Budapesti Mőszai és Gazdaságtudományi Egyetem Alalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszé ÖKOTOXIKOLÓGIAI MÓDSZEREK VÍZI TESZTORGANIZMUSOKKAL Laborgyaorlat 2010
Tartalomjegyzé Bevezetés... 2 1. Algateszt... 3 2. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt... 5 3. Lemna minor béalencse szaporodásgátlási teszt... 6 4. Heterocypris incongruens édesvízi agylósrá letalitási teszt... 8 5. Daphnia aut immobilizációs teszt... 10 6. Halteszte... 11 7. A tesztorganizmuso fenntartásához illetve a teszte során használt tápoldato, tenyésztıvize receptjei:... 12 8. A tesztleíráso során felhasznált forráso:... 13 Bevezetés Az öotoxiológiai teszteet ét fı szempontból csoportosíthatju: - Tesztelés idıtartalma - Tesztorganizmus faja illetve a tesztrendszer fajösszetétele A tesztelés idıtartalma alapján megülönböztetjü az aut (rövid idıtartam) és a rónius (hosszabb idıtartam) teszteet. Az aut teszteben alalmazott tesztorganizmuso esetében a tesztelési idı (24, 48 illetve 72 óra) alatt nem jellemzı a reprodució. A rónius teszte idıtartama a tesztorganizmus életidejétıl illetve reproduciós cilusána hosszától függ. A rónius tesztre jellemzı, hogy a teszt idıtartama az alalmazott tesztorganizmus életéne nagy részét magában foglalja. A tesztrendszer fajösszetétele alapján megülönböztetjü az egy- illetve a több fajt alalmazó teszteet. Egy fajt alalmazó teszte esetében beszélhetün továbbá szárazföldi, vízi és üledélaó tesztorganizmusoról A örnyezeti elem szerinti megülönböztetés azért fontos, mert ettıl függıen az expozíciós útvonala is eltérıe lehetne. Vízi teszte esetében aor szimulálju megfelelıen az expozíciót, ha az egész testet éri a vegyi anyag vagy a vizsgálni ívánt minta. Szárazföldi teszte esetében is mód van olyan tesztörülménye és tesztorganizmus iválasztására, mely teljes testfelülettel érintezi a talajjal (pl. földigiliszta, Collembola, stb.). Az üledélaó esetében még összetettebb expozíciós útvonala létezhetne az üledéel való özvetlen érintezés öveteztében. A tesztorganizmuso helyes megválasztása az öotoxiológiai teszte ritius pontja. A tesztorganizmusona meg ell felelnie a övetezı övetelményene: - Könnyen hozzáférhetı faj legyen - Laboratóriumi örülménye özött fenntartható és tenyészthetı legyen - A tenyészet története és genetiája ismert legyen - Érzéeny legyen több típusú vegyi anyagra - Jól mérhetı végponttal rendelezzen és reproduálható eredményt adjon - Ne legyen patogén - Jól reprezentálja osztályát vagy trofius szintjét Az öotoxiológiai mérés végpontja a bioémiai szinttıl az organizmus és özösség szintjén eresztül az öoszisztéma szintjéig bárhol megválasztható a cél függvényében. A mérhetı végpont eredménye alapján gyaran további származtatott értéeet használun fel a ocázat mértééne megállapításához, döntése elıészítéséhez. Meg ell ülönböztetnün a mérés végpontját, amely nem más, mint a tesztorganizmuson vagy más szinten özvetlenül mért érté, és a teszt számítással származtatott vizsgálati végpontját. Gyaori mérési végpont a stresszfehérjé megjelenése, enzime ativitása, fényibocsátás, mozgáséptelenség, halál, stb. A mérési végpontoból származtatott eredmény többletinformációt szolgáltat, pl.
