Állati eredetű élelmiszerek növényvédőszer-maradék vizsgálata Solymosné Majzik Etelka, PhD NÉBIH NTAI Velencei Növényvédőszer-analitikai Laboratórium Hungalimentaria 2013 2013.04.16. 1
Állati eredetű élelmiszerek növényvédőszer-maradék vizsgálata 2012. évtől került szakmai feladatként a NÉBIH NTAI növényvédőszermaradék-analitikai laboratóriumaihoz A Velencei Növényvédőszer-analitikai Laboratórium látja el az állati eredetű élelmiszerek és nagy zsírtartalmú termékek növényvédőszer-maradék vizsgálata területén az EU Nemzeti Referencia Laboratórium (EU-NRL-AO) feladatait Új módszerek bevezetése, validálása és az MS detektorok szélesebb körű alkalmazása tekintetében szakmai együttműködést alakítottunk ki az Európai Unió Freiburgban lévő Referencia Laboratóriumával (EU-RL-AO) 2
Vizsgált minták megoszlása 2012 évben 942 db állati eredetű élelmiszer minta (decemberig beérkezett minták) Tétel típusok Minta típusok Mintaszám (db) Sertés Izom, máj, zsírszövet 358 Baromfi (csirke, tyúk, pulyka, kacsa, liba) Izom, máj, zsírszövet 242 Szarvasmarha Izom, máj, zsírszövet, szív, vese 55 Vad (szarvas, vaddisznó, fácán) Izom, máj, zsírszövet 41 Méz Méz 63 Tyúktojás Tyúktojás 43 Tej, tejtermék (szarvasmarha, juh, kecske) Tej, vaj 55 Egyéb (juh, nyúl, csiga, hal) Izom, máj, zsírszövet 61 Feldolgozott termékek (sonka, szalonna, kolbász, szalámifélék) Sonka, szalonna, kolbász, szalámifélék 24 3
Módszerfejlesztés Zsírtartalom meghatározási módszerek összevetése Hatóanyagcsoportok és hatóanyagok körének bővítése Extrakciós módszerek korszerűsítése A módszerek ellenőrzése és validálása különböző mintamátrixokban a Document N SANCO/12495/2011 irányelv útmutatásai szerint Tömegspektrometriás detektálási módszerek bevonása és mind szélesebb körű alkalmazása A módszerek kidolgozásánál figyelembe kell venni a vizsgálati eredmények megadási módjának várható változásait! 4
Zsírtartalom meghatározás A zsírtartalom meghatározása kiemelt jelentőségű az állati eredetű élelmiszerek vizsgálata esetén Zsírban jól oldódó hatóanyagok 396/2005/EK rendeletben (F ) jelzésű illetve a log Pow nagyobb vagy egyenlő, mint 3 A zsírban jól oldódó komponensek esetén az MRL érték és a vizsgálati eredmény megadása jelenleg elég bonyolult (a mintamátrixtól és annak zsírtartalmától függően eltérő) a szabályozás egyszerűsítése folyamatban van, 2013 év folyamán várható 5
Zsírtartalom meghatározási módszerek A laboratóriumaink által jelenleg alkalmazott módszerek (tömegmérésen alapulnak) MSZ EN 1528-2:1998 6.1.2. kivonás oszlopon MSZ EN 1528-2:1998 6.1.4.1.2.; 6.4.6.1.; 6.4.6.2. kivonás hűtőcentrifugálással (Na 2 SO 4 + n-hexán) Svéd módszer (EU-RL-AO labor közvetítésével) Etilacetát:ciklohexán (1:1) eleggyel történő kivonás 6
Zsírtartalom meghatározás Zsírtartalom mérési eredmények Minta megnevezése Zsírtartalom átlag (m/m %) SD (m/m %) n (db) medián (m/m %) csirke izom, mell 1,5 1,2 23 1,1 csirke izom, comb 4,2 1,8 10 3,7 házityúk izom, vegyes 3,0 1,8 14 2,6 házityúk máj 1,1 0,7 18 0,9 sertés izom 4,0 6,7 107 2,0 sertés máj 2,4 1,2 106 2,0 sertés zsírszövet 63,8 18,3 131 69,2 tojás 7,4 5 tej 1,2 5 tejszín 29,3 6 hal 5,6 5 7
Hatóanyagcsoportok, hatóanyagok körének bővítése Hagyományosan vizsgált hatóanyagcsoportok Klórozott szénhidrogének Foszforsav-észterek Karbamátok Piretroidok A fenti csoportokon belül új hatóanyagok bevonása A vizsgálatok kiterjesztése további csoportokba tartozó hatóanyagokra Jelenleg összesen 336 komponens vizsgálatára van lehetőség a szűrővizsgálati programokban (egyedi módszerekkel vizsgálandó komponenseket nem tekintve) 8
