtsérülést okozott. Majdnem az összes baktériumfonal megduzzadt és töredezett. A sejtkárosodások ellenére képesek voltak növekedni és osztódni. 48 óra múlva 32 mg/l kadmium jelenlétében a sejtek flokkulációt mutattak, míg 96 óra elteltével a sejtek megsárgultak. Ez más kadmiumkoncentráció hatására nem észlelhető. Az IC 50 24, 48, 72 és 96 órakor 13,15, 16,88, 17,28, ill. 18,35 mg/l volt. 1,4 1,2 optikai sűrűség, 560 nm 1,0 0,8 0,6 0,4 0, idő, óra Cd 0 mg/l Cd 2 mg/l Cd 4 mg/l Cd 8 mg/l Cd 16 mg/l Cd 32 mg/l 1. ábra Kadmium hatása S. platensis szaporodására

4 Ultrastrukturális vizsgálatok A kadmium hatására megfigyelhető, legjellemzőbb sejtplazmajelleg a kis tilakoid membránokból (pigmenttartalmú göngyölegek) álló fotoszintetikus lemezek megjelenése. Ezenkívül számos gázvakuola figyelhető meg, amelyek fürtöket alkottak a sejt peremén. A sejtek néha karboxiszómákat tartalmaztak, amelyek szétszóródtak a sejtplazmában. A sejtkárosodás annál súlyosabb volt, minél hosszabb volt az expozíció. 24 óra múlva a membránok dezintegrációja figyelhető meg, és a gázvakuólák kezdtek eltűnni. 48 óra múlva még súlyosabb sejtkárosodás figyelhető meg (polifoszfát-testek megjelenése) és 96 óra elteltével a sejtek feloldódtak. Ezenkívül cianoficinszemcsék jelentek meg a plazmában. Kadmiumszorpció A S. platensis kadmiumszorpciója két lépésben megy végbe. Az első szakaszban egy kezdeti, gyors szorpció figyelhető meg: 5 percen belül a kadmium több, mint 78%-a eltűnik az oldatból (2. ábra). Az ezt követő, lassabb fázisban 30 percen belül egyensúly alakul ki, és a fém közel 95%-a adszorbeálódik. Ezért a 30 percet választották a kadmiumfelvétel vizsgálata során kontakt időként. eltávolított Cd %-a idő, perc 2. ábra Cd-oldatban (100 mg/l) szuszpendált S. platensis (4 g száraztömeg/l) fémadszorpciójának időbeli lefolyása

5 A kadmiumszorpciót jelentősen befolyásolja a ph (1. táblázat). A kadmium alig adszorbeálódik (0,91%) ph = 3 mellett, de a folyamat felgyorsul ph = 3 fölött. A sejtek jól adszorbeálják a kadmiumot ph = 4 8 között. A maximális kadmiumfelvétel 95,93% volt, ph = 7-nél és ph = 8-nál kiegyenlítődik. 1. táblázat ph és hőmérséklet hatása a S. platensis Cd-adszorpciójára ph % Cd-eltávolítás Hőmérséklet ( C) % Cd-eltávolítás ,91±0,41a 72,67±0,62b 74,83±2,25c 91,85±1,29d 95,93±0,64e 86,86±1,21f A betűkkel jelölt átlagértékek szignifikánsan eltérnek P 0,05-nél. 93,746±0,348 94,0,33±0,883 94,024±0,853 94,166±1,16 A hőmérséklet hatását a szorpcióra ph = 7 mellett 30 percig vizsgálták. Megfigyelték, hogy C között a fémfelvétel nem különbözik szignifikánsan (P 0,5). Cd-koncentráció, mg/l vizes oldatban maradt Cd koncentrációja a sejtek Cd-felvétele kezdeti Cd, mg/l 3. ábra Cd-koncentráció 30 perc adszorpció után és a S. platensis Cd-felvétele