fényibocsátásból relatív lumineszcenciagátlás, enzimativitásból integrált érté a mérési idıszara vonatozó görbe alatti terület, mozgáséptelen/ elpusztult állato számából a oncentráció-hatás görbe egyezményes pontjai (20 illetve 50%-os gátláshoz tartozó oncentráció: EC 20 és EC 50 ). 1. Algateszt Az egysejtő algáat felhasználó tesztene számos változata van: több fajt is lehet alalmazni, a sejtszaporulat meghatározására is többféle módszer létezi, és a tesztszervezet expozíciós idejét teintve is válogathatun a szabványosított és nem szabványosított módszere özül. 96 órás alganöveedési teszt a toxius vegyi anyagona az elsıdleges termelıre gyaorolt gátló hatását vizsgálja. Tesztorganizmusént édesvízi és tengeri algáat használhatun. Az ASTM (American Society for Testing and Materials) az alábbi algáat ajánlja tesztelésre: Édesvízi algá: - Zöld algá: Selenastrum capricornutum, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris - Ké algá (cianobatériumo): Microcystus aeruginosa, Anabena flos-aquae Tengeri algá: - Kovamoszato: Seltonema costatum, Thalassiosira pseudonana - Ostoros moszato: Dunaliella tertolecta 1.1. A teszt jellemzıi Teszt típusa: Egy fajt alalmazó, laboratóriumi, aut toxicitási teszt Tipius alalmazási területe: Vízben oldható vegyi anyago; felszíni vize, talajvize, szennyvize toxiológiai vizsgálata. Tesztorganizmus: egysejtő, édesvízi algafajo: Pseudoirchneriella subcapitata (Selenastrum capricornutum, Raphidocelis subcapitata), Scenedesmus subcapitus, Chlorella vulgaris, Scenedesmus obtusiusculus (Senedesmus bijugus) Mérés végpontja: optiai denzitás értée Teszt vizsgálati végpontja: EC 20 és EC 50 értée Szüséges mőszer: miroszóp vagy fotométer A teszt idıtartalma: 24-96 h A teszt szabványosított formája: MSZ 21978-2:1986 Veszélyes hulladéo vizsgálata. Algateszt (metanolos lorofill extració) MSZ 21978-36:1989 Veszélyes hulladéo vizsgálata. A mérgezıépesség meghatározása algatenyészettel MSZ EN ISO 8692:2005 Vízminıség. Édesvízi alga növeedésgátlási tesztje egysejtő zöldalgafajoal ISO 8692:2004 Water quality - Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae OECD 201 Alga, Growth Inhibition Test (extració nélül) 1.2. A tesztorganizmuso bemutatása, fenntartása Az algateszt egysejtő édesvízi algafajoat használ, létezne olyan teszte, melye tengeri algáat vagy telepes felépítéső, maroalgáat alalmazna tesztorganizmusént, itt csa az édesvízi, egysejtőeel foglalozun. Néhány algatesztben használható faj miroszópos épe a 1 1., 1 2. és 1 3. ábráon látható.
1-1. ábra Chlorella vulgaris miroszópos épe 1-2. ábra: Pseudoirchneriella subcapitata miroszópos épe 1-3. ábra: Scenedesmus subspicatus miroszópos épe (Culture Collection of Autotrophic Organisms) Az egysejtő algafajoat egyszerően fenntarthatju tápagaron és tápsóoldatban is. Az alga növeedéséhez 10:14 órás sötét:világos cilus, (megvilágítás paraméterei: fényerısség: 0,72x10 20 foton/m 2 s ± 20 %, 8000 lux, spetrum:400-700 nm, színhımérsélet 4200K) és 20-25 C szüséges. Sejtszaporulat vantitatív meghatározása özvetlenül az algaszuszpenzió optiai denzitásána (OD) mérése 670 nm (AlgalToxKit) vagy 750 nm-en (MSZ 21978-2:1986) sejtszámlálás Bürer-amrával metanolos extracióval, majd extinció mérése fotométerrel 750 nm-en és 665 nm-en (MSZ 21978-2:1986) 1.3. A mérés leírása A mérés során felhasznált tesztorganizmuso: - Chlorella vulgaris - Pseudoirchneriella subcapitata - Scenedesmus subspicatus A méréshez felhasználni ívánt algaszuszpenzió észítése Minden folyamatot steril füle alatt végzün. A teszt indításához megfelelı oncentrációjú algaszuszpenzióra van szüség. Ehhez friss alga tápoldattal mossu le az algasejteet az agar felszínérıl, majd Bürer-amra segítségével meghatározzu az algaoncentrációt. A teszthez az algaszuszpenzió iindulási sejtszáma 2 6x10 5 db sejt/ml legyen. A mérés ivitelezése A mérés során mirolemezeet használun tesztedényént. Minden cellába bemérün 100 µlt az elızıleg elészített és megfelelı sejtszámú (2-6*10 5 db sejt/ ml) algaszuszpenzióból, majd a már bemért algára szintén rámérün 100 µl tesztelni ívánt mintát. A teszt indításaor, majd 24 óránént mérjü a mirolemeze celláiban található algaszuszpenzió optiai denzitását 4 ülönbözı hullámhosszon (405, 450, 490, 630 nm) Dialab EL800 spetrofotométerrel. Az eredménye iértéelése és interpretációja A méréseet KC Junior nevő szoftver segítségével végezzü. A programmal a mért értéeet Excel fájlba exportálju. A mért OD értéeet az idı függvényében ábrázolva, majd görbét illesztve az összetartozó pontora, meghatározzu a szaporodási görbe alatti területet. 1. Szaporodásgátlási százalé iszámítása az egyes oncentráció vagy dózis értéehez, az öotoxiológiában szoásos módon történi:
