A sárgadinnye (Cucumis melo) archeogenetikája, ITS- és SSR -heterogenitása egy 15. századi lelett l a mai fajtákig

Szent István Egyetem Gödöll A sárgadinnye (Cucumis melo) archeogenetikája, ITS- és SSR -heterogenitása egy 15. századi lelett l a mai fajtákig Doktori Értekezés Szabó Zoltán Gödöll 2006

2 A doktori iskola megnevezése: SZIE Növénytudományi Doktori Iskola tudományága: Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok vezet je: Dr. Virányi Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Szent István Egyetem Növény védelemtani Tanszék doktori program: Növénynemesítés Genetikai és Biotechnológiai Módszerekkel programvezet : Dr. Heszky László egyetemi tanár, az MTA tagja Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék témavezet : Dr. Gyulai Gábor egyetemi docens, a biológiai tudományok kandidátusa Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék...... Dr. Virányi Ferenc Dr. Gyulai Gábor doktori iskola vezet je témavezet

TARTALOMJEGYZÉK 3 1. TARTALOMJEGYZÉK 1. TARTALOMJEGYZÉK...3 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...4 3. BEVEZETÉS ÉS CÉLKIT ZÉSEK...6 4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...8 4.1 ARCHEOGENETIKA...8 4.1.1 Posztmortem DNS degradáció...8 4.1.2 Archeológiai leletek az állatvilágból...16 4.1.3 Archeológiai leletek: az ember...21 4.1.4 Archeológiai leletek: növények...24 4.2 ARCHEOLÓGIAI NÖVÉNYANYAG FELTÁRÁSA...27 4.3 A SÁRGADINNYE...28 4.3.1 A sárgadinnye (Cucumis melo L.) domesztikációja (mikroevolúció)...28 4.3.2 A sárgadinnye (Cucumis melo L.) rendszertani besorolása...30 4.3.3 A sárgadinnye (Cucumis melo L.) fajtatípusai...34 4.3.4 Molekuláris vizsgálatok a sárgadinnye (Cucumis melo L.) genom elemzésében...40 5. ANYAG ÉS MÓDSZER...43 5.1 ARCHEOLÓGIAI NÖVÉNYANYAG...43 5.1.1 Növényminták feltárása, rendszerezése, osztályozása...43 5.1.2 Magbiológiai meghatározás...44 5.1.3 Szövettenyésztés...45 5.2 SÁRGADINNYE FAJTÁK, TÁJFAJTÁK...45 5.2.1 Morfológiai vizsgálatok...45 5.3 DNS IZOLÁLÁSA...48 5.4 GENETIKAI VIZSGÁLATOK...49 5.4.1 ITS...49 5.4.2 RAPD...49 5.4.3 SSR...51 5.4.4 ALF...51 5.5 SZEKVENCIAANALÍZIS...53 5.6 STATISZTIKAI ELEMZÉS...54 6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK...55 6.1 SÁRGADINNYEMAGVAK FELTÁRÁSA, IN VITRO KALLUSZINDUKCIÓ, ÉS TÚLÉL SEJTEK IZOLÁLÁSA...55 6.2 A MAI FAJTÁK MORFOLÓGIAI ÖSSZEHASONLÍTÁSA SÁRGADINNYE-TÍPUSOK SZERINT.59 6.3 DNS IZOLÁLÁS AZ ARCHEOLÓGIAI, ÉS MAI FAJTÁKBÓL...63 6.4 ÖSSZEHASONLÍTÓ MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATOK...66 6.4.1 ITS...66 6.4.2 RAPD...68 6.4.3 SSR...71 6.5 SZEKVENCIAANALÍZIS ÉS FAJTAREKONSTRUKCIÓ KLASZTER ANALÍZIS ALAPJÁN...76 6.5.1 ITS szekvenciák...76 6.5.2 SSR elemzés...78 6.5.3 Fajtarekonstrukció...81 6.6 ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK...82 7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK...83 8. ÖSSZEFOGLALÁS...84 9. MELLÉKLETEK...88 9.1 IRODALOMJEGYZÉK...88 9.2 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK...101 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...103

4 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 1/2MS: Murashige és Skoog alaptáptalaj ABI prism: ABI PRISM 310 DNS Szekvenáló AFLP: (Amplified Fragment Length Polymorphism) felszaporított fragmentum hossz polimorfizmus ALF: Automata lézer fluorométer AP-PCR: (Arbitrarily Primed PCR) véletlenszer en kapcsolt PCR bp: bázispár cm: centi Morgan DNS: Dezoxi-ribonukleinsav dntp: Dezoxi-nukleotid-trifoszfátok EDTA: Etilén-diamin-tetraecetsav EST: Expresszálódó szekvencia részletek (Expressed Sequence Tag) EtBr: Etídium-bromid GC: Gáz kromatográfia IMA: Inter Mikroszatellita Amplifikáció ISSR: mikroszatellitaák közötti szekvenciák (Inter Simple Sequence Repeat) ITS: (Internal Transcribed Spacer) bels átíródó rdns spacer klp DNS: kloroplaszt DNS LB: Luria-Bertani féle táptalaj MgCl 2 : Magnézium klorid mm: millimol MS: Murashige és Skoog alaptáptalaj l: mikroliter mtdns: Mitokondriális DNS Na-OCl: Nátrium-hipoklorit ng: nanogramm