6 A kadmiumszorpció megvilágítására az adszorbeált sejteket 10 mm EDTA-val erős kelátképző anyag mosták. 10 perc múlva a kadmium kb. 78%-a adszorbeálódott a sejtek felületére, de nem épült be a sejtekbe (3. ábra). A kadmiumszorpció jól megfelel a Langmuir-modellnek (4. ábra). A maximális szorpciós kapacitás (q max ) 98,04 mg Cd/g, míg a kötési állandó 0,076 volt. q, mg/g C f, mg/l 4. ábra Az S. platensis Langmuir-izotermája különböző Cd-koncentrációnál Értékelés A nagyobb kadmiumkoncentráció hatására elpusztultak a baktériumsejtek, míg a kisebb koncentráció enyhén gátolta a szaporodást. A külső felületre való adszorpció az első védekezési mechanizmus a toxikus nehézfémekkel szemben. Amikor a külső adszorpció eléri a telített fázist, megkezdődik a belső felvétel, különösen nagy nehézfém-koncentráció hatására. A mikroorganizmusok nehézfémfelvétele két egy kezdeti gyors és egy későbbi lassú szakaszban megy végbe. Az első fázisban a fémionok adszorbeálódnak a mikroorganizmusok felületére, míg a másodikban a sejthártyán keresztül a plazmába vándorolnak. Egyesek megfigyelték, hogy az Anabaena cianobaktérium esetében az ólom-foszfát mind a sejtfalon, mind a sejt belsejében kicsapódik. Ez megerősítette, hogy a sejtburokba igen gyors, míg a sejt belsejébe lassúbb

7 a fémfelvétel. A szaporodás gátlása fokozódik a közegben levő kadmium koncentrációjával arányosan. Az elektronmikroszkópos megfigyelések szerint kadmiumexpozíció hatására a sejtben levő tilakoid membránok károsodnak, ami a fotoszintetikus aktivitás és szaporodás csökkenését jelzi. Újabb vizsgálatok szerint egyes cianobaktériumok fotoszintetikus struktúrái vagy organellumai (kloroplasztisz) a kadmium célszervei, ahol gátló hatást fejt ki. Közölték, hogy cianobaktériumokban nehézfémek hatására megszaporodnak a polifoszfáttestek (PPB), így ezek valószínűleg a fémadszorpció helyei. A PPB-ben levő polifoszfát erősen negatív felszíni töltése az itt előforduló lipidekkel és fehérjékkel együtt együttesen elősegíti a fémadszorpciót. Cink hatására a PPB-k száma növekedett az Anabaena sejtjeiben. A S. platensis sejtjeinek vizsgálata is azt mutatta, hogy növekszik a PPB-k száma az expozíciós idő meghosszabbodásával. A PPB-k foszforon kívül még magnéziumot, nátriumot, káliumot, vasat és rezet is tartalmaznak. Feltehetően a PPB-k funkciója nem csak a foszfortárolás, hanem méregtelenítő mechanizmusként is működnek. A jelenlegi vizsgálat során a S. platensis nagyfokú kadmiumtörést mutatott és IC 50 -értéke nagyobb volt az eddig közölt típusoknál. A legtöbb cianobaktérium tartalmaz cianoficin-szemcséket, amelyek arginin-aszpartát-tartalmú, nitrogénraktározó polimerek. Ezek a szemcsék nagy mennyiségben felhalmozódnak olyan sejtekben, amelyek különböző környezeti viszonyoknak (foszforhiány, nátrium- és vashiány) és rovarölő szereknek (triklorofon) vannak kitéve. Valószínűleg ezek a szemcsék a sejt belső méregtelenítő rendszerének részét alkotják. A tenyészet ph-ja csökkentheti a kadmium toxicitását, mivel megváltoztatja formáját. A cianobaktériumok jól szaporodnak még ph = 8 mellett is. Ilyenkor a kadmium kicsapódik és komplexet képez az OH-csoporttal. Megfigyelték, hogy a Cd 2+ gátló hatása nagyobb, mint az ugyanolyan koncentrációban jelen levő Cd(CN) 4 2+ komplex ioné. A kísérlet folyamán a S. platensis kadmiumszorpciójának gyors fázisa 5 percig tartott. Mások szerint a Chroococcus 1 percen belül megkötötte a Cd-ot, Zn-et és Cu-et. Mások közölték, hogy a Chlorella az első 6 perc során gyorsan felvette az uránt. A nehézfémek gyors felvétele igen jelentős, ha a sejteket szennyvíztisztítás során alkalmazzák. Azonban a kezdeti, gyors fázis intenzívebb nagyobb sejtkoncentráció mellett. A Langmuir-izoterma modellt általában használják fémeknek mikrobafelületre való szorpciójának leírására. Az adszorpciós karakterisztika (q max ) megfelel a maximális fémionfelvételnek. Az adszorpciós izoterma lefutása is fontos és egy meredek izoterma kis maradékkoncentrációjú szorbát esetében előnyös, mivel a szorbens nagy affinitására utal. A jelenlegi vizsgálat során kimutatták a S. platensis nagyfokú kadmiumfelvevő kapacitását (q max = 98,04), valamint az erős affinitást egy meredek bioszorpciós izoterma is alátámasztotta.