Vizsgálatba bevont hatóanyagok Klórozott szénhidrogén típusú vegyületek (27) Aldrin HCH, alfa- DDD, o,p - HCH, béta- DDD, p,p - HCH, delta- DDE, o,p - HCH, gamma- (Lindán) DDE, p,p - Heptaklór DDT, o,p - Heptaklór-epoxid, cisz- DDT, p,p - Heptaklór-epoxid, transz- Dieldrin Hexaklórbenzol Endoszulfán, alfa- Izodrin Endoszulfán, béta- Klórdán, cisz- Endoszulfán-szulfát Klórdán, transz- Endrin Metoxiklór Endrin-aldehid Oxiklórdán Endrin-keton EU monitoring programban kötelező: Opcionális: Jelenleg nincs a programban: 9
Vizsgálatba bevont hatóanyagok Szerves foszforsav-észter típusú vegyületek (80) Acefát Etion Foszmet Monokrotofosz Azinfosz-etil Etoprofosz Fosztiazát Ometoát Azinfosz-metil Etrimfosz Foxim Paraoxon-etil Brómfenvinfosz Fenamifosz Heptenofosz Paraoxon-metil Bromofosz-etil Fenamifosz-szulfon Izofenfosz Paration-etil Bromofosz-metil Fenamifosz-szulfoxid Izofenfosz-metil Paration-metil Demeton-S-metil Fenitrotion Izokarbofosz Pirazofosz Demeton-S-metilszulfon Fenklórfosz Kaduzafosz Piridafention Demeton-S-metilszulfoxid Fenklórfosz-oxon Kinalfosz Pirimifosz-etil Dialifosz Fenszulfotion Klórfenvinfosz Pirimifosz-metil Diazinon Fention Klórpirifosz Profenofosz Diklofention Fention-szulfon Klórpirifosz-metil Protiofosz Diklórfosz Fention-szulfoxid Kumafosz Szulfotep Dikrotofosz Fentoát Malaoxon Terbufosz Dimetoát Fonofosz Malation Terbufosz-szulfon Diszulfoton Forát Mekarbam Tetraklórvinfosz Diszulfoton-szulfon Forát-szulfon Metakrifosz Tiometon Diszulfoton-szulfoxid Formotion Metamidofosz Tolklofosz-metil Ditalimfosz Foszalon Metidation Triazofosz EPN Foszfamidon Mevinfosz Triklórfon 10
Vizsgálatba bevont hatóanyagok Piretroid típusú vegyületek (15) Akrinatrin Béta-ciflutrin Bifentrin Cipermetrin Deltametrin Etofenprox Fenpropatrin Fenvalerát+Eszfenvalerát (RR&SS) (Eszfenvalerát) Fenvalerát+Eszfenvalerát (RS&SR) (Fenvalerát) Lambda-cihalotrin Permetrin Rezmetrin Tau-fluvalinát Teflutrin Tetrametrin EU monitoring programban kötelező: Opcionális: Jelenleg nincs a programban: 11
Vizsgálatba bevont hatóanyagok Karbamát típusú vegyületek (24) Aldikarb Aldikarb-szulfon Aldikarb-szulfoxid Benfurakarb Fenoxikarb Formetanát Indoxakarb Iprovalikarb Izoprokarb Karbaril Karbofurán Karbofurán, 3-hidroxi- Karboszulfán Metiokarb Metiokarb-szulfon Metiokarb-szulfoxid Metomil Oxamil Pirimikarb Pirimikarb, dezmetil- Propamokarb Propoxur Tiodikarb Triallát EU monitoring programban kötelező: Opcionális: Jelenleg nincs a programban: 12
Vizsgálatba bevont hatóanyagok További vegyülettípusokba tartozó komponensek (85) Acetamiprid Buprofezin Dimetil-amino-szulfotoluidid (DMST) Fipronil-szulfon Acetoklór Butilát Dimetilfenil-formamid, 2,4- (DMF) Fludioxonil Alaklór Ciazofamid Dimetilfenil-N-metilformamidin, N-2,4- (DMPF) Flufenacet Ametrin Cikloxidim Dimetomorf Flufenoxuron Amitráz (DMPF alapon) Cimoxanil Dimoxistrobin Flufenzin Amitrol Ciprodinil Dinikonazol Fluometuron Atrazin Ciprokonazol Diuron Fluopikolid Avermektin (B1a, B1b) Dietil-m-toluamid, N,N- (DEET) Epoxikonazol Fluopirám Aziprotrin Dietofenkarb EPTC Fluorkloridon Azoxistrobin Difenil-amin Etirimol Fluquinkonazol Benalaxil Difenokonazol Famoxadon Flutriafol Benfluralin Diflubenzuron Fenamidon Fluzilazol Bifenil Diflufenikán Fenarimol Folpet Bifenox Diklobenil Fenazaquin Haloxifop Bitertanol Diklofluanid Fenbukonazol Hexaflumuron Bixafen Diklorán Fenhexamid Hexakonazol Boszkalid Diklóranilin, 3,5- Fenpiroximát Hexazinon Bromoxinil Dikofol, p,p'- Fenpropidin Hexitiazox Brómpropilát Dimetaklór Fenpropimorf Imazalil Bromukonazol Dimetenamid Fenzon Imidakloprid Bupirimát Dimetipin Fipronil Ioxinil 13