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5 PCR: pg: pm: PTB: QTL: r DNS: RAPD: rbcl: RFLP: RNS: SDS: SNP: SSR: Tris: Tris-HCl: UV: (Polimerase Chain Reaction) Polimeráz láncreakció pikogramm pikomol N-fenilsav thiazólium-bromid (Quantitative Trait Loci) kvantitatív tulajdonság lókusza riboszómális DNS (Randomly Amplified Polymorphic DNA): véletlenszer en felszaporított polimorf DNS kloroplaszt ribulózbifoszfát-karboxiláz (Restriction Fragment Length Polymorphism) restrikciós fragmenthossz polimorfizmus Ribonukleinsav Nátrium-dedocil-szulfát (Single Nucleotid Polymorphism) (Simple Sequence Repeat) egyszer szekvencia ismétl dés Tris(hidroximetil) aminometán Tris hidroklorid Ultra ibolya sugárzás

6 BEVEZETÉS ÉS CÉLKIT ZÉSEK 3. BEVEZETÉS ÉS CÉLKIT ZÉSEK A sárgadinnye a világ trópusi, szubtrópusi és mérsékelt övi területeinek fontos zöldségnövénye. A rendszertani besorolással, és a domesztikációval kapcsolatos kérdések még nem teljesen tisztázottak. A magyarországi elterjedésér l különböz régészeti leletekb l származnak az információink. A régészeti leletekb l (magvak) már számos esetben (kamut búza, Lupinus spp., Triticum dicoccum) sikerült növényt regenerálni. Az archeogenetika segítségével lehetséges az évszázadok, illetve évezredek óta konzerválódott növények maradványaiból DNS izolálása, és a PCR technológia felhasználásával a kis mennyiség DNS-b l (akár egy kópiából) a fragmentumok amplifikációja. A Budai Várban folytatott ásatások során ép növény magvak kerültek el egy 15. századi feltárt kútból (Teleki palota, 8-as kút). A magvak jó állapotából kiindulva munkánk célja a Magyarországon termesztett archeo sárgadinnye (Cucumis melo L.), regenerálása, és a régészeti leletekb l különböz módszerekkel molekuláris vizsgálatokhoz alkalmas DNS izolálása. Molekuláris vizsgálatokkal lehetséges a középkori magyarországon termesztett és fogyasztott dinnyetípus azonosítása. Az összehasonlításban használt 47 sárgadinnyefajta (hazai-külföldi, tájfajta-termesztett fajta) morfológiai és molekuláris vizsgálatával a fajták egyértelm en azonosíthatók és elkészíthet a pontos rokonsági kapcsolatokat feltáró klaszter analízis.

BEVEZETÉS ÉS CÉLKIT ZÉSEK 7 Munkánk célja a feltárt növényanyagból kiválogatott sárgadinnye archeogenetikai feldolgozása, melynek során a következ feladatokat fogalmaztam meg: 1. meghatározom és kiválogatom a középkori (15. századi) növényanyagból az ép sárgadinnye magvakat, 2. kimutatom a közel 600 éves sárgadinnye magvak fennmaradt DNS állományát és meghatározom a degradáció mértékét a mai fajtákkal történ SSR fragmentumelemzés alkalmazásával, 3. izoláljuk az exogén fert zött, valamint ITS elemzéssel kiszelektált endogén fert zött középkori magvak elkülönítését követ en a középkori sárgadinnyemag fajazonos DNS állományát, 4. igazolom molekuláris módszerekkel a középkori DNS amplifikálhatóságát és meghatározom a maximálisan amplifikálható DNS fragmentum méreteket, 5. azonosítom a középkori sárgadinnye megközelít genotípusát fajspecifikus SSR allélok kimutatásával, a 47 mai fajtával (11 köztermesztés fajta, 20 tájfajta, és 16 gy jteményekb l származó fajta) történ összehasonlítás alapján, 6. megvizsgálom, hogy a középkori mikroszatellita fragmentumok méretének és szekvenciáinak heterogenitása alkalmas-e molekuláris óra mikroevolúciós lépéseinek kimutatására, 7. meghatározom a középkori sárgadinnye megközelít fenotípusát a molekuláris összehasonlítás alapján, a fajtaköri besorolás 23 morfológiai bélyegét felhasználva.

