KUTATÁSI TÉMAJAVASLAT ITC hallgatónak jelentkezők számára témavezető: MÉNESI Dalma, M.Sc. intézet: Növénybiológiai Intézet e-mail cím: menesi.dalma@brc.mta.hu CV: http://www.szbk.hu/file/cv/plant_menesi_dalma_hu.pdf Társ-témavezető: FEHÉR Attila, Ph.D., D.Sc. téma címe: ROP GTPÁZOK ÁLTAL KÖZVETÍTETT JELÁTVITEL NÖVÉNYEKBEN ÖSSZEFOGLALÁS A Rho-típusú GTPázoknak központi szerepük van számos egyedfejlődési, és stresszválasz útvonal szabályozásában. Az eukarióta Rho-típusú GTP kötő fehérjék több alcsaládra oszthatók, úgymint Rho, Cdc42, Rac, és ROP. Növényekben a ROP GTPázok a Rho család egyetlen, specifikus képviselői. A Rho GTPázok által szabályozott jelátviteli utak, és az ezekben résztvevő különböző protein kinázok, más eukariótákban már elég jól ismertek, azonban növényekben nagyon keveset tudunk a ROP-ok, és különböző kináz kaszkádok kapcsolatáról. A projekt célja, hogy felfedje a ROP GTPázok szerepét a növényi jelátviteli útvonalakban. HÁTTÉR Kinázok lehetséges szerepe a ROP GTPáz jelátvitelben. A ROP GTPázok GDP- és GTP kötött állapotuk között ciklizálnak, amit regulátor fehérjék (GEF, GDI, GAP) szabályoznak. A receptor kinázok és a ROP GEF-ek kapcsolata már jól ismert, de ezek a kinázok a GAP, GDI, sőt maguknak a ROP fehérjéknek a foszforilációjával is befolyásolhatják a ciklust. Ismeretlen citoplazmatikus kinázok is foszforilálhatják közvetlenül a ROP GTPázokat (de akár regulátor fehérjéit is). A ROP-ok GTP-kötött állapotban effektor kinázokat (pl. RLCK VI_A) aktiválhatnak, melyek szubsztrátjaik foszforilációján keresztül megfelelő sejtválaszokat váltanak ki. Az egyszerűség kedvéért csak azokat a kináz-szubsztrát kapcsolatokat mutatjuk, melyeknek van valamilyen kísérletes indikációja. Annak ellenére, hogy a Rho GTPázok struktúrája evolúciósan erősen konzervált, a növényi ROP-ok számos egyedi strukturális tulajdonsággal rendelkeznek, ami azt jelzi, hogy az állati, vagy élesztő megfelelőiktől eltérő kölcsönható partnereik lehetnek. Valójában a legtöbb ROP effektor és regulátor szintén növényspecifikus. A növényekből ugyanakkor hiányoznak azok az effektor kinázok, illetve receptor kinázok is, melyeknek más eukariótákban fontos szerepük van a Rho GTPáz-mediált jelátvitelben. Tehát a növényi ROP-ok, és a jelátviteli-szerepű kinázok kapcsolata egyelőre még tisztázatlan. KUTATÁSI IRÁNY Néhány évvel ezelőtt a csoportunk azonosított egy növényspecifikus kináz alcsaládot (RLCK VI_A), melynek tagjai az in vitro foszforilációs képességük kifejtéséhez aktív ROP GTPáz kapcsolódását igényelték. Mivel jelenleg ezek az egyetlen ismert ROPok által aktivált kinázok növényekben, még elég keveset tudunk róluk. Célunk az, hogy feltárjuk azokat a jelátviteli útvonalakat, amelyekben ezek az RLCK
kinázok részt vesznek. Ennek érdekében számos olyan transzgenikus lúdfű (Arabidopsis thaliana) növényvonalat állítottunk elő, amelyekben megváltoztattuk egyes RLCK VI_A fehérje gének kifejeződését. Ezen vonalak jellemzése jelenleg is folyamatban van. Elsődleges adataink alapján elmondhatjuk, hogy ezek a kinázok befolyásolják a poláris sejtnövekedést, valamint a gomba kórokozók növényi sejtekbe jutását is. Annak érdekében, hogy feltérképezzük az RLCK VI_A kinázokkal kapcsolatban álló jelátviteli útvonalak további elemeit, terveink közt szerepel ezen kinázok potenciális szubsztrátjainak azonosítása is. A ROP effektor kinázok azonosítása mellett, kutatásunk középpontjában állnak a ROP GTPázok felett elhelyezkedő jelátviteli kinázok is. Növényekben a ROP foszforiláció szerepe kevésbé tanulmányozott terület, holott állati sejtekben már a RhoA, a Rac, és a Cdc42 fehérjékről is kimutatták, hogy foszforilálódhatnak különböző helyeken specifikus protein kinázok által. Ezek a poszttranszlációs módosítások befolyásolják a G- proteinek in vitro, és in vivo aktivitását, és jelátviteli funkcióit is. Feltételezéseink alapján a növényekben is hasonló