Fruktooligoszacharidok enzimatikus előállítása integrált rendszerben Enzymatic synthesis of fructooligosaccharides in integrated system Csanádi Zsófia és Sisak Csaba Pannon Egyetem, Műszaki Informatika Kar, Műszaki Kémiai Kutató Intézet 8200 Veszprém, Egyetem u. 10. Summary Healthy living and nutrition including the wholesome food products and food additives have become more and more important in the last years. The so-called functional foods contain useful components that have beneficial effects on health conditions. Typical representatives of the functional foods are the prebiotic fructooligosaccharides. They have become important and their significance has risen recently because of their favorable properties shown in human and animal nutrition as health foods and special feed additives. Fructooligosaccharides are not decomposed in the small intestine by the digestive enzymes so reach the colon where they are fermented by the microbial flora (e.g. Bifidobacteria sp., Lactobacillus sp.) to lactate and short chain fatty acids, like acetate, propionate and butyrate. Consequently, fructooligosaccharides stimulate the growth and fermentation of these microbes and this way, prevent spreading of the harmful pathogens. On the other hand, they have low sweetness intensity and they cause no caries, so they can be applied as alternative sweeteners, too. These advantageous properties make them applicable as the so called functional food ingredients. Short chain fructooligosaccharides are mainly composed of 1-kestose (GF 2 ), nystose (GF 3 ) and fructosyl-nystose (GF 4 ), in which two, three and four fructose units are bound to one unit of glucose, respectively. Fructooligosaccharides are natural components of many vegetables, for example onion, asparagus, rice, sugar beet, wheat, etc. The industrial scale recovery from these plants is not economical since their low concentration. For this reason, they are produced commercially via biosynthetic way using fructosyl-transferase enzyme as well as hydrolytic methods. The raw material of the synthesis reaction is sucrose and the product mixture contains unconverted sucrose and glucose as a by-product besides GF 2, GF 3 and GF 4. Elimination of the formed by-product component can result an increase in the product yield. For this purpose several methods can be applied: e.g. membrane separation, chromatographic separation, or enzymatic method like elimination with glucose oxidase. In the course of our work we established a solid-phase biocatalyst for the production of fructooligosaccharides. For this purpose we applied a commercial grade complex enzyme product originated from Aspergillus aculeatus Pectinex Ultra SP-L containing fructosyl-transferase activity beside other enzyme activities (pectinase, cellulose, β-galactosidase). For the elimination of glucose we established a co-immobilized fine chemical grade glucose oxidase-catalase solid-phase biocatalyst. Hydrogen peroxide formed in the reaction is an inhibitor for the enzyme, so it is appropriate to remove it from the reaction mixture, for this purpose catalase was applied for the decomposition of H 2 O 2. We worked out an immobilization method for these biocatalysts onto an anionic ion exchange resin, Amberlite UP 900, using a combination of adsorption and cross-linking by glutaraldehyde treatment. The immobilization parameters and operational conditions have been optimized for the biocatalysts. In our studies we made experiments for the production of fructooligosaccharides with immobilized Pectinex Ultra SP-L and reached ~60 % product yield. After it we constructed an integrated reactor system for the fructooligosaccharide production and glucose elimination and reached ~74 % product yield. Aim of this paper is to summarize our work in which we elaborated two kind of solid phase biocatalysts for the production of fructooligosaccharides and elimination of the formed by-product and studied their operation in an integrated system.
Bevezetés Az utóbbi időben megnövekedett az érdeklődés az egészséges táplálkozás és étrend, valamint a természetes anyagokból származó táplálékkiegészítők iránt. Ezek közül a fruktooligoszacharidok számos olyan előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek lehetővé teszik széleskörű élelmiszeripari és takarmányozási célú alkalmazásukat. Az emésztőszervrendszer enzimei nem képesek őket lebontani, ebből adódóan diabetikus és alacsony kalóriatartalmú termékek gyártására is felhasználhatók. Nem hidrolizálódnak a szájüregben, ezért nem okoznak fogszuvasodást. Emellett prebiotikus hatásúak, azaz kedvezően befolyásolják a bélflóra hasznos baktériumainak (Bifidobacteria, Lactobacillus sp.) szaporodását és működését, ezért használják őket ún. funkcionális élelmiszerek alkotórészeiként. [1][2][3]. A fruktooligoszacharidok szerkezetüket tekintve egy