8 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.1 ARCHEOGENETIKA 4.1.1 Posztmortem DNS degradáció A genetikai információ hordozójának, a dezoxi-ribonukleinsav (DNS) els dleges szerkezetének felfedezését l (Watson és Crick, 1953) napjainkig a különböz DNS vizsgálatok új perspektívát nyújtanak az él lények evolúciójának tanulmányozásához, és a DNS szekvenciák lehet vé teszik a kihalt organizmusok és a ma él leszármazottaik összehasonlítását, genetikai távolságuk meghatározását (Hofreiter et al., 2001). Az archeogenetika segítségével lehet ség nyílik évszázadok, illetve évezredek óta konzerválódott él lények archeológiai, paleontológiai maradványaiból (szövetek és sejtek) DNS izolálására (Cherfas, 1989), és a PCR technológiával lehetséges a kis mennyiség DNS-b l (akár egy kópiából) azonos szekvenciájú DNS fragmentumok másolása, sokszorozása (Pääbo et al., 1988; Pääbo, 1989; 1990). A morfológiai és sejtes szerkezet bomlása mellett a DNS molekulák is degradálódnak a sejten belül (Eglington és Logan, 1991), amelyre különböz vizsgálatokból származnak ismereteink: (1) DNS bomlás kontrolált laboratóriumi körülmények közötti vizsgálata (Lindhal, 1993); (2) különböz fajok archeológiai mintáinak biokémiai vizsgálata (Pääbo, 1989; Tuross, 1994); (3) si fosszíliákból izolált DNS minták vizsgálata és összehasonlítása (Golenberg, 1999; Höss et al., 1996). Az él lény halála után a sejteket megtámadják és a különböz makromolekulákat elbontják a baktériumok, gombák, rovarok (Eglington et al., 1991). Az él sejtekben a DNS szerkezete állandó, köszönhet en az enzimatikus javítómechanizmusoknak (Lindhal, 1993). A sejtalkotókban felhalmozott, és tárolt különböz katabolikus enzimek, mint a lizoszómális

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 9 nukleázok az él sejt halála után kiszabadulnak, és a DNS-t az id múlásával elbontják. A folyamat el rehaladtával a DNS elveszti sértetlenségét, felbomlik, és a nukleotid szekvencia információ elvesztése visszafordíthatatlanná válik. Szerencsés körülmények azonban, - mint pl. az alacsony h mérséklet, gyors kiszáradás, magas sókoncentráció - tönkretehetik, illetve gátolhatják ezeket a nukleázokat, miel tt nukleotidokra bontanák a DNS szálakat, elkerülve így az enzimatikus, mikrobiális degradációt (Höss et al., 1996 Smith et al., 2003; Willerslev et al., 2003; 2004). 4.1. táblázat: A DNS-en végbemen oxidáció, direkt és indirekt háttérsugárzás okozta változásokhoz (hidrolitikus folyamatokat, depurinációt, valamint deaminációt) (Pääbo et al., 2004) Sérülés típusa Folyamat Hatás a DNS-re Megoldás Törések a láncban Oxidatív léziók DNS összekapcsolódás Hidrolitikus léziók Mikrobilális lebomlás Halott sejten belüli nukleáz emésztés Nukleotid bázis sérülések Dezoxi-ribóz maradványok sérülése A DNS összekapcsolódása más DNS, vagy egyéb biomolekulákkal Amino csoportok átalakulása: 1. adenin hypoxantin 2. citozin uracil 3. 5-metil-citozin timin 4. guanin xantin DNS mennyiség csökkenése Méretcsökkenés Nukleotid bázis fragmentáció Cukor fragmentáció Nukleotid bázis modifikáció Mailard termékek Kódoló képesség változása PCR rövid szakaszokra tervezett átfed primerekkel PCR rövid szakaszokra tervezett átfed primerekkel Multi PCR, klónozás, és szekvenálás Az él sejtekben végbemen változásokhoz hasonló, a DNS-en lassabb, de megállíthatatlan folyamatok során (4.1. táblázat), az oxidáció, a direkt és indirekt háttérsugárzás megváltoztatja a cukor-foszfát láncot, és els sorban PTB Multi PCR, klónozás, és szekvenálás

10 IRODALMI ÁTTEKINTÉS hidrolitikus folyamatokat, depurinációt, valamint deaminációt okozva károsítja, majd feldarabolja a DNS láncot (4.1. ábra). 4.1. ábra: Az si DNS-ben bekövetkez legvalószín bb sérülések. A maradványokból izolált DNS-en leggyabrabban bekövetkez változás a degradáció, amely során a DNS molekulák kisméret, átlagosan 100-500 bp nagyságú fragmentumokká töredeznek (Hofreiter et al., 2001; Pääbo, 1989). A méretcsökkenés közvetlen oka a halált követ enzimatikus folyamat, és a hidrolízis (Lindhal, 1993; Pääbo, 1990). A hidrolitikus folyamatok során a nukleotidok - f leg purin (A, vagy G) és cukor bázisok között -, a foszfát-cukorváz foszfo-diészter kötései