8 Ez a faj más cianobaktériumokhoz képest nagyobb szorpciós kapacitással rendelkezik, amely más mikroorganizmusok (Pseudomonas, Penicillium) adszorpciós képességét is meghaladta. Ezért a S. platensis igen vonzó bioszorpciós anyag szennyvíztisztító rendszerek számára. Leírták, hogy a nehézfémek bioszorpciója hatékonyabb és olcsóbb, mint a kvaterner szennyvíztisztító eljárások. A spirulinából és más algafajokból készült kereskedelmi terméket alkalmaztak mind az ipari, mind a házi szennyvizek kezelésére. Megfigyelték, hogy a nitrogén 87%-a és a foszfor 60%-a távolítható el S. maxima alkalmazásával. A hidrogénionok fontos szerepet játszanak a többkomponensű szorpcióban, mivel a kadmiumeltávolítást szignifikánsan befolyásolja az oldat kezdeti ph-ja. A zöldmoszatok és cianobaktériumok kadmiumfelvétele fokozódik a ph emelkedésével. A fémkationok ph-függése akkor figyelhető meg, ha a sejtfelszíni fémkötő hely egy protonnal kapcsolódik, amely versenyez a fémionokkal. A kísérleti eredmények szerint a kadmium jól adszorbeálódik ph = 4 8 között, efelett oldhatatlan kadmium-hidroxid képződik, és így a valódi szorpciót nem lehet vizsgálni. Igen alacsony ph-jú oldatot használni lehet a szorbens deszorpciójához, EDTA helyett. Bioszorpció után megfigyelték az oldat ph-jának emelkedését. Egyesek szerint ez egyes sejtplazmakomponensek oldódásának vagy néhány ion (pl. karbonát) oldatba kerülésének következménye lehet. Ezenkívül a ph emelkedése abból ered, hogy a biomassza protonokat köt meg az oldatból. A mikroorganizmusok nehézfémfelvétele (0 50 C között) független a hőmérséklettől. Ez arra utal, hogy a bioszorpcióban nem vesznek részt anyagcsere-folyamatok vagy a sejtek energiaigénye. Megfigyelhető, hogy a hővel elölt sejtek fokozzák a biomassza bioszorpciós kapacitását. Következtetések A S. platensis igen alkalmas kadmium eltávolítására szennyvízből, mivel gyorsan adszorbeál és nagy a szorpciós kapacitása. Ezenkívül igen széles ph- és hőmérséklet-intervallumban képes megkötni a kadmiumot. A baktérium élő és elhalt sejtjei egyaránt jól tolerálják a kadmiumot, így eredményesen alkalmazható szennyvíz fitoremediációjára. A S. platensis jelentős képességgel rendelkezik nehézfémszennyezés fitoremediációjára, mert: a) kadmiumszorpciós kapacitása nagyobb, mint egyéb mikroorganizmusoké; b) hatékonyan megköti a kadmiumot ph = 4 8 között; c) a kadmiumszorpcióban nem szerepelnek sejtanyagcsere-folyamatok vagy energia, mivel hőmérséklettől független; d) szűréssel könnyen elválasztható az oldatból;

9 e) kevés tápanyag jelenlétében is jól szaporodik; így megelőzhető más mikroorganizmusokkal való szennyeződés; f) olcsón tenyészthető szabadban vagy laboratóriumban; g) jól szaporodik állóvízben, szubtrópusi és trópusi vidéken. (Dr. Pálfi Ágnes) Rangsayatorn, N.; Upatham, E. S. stb.: Phytoremediation of Spirulina (Arthrospira) platensis: biosorption and toxicity studies of cadmium. = Environmental Pollution, 119. k. 1. sz p Costa, A. C. A.; Franca, F. P.: Short communication: cadmium uptake by Spirulina maxima: toxicity and mechanism. = World Journal of Microbiology and Biotechnology, 14. k p