A kenetek laboratóriumi feldolgozása, az optimális minőség elérése CHALUPA ISTVÁNNÉ

Átírás

1 A kenetek laboratóriumi feldolgozása, az optimális minőség elérése CHALUPA ISTVÁNNÉ 2017

2 Citológiai laboratóriumi munkafolyamatok a minta és a citológiai vizsgálatkérő lap átvétele a minta és vizsgálatkérő lapok beszámozása, egyedi labor sorszámmal történő ellátása a beteg adatainak és a kenet számának felvétele a labor informatikai rendszerébe a kenetek festése, lefedése és számozása akenetek előszűrése a citológiai szakasszisztensek által alaboratóriumban alkalmazott minőségellenőrzési eljárásoknak megfelelően a kenetek újraszűrése citopatológusszakorvos vagy egy második citológiai szakasszisztens részvételével a kiszűrt kenetek bemutatása a citopatológus szakorvosnak a leletek elkészítése és postázása a vizsgálatot kérő számára a leletek, vizsgálatkérő lapok és a kenetek archiválása

3 A citológiai minták átvétele Laboratóriumi átvételkor a keneteken és a vizsgálatkérő lapokat egyeztetni kell A keneten és a kérőlapon szereplő azonosítónak meg kell felelnie egymásnak: -a páciens neve és születési dátuma - a páciens TAJ vagy személyazonosító száma - ambuláns napló sorszáma - vonalkódos azonosítás

4 Fontos: A keneten és a vizsgálatkérő lapokon lévő azonosítóknak pontosnak és azonosnak kell lennie megakadályozva ezáltal a kenetek végzetes következménnyel járó összecserélését.

5 Feldolgozásra alkalmatlan kenetek: jelöletlen tárgylemez tartós jelölés nélküli vagy papír címkés tárgylemez tárgylemez citológiai vizsgálatkérő lap nélkül túl sok darabra tört és nem javítható tárgylemez törött tárgylemez, amely javítható a leleten fel kell tüntetni a feldolgozásra nem került keneteket a leleten jelölni kell

6 Fixálás A pontos citológiai diagnózis előfeltétele a tökéletes fixálás Megfelelő fixálószer - gyorsan a sejtekbe hatol - megvédi a sejteket a kiszáradástól és az összezsugorodástól - megőrzi a minta szerkezeti jellegzetességeit: nem oldja fel vagy torzítja a sejtalkotókat - inaktivája az autolitikus enzimeket - lehetővé teszi a festést és a differenciálást - fokozza a sejtkomponensek és szövetek festődési tulajdonságát -tisztán kihangsúlyozza a magrészleteket, hozzájárulva a malignus sejtek könnyebb azonosításához - segíti a sejtek tapadását a tárgylemez felületére - megállítja a sejtek és a mikrobák növekedését

7 Nedves fixálás A frissen elkészített kenetek azonnali elmerítése folyékony fixálószerbe A gyors fixálás szükséges ahhoz, hogy a sejtrészleteket megőrizzük Ideális eljárás nőgyógyászati és nem nőgyógyászati citológiában

8 Fixálás módjai Immerziós fixálás: - a keneteket belemerítése a fixáló szerbe percre -hatása: vízkivonás, mely a szerkezetet és kémiai struktúrákat nem módosítja Spray fixálás - alkohol és polietilén-glikol vizes oldata Alkoholos fixálás előnyei: - az alkohol kb.10 perc múlva elpárolog - a minták szárazak, festhetőek, tárolhatóak és szállíthatóak

9 Rutin fixálószerek 95%-os etil-alkohol ideális, legelterjedtebb fixálószer éter-alkohol keverék kitűnő fixáló, de veszélyes a fokozott párolgás miatt 100%-os metil-alkohol elfogadható helyettesítője a 95 %-os alkoholnak 96%-os propil-alkohol és izopropil-alkohol helyettesítheti a 95%-os alkoholt denaturált alkohol