glükóz egységből és az ahhoz kapcsolódó két, illetve több fruktóz egységből felépülő nyílt láncú molekulák. Előállításukra a gyakorlatban főként enzimatikus szintézist alkalmaznak: Szacharóz (GF) kiindulási anyagból ún. fruktozil-transzferáz (Ft-áz) (EC 2.4.1.9.) enzim segítségével szintetizálható rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye [4], amely rendszerint kesztózt (GF 2 ), nisztózt (GF 3 ), fruktozil-nisztózt (GF 4 ) és az át nem alakult szacharóz mellett glükóz mellékterméket is tartalmaz. Mivel a glükóz a szintézisreakció kompetitív inhibitora, így annak szimultán eltávolítása nélkül maximálisan kb. 60%-os fruktooligoszacharid- érhető el. A glükóz eltávolítására több lehetőség is kínálkozik: a membránszeparáció [5], a kromatográfiás elválasztás [6], vagy az enzimatikus út, pl. a glükóz-oxidázzal (GOD) (EC 1.1.3.4.) történő eliminálás [7]. Jelen előadásunkban bemutatjuk azt a két rögzített biokatalizátorból álló rendszert, amellyel sikeresen oldottuk meg a fruktooligoszacharid hozam növelését. Eredmények A fruktooligoszacharid szintézisére az Aspergillus aculeatusból származó Pectinex Ultra SP-L-t (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) alkalmaztuk, amely főként pektináz, celluláz, β- galaktozidáz enzimek keveréke, de számottevő fruktozil-transzferáz aktivitása [8] is van, ezért szóba jöhet egy, a gyakorlatban is használható immobilizált fruktozil-transzferáz katalizátor kiindulási anyagaként. A glükóz eliminációra egy finomvegyszer tisztaságú glükóz-oxidázt (FLUKA, 215 U/mg) használtunk és azt egy hasonló minőségű katalázzal (SIGMA, 830 U/mg) (EC 1.11.1.6.) koimmobilizáltuk. A katalázra azért volt szükség, mert a GOD katalizálta glükóz oxidáció során hidrogén-peroxid is keletkezik, amely denaturálhatja az enzimfehérjéket, a kataláz viszont elbontja a H 2 O 2 -t. Az enzimek rögzítése, a szilárd fázisú biokatalizátorok jellemzése A biokatalizátorok immobilizálásánál Amberlite UP 900 (Rohm and Haas) anioncserélő gyantát alkalmaztunk hordozóanyagként. 1. táblázat: A fruktozil transzferáz és glükóz oxidáz/kataláz rögzítésének optimális körülményei és az optimális reakciókörülmények Rögzítési idő (min) Glutáraldehid (%) Optimális reakcióhőmérséklet ( C) Fruktoziltranszferáz Glükóz oxidáz/kataláz 15 60 0,25 0,5 53 30 Optimális ph 5,6 5,1
A kombinált rögzítési módszer [9] során az enzimet adszorbeáltattuk a hordozón és a megkötött fehérjemolekulák között glutáraldehiddel keresztkötéseket alakítottunk ki [10]. Az alkalmazott enzimek aktivitásának meghatározási módszereit két korábbi előadásunkban ismertettük [11], [12]. A rögzítés optimális körülményeit, valamint az optimális reakciókörülményeket előző munkáink során meghatároztuk [13], [14]. Az összefoglalt adatokat az 1. táblázatban tüntetjük fel. Rögzített Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok előállítására Fruktooligoszacharid szintézis integrált rendszerben A fentiekben leírt rögzített biokatalizátorok alkalmazásával egy termékelőállításra és melléktermék-eltávolításra egyaránt alkalmas integrált rendszert állítottunk össze és alkalmaztuk fruktooligoszacharidok szintézisére. Az integrált rendszer összeállítása során két laboratóriumi méretű oszlopt, - egyiket rögzített Pectinex Ultra SP-L töltettel, másikat glükóz oxidáz/kataláz töltettel - kapcsoltunk össze, a 2. ábrán látható módon. Az oxigén koszubsztrát bevitelét a glükózoxidációs ba oxigén bebuborékoltatásával oldottuk meg. Egy 15,6 Ug -1 fruktozil-transzeferáz aktivitással rendelkező rögzített Pectinex Ultra SP-L készítményt alkalmazva, rázatott lombikos kísérletekben vizsgáltuk az oligoszacharidok előállítását. A reakciókörülmények a következők voltak: 6 g immobilizált Pectinex Ultra SP-L + 80 cm 3 szacharóz oldat (2 M, ph=5,6, 0,05 M acetát pufferben), 53 C hőmérséklet, 150 rpm rázatási sebesség.. Egy kísérlet időbeli lefutását az 1. ábrával illusztráljuk. 700 GF4 GF3 GF2 GF G 600 500 400 300 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 idő (h) 1. ábra: Fruktooligoszacharidok szintézisének időbeli lefutása rögzített Pectinex Ultra SP-L segítségével, rázatott lombikos kísérletben Az oligoszacharid összhozam elérte a 60%-ot, ami megfelel az irodalmi adatoknak. A glükóz végja (170 mgcm -3 ) mutatja, hogy a kiindulási anyag jelentős részéből melléktermék képződik. 2 ábra: Fruktooligoszacharidok szintézisének vizsgálatára szolgáló integrált rendszer összeállítási vázlata A fruktooligoszacharidok előállítására szolgáló egységet 53 C-ra termosztáltuk, míg a glükóz eltávolítására szolgáló készüléket szobahőmérsékleten működtettük. A két ban ciklikusan folytak a reakciók, a fruktooligoszacharidok szintézise, illetve a glükóz oxidációja, a folyadékfázisokat minden ciklus végén megcseréltük a két oszlop között, így biztosítva a félfolyamatos termék-előállítást, valamint a melléktermék-eltávolítást a rendszerben.