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 11 felszakadnak, és a kapott egyszálú DNS-en a nyitott lánc pozíciónál sokkal könnyebben következik be törés (Lindhal, 1993). A glikozides kötések a nitrogén bázisok és a cukor váz között a hidrolízis során felbomlanak, és nem-bázikus véget eredményeznek (Lindhal et al., 1972; 1973; Schaaper et al., 1983). A nukleotid leválásakor a nem-bázikus vég kémiai átrendez désen mehet keresztül, ami hasonló, vagy kisebb arányban, mint a báziskieséskor (Friedberger et al., 1995; Shapiro, 1981) el segíti a száltörés gyakoriságát. A folyamat során bekövetkez degradáció mértéke a meg rzés jellegét l, sajátosságától függ, és eltér lehet még a hasonló korokból fennmaradt minták esetében is. Az ilyen, és ehhez hasonló folyamatok rendkívül megnehezítik az si DNS kivonását (Morin et al., 2001), és komoly problémákat okoznak, mivel a PCR során gátolják a DNS-polimeráz m ködését, ezáltal az egész PCR reakciót (Höss et al., 1994). A PCR reakció során felszaporítható DNS szekvenciák méretét a száltörésen kívül különböz sérülések befolyásolják, amelyeket a háttérsugárzás és egyéb okok miatt keletkez szabadgyökök, a peroxid (O 2 ), a hidrogén peroxid (H 2 O 2 ), és a hidroxil (OH) okoznak a PCR során történ szálnövekedést blokkolva. A DNS láncban az oxidatív sérülésekre hajlamosabb purinok és pirimidinek kett s kötései feldarabolódnak, és gy r szakadást (Friedberger et al., 1995; Lindahl et al., 1993), valamint magas citozin : timin arányt eredményeznek (oxidálódva hydantoinokká alakulnak). A maradványokból izolált DNS-b l az oxidált pirimidinekre specifikus endonukleáz III enzimmel (Pääbo et al., 1989) való emésztést követ en sikerült szekvenciát izolálni. A paleontológiai minták nagyobb mennyiség oxidált pirimidineket (5-hidroxi-5-metilhydantoin, és 5-hidroxihydantoin) tartalmaznak, amelyek blokkolják a Taq DNS polimerázt a PCR során, így teljesen lehetetlenné téve a DNS amplifikációt (Höss et al., 1996). A Taq polimerázt blokkoló

12 IRODALMI ÁTTEKINTÉS sérülések másik fajtája a DNS összekapcsolódása (Mailard termékek), amely megfigyelhet az archeológiai DNS elektronmikroszkópos preparációja során (Pääbo et al., 1989). A fehérjékben, és aminósavakban els dleges aminócsoport és cukrok között végbemen kondenzációs reakciók termékeit, az illékony Mailard termékeket el ször az si fekáliákból (korpolitok) mutatták ki gázkromatográfiával, és tömegspektrometriával (Poinar et al., 2001). A Mailard termékek N- phenacylthiazolium bromidos hasítását követ en (Vasan et al., 1996) sikerült az >20 000 (Poinar et al., 1998) és 40 000 (Krings et al., 2000) éves mintákból DNS-t amplifikálni. Az si szövetekben bekövetkez fragmentáción és DNS modifikációkon kívül más ismert és ismeretlen sérülések akadályozhatják a DNS polimeráz m ködését. A leggyakoribb sérülések az adenin, citozin, 5-metil-citozin, és guanin aminocsoportjának hidrolitikus elvesztése, és ezáltal xantin, hypoxantin, uracil, timin keletkezése. A deaminálódott termékek, mint az uracil (citozin), xantin (adenin), 5-metil-citozin (timin) hibás bázispárosodást okoznak a PCR során (A helyett G, C helyett T) (Pääbo et al., 1989). Az archeológiai mintákon végzett szekvenciakutatások során, a mai mintákhoz viszonyítva nagyobb számban tapasztalhatók véletlenszer báziscserék (Hansen et al., 2001; Hofreiter et al., 2004), köszönhet en a bázisok deaminálódásának. Ugyanezt támasztja alá a régi DNS minták érzékenysége a DNS-b l az uracilt eltávolító uracil-dns-glikozidázra (Pääbo, 1989), illetve a nagyszámú C T, G A nukleotid csere (Higuchi et al., 1984 ). A Taq polimeráz m ködése során bekövetkez T C, A G báziscserék az adenin deaminálódásával keletkez hypoxantin által kiváltott citozin származékok beépítéséb l következik (Gilbert et al., 2003).