N H = 100 H szaporodásgátlás (%) N ontroll tenyészet abszorbanciája ta N N min ta N min mérendı mintát tartalmazó tenyészet abszorbanciája 2. oncentráció/ dózis-válasz görbe észítés 3. a 20 és az 50%-os gátláshoz tartozó oncentráció vagy dózis megállapítása, vagyis az EC 20 és EC 50 értée meghatározása 2. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt Toxius fémere tapasztalatain szerint evéssé érzéeny tesztorganizmus a Tetrahymena pyriformis, egysejtő protozoa, szerves szennyezıanyago toxicitására viszont annál inább. A Tetrahyméná az öotoxiológiában is úgy, mint a sejtbiológiai és genetiai utatásoban, az euarióta sejtet épviseli. A Tetrahymena pyriformis vízben élı állati egysejtő (protozoa). A protozoá országán belül, a legfejlettebb fajoat magában foglaló csillós egysejtőe törzsébe (Ciliopora) tartozi. A Tetrahymena pyriformis mérete örülbelül 25 90 µm, nevét örtére emléeztetı alajáról, illetve a sejtszáj négy mozgó, hártyaszerő épletérıl apta. Külsı felületén sőrő, hajszerő bevonatot, épezne a csilló, melyene oordinált mozgását primitív idegrendszer irányítja. Kutatáso edvelt tesztorganizmusa, a önnyő fenntarthatósága, gyors szaporodása miatt, de fıént azért, mert sejtje soban hasonlít a nála jóval fejlettebb gerincese sejtjeihez. Az állato számána (sejtszám) változását nyomon övetve a vegyi anyago és örnyezeti mintá (talaj, üledé, felszíni és felszín alatti víz, továbbá szennyvíz) toxius hatása vizsgálható. A tesztmódszer Gruiz és Leitgib (2006) fejlesztetté i, ésıbb a módszer a BME ABÉT tanszéen továbbfejlesztésre erült. 2 1. ábra: Tetrahymena pyriformis miroszópos épe 2.1. A teszt jellemzıi Teszt típusa: Egy fajt alalmazó, laboratóriumi teszt Alalmas: Vízben oldható vegyi anyago; felszíni vize, talajvize, szennyvize toxiológiai vizsgálata Tesztorganizmus: Tetrahymena pyriformis, egysejtő állat A tesztorganizmus ora: 6 napos Mérés végpontja: sejtszám/ ml Teszt, vizsgálat végpontja: szaporodásgátlás Szüséges berendezés, eszöz: fénymiroszóp, Bürer-amra Tesztelés idıtartalma: 96 h A teszt szabványosított formája: nincsen 2.2. A tesztorganizmus bemutatása, fenntartása A Tetrahymena pyriformis utatáso edvelt modellállata, a önnyő fenntarthatósága, gyors szaporodása miatt, de fıént azért, mert sejtmembránjána összetétele, ulcsenzimjei és
bizonyos hormono (inzulin, adrenalin) termelése az emlısöel mutat hasonlóságot. Triptont és peptont tartalamzó tápoldatban (T-P tápoldat) tartju fenn ıet. Hetente 5 ml tápoldatba 100 µl sejtszuszpenziót oltun át az elızı átoltásból fenntartás céljából. Az átoltás során figyeljün arra, hogy a Tetrahyméná a sejtszuszpenzió felsı, oxigéndúsabb rétegében vanna, míg az alsóbb rétegben a halott sejte ülepedne i, ezért az átoltás elıtt ne everjü fel az inoulumot és anna felsı rétegébıl oltsun át. 2.3. Mérés leírása Inoulum elıállítása a teszthez A teszthez 6 napos tenyészetet használun fel, a iindulási inoulum sejtszámát úgy állítju be, hogy a ezdeti sejtszám az összeállított tesztoldatban 4 db/ml legyen A bemérendı minta mennyiségét örnyezeti minta típusa és a ísérlet célja-jellege szabja meg, mennyisége a tápoldattal együtt 30 ml legyen. A sejtszámláláso idıpontját sem határozzu meg pontosan, mert ezt is a szennyezıanyag típusána, hatásmechanizmusána megfelelıen, a legjellemzıbb idıpont szerint adju meg ehhez elıísérlete vagy orábbi tapasztalo eredményei szüségese. A mérés ivitelezése 1. A tesztözeg összeállítása: 100 ml-es lombioba 30-30 ml T-P tápoldatot, 468 µl antibiotium mix oldatot, a sejtszuszpenzióból 600 µl-t pipettázun és végül bemérjü a mintát. 2. Sejtszámlálás és mintavétel a tesztoldatból: örülbelül 24 óránént számolju meg a sejteet fénymiroszóp segítségével, minden mintavételnél 0,5 ml-t veszün i a felevert sejtszuszpenzióból, 20 µl 1 %-os formaldehid oldatot adun hozzá, majd egy 2 µl-es csepp sejtszámát Bürer-amrában fénymiroszóp segítségével 100 vagy 400-szoros nagyításban megszámolju. Ügyeljün arra, hogy a formaldehid hozzáadása után rövid idın belül számolju meg a sejteet, mert ipuadhatna. Az eredménye értéelése és interpretációja Meghatározzu a vizsgált mintá hígításaina százaléos sejtszám-változását a ontrollhoz viszonyítva, a apott százaléos szaporodásgátlási értéeet pedig a szennyezıanyag oncentrációval ábrázolva megállapítju az EC 20 és EC 50 értéeet az egyes idıpontoban. 3. Lemna minor béalencse szaporodásgátlási teszt Fıleg ét béalencse fajjal végezne toxicitási méréseet: Lemna minor és Lemna gibba. Ez a növény egyre népszerőbb tesztorganizmus apró méretüne és önnyő fenntarthatóságuna, gyors szaporodásuna öszönhetıen. 3.1. A teszt jellemzıi Teszt típusa: Egy fajt alalmazó, laboratóriumi, növényi, rónius teszt Alalmas: Vízben oldható vegyi anyago; felszíni vize, talajvize, szennyvize toxiológiai vizsgálata. Tesztorganizmus: Lemna minor Mérés végpontja: levélszám Teszt, vizsgálat végpontja: EC 20 és EC 50 Tesztelés idıtartalma: 7 nap A teszt szabványosított formája: A magyar szabvány elıészületben.