Vizsgálatba bevont hatóanyagok További vegyülettípusokba tartozó komponensek (105) Iprodion Mandipropamid Oxadixil Propargit Terbutilazin Izoprotiolan Mepanipirim Oxifluorfen Propazin Terbutrin Izoproturon Mepronil Paklobutrazol Propikonazol Tetradifon Kaptán Meptil-dinokap Pencikuron Propizamid Tetrakonazol Karbendazim Metaflumizon Pendimetalin Propizoklór Tiabendazol Karboxin Metalaxil Penkonazol Proquinazid Tiakloprid Klofentezin Metamitron Pentaklóranilin Protiokonazol-deztio Tiametoxám Klomazon Metazaklór Pikoxistrobin Quinoxifen Tiofanát-metil Klórantraniliprol Metkonazol Piperonil-butoxid Quintozén Tolilfluanid Klórbenzilát Metobromuron Piraklostrobin Rotenon Triadimefon Klórfenapir Metoxifenozid Piridaben S-metolaklór Triadimenol Klórfenzon Metrafenon Pirifenox Spinozin A Triciklazol Kloridazon Metribuzin Pirimetanil Spinozin D Trifloxistrobin Klórprofám Mezotrion Piriproxifen Spirodiklofen Triflumizol Klórtoluron Miklobutanil Procimidon Spiroxamin Triflumuron Klotianidin Molinát Profám Tebufenozid Trifluralin Klozolinát Napropamid Profluralin Tebufenpirad Triforin Krezoxim-metil Nitrofen Prokloráz Tebukonazol Triklórfenol, 2,4,6- Lenacil Novaluron Prometrin Teflubenzuron Tritikonazol Linuron Nuarimol Propaklór Teknazén Vinklozolin Lufenuron Orto-fenilfenol Propaquizafop Terbacil Zoxamid Összesen 336 hatóanyag illetve bomlástermék! 14
Extrakciós módszerek MSZ EN 1528-2:1998, 6.1.2 kivonás oszlopon tej, tejtermékek, izom (hús), hal, haltermékek, tojás, máj, állati zsiradék (zsírszövet) és egyéb feldolgozott termékek mintamátrixokra a módszer ellenőrzés az összes alkalmazott mátrix esetén folyamatos Saját fejlesztésű módszer állati zsiradék (zsírszövet) mintamátrixokra (Miskolc) n-hexán - ACN eleggyel a validálás folyamatban Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009, MR 415 ) tej, tejtermékek, izom (hús), hal, haltermékek, tojás, máj, feldolgozott termékek és egyéb mintamátrixokra pl. méz, méhhullák, méhészeti termékek (30 % zsírtartalom alatt) a validálás részben megtörtént, részben folyamatban van a módszer ellenőrzés az összes alkalmazott mátrix esetén folyamatos 15
Extrakciós módszerek MSZ EN 1528-2:1998, 6.1.2 Kivonás oszlopon Minta mennyiség Extrakció Tisztítás Oldószercsere Detektálás 5 g (10 g) minta standard hozzáadások 50 g savval mosott tengeri homok : vízm. Na 2 SO 4 (1:1) porszerűvé dörzsölés 2 cm vízm. Na 2 SO 4 réteg minta keverék kromatográfiás oszlopba töltés eluálás 75 ml (150 ml) n-hexán:aceton (2:1) eluátum bepárlása 40 ⁰C-on csökkentett nyomáson gélkromatográfia (GPC) oldószercsere a műszeres méréshez GC-ECD; GC-PFPD/TSD; GC-MS ; LC-MS/MS 16
Extrakciós módszerek Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) Minta Extrakció Tisztítás Detektálás Módosított QuEChERS 5 g (10 g) minta 50 ml-es cetrifugacső standard hozzáadások 10 perc várakozás víz hozzáadás (10 ml) kézi rázás 10 ml ACN hozzáadás 15 perc rázás rázógépen (300 löket/perc) 6,5 g sókeverék (4 g MgSO 4 + 1 g NaCl + 1 g Na 3 -citrát-dihidrát + 0,5 g Na 2 H-citrátszeszkvehidrát) 15 perc rázás rázógépen (300 löket/perc) centrifugálás (3000 f/perc, 5 perc) 15 ml-es cetrifugacső kifagyasztás (mátrixtól függően, opcionális) DSPE: 150 mg MgSO 4 + 25 mg PSA (+ 25 mg C18 mátrixtól függően) / 1 ml extrakt 15 perc rázás rázógépen (300 löket/perc) centrifugálás (3000 f/perc, 5 perc), szűrés extraktum stabilizálás (5% hangyasav, ACN), kifagyasztás, GC-s méréshez oldószercsere 17 GC-ECD; GC-PFPD/TSD; GC-MS ; LC-MS/MS