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 13 Hosszú id t követ en, a DNS degradáció olyan mértékben el rehaladottá válik, hogy nem marad egyetlen használható DNS fragmentum sem, habár a fiziológiás koncentrációnak megfelel sótartalomnál, semleges ph-n és 15C -on mért 4 x 10-9 /másodperces spontán depurinációs (purin bázisok elvesztése) ráta alapján a DNS csupán 100 000 év alatt degradálódna teljesen, és ez a degradáció sem lineáris (Pääbo et al., 1991). Az extrém környezeti feltételek, köztük az alacsony h mérséklet, kinyújthatják ezt az id korlátot, más esetben az ellenkez jét is okozhatják (Lindahl, 1993). Az archeológiai, és paleontológiai fajtákból izolált DNS mennyisége rendkívül kevés, és min sége töredezettsége miatt jóval elmarad a mai fajokból izolált DNS-t l. A vizsgálatok rendkívül nagy körültekintést igényelnek, mint: a mai és archeo minták elkülönített kezelése, az eszközök sterilezése (UV, Na-OCl), véd ruha és maszk viselése, hogy megfelel en sterilizáljuk az egyes munkafolyamatokat, munkaterületeket, és elkerüljük a DNS kontaminációt. A minták feltárásakor és tárolásakor könnyen el fordulhat a humán DNS kontaminációja, amely ismert és ismeretlen modifikációt eredményezhet. Pusch és Bachmann a mai humán mitokondriális DNS indukálta mutációt állapított meg a PCR során, amely valószín leg néhány a Taq polimerázt befolyásoló, és hibára hajlamossá tev, még nem ismert faktornak köszönhet (Pusch és Bachmann 2004). A DNS izolálást megel z en a legfontosabb a használható minták gyors kiválogatása és elkülönítése a DNS-t nem tartalmazó egyéb frakciótól. A maradványok aminosav elemzésével, amely figyelembe veszi a mintákban fennmaradó teljes aminosav tartalmat, az aminosav összetételt, és az aminosav térszerkezetében bekövetkezett változásokat, a DNS izolálás el tt megállapítható a nukleotid szekvenciák fennmaradásának esélye (Poinar et

14 IRODALMI ÁTTEKINTÉS al.,. 1996).A DNS fragmentumok amplifikálásával és szekvenálásával, vagy a pirolízissel kombinált gázkromatográfiával és tömegspectrometriával (GC/MS) alátámasztható az eredeti archeo makromolekulák meg rzése az si mintában. A PCR technika felfedezését l napjainkig, a múzeumokban kontrollált körülmények között rzött 200 éves növények és állatok DNS szekvenciáinak vizsgálata szinte már rutinszer nek mondható. A PCR amplifikációt megel z en az si DNS molekulák mennyiségének, és a templátok számának meghatározása (kvantifikálása; kompetitív PCR, real time kvantitatív PCR) elengedhetetlen a megmaradt szekvenciák min ségének meghatározásához, mivel el fordulhat, hogy a reakció néhány, vagy egy kópiából indul ki, így az els pár ciklusban bekövetkezett hibák, melyek a DNS sérüléseib l származnak a teljes PCR termékben megtalálhatók lesznek (Handt et al., 1996; Morin et al., 2001). A templát DNS alacsony száma miatt a vizsgálatok során különböz speciális kritériumokat (4.2. táblázat) kell figyelembe venni (Pääbo et al., 1989; Lindahl et al., 1993; Hofreiter et al., 2001). Az archeo DNS mintákon végzett vizsgálatoknál, mivel ha kevés molekulából (<1000) indul el a reakció, különböz kivonatból több ismétléses PCR-re van szükség. Klónozás és szekvenálás szükséges (Handt et al., 1994) az el fordulható kontamináció és az archeo DNS nukleotid sorrendjében található, vagy a PCR amplifikáció során bekövetkez bizonyos nukleotidok hibás beépítésének elkerüléséhez (Hofreiter et al., 2001). A PCR reakció során néhány száz (Cooper et al., 1992, 2001; Haddrath et al., 2001), vagy ritka esetekben akár több mint 1 kilobázis amplifikálható (Lambert et al., 2002).