ISO 20079:2005 ISO Water quality -- Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on ducweed (Lemna minor) - Ducweed growth inhibition test OECD 1948054:2002 Lemna species Growth inhibition test 3.2. A tesztorganizmus bemutatása, fenntartása A béalencsé a víz felszínén úszó egysziő, lágyszárú vízinövénye. Nagyon elterjedt, gyorsan szaporodó évelı. Méretü 2-12 mm lehet. Virágai egyivarúa. Ritán virágozna, általában testü sarjadzásával szaporodna. A béalencsé szaporodási sebessége eltérı, a Lemna nemzetség duplázódási ideje laboratóriumi örülménye özött 0,35-2,8 nap. Az apró béalencse tömeges megjelenése eutrofizációt jelezhet. A béalencse fenntartása 20-25 C-on, idıszaos megvilágítás (8:16 órás sötét:világos cilus, 10 000 lux) mellett történi a Hoagland-féle tápoldatban. A tápoldatot hetente egyszer cseréljü a növénye alatt. 3 1. ábra: Lemna minor béalencse 3.3. A mérés leírása A mérés ivitelezése A tesztet 150 ml-es fızıpoharaban indítju, 3 párhuzamossal dolgozun. Kontrollént tápoldatot használun. A tesztoldatoból 50-50 ml-t mérün be a fızıpoharaba, tetejüre 10 10 darab étlevelő, sérülésmentes zöld színő béalencsét helyeztün. A fızıpoharara fóliát, hogy ne párolódjon, illetve szennyezıdjön be az oldat a teszt ideje alatt. Az összeállított ísérleti rendszereet 20 25 C-os termosztátban inubálju 7 napig megvilágítás mellett (8:16 órás sötét:világos cilus, Daylite, 10.000 lux). A tesztelési idı alatt minden nap adott idıpontban megszámolju a béalencsé leveleine számát. A levélszámból az eredménye iértéelése során az alábbiaban olvasható paramétereet számolju i. Eredménye iértéelése és interpretációja A. Paramétere iszámolása 1. átlagos szaporodási sebességet (µ i-j ) ln ( N j ) ln ( Ni ) µ i j = t t i j j i µ átlagos szaporodási sebesség az i-di és a j-di idıpont özött N i levélszám az i-di idıpontban N levélszám a j-di idıpontban j t i i-di idıpont t j-di idıpont j 2. szaporodásgátlási százaléot (I r ) ( µ C µ T ) Ir = 100 µ C
I r szaporodásgátlási százalé (%) µ a ontroll mintában lévı béalencse átlagos szaporodási sebessége C µ a vizsgált mintában lévı béalencse átlagos szaporodási sebessége T 3. átlagos duplázódási idı (T D ) ln 2 T = D µ i j T D duplázódási idı µ átlagos szaporodási sebesség a iindulási és a végpont özött i j 4. szaporodási görbe alatti területet (T) ln N1 ln N0 ln N1 + ln N2 2 ln N0 ln Nn 1 + ln Nn 2 ln N0 T = t + t t +... + tn t 2 2 2 T szaporodási görbe alatti terület N iindulási levélszám (db) 0 1 ( ) ( ) 1 2 1 n 1 N elsı leolvasásor (1. nap) számolt levele száma (db) N utolsó leolvasásor (7. nap) számolt levele száma (db) 1 n t elsı leolvasás idıpontja (1. nap) t másodi leolvasás idıpontja (2. nap) 2 t a teszt végéne idıpontja (7. nap) n 5. görbe alatti terület szerinti szaporodásgátlási százaléot (I T ) ( AC AT ) IT = 100 A A a ontroll minta görbe alatti területe C A a vizsgált minta görbe alatti területe T c B. oncentráció/ dózis-válasz görbe észítés C. a 20 és az 50%-os szaporodásgátláshoz tartozó oncentráció vagy dózis megállapítása, vagyis az EC 20 és EC 50 értée meghatározása A teszt eredményeine elfogadásához a övetezı feltételne ell teljesülnie: A ontroll oldatban lévı növénye duplázódási ideje nem haladhatja meg a 2,5 napot. 