Extrakciós módszerek Saját fejlesztésű módszer (Miskolc) n-hexán acetonitril extrakció Minta 5 g minta 50 ml-es cetrifugacső standard hozzáadások 10 perc várakozás 20 ml n-hexán + 20 ml ACN hozzáadás 10 perc rázás rázógépen (200 löket/perc) Extrakció Tisztítás Detektálás 2 g vízmentes Na 2 SO 4 2 perc rázás rázógépen (200 löket/perc) szűrés vákuummal 100 ml-es főzőpohárba bemosva 10 ml n-hexán: ACN (1:1) eleggyel rázatás rázótölcsérben 2 percig ACN-es fázis gyűjtve n-hexános fázis 2 x 20 ml ACN-el újra kirázva extraktum bepárlása, 40 ⁰C-on (vákuum) n-hexánba felvéve 1 g/ml kifagyasztás -20 ⁰C-on 30 perc 2 ml extrakt 8 g V. aktivitású neutrális Al 2 O 3 -on eluálás 30 ml 1 v/v % aceton tartalmú kiegyensúlyozott n-hexánnal bepárlás 40 ⁰C-on (vákuum), n-hexánba felvéve GC-ECD; GC-PFPD; GC-MS ; LC-MS/MS 18
Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) Mintamátrixok tojás, izom, máj tej, tejszín, hal (jelenleg folyamatban) Hozzáadási szintek (mg/kg) 0,005; 0,01; 0,05; 0,1 (szintenként 5-5 hozzáadás) Vizsgálatba vont hatóanyagok az előzőekben felsorolt komponensek Vizsgált paraméterek specifikuság, linearitás, kimutatási határ pontosság, precizitás (ismételhetőség), tartomány 19
A visszanyerési értékek megoszlása 100% 90% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer pontosságának vizsgálata tojás mintamátrix esetén 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 0,1 mg/kg 20% 10% 0% <50% 50-70% 70-120% 120-130% >130% A visszanyerési értékek nagysága 20
A visszanyerési értékek megoszlása 100% 90% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer pontosságának vizsgálata izom mintamátrix esetén 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 20% 10% 0% <50% 50-70% 70-120% 120-130% >130% A visszanyerési értékek nagysága 21
A visszanyerési értékek megoszlása 90% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer pontosságának vizsgálata máj mintamátrix esetén 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 20% 10% 0% <50% 50-70% 70-120% 120-130% >130% A visszanyerési értékek nagysága 22
A visszanyerési értékek megoszlása 100% 90% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer pontosságának vizsgálata 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 0,1 mg/kg 20% 10% 0% <50% 50-70% 70-120% 120-130% >130% A visszanyerési értékek nagysága 23
A visszanyerések RSD % értékeinek megoszlása 60% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer precizitásának vizsgálata tojás mintamátrix esetén 50% 40% 30% 20% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 0,1 mg/kg 10% 0% <5% 5-10% 10-20% >20% A visszanyerések RSD % értékei 24
A visszanyerések RSD % értékeinek megoszlása 45% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer precizitásának vizsgálata izom mintamátrix esetén 40% 35% 30% 25% 20% 15% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 10% 5% 0% <5% 5-10% 10-20% >20% A visszanyerések RSD % értékei 25