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 15 4.2. táblázat: Az archeo DNS mintákon végzett vizsgálatok során megfogalmazódó különböz speciális kritériumok Hitelességgel kapcsolatos kritériumok 1. Igazolni kell biokémiai vizsgálatokkal (aminosav) a makromolekulák (DNS) meg rzésének, és fennmaradásának állapotát (Poinar et al., 1996). 2. Ellen rizni kell a DNS extrakciót, és PCR amplifikációt vak kontrollokkal és legalább három ismétléssel (Pääbo et al., 1990). 3. A kiindulási templát DNS mennyiségi és min ségi meghatározása (Serre et al., 2004). 4. Amplifikáció ismétlése egy újabb izolálásból (Navidi et al., 1992). 5. Amplifikáció termékeinek klónozása, és különböz klónok szekvenálása, a DNS sérülésekb l, vagy PCR amplifikációs hibából ered heterogenitás kisz résére (Pääbo et al., 1990). 6. Negatív korreláció az amplifikáció hatékonysága és a DNS fragmentumok mérete között (Lambert et al., 2002). 7. A nukleáris DNS-en belüli mtdns inszerciók kisz rése (Timmis et al., 2004). 8. A laborspecifikus szennyez dések kisz résére más laboratóriumban meg kell ismételni a kísérletet (Zischler et al., 1995). A DNS degradációja 1 millió év alatt (a helyes terminológia: özönvíz el tti DNS; Lindahl et al., 1993) meghaladja a DNS szekvencia menthet ségének fokát. A fajok filogenetikai vizsgálatai során a haploid genomban egyszer szerepl nukleáris DNS lókuszok helyett az si maradványokból a legnagyobb hatékonysággal a több száz kópiában jelen lév kloroplaszt- (növényb l) és mitokondrium- (állatokból, és emberb l) DNS nyerhet ki, ezért találkozhatunk legtöbbször az organelláris DNS szekvenciákat célzó kísérletekkel. A klp-dns, mt-dns felhasználása a filogenetikai vizsgálatok során ma már teljesen elfogadott a nem túl közeli fajok rokonsági összehasonlításakor, mert elég id telt el az elkülönülés eseményeit l és a genom összes része hasonló törzsfejl dést mutat. Közeli fajok és populációk összehasonlításakor, f leg ha gyorsan különültek el, vagy az egyes genomrészeknek más a filogenetikája, problémát jelent, hogy az organelláris DNS mindössze egy lókusza nem tükrözi h en a teljes genomot, így nem lehetséges a különálló lókuszok vizsgálatával filogenetikai következtetéseket levonni.

16 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.1.2 Archeológiai leletek az állatvilágból A paleontológusok és biológusok a 80-as évek közepéig az hitték, hogy csak a biokémiailag stabil molekulák, mint a lipidek, és a lignin képesek az él lény elpusztulását követ fosszilizációs folyamattal járó lebomlást túlélni, ezzel szemben a gének, valamint a genetikai információk a DNS molekulák teljes pusztulását követ en nem vizsgálhatók. Kihalt állatokból els ként 1984-ben sikerült egy 140 éves, múzeumban rzött, quagga (Equus quagga) b rét felhasználva DNS-t izolálni (Higutchi et al., 1984), ezt követte az Ausztráliában shonos ragadozó kutyaféle, a kihalt erszényes farkas molekuláris vizsgálata. Az archeogenetikai vizsgálatokhoz az ehhez hasonló kihalt, és múzeumokban kiállított állatok sikeres molekuláris vizsgálatai adták meg a kezd lökést. A természettörténeti múzeumokban fellelhet genetikai gy jtemények a továbbiakban is nagyban hozzájárulnak a kihalt állatok filogenetikai vizsgálataihoz (Suarez et al., 2004). Mára a kihalt állatokkal végzett sikeres vizsgálatok száma meghaladja az 50- et. Az évszázad elején a Mohave sivatagból begy jtött kenguru patkány volt az els kihalt eml s, melyen populációs vizsgálatokat végeztek, és meghatározták a napjainkban kihalt fajokhoz való genetikai rokonságát (Thomas et al., 1990). Az állatokon végzett archeológiai vizsgálatoknál a mai fajokkal, vagy fajtákkal történ összehasonlítás során el forduló kontamináció kiküszöbölhet, mert a kísérletek nagy részében a szekvenciaazonosság a kihalás el tti azonos taxonómiai csoportba való tartozást támasztja alá. Az elmúlt évtized számtalan el relépést hozott az 50-100 ezer éves, nem emberi maradványok DNS vizsgálatában, és szekvencia elemzésében. A kihalt állatfajok genetikai rokonságviszonyait az egyes vizsgálatok általában az mtdns alapján próbálták alátámasztani. A 20. század elején kihalt erszényes farkasból izolált örökít anyag, és a világ más