4. Heterocypris incongruens édesvízi agylósrá letalitási teszt A teszt újdonságát az adja, hogy eze a tesztorganizmuso a szennyezett üledéel/talajjal való özvetlen érintezésüne öszönhetıen a vizsgált özeg össztoxicitása (vízben oldott és nem oldott szennyezıanyagból adódó) mérhetı. 4.1. A teszt jellemzıi Teszt típusa: Egy fajt alalmazó, laboratóriumi, állati teszt Tipius alalmazási területe: Szerves és szervetlen vegyületeel szennyezett édesvízi üledée és talajo toxiológiai vizsgálata Tesztorganizmus neve: Heterocypris incongruens A mérés végpontja: az életben maradt állato száma A teszt, vizsgálat végpontja: EC 20 és EC 50 értée A teszt idıtartalma: 3 nap A teszt szabványosított formája:
A teszt szabványosított formában még nem létezi. 4.2. A tesztorganizmus bemutatása, fenntartása A agylósráo (Ostracoda) osztályába tartozó állato legjellemzıbb tulajdonsága a ettıs tenı, melybe a lágytest visszahúzódhat. Méretü 0,1 32 mm özött változi. Az állat testét meszes héj fedi, melyet egy rugalmas saropánt nyit és egy haránt izomnyaláb zár. Amior inıtté a héjat, levedli azt (vagyis elhagyja és újat növeszt). A héj hasítéából inyúli hét pár láb. Váltivarúa, de nem ismeretes még minden fajna a hímje. Mind megterméenyített, mind szőz peté révén is szaporodhatna. A agylósráo élhetne édes- és tengervizeben is. Fenélaó állat, mely túrja az iszapot. Többnyire algával illetve apró vízi szervezeteel táplálozna. Az állat fenntartása szőrt és levegızetett aváriumi vízben 20 25 C-on, idıszaos megvilágítás (8:16 órás sötét:világos cilus, 3000-4000 lux) mellett történi. Az állato táplálása egysejtő algával történi. 4 1. ábra: Heterocypris incongruens állat 4.3. A mérés leírása A ontroll méréshez használt vize elıészítése Elészítjü a standard vizet és leszőrjü az aváriumi vizet, majd mind a ettıt 24 h-n át levegıztetjü. A mérés ivitelezése A mérıedényebe bemérün 10 10 ml-t a tesztelni ívánt mintából, majd ezebe átemelün 10 10 darab tesztorganizmust. A mérés során 3 párhuzamossal dolgozun. A mérıedényeet lefedjü és 20 25 C-os termosztátban inubálju 3 napig 10:14 órás sötét:világos cilusú megvilágítás mellett. 24 óránént megszámolju az életben maradt állatoat. Eredménye iértéelése és interpretációja: 1. letalitási százalé iszámítása az egyes oncentráció vagy dózis értéehez, az öoxiológiában szoásos módon történi: N N min ta H = 100 N H letalitási százalé (%) N a ontroll/referencia üledében életben maradt állato száma(db) N min a mérendı üledében életben maradt állato száma (db) ta 2. oncentráció/ dózis-válasz görbe észítés 3. a 20 és az 50%-os letalitáshoz tartozó oncentráció vagy dózis megállapítása, vagyis az EC 20 és EC 50 értée meghatározása A teszt eredményeit csa abban az esetben fogadhatju el, ha a ontroll mérésben használt állato letalitási százaléa nem haladja meg a 20%-ot.