Ciklusidőnek 2 órát választottunk, mert ennyi idő alatt keletkezett annyi glükóz, amely még nem okozott jelentős inhibíciót. Kiindulási állapotként (1. ciklus) az 1. ba 10 g rögzített Pectinex Ultra SP-L biokatalizátort, valamint 130 cm 3 2 M szacharóz szubsztrátot (ph=5,6, 0,05 M acetát puffer) töltöttünk. A ph=5,6 érték kiválasztásánál figyelembe vettük, hogy a kétfajta biokatalizátor ph optimumai között nincs jelentős különbség. A 2. ban a töltet 5 g koimmobilizált GOD/kataláz volt, viszont az 1. ciklusban itt nem volt folyadékfázis, hiszen ekkor glükóz eltávolítására még nem volt szükség. A 2. ciklusban az 1. ból a folyadékot átvezettük a 2. oszlopra, az 1. oszlopba pedig 130 cm 3 mennyiségű friss 2 M szacharóz szubsztrátot (ph=5,6, 0,05 M acetát puffer) adagoltunk. Így tulajdonképpen 2 párhuzamosan futó reakció (I. és II.) folyt a két ban, a reakcióelegyek ciklikus cseréjével. A ciklusok ismétlését mindaddig folytattuk, amíg megfelelően magas fruktooligoszacharid-t el nem értünk. Egyes ciklusok végén mindkét elegyben mértük a keletkező, illetve a maradék glükóz mennyiségét (2. táblázat). 2. táblázat: Az integrált rendszer egységeiben, adott ciklusok végén mérhető glükóz-k alakulása ciklusok 1. I. II. 2. glükóz 1. 2. glükóz 1 20,33-19,23-2 22,41 0,14 23,62 0,54 5 24,32 1,89 22,61 2,12 10 35,33 2,33 41,74 3,66 A kísérletsorozat végén meghatároztuk a fogyott szacharóz és a keletkezett fruktooligoszacharidok mennyiségét mindkét elegyben. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze. Látható, hogy az alkalmazott idő, illetve ciklusszám mellett 70 % feletti termékhozamot sikerült elérni, amely lényegesen magasabb, mint a melléktermék eltávolítása nélkül elérhető érték. Következtetések Az enzimatikus fruktooligoszacharid szintézis során keletekező glükóz mellékterméknek a szintézissel szimultán oxidatív eliminálásával az inhibíciós hatás megszüntethető, így a termékhozam jelentősen fokozható. Az általunk kifejlesztett rendszer, amelyben párhuzamosan folyik a biokatalitikus szintézis és az ún. extraktív biokatalízis, alapja lehet egy fruktooligoszacharid előállító technológiának, de ehhez szükséges a rendszer optimálása és stabilitásának vizsgálata. 3. táblázat: A szacharóz és oligoszacharid végk az integrált rendszerben GF GF 2 GF 3 GF 4 Hozam (%) Irodalomjegyzék I. II. 67 75,23 245,36 237,98 181,23 169,47 82,58 75,36 74,44 70,59 [1] Farr, D.R., Cancer Letters 114, 59-63 (1997) [2] Bloch, A., Thomson, C.A., Journal of the American Dietetic Association 95, 493-496 (1995) [3] Hilliam, M., International Dairy Journal 8, 349-353 (1998) [4] Yun, J.W., Enzyme and Microbial Technology 19, 107-117 (1996)
[5] Nishizawa, K., Nakajima, M., Nabetani, H., Biotechnology and Bioengineering 68, 92-97 (2000) [6] Vonach, R., Lendl, B., Kellner, R., Journal of Chromatography A 824,159-167 (1998) [7] Mislovičová, D., Michálková, E., Vikartovská, A., Process Biochemistry, 42, 704-709 (2007) [8] Del-Val, M.I., Otero, C., Enzyme and Microbial Technology 33, 118-126 (2003) 9] Dinella, C., Lanzarini, G., Stagni, A., Palleschi, C., Journal of Chemical Technology and Biotechnology 59, 237-241 (1994) [10] Pifferi, P.G., Bonora, V., Spagna, G., Tramontini, M., Process Biochemistry 28, 29-38 (1993) [11] Csanádi, Zs., Sisak, Cs., Műszaki Kémiai apok 2005, Konferenciakiadvány 153-156 (2005) [12] Csanádi, Zs., Szajáni, B., Sisak, Cs., Műszaki Kémiai apok 2006, Konferenciakiadvány 105-107 (2006) [13] Csanádi, Z., Sisak, C., Acta Alimenaria. Hung. 35, 205-212 (2006) [14] Sisak, Cs., Csanádi, Zs., Szajáni, B., Magyar Kémiai Folyóirat 113, 97-101 (2007)