Gyors DNS alapú mangalica specifikus kimutatási rendszer kidolgozás a MANGFIELD projekt keretében SZÁNTÓ-EGÉSZ RÉKA 1, MOHR ANITA 1, SIPOS RITA 1, MICSINAI ADRIENN 1, KOPPÁNYNÉ SZABÓ ERIKA 2, JÁNOSI ANNA 2, ANTON ISTVÁN 3, RÁTKY JÓZSEF 3 ZSOLNAI ATTILA 3 1 Biomi Biotechnológai Szolgáltató Kft. 2 Központi Környezet- és Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet 3 Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet 2100 Gödöllő, Szent-Györgyi Albert út 4. info@biomi.hu, www.biomi.hu
Mi is az a Mangalica? Őshonos magyar sertés fajta Eredete az Osztrák Magyar Monarchia idejére tehető 1830-as évek Ellenálló fajta, nagy zsírtömeggel Szőke mangalica Vörös mangalica Fecskehasú mangalica
A projekt célkitűzése Egy olyan kimutatási rendszer kifejlesztése, amit mindenhol alkalmazni lehet insitu, ahol szükségessé válik meghatározni, hogy az adott sertés mangalica-e vagy a hústermék tartalmaz-e a mangalica összetevőt.
Alkalmazott módszerek TwistDX kit izometriális DNS kimutatási módszer Milenia HybriDetect gyors és univerzális detektálási módszer
Optimalizálás eredménye TwistDX reakció összetétele Vegyszer Bemért mennyiség Kimutatás Milenia HybriDetect Primer A (10 µm) 2,1 µl Primer B (10 µm) 2,1 µl Próba (10 µm) 0,6 µl Puffer 29,5 µl Víz 12,2 µl MgAc (280mM) 2,5 µl Templát DNS (10 ng/µl) 1 µl Negatív eredmény Termosztálási protokoll Pozitív eredmény 39 C-on 30 perces termosztálás
Specificitás vizsgálata Vizsgált fajta neve Mintaszám Pozitív eredmény Sertés Mangalica 64 db 64 F1 (MangalicaxDuroc) 18 db 18 Pietrain 12 db 0 Hampshire 12 db 0 Nagyfehér 12 db 0 H39xNagyfehér 36 db 0 Vizsgált fajta neve Mintaszám Pozitív eredmény Növények szója 1 db 0 Kukorica 1 db 0 Rizs 1 db 0 Bors 1 db 0 Fokhagyma 1 db 0 Kömény 1 db 0 Egyéb állat Nagyfehér x Magyar Lapáj 12 db 0 Vaddisznó 2 db 0 Ló 1 db 0 Házi tyúk 2 db 0 Pulyka 1 db 0 Kacsa 1 db 0 Lúd 1 db 0 Szarvas 1 db 0 Szarvasmarha 1 db 0 Zeller 1 db 0 Csicseriborsó 1 db 0 Dió 1 db 0 Cukorrépa 1 db 0 Bab 1 db 0 Mák 1 db 0 Repce 1 db 0 Rozs 1 db 0
Kimutathatósági tartomány Hígítás mértéke Kópiaszám Kimutathatóság 1x 2900 pozitív 2x 1450 pozitív 4x 725 pozitív 8x 362 pozitív 16x 181 pozitív 32x 90 pozitív 40x 72 pozitív 50x 58 pozitív 58x 50 pozitív 64x 45 negatív
Vizsgálat reprodukálhatósága 1. felhasználó 1 2 3 4 5 6 7 2. felhasználó 1 2 3 4 5 6 7
Feldolgozott termékek tesztelése 1. Izolálási mód kiválasztása a vizsgálati eredmény reprodukálhatóságának figyelembe vételével történt Tesztelt izolálási mószerek: Nátrium hidroxidos előkészítés WizardDNS izolálási módszer Chelex gyanta DNArelasy izolálás 1 2 3 4 5 6 7 1-2: Nyers mangalica hús, 3-4: Mangalicát tartalmazó kolbász, 5-6: Mangalicát tartalmazó párizsi, 7-NTC 2g mintához 0,5 M NaOH oldatot adtunk 300mg 100 C-on mintához 5 perc adunk extarháló termosztálás 2g mintához puffert, adunk EDTA-t, 5 perc hűtés NaCl-ot, prot- 10%-os Chelex 100 100mg K-át, 0,5M guanidinhidroklorid-ot semlegesítettük oldat 5 perc speciális HCl mintához oldattal adunk gyantát DNAreleasy 100 C-on termosztálás 55 C-on 2 perc után termosztátban 3 óra felülúszóból 65 C-5 perc, 96 C-5 termosztálás vettünk mintát perc, 20 C 5 perc 10 perc centrifugálás Az mintát oldat a viszkózussá felülúszóból Felülúszó Wizard Clean vált, kaptunk alkalmatlan a up nem oszlopon homogenizált tisztítás további E-vel oldjuk feldolgozásra mintánál le is az a A oszlopról mintastruktúra a DNS-t jól Előnye, hogy előzetesen mátrixstruktúra felbomlik. oldódik, hátránya az Az izolált DNS nem Hosszú ára. hozta az elvárt és eszközigényes eredményt.
Feldolgozott termékek tesztelése 2. Kimutathatósági határ tesztelése Párizsi: 0%, 20%, 50%, 70%, 100% Kolbász: 0%, 20%, 50%, 70%, 100% Különböző mangalica tartalmú kolbászok vizsgálata Különböző mangalica tartalmú párizsik vizsgálata 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1-0%; 2-20%; 3-50%; 4-70%; 5-100%; NTC 1-0%; 2-20%; 3-50%; 4-70%; 5-100%; NTC
A módszer validálása - Körvizsgálat eredményei A körvizsgálatban 3, egymástól független, laboratórium vett részt A körvizsgálat tárgya 9 db feldolgozott húsipari termékben a mangalica jelenlét meghatározása Körvizsgálatban alkalmazott minták és azok eredményei Minta típusa Mangalica tartalom (%) Pozitivitásra kapott %-os eredmény Hús 70 100 Hús 50 100 Hús 20 100 Párizsi 70 100 Párizsi 50 66 Párizsi 20 66 Kolbász 70 100 Kolbász 50 100 Kolbász 20 100
Összefoglalás Sikerült egy olyan mangalica kimutatásra alkalmas rendszer kifejleszteni, amely: gyors megbízható olcsó nem igényel nagy laboratóriumi hátteret szinte bármely helyszínen alkalmazható A MANGFIELD projekt a Vidékfejlesztési Minisztérium támogatásával valósulhatott meg, ÁHT azonosító: 334740
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!