5. Daphnia aut immobilizációs teszt Ennél a tesztnél Daphnia magna és Daphnia pulex fajoat lehet használni. A Daphnia másépp vízibolha az egyi legelterjedtebb vízi tesztorganizmus. Teszteléshez a laboratóriumban nevelt harmadi generáció alalmazható. Szabványosított formában aut immobilizációs és rónius szaporodásgátlási teszt létezi. Az aut tesztnél 6 és 24 óránál ellenırizzü a tesztorganizmuso mobilitását, míg a rónius teszt minimum 14 napos, és a Daphniá szaporodását övetjü nyomon. Ez a leirat csa az aut teszttel foglalozi. 5.1. A teszt jellemzıi Teszt típusa: Egy fajt alalmazó, laboratóriumi, aut toxicitási teszt Tipius alalmazási területe: Vízben oldható vegyi anyago; felszíni vize, talajvize, szennyvize toxiológiai vizsgálata Tesztorganizmus neve: Daphnia magna, Daphnia pulex A mérés végpontja: Immobilizáció (mozgáséptelenség) illetve letalitás A teszt, vizsgálat végpontja: EC 20 és EC 50 értée A teszt idıtartalma: 6-96 h A teszt során felhasznált tenyészet ora: 24 órás A teszt szabványosított formája: MSZ 21976-18:1993 Települési szilárd hulladéo vizsgálata. Daphniateszt MSZ 21978-13:1985 Veszélyes hulladéo vizsgálata. Daphniateszt MSZ EN ISO 6341:1998 Vízminıség. A mobilitásgátlás meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea). Aut toxicitási teszt (ISO 6341:1996) MSZ ISO 10706:2002 Vízminıség. Anyago hosszú távú mérgezı hatásána meghatározása Daphnia magna Straus-on (Cladocera, Crustacea) OECD 202 Daphnia species, acute Immobilisation Test, Part I the 24 h EC50 acute immobilisation ntest, Part II the reproduction test (at least 14 days) 5.2. A tesztorganizmus bemutatása, fenntartása A Daphnia magna aár 5 mm-re is megnıhet, míg a D. pulex maximális mérete 2-3 mm, laboratóriumunban Daphnia magna-val dolgozun. A Daphniá szőznemzéssel szaporodna, egy nıstény általában egyszerre 4-10 ivadéna ad életet (ez idısza alatt a ielt lárvá is nısténye). Az embrió fejlıdése az anyaállat testében aár miroszóp nélül is megfigyelhetı. A fiatal nısténye négy napos orutól már minden harmadi napon tovább szaporodna, örülbelül 40 napos életüben aár 25 alalommal. Ha edvezıtlen örülménye özé erülne az állato (alacsony hımérsélet, evés táplálé), a petébıl híme is ifejlıdne, és a nısténye által raott petéet megterméenyíti, eze az úgynevezett tartós peté (ephibiumo), amelye a edvezıtlen örülményene ellenállna. A petéet raó nısténye önnyen megülönböztethetı a szőznemzéssel szaporodó, élıet szülı társaitól, mivel a fejlıdı ephibium feete pontént jól látható az állat hátsó végénél. Amior a örnyezeti feltétele megint ideálissá válna, a petéet raó generáció átvált az elevenszülésre és az új ivadéo már mind nısténye leszne. A hím populáció ihal egészen addig, amíg az idıjárási és táplálozási feltétele romlani ezdene. Tápláléul egysejtő alga szolgál a Daphniána, általában Scenedesmus subspicatus vagy Chlorella vulgaris. Legalább étnaponta etetjü ıet, a tenyésztıvizü tartalmazzon örülbelül 5*10 3 sejt/ml algát. A Daphniá batériumoat és élesztıt is eszne, eze azonban önnyen túlszaporodna és anaerob örülménye alaulna i a tenyésztıvizüben, ezért a rendszeres etetéshez ez nem javasolt. Tenyésztıvízént bármilyen víz használható, amelyben a Daphniá szaporodna, ez lehet tápsóból és desztillált vízbıl elıállított mesterséges víz, csapvíz, forrásvíz vagy szőrt aváriumvíz. A Daphniá szaporodásához és fenntartásához nem szüséges fény, azonban a fény biztosításával vizüben lévı egysejtő algá szaporodását és a
megfelelı oldott oxigén-oncentráció fennmaradását segíthetjü, a batériumo elszaporodását és az anaerob örülménye ialaulását pedig megaadályozhatju. 5 1. ábra: Daphnia magna (Caudata.org, Newt & Salamander Information Portal) 5.3. A mérés leírása A mérés elıészítése: A tesztre alalmas egyede iválasztása 20-30 darab több, mint 7 napos, testüben embrióat hordozó anyaállatot ülönítün el nagy lyumérető osztályozóháló segítségével. A öltıtasaból iszabadult, 24 órás állato mérete 1-2 mm özötti, az ilyen orú állatoat a nagyobb, anyaállato özül isebb lyumérető osztályozóháló segítségével válogatju i. A mérés ivitelezése 125 125 ml-es fızıpohárba bemérjü az 50 50 ml vizsgálni ívánt mintát. Ezután iválogatun 10 db 24 órás állatot, majd ezeet a mérıedényben lévı folyadéba helyezzü. 