10 Fixálási idő Minimális fixálási idő 15 perc Meghosszabbított fixálás (néhány nap vagy néhány hét) nem hat a sejtek morfológiájára

11 Spray fixálás alkohol és polietilén-glikol vizes oldata gyors és egyszerű a még nedves keneteken kell alkalmazni vékony rétegben beterítia sejteket, megállítja a sejtek kiszáradását kb.20 cm távolságból kell alkalmazni, hogy elkerüljük a lehetséges sejtvesztést festés előtt a polietilén-glikoltkenetek felületéről vizes alkoholos áztatással kell eltávolítani

12 Festődést meghatározó tényezők Fixálás Festést megelőző kezelések által kialakított sejt-és szöveti ph Oldószer Festési idő

13 A festés minősége Rosszul kivitelezett festés okozhat: Halvány festődést Túlfestődést Megváltoztatja a sejt morfológiáját, mag-plazma arányt Szerepet játszhat a sejtkép helytelen értékelésében: álnegatív és álpozitív esetek előfordulásának forrása lehet

14 Egyenletes, megfelelő minőségű festéshez szükséges Rendszeresen szűrt és ellenőrzött festék Festékcsere: - Meghatározott számú festett kenet után - Meghatározott idő eltelte után A festék minőségét minden nap ellenőrizni és dokumentálni kell Az optimálistól való eltéréseket azonnal fel kell jegyezni, a problémákat azonosítani és javítani kell Minden problémát és javító folyamatot dokumentálni kell Ha a festés minősége elfogadható és a kenetek megfestődtek, azok átadhatók szűrésre

15 Fontos: A nőgyógyászati keneteket meg kell védeni a nem nőgyógyászati minták átszennyeződésétől Ha egyetlen festősor van beállítva az oldatokat cserélni vagy szűrni szükséges nőgyógyászati és nem nőgyógyászati minták között

16 Papanicolaou(PAP) festés Több lépésből álló, egyszerű, gyorsan elvégezhető festési eljárás Magfestés: Harris hematoxilin Citoplazma festés: orange G polikróm festék (eozin azúr)

17 1. lépés 2.lépés 3.lépés PAP festés 1. lépés : magfestés -Harris-hematoxilin 2. lépés: citoplazma festés- orange G 3. lépés: citoplazma festés-polikróm festék

18 Harrishematoxilin sejtmagot festi - kromatin, maghártya mélykék - magvacska: vörös, piros

19 Orange-G citolazma festő: -keratintartalmától függően sárga, vagy narancsvörös - felismerhetővé teszi: hiperkeratózis HPV fertőzés laphámák

20 Polikróm festék eozin-azúr citoplazma festő - eozin-y, light green, Bismark barna alkoholos oldata - savanyú, bázikus, és amfoterm festék keveréke - -acidofilcitoplazmájú sejtek az eozint kötik meg, halvány piros és sárga közötti árnyalattal festődnek - Bazofilcitoplazmájú sejtek a lightgreenhezmutatnak affinitást és halványkékzöldeskék színűek - Bismark-barna hozzájárul a festékoldat stabilitásának megtartásához

21 Eozin Y eozin Y-nal festődő sejtek, sejtalkotók: - érett laphámsejtek - magvacska - csillószőr

22 Light green Light green-nel festődő sejtek: intermedier sejtek parabazál sejtek

23 Papanicolaoufestés sajátságai intenzív, részlet gazdag magfestést biztosít differenciált kontrasztfestést nyújt transzparens citoplazma festődést eredményez

24 Papanicolaou festés sajátságai intenzív, részlet gazdag magfestés rosszindulatúság citológiai elbírálásánál igen lényeges szempont

25 Papanicolaou festés sajátságai differenciált kontrasztfestés -a mag és a citoplazma jól elkülöníthető egymástól -a citoplazmát többféleképpen tudja megfesteni, a bazális rétegből származó sejtek citoplazmája mélyzöldre, a felületesebb eredetű sejtek narancsvörösre színeződnek -különböző lényeges tulajdonságait képes érzékeltetni -megkönnyíti a sejtek típusának pontos meghatározását