A visszanyerések RSD % értékeinek megoszlása 70% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer precizitásának vizsgálata máj mintamátrix esetén 60% 50% 40% 0,005 mg/kg 30% 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 20% 10% 0% <5% 5-10% 10-20% >20% A visszanyerések RSD % értékei 26
A visszanyerések RSD % értékeinek megoszlása 70% Módszer validálás Módosított QuEChERS (MSZ EN 15662:2009) A módszer precizitásának vizsgálata 60% 50% 40% 30% 20% 0,005 mg/kg 0,01 mg/kg 0,05 mg/kg 0,1 mg/kg 10% 0% <5% 5-10% 10-20% >20% A visszanyerések RSD % értékei 27
A módszerek ellenőrzése Vizsgálati módszer módosított QuEChERS (módosított MSZ EN 15662:2009) (MR 415.) MSZ EN 1528-2:1998 6.1.2 Mintamátrix Hozzáadási szintek (mg/kg) Visszanyerések száma (db) hal 0,1 271 izom 0,004-1 253 máj 0,02-1 34 méz 0,008-0,08 40 szalámi 0,01-0,08 17 tej 0,01-0,1 384 tojás 0,05-0,1 279 Összesen: 0,004-1 1278 tojás 0,05-0,1 271 vaj 0,05 17 zsírszövet 0,004-0,4 65 Összesen: 0,004-0,4 353 MSZ EN 1528-2:1998 6.1.4.1.2; 6.1.4.2 tej 0,01-0,05 38 MSZ EN 1528-2:1998 6.4.6.2; 6.1.4.2 zsírszövet 0,1 83 Mindösszesen: 0,004-1 1752 28
Hatóanyagok száma (db) Az alkalmazott detektálási módszerek A mérésbe bevont hatóanyagok megoszlása a detektálási módszerek között 180 160 169 169 140 120 100 80 83 60 40 62 49 20 0 GC-ECD GC-MS GC-PFPD GC-TSD LC-MS/MS Detektálási módszerek 29
LC-MS/MS Az alkalmazott detektálási módszerek GC-MS/MS GC-TSD/PFPD 30
Az MRL és a vizsgálati eredmények megadási módjában várható változások (396/2005/EK rendelet lábjegyzete) A jelenleg érvényben lévő szabályozás szerint az MRL és ezzel összhangban a pozitív vizsgálati eredmények megadása függ attól, hogy A vizsgált komponens zsírban jól oldódó, vagy nem (F jelzés ill. log Pow kisebb, ill. nagyobb vagy egyenlő 3) A mintamátrixtól és annak zsírtartalmától A komponens mennyiségi meghatározási határértékétől (LOQ) és annak viszonyától az MRL-hez Fentiektől függően teljes termékre vagy annak zsírtartalmára vonatkozóan kell megadni Tovább bonyolítja a helyzetet amennyiben feldolgozott termékekről van szó (pl. tejtermékek) 31
Az MRL és a vizsgálati eredmények megadási módjában várható változások (396/2005/EK rendelet lábjegyzete) Felmerülő kérdések, problémák Mi legyen a definíciója annak, hogy zsírban jól oldódó a komponens (F jelzés ill. log Pow)? Tej és tejtermékek esetén a megítélés következetes? Megfelelő-e a tehéntej esetén a 4 %-os zsírtartalommal történő számítás és mi a helyzet a többi tejféleséggel? Indokolt-e tyúktojás esetén különbséget tenni a zsírtartalom szerint (< 10 % ill. > 10 %) Meg kell-e tartani egyáltalán a lábjegyzetet, vagy minden információt magában a táblázatban kell szerepeltetni? Változtatni kell a rendelet I. mellékletében szereplő termékek rendszerén (Annex I)! 32
Az MRL és a vizsgálati eredmények megadási módjában várható változások (396/2005/EK rendelet lábjegyzete) Megoldások, melyek megvalósultak és amelyek körvonalazódnak A Bizottság 212/2013/EU rendelete (2013. március 11.) a 396/2005/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet I. mellékletének az említett mellékletben felsorolt termékekre vonatkozó kiegészítések és módosítások tekintetében való felváltásáról (hús izom) Az I. melléklet módosítása (egyszerűsítése) előfeltétele volt annak, hogy a határértékeket tartalmazó II. melléklet szükséges módosításai elvégezhetőek legyenek A cél elsősorban az MRL és az eredmények megadási módjának egyszerűsítése a zsírban jól oldódó komponensek esetében. 33
Köszönöm a figyelmet! solymosnee@nebih.gov.hu Hungalimentaria 2013 2013.04.16. 34