96 órán át 20 25 C-on 8:16 órás világos:sötét cilusú megvilágítás mellett inubálju a tesztorganizmusoat, 24 óránént szabad szemmel és/vagy sztereomiroszóppal megszámolju a mozgásépes állatoat. Eredménye értéelése és interpretációja 1. letalitási százalé iszámítása az egyes oncentráció vagy dózis értéehez, az öotoxiológiában szoásos módon történi: N N min ta H = 100 N H letalitási százalé (%) N ontroll mintában életben maradt állato száma N min mérendı mintában elpusztult állato száma ta 2. oncentráció/ dózis-válasz görbe észítés 3. a 20 és 50%-os gátláshoz tartozó oncentráció vagy dózis megállapítása, vagyis az EC 20 és EC 50 értée meghatározása. A teszt eredményeit aor fogadju el, ha a ontrollban az állato több mint 80 %-a mozgásépes maradt. 6. Halteszte A halaat más vízi gerincese és marogerinctelene mellett iterjedten alalmazzá vízi öoszisztémá érzéenységéne jellemzésére, a vízi öoszisztémát veszélyeztetı vegyi anyago hatásána vizsgálatára. A vízi öoszisztémát jellemzı tesztorganizmuso beszerzése általában bonyolult feladat, mert nehézes egészséges és állandó minıségő tesztorganizmushoz jutni. A halpopuláció nagyban eltérhetne egymástól, ez fıént ugyananna a halfajna a laboratóriumi és vad változata esetén jelentıs. A mási ényes érdés a vízminıség. Tiszta, szennyezetlen vízben ell fenntartani a teszteléshez használni ívánt állatoat, valamint szintén tiszta vizet ell alalmazni tesztelés során hígítóvízént. A
haltesztenél jól ismert LC 50 értéet adó toxius anyagot használun referenciaént, amelyne segítségével minısíthetjü a tesztrendszerünet és a tesztorganizmusunat. A tesztrendszerben mért és ontrollált hımérsélet, ph, vízeménység megvédheti a tesztet a nem megfelelı örülménye miatti rossz eredményetıl. A legnépszerőbb édesvízi teszthala a Pimephales promelas, a Lepomis macrochirus, az Ictalarus punctatus és az Oncorhynchus myiss. A tesztállato iválogatásánál arra ell töreednün, hogy orban és méretben azonos egyedeel dolgozzun. Fiatal állatoat válasszun, melye tömege 1,0 5,0 g özött változhat, valamint a leghosszabb hal mérete ne legyen nagyobb, mint a legisebb étszerese. A tesztedény vízszintes mérete legalább háromszorosa legyen a legnagyobb állat hosszána, mélysége legalább háromszorosa a legnagyobb állat magasságána. A tesztoldat minimum 150 mm mély legyen a 0,5 g-nál nagyobb, 50 mm a 0,5 g-nál isebb mérető hala számára. Naponta legalább egyszer etessü a halaat jó minıségő tápláléal. A teszt idıtartalma statius teszt esetén 96 óra, hosszabb idejő tesztenél legalább 96 óránént frissítésre van szüség. A teszt során a víz hımérsélete a fajtól függıen változhat (pl. O. myiss esetében 12 C, P. promelas esetén 25 C). A víz ph-ját is a tesztállat igénye szerint állítjá be. A megvilágítás intenzitása általában nincs megadva, de fontos, hogy a 16 órás megvilágítást 8 órás sötétség övessen. Végpontént a pusztulás vagy a mozgáséptelenség mérhetı. 7. A tesztorganizmuso fenntartásához illetve a teszte során használt tápoldato, tenyésztıvize receptjei: 7.1. Algateszt Tápoldato összetétele Maroelem oldat (100x) 1 liter desztillált vízhez: NH 4 Cl 1 500 mg/l MgCl 2.6H 2 O 1 200 mg/l CaCl 2.2H 2 O 1 800 mg/l MgSO 4.7H 2 O 1 500 mg/l KH 2 PO 4 160 mg/l Agar: 17 g/l Fe-oldat (1 000x) 1 liter desztillált vízhez: FeCl 3.6H 2 O 80 mg/l Na 2 EDTA.2H 2 O 100 mg/l Karbonát-oldat (100x) 1 liter desztillált vízhez: NaHCO 3 50 mg/l (nem autolávozható) Miroelem oldat (1 000x) 1 liter desztillált vízhez: H3BO 3 185 mg/l MnCl 2.4H 2 O 415 mg/l ZnCl 2 3 mg/l CoCl 2.6H 2 O 15 mg/l CuCl 2.2H 2 O 0,05 mg/l Na 2 MoO 4.2H 2 O 7 mg/l Alga tápsó oldat 1 liter desztillált vízhez a töményített tápsóoldatoból a megfelelı mennyiséget bemérjü, alapos összerázás után a ph-na 8 örüline ell lennie. Egyéb fontos paramétere: P 0.7 mg/l, N 10 mg/l, elatoro 10-3 mmol/l, összeménység: (Ca + Mg) 0.6 mmol/l A tápagar az algatenyészet fenntartásához szüséges. 7.2. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt Antibiotium mix oldat: 1%-os nystatin 0,2%-os penicillin, (Na-Penicillin G) 2%-os streptomycin, (Sztreptomycin-szulfát) Külön-ülön tárolju hőtıben, steril szőrve, a felhasználás elıtt frissen állítom össze a mixet: a 3 féle antibiotium oldatból 1:1:1 arányban. T-P tápoldat: 1 g tripton 0,1 g élesztı ivonat 100 ml desztillált víz Formaldehid oldat: 35 %-os formaldehid oldatból hígítással.