26 Papanicolaou festés sajátságai transzparens citoplazma festődés a megfestett citoplazma áttetsző marad, így az egymásra rétegződött sejtek vagy vastag kenetek is vizsgálhatók

27 Papanicolaou festés típusai progresszív magfestés technika 1. magfestés végpontig 2. folyó csapvizes öblítés: kékítés, festék tartós fixálása regresszív magfestés technika 1. Harris-hematoxilinnal való túlfestés 2. felesleg eltávolítása savas differenciálással 3.folyó csapvizes öblítés: kékítés, festék tartós fixálása

28 Sikeres festés előfeltételei 1. kémiailag megfelelő festékek, melyek biztosítják a megfelelő színt 2. kölcsönösen egymástól függő, kiegyensúlyozott festési idő, mely megengedi mind a 4 festék felvételét 3. öblítések, melyek eltávolítják a felesleges festékmennyiséget 4. a festék gyakori cseréje és az öblítések biztosítják a reprodukálható, célravezető eredményt Az ajánlott metodikától való eltérés festési hibákhoz vezethet

29 Festési hibák sejtmag festési hiba citoplazma festési hiba kenet egészének festési hibája

30 sejt morfológia elmosott Festési hibák mag/plazma arány elmosott mag membrán és struktúra nehezen megítélhető halvány magfestődés a mag/citoplazma kontraszt elmosott

31 Fakó hematoxilin festés: nemcsak halvány magfestést, hanem egyenetlen citoplazma festődést is okozhat, oka lehet a highgrade lesio eltévesztésének

32 Festési hiba makroszkóposan az összes lemez rózsaszínű,narancssága vagy szürke oka: szárítókemence hőmérséklete túl magas javítás: meg kell ismételni a mintavételt fakó rózsaszínű és degenerált megjelenés hisztológiai mintákkal együtt tárolt vagy szállított kenetek, oka a formalin javítás: gondoskodni kell a formalinos edények és a kenetek elkülönített szállításáról sejtek fakó szürke megjelenése oka : vizet tartalmazó víztelenítő és mosófolyadék, polietilén-glikol fedőréteg nem lett eltávolítva festés előtt a lemezekről javítás: víztelenítő és mosófolyadék rendszeres cseréje, festés előtti vizes alkoholos áztatás idejének növelése opálos, fehér elszíneződés a kenetek hátoldalán oka: kékítő oldat nem lett eltávolítva a lemezekről (progresszív PAP festés), javítás: 2 különálló vizes öblítés használata festékcsapadék oka: festékoldatok nem megfelelő cseréje és szűrése javítás: festékoldatok rendszeres cseréjének és szűrésének biztosítása gomba szennyeződés oka: kenetek gombával való beszennyezése festés alatt javítás: festékoldatok rendszeres cseréje és a festőkádak fertőtlenítése

33 Sejtmag festési hibái sötét sejtmag oka: túl hosszú idő Harris hematoxilinben nem elég idő HCl-ben vagy koncentrációjal alacsonyabb az ajánlottnál javítás :idő intervallum csökkentése halvány magfestődés oka: polietilén-glikol fedőréteg nem lett eltávolítva festés előtt a lemezekről javítás :festés előtti vizes alkoholos áztatás idejének növelése oka: HCl koncentráció magasabb az ajánlottnál javítás :idő csökkentése megfelelő mennyiségű HCl használata oka: nem elég idő Harris-hematoxilinben javítás :festési idő növelése oka: Hematoxilin vizes hígulása (ha víz nem megfelelően folyt le a tárgylemezekről) javítás :biztosítani kell, hogy a festőautomata karja megfelelően működjön oka: ha a festék nincs cserélve rendszeresen a hematoxilin kifárad javítás :előírásos mennyiségű kenet után a festéket cserje