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 17 tájairól származó erszényes ragadozók mtdns-ének (citokrom b gén) vizsgálatával a kutatóknak sikerült bebizonyítani, hogy a kihalt tasmániai farkasfaj közelebb áll az evolóciós fejl désben a többi ausztráliai erszényeshez, mint a dél-amerikai ragadozó erszényesekhez (Thomas et al., 1989; Krajewski et al., 1992; Krajewski et al., 1997). Az eredmények tovább er sítették azt az elméletet, mely szerint a két kontinensen az erszényes ragadozók fejl dése, és morfológiai tulajdonságainak kialakulása paralell módon ment végbe (Krajewski et al., 1997). Az organellum DNS-en végzett molekuláris vizsgálatokkal, a maradványokból tanulmányozhatók a kontinensek felfedezése, és az emberi telepesek megjelenése óta veszélyeztetett és kihalt állatfajok. Az Új-Zélandon kihalt moa (4.2. ábra) esetében a múzeumokban meg rzött csontok adták a lehet séget a faj evolúciós kérdéseinek tisztázására, összehasonlítva más röpképtelen madárfajokkal (futómadarak), mint a napjainkban Új-Zélandon él kiwivel, az afrikai struccal, a dél-amerikai nanduval, vagy az ausztráliai emuval és kazuárral. A mitokondriális DNS szekvenciák a moa ausztráliai származását, futómadár rokonságát bizonyították, szemben a szintén új-zélandi, kihalással veszélyeztetett kiwivel (Cooper et al., 1992). A teljes DNS állomány rekonstruálása terén az els sikereket 2001-ben érték el a kutatók, amikor sikerült egy 400 éve kihalt moa futómadár teljes mitokondriális DNS állományának (4.2. ábra) (16500 nukleotid) bázispársorrendjét meghatározni (Cooper et al., 2001). Sikerült igazolniuk a röpképtelen madarak eredetét a Kréta korig, és azt, hogy Új-Zélandot kétszer kolonizálták a futómadarak (4.2. ábra). A long range PCR technikával elkészített mitokondriális térkép lehet séget ad a ku tatóknak, hogy a moa pontos rendszertani helyét megállapítsák a futómadarak (nandu, strucc, elefántmadár, kiwi, emu, kazuár,

18 IRODALMI ÁTTEKINTÉS moa, dodó) közt, illetve megrajzolják az evolúciós fejl dés útját, és meghatározzák a fajok szétválásának idejét (Baker et al., 2005). A nukleáris DNS szekvenciák ivarhoz kapcsolt lókuszainak vizsgálatával, sikerült az el z leg különböz moa fajnak leírt hím és n i egyedeit azonosítani, és 9-re csökkenteni a kihaltnak hitt moa fajok számát (Bunce et al., 2003; Huynen et al., 2003). (a) (b) (c) 4.2. ábra: A struccra emlékeztet kipusztult (a) moa és (b) a long range PCR technikával készített mitokondriális genomtérképe, valamint (c) a futómadarak törzsfája (Cooper et al., 2001). Napjainkban sikerült az els rövid nukleáris DNS szakaszok izolálása, amplifikálása a pleisztocén korból fennmaradt megafaunából (Greenwood et al., 1999). Ma már lehetséges az utolsó jégkorszak (kés i pleisztocén) el tti, és alatti él világban felmerül populációgenetikai kérdések megválaszolása, az mtdns szekvenciák alapján. Az organellum DNS szakaszokat konzerválódott egység -ként felhasználva a populációgenetikai vizsgálatokban sikerült az alaszkai barnamedve mitokondriális DNS típusát kimutatni a különbözö szeparált földrajzi helyeken él barnamedve populációkban, és a 30 000 évvel ezel tt él populációkból is (Leonard et al., 2000), ami a kis populációkon

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 19 bekövetkezett hosszútávú elkülönülést követ alacsony mtdns variabilitás következménye (Pääbo et al., 2000). A 191 jelenkori és különböz archeológiai (alaszkai-28 000 éves; svéd-2000 éves) lófajtán végzett kísérletek igazolták a fajon belüli nagyfokú mtdns variabilitást, és az archeológiai mtdns szekvenciák hasonlóak voltak a mai lovak változataihoz (Vila et al., 2001), melynek magyarázatát nem a ló mitokondriális örökít anyag evolúciós rátájának felgyorsulásában, vagy a vadlovak DNS-ének a génállományba való recens bejutásában látták, hanem a vadlovak és a modern lovak mtdns-ének a háziasítás korai szakaszában bekövetkezett keveredésében. A vadlovakon kívül a szarvasmarha (Bailey et al., 1996; Troy et al., 2001), a kutya (Leonard et al., 2002; Savolainen et al., 2002; Vila et al., 1997), a disznó (Watanabe et al., 2001; 2002), a kecske (Kahila Bar-Gal et al., 2002), és a nyúl (Hardy et al., 1995) seire, és háziasítására találtak a kutatók az mtdns szekvenciák vizsgálata során bizonyítékokat. A mitokondriális DNS szekvenciákat vizsgálva bebizonyosodott, hogy a kihalt hawaii endemikus liba populációk a kanadai liba leszármazottai (Paxinos et al., 2002). Az utolsó jégkorszakból (10 000 éve) fennmaradt jégbe fagyott mammutborjú szöveteib l 1977-ben Russel Higuchi-nak sikerült els ként DNS-t izolálni. A kés pleisztocén korból fenmaradt szövetekb l sikerült DNS szekvenciákat izolálni, mind a mammut (Hagelberg et al., 1994; Höss et al., 1992 ), mind a mastodon (Debruyne et al., 2003; Greenwood et al., 1999; Greenwood et al., 2001; Noro et al., 1998; Yang et al., 1996) esetében.