7.3. Lemna minor szaporodásgátlási teszt Miroelem oldat: Fe-EDTA oldat: H 3 BO 3 2,86 g/l FeCl 3 6H 2 O 0,121g/250ml MnCl 2 4H 2 O 1,82 g/l EDTA 0,375g/250ml ZnSO 4 7H 2 O 0,22 g/l Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,09 g/l CuSO 4 5H 2 O 0,09 g/l Béalencse (Hoagland féle) tápoldat (Missouri Botanical Garden): 1 liter steril desztillált vízhez az autolávozott oldatoból a megfelelı mennyiséget bemérjü, majd az alapos összerázás után beállítju a ph értéet 5,8-ra steril NaOH oldattal. A tápoldat elészítése során a övetezı mennyiségeet mérjü be: MgSO 4 7H 2 O (24,6 g/100ml) Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O (23,6 g/100ml) KH 2 PO 4 (13,6 g/100ml) KNO 3 (10,1 g/100ml) Miroelem oldat Fe-EDTA oldat 1,0 ml/l 2,3 ml/l 0,5 ml/l 2,5 ml/l 0,5 ml/l 20,0 ml/l 7.4. Heterocypris incongruens édesvízi agylósrá letalitási teszt Standard víz összetétele (10 liter desztillált vízhez): 9,5 liter desztillált vízbe: MgSO 4 0,6 g NaHCO 3 0,96 g KCl 0,04 g és 0,5 liter desztillált vízbe: CaSO 4 2H 2 O 0,6 g A omponense oldódását övetıen összeöntjü a ét oldatot. Az elészült standard vizet használat elıtt 24 órán eresztül levegıztetjü. 7.5. Daphnia aut immobilizációs teszt Tenyésztıvíz összetétele (1 literre) CaCl 2 * H 2 O 11,76 g MgSO 4 * 7 H 2 O 4,93 g NaHCO 3 2,59 g KCl 0,23 g 8. A tesztleíráso során felhasznált forráso: Culture Collection of Autotrophic Organisms (CCALA ) Institute of Botany, Academy of Sciences of the Czech Republic, [http://www.butbn.cas.cz/ccala/index.php] The Taxonomicon: Brands, S.J. (comp.) 1989-present. The Taxonomicon. Universal Taxonomic Services, Zwaag, The Netherlands. [http://taxonomicon.taxonomy.nl/] MSZ 21978-2:1986 Veszélyes hulladéo vizsgálata. Algateszt (metanolos lorofill extració) MSZ 21978-36:1989 Veszélyes hulladéo vizsgálata. A mérgezıépesség meghatározása algatenyészettel MSZ EN ISO 8692:2005 Vízminıség. Édesvízi alga növeedésgátlási tesztje egysejtő zöldalgafajoal ISO 8692:2004 Water quality -- Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae OECD 201 Algae, Growth Inhibition Test Gruiz Katalin, Horváth Beáta, Molnár Mónia: Környezettoxiológia. Vegyi anyago hatása az öoszisztémára, Mőegyetemi Kiadó, 2001 Leitgib, L., Kálmán J. és Gruiz K. (2007) Comparison of bioassays by testing whole soil and their water extract from contaminated sites Chemosphere 66, 3, 428-434 Missouri Botanical Garden [http://www.mobot.org/jwcross/ducweed/media.htm] ISO 20079:2005 ISO Water quality - Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on ducweed (Lemna minor) - Ducweed growth inhibition test OECD 1948054:2002 Lemna species Growth inhibition test
Brehm, az állato világa, Digitális iadás: Arcanum Adatbázis Kft. 2000. [http://me.osz.hu/03400/03408/html/] John Clare, B.A., Ph.D. (2007) Daphnia: An Aquarist's Guide, Caudata.org, Newt & Salamander Information Portal [http://www.caudata.org/daphnia/] OECD 202 Daphnia species, acute Immobilisation Test, Part I the 24 h EC50 acute immobilisation ntest, Part II the reproduction test (at least 14 days) MSZ 21976-18:1993 Települési szilárd hulladéo vizsgálata. Daphniateszt MSZ 21978-13:1985 Veszélyes hulladéo vizsgálata. Daphniateszt MSZ EN ISO 6341:1998 Vízminıség. A mobilitásgátlás meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea). Aut toxicitási teszt (ISO 6341:1996) MSZ ISO 10706:2002 Vízminıség. Anyago hosszú távú mérgezı hatásána meghatározása Daphnia magna Straus-on (Cladocera, Crustacea)