34 Citoplazma festési hiba Egyenetlen festődés - fixálás előtti levegőn száradás jelezni kell a mintavételt végző nőgyógyásznak vagy védőnőnek - polietilén bevonat elégtelen eltávolítása festés előtti vizes alkoholos áztatás idejének növelése - az oldatok nem megfelelő szintje a festőkádakban ellenőrizni kell az oldatok szintjét -túl sok idő hematoxilinben vagy nem megfelelő eltávolítása OG és EA festés előtt festési idő csökkentése -a lemezek túl sokáig maradnak az OG vagy EA-tkövető alkoholos öblítőben öblítési idő csökkentése

35 Citoplazma festési hiba Egyenetlen festődés - oldatok közötti elégtelen öblítés az alkohol rendszeres ellenőrzése és cseréje - festékoldatok utáni elégtelen öblítés alkoholos öblítés idejének növelése - csapvíz és desztillált víz ph-ja nem eléggé lúgos ph ellenőrzése -EA ph-ja nem megfelelő(max.4,5-5,0) ph ellenőrzése -EA kimerült előírásos mennyiségű kenet után a festéket cserje

36 Festési hibák hematoxilinnalvaló túlfestés eredményezhet erős háttérfestődést, és a mag és a citoplazma elkülönítésének nehézségét

37 Festési hiba kimerült festékoldat okozhatja a magok pirosas festődését

38 rosszul elkészített vagy kimerült EA-oldat eredményezheti a fakó citoplazma festődést és a kontrasztos festődés hiányát

39 Beszáradt kenetek fixálás előtt a sejt és a sejtmag mérete megnő kromatinszerkezet nem látható a citoplazma több eozint köt meg

40 formalin hatása a szövettani mintákkal együtt tárolt keneteken kromatinszerkezet nem látható módosul a citoplazma festődése

41 Hajtóanyag szennyeződés spray fixálás estén fordul elő, ha a fixáló majdnem üres és a spray többnyire hajtóanyagot és kevés alkoholt tartalmaz a sejtek sötétebbre festődnek a normálisnál, fedve vannak szürkéskék árnyalattal és finom szemcsékkel a probléma kiigazítható egy éjszakás 2%-os HCl-os áztatással és újrafestéssel(b)

42 Víztelenítés és mosás Festést követő mosó folyadék, növekvő alkohol sor: az utolsónak színtelennek kell lennie és refraktív indexének közel kell állnia a fedőlemezhez, tárgylemezhez, és a fedőanyaghoz, legáltalánosabban használt: xylol Xylol használata: jól szellőző helyen vagy vegyi fülke alatt kell alkalmazni, hogy limitáljuk a a vele való expozíciót

43 A kenetek fedése A fedőanyag: - létrehoz egy tartós réteget a tárgylemez és a fedőlemez között, - összeférhetőnek kell lennie a mosófolyadékkal - refraktív indexe hasonló mint a tárgylemezé és a mintáé Szerepe: - megvédi a sejteket kiszáradástól, zsugorodástól - megakadályozza a festék kifakulását Fedéshez szükséges: -erős fény - szellőztetés - védőszemüveg - elvárás a fedőlemez alkalmazása, a csónaklakk használata nem elfogadható

44 A kenetek fedésének lépései Manuális fedés 1. tárgylemez eltávolítása a xylolból egyesével, hogy elkerüljük a sejtek felületének száradását 2. fedőanyag azonnali rácseppentése a tárgylemezre, hogy megakadályozzuk a kiszáradást, a zsugorodást és a buborék képződést 3. fedőlemez ráhelyezése a tárgylemezre, középre, úgy hogy ne érjen túl a tárgylemezen optimális fedőlemez méret 24X50 mm, vastagsága nem több mint 0,17 mm használható műanyag fólia, ha megfelel a követelményeknek 4. szárítás mikroszkópos vizsgálat előtt a sejtréteg mozgásának csökkentésére 16 óra szobahőmérsékleten 3-12 óra 37 Celsius fokon Automata fedés a gyártó használati utasításának megfelelően