szabályozó mechanizmusok lehetnek jelen, ezért célul tűztük ki, hogy azonosítjuk azokat a kinázokat, amelyek foszforilálják, ezáltal pedig szabályozzák, magukat a ROP GTP-ázokat. Végső célunk pedig az, hogy feltárjuk a ROP GTPáz kapcsolt kinázok szerepét a sejtpolaritás szabályozásában (in vitro pollencső kísérletek), a morfogenezis során (teljes növény), és a növény-kórokozó kapcsolatban (gomba kórokozókkal fertőzött sejtek vizsgálata). CÉLKITŰZÉS Annak érdekében, hogy megismerjük azokat a jelátviteli útvonalakat, amelyekben a ROP effektor RLCK kinázok részt vesznek, olyan transzgenikus Arabidopsis vonalakat fogunk használni, melyekben megváltoztatjuk az RLCK VI_A kifejeződését. Ezen kívül még tervezzük az RLCK VI_A kinázok szubsztrátjainak azonosítását is különböző módszerekkel. Az Arabidopsis Rop1 GTPáz potenciálisan foszforilált helyeinek meghatározásával pedig megkíséreljük azon kináz(ok) azonosítását, amelyek foszforilálni, ezáltal pedig szabályozni is képes(ek) a ROP GTPázokat in vivo. ALKALMAZANDÓ / ELSAJÁTÍTANDÓ MÓDSZEREK Klónozás Fehérje tisztítás baktériumból In vitro kináz aktivitás mérés Western blott RNS tisztítás, RT-PCR Kémiai-genomikai szubsztrát azonosítási módszer Élesztő két hibrid technika Mutáns, és transzgenikus Arabidopsis növények létrehozása, és jellemzése JAVASOLT IRODALOM Fehér A, et al.: Regulation of ROP GTPase signalling at the gene expression level: A review. Open Plant Sci. J., 2:21 30(2008) Nagawa S, et al.: RHO GTPase in plants: Conservation and invention of regulators and effectors. Small GTPases, 1:78-88(2010) Berken A, et al.: Structure and function of Rho-type molecular switches in plants. Plant Physiol. Biochem., 46:380-93(2008) Huang J-B, et al.: ROP3 GTPase contributes to polar auxin transport and auxin responses and is important for embryogenesis and seedling growth in Arabidopsis. Plant Cell, 26:3501 18(2014) Miyawaki KN, Yang Z.: Extracellular signals and receptorlike kinases regulating ROP GTPases in plants. Front. Plant Sci., 5:449(2014) André K, et al.: Strategies for the identification of kinase substrates using analog sensitive kinasaes. Eur. J. Cell Biol., 89:184-93(2010) Schultheiss H, et al.: A small GTP-binding host protein is required for entry of powdery mildew fungus into epidermal cells of barley. Plant Physiol., 128:1447-54(2002) Brembu T, et al.: A RHOse by any other name: a comparative analysis of animal and plant Rho GTPases. Cell Res., 16:435 45(2006) a program a TÁMOP 4.1.1.C -13/1/KONV.2014-0001 projekt támogatásával készült
A FOGADÓ LABORATÓRIUM RÖVID BEMUTATÁSA Jelentősebb publikációk Jurca M, et al.: Characterization of a family of Arabidopsis receptor-like cytoplasmic kinases (RLCK class VI). Plant Cell Rep., 27:739-748(2008) Dorjgotov D, et al.: Plant Rho-type (Rop) GTPase-dependent activation of receptor-like cytoplasmic kinases in vitro. FEBS Lett., 583:1175-82(2009) Fodor-Dunai C, et al.: The phosphomimetic mutation of an evolutionary conserved serine residue affects the signaling properties of plant ROPs. Plant J., 66:669-79(2011) Reiner T, et al.: The Arabidopsis ROP-activated receptor-like cytoplasmic kinase RLCK VI_A3 is involved in control of basal resistance to powdery mildew and trichome branching. Plant Cell Rep., 34:457-68(2015) Reprezentatív kutatási pályázatok Sejtpolaritás szabályozása a növényi morfo- és patogenezis alatt: a kinázok szerepe (OTKA, 2012 2016) A laboratórium néhány közelmúltbeli hallgatója Lajkó D, Ph.D., 2012-jelenleg is, A Rho GTP-ázokhoz kapcsolt növényi jelátviteli hálózatok feltárása Jurca M, ITC és Ph.D., 2007-2011, Characterization of ROP GTPase-activated Arabidopsis receptor-like cytoplasmic kinases (RLCK class VI_A) Dorjgotov D, M.Sc. és Ph.D. 2000-2009, Növényi RHO (ROP) GTP-áz aktivált kinázok azonosítása és jellemzése a program a TÁMOP 4.1.1.C -13/1/KONV.2014-0001 projekt támogatásával készült