45 Cornflake hatás barna szennyeződés valószínűleg abban az esetben keletkeznek ha az utolsó xylolos öblítést követően a kenetek későn kerülnek lefedésre

46 Kovamoszat vízzel terjedő szennyeződés

47 Alternaria levegő által terjesztett gomba kenetvételkor vagy feldolgozás során kerül a mintára

48 Penszgomba levegő vagy víz által közvetített szennyeződés általában a sejtek fókuszsíkja felett látható szegmentált, valódi hifákat alkotnak

49 Pollenszemcse felismerhető a bizarr, de szimmetrikus alakjáról és a relatíve nagy méretéről a tárgylemezen a fókuszsík felett jelenik meg

50 Pollenszemcse levegő útján terjednek jellemzőjük a vastag fénytörő sejtfal

51 Kartonpapír lenyomat csomagolási műtermék cellulóz rostokkal való érintkezés okozta mintázat akkor keletkezik, amikor a keneteket még a fixálótól nedvesen helyezik a karon kenettartóba

52 Minőségbiztosítás Célja: a tévedések és hibaforrások minimálisra való csökkentése Minőségbiztosítási rendszer: -belső -külső

53 Belső minőségbiztosítás Belső minőségbiztosítási rendszer(iqa) laboratóriumon belül, napi rendszerben működik ezek: festés minőségi ellenőrzése festék és mosó oldatok ellenőrzése

54 Minőségellenőrzési és minőségbiztosítási szabályok - Standard működési eljárások, melyek biztosítják a festési eljárás betartását - Reagensek, fixáló és festékek egyértelmű címkézése és megfelelő feltételek mellett való tárolása - A használt reagensek és törött tárgylemezek rendszeres ártalmatlanítása - Napi feljegyzést kell vezetni a mosó-és festékoldatok feltöltéséről és cseréjéről festékoldatokat gyakrabban kell cserélni meleg időben vagy nagy mennyiségű kenet után

55 Minőségellenőrzési és minőségbiztosítási szabályok - Gyakorlott laboratóriumi személyzet naponta ellenőrizze a minőségi festést: magfestés intenzitása magkromatin szerkezete eozinofil és cianofil citoplazma festődés víztelenítés minősége fedés tisztasága - Évente ellenőrizni kell véletlenszerűen kiválasztott keneteken a festés gyengülését és kiszáradását Jól festett kenetek festés intenzitása legalább 10 évig megőrzött - A laboratóriumnak meg kell felelnie az egészségügyi és biztonsági feltételeknek

56 Alkohol minőségi ellenőrzése A napi karbantartás és menetrend része az alkoholok festék telítettségének ellenőrzése A festő sorban a festékhez lévő legközelebbi alkoholt el kell távolítani a többi alkoholt átmozgatni az előtte lévő pozícióba, majd az utolsó helyen lévő pótolni szükséges.

57 Festék minőségi ellenőrzése Hematoxilin kimerülés ellenőrzése: - a festék szűrése után a szűrőpapíron mély lila gyűrű keletkezik, ha a gyűrű színe barna vagy barnás zöld friss festéket kell használni - egy üveg csapvízbe 5-6 csepp festék cseppentése, ha a víz mély lila színű marad, a festék megfelelő. Ha a víz színe barna vagy barnás zöld színűre változik a festék oxidálódott és le kell cserélni

58 Festés minőségi ellenőrzése lépései: 1. kontroll kenet megfestése a festési eljárás alapján 2. mikroszkópos értékelés 3. festési idők állítása, ha szükséges a legjobb festési minőség eléréséhez

59 Külső minőségbiztosítás Külső minőségbiztosítási rendszereket (EQA) egy külső szabályozó testület alkalmaz. - Keneteket biztosít a résztvevő laboratóriumoknak festés céljára - Festett kenetek kiértékelése megadott szempontok alapján : magfestés: megfelelő, erős, gyenge, részletszegény citoplazma festődése: megfelelő, erős, gyenge, részletszegény - A laboratórium értesítése a festés minőégéről.

60 Köszönöm a figyelmet!