20 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az egyéb jégkorszak el tti id b l származó maradványokból izolált DNS szekvenciák, földi lajhár (Greenwood et al., 2001; Hofreiter et al., 2003; Höss et al., 1996; Poinar et al., 2003), barlangi oroszlán (Burger et al., 2004), barlangi medve és jégkorszaki barna medve (Barnes et al.,2002; Hänni et al., 1995; Hofreiter et al., 2002; Leonard et al., 2000; Loreille et al., 2001) lehet vé teszik a kihalt állatok genetikai távolságainak közvetlen meghatározását egymástól, és más még él rokonaiktól. (a) (b) (c) 4.3. ábra: Borostyánk be zárt (a) diptera fajok, (b) termeszek, és (c) szúnyog leletek (www.fossilmuseum.net). A miocén korból (5-25 millió éve) származó borostyánba zárt dipterákból (4.3. ábra) (Austin et al., 1997a; 1997b), zsizsikb l (Cano et al., 1993), és termeszb l (Desalle et al., 1992), valamint a dinoszauroszok korából származó csontokból (Zischler et al., 1995), és a rovargyomorból (Cano et al., 1993), vagy sókristályból (Fish et al., 2002; Vreeland et al., 2000) nem tudtak DNS izolálni reprodukálhatóan, köszönhet en annak, hogy az így fennmaradt állati maradványokban mindenféle fizikai kémiai és biológiai változás ment végbe. 1982-ben Poinar 40 millió éves borostyánk be zárt rovarból izolált szöveteket, de DNS szekvenciákat nem tudott reprodukálni (Poinar et al., 1993), és a kés bbi kísérletek során nem sikerült izolálni a borostyánból kitin

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 21 molekulákat sem (Stankiewicz et al., 1998). Az elmúlt évtized során az emberi hatást és a mitokondriális DNS filogenetikai változásait vizsgálták nyulakon (Hardy et al., 1995), ürgén (Hadly et al., 1998), vadászgörényen (Wolpoff et al., 2000), vidrán (Pertoldi et al., 2001), tengeri vidrán (Larson et al., 2002), grizlin (Miller et al., 2003), mókuson (Hale et al., 2001), pingvinen (Lambert et al., 2002), és egéren (Pergams et al., 2003 ). A fekáliákat, ürüléket felhasználva (Kohn et al., 1997) lehet ség nyílik a kihalt, vagy kihalással veszélyeztetett, ritka állatfajok (f eml sök) genotípusának vizsgálatára nukleáris mikroszatellita markerekkel (Constable et al., 1995; Vigilant et al., 2001 ). 4.1.3 Archeológiai leletek: az ember A legnagyobb nehézségekbe a kutatók az emberi maradványokon végzett kísérletek során ütköztek, mert rendkívül nehéz volt elkülöníteni a vizsgálandó si mintát a laboratóriumok, és múzeumok környezetében igencsak elterjedt emberi DNS szennyez dést l, így el fordulhat, hogy a vizsgált mitokondriális szekvencia nem más, mint egy nukleáris inszerció, és kontamináció eredménye (Zischler et al., 1995). Ennek köszönhet en az si DNS szekvenciák valójában kisebb hatással vannak a mai ember történelmének, és evolúciójának feltárására (Hofreiter et al., 2003). A vizsgálatokat tovább nehezíti, hogy a ma él emberi populációk még a rendkívül gyorsan változó, mitokondriális genomon belül is hasonló DNS szekvenciákkal rendelkeznek. Az archeogenetika segítségével bepillantást nyerhetünk a világ más tájaira (Európa, Ázsia) 100 000 évvel ezel tt Afrikából szétvándorló mai modern ember, és az Európában Nyugat- Ázsiában 300000 évvel ezel tt már él el deik a neandervölgyiek közötti kapcsolatba. A Neandervölgyi ember kialakulása az mtdns-ében lév

22 IRODALMI ÁTTEKINTÉS eltérések alapján 500000 évre vezethet vissza (Krings et al., 1999), míg a ma él összes ember mtdns-e egy 170000 évvel ezel tt Afrikában él közös st l származik (Ingman et al., 2000).Egyes antropológusok régészeti maradványok alapján különböz teóriákat állítottak fel, bizonyos genetikai és leszármazottsági kapcsolatot, és folytonosságot feltételeztek a neandervölgyi és a mai európai ember között (Duarte et al., 1999; Hawks et al., 2001; Trinkaus et al., 2000; Wolpoff et al., 2000; 2001). Ugyanezt az adatsort felhasználva a többség a neandervölgyi és a mai ember teljes, vagy majdnem teljes kicserél dését támasztotta alá (Stringer et al., 1988; 2002). Az utolsó jégkorszakig, közel 30000 évvel ezel ttig Euróbában és Nyugat-Ázsiában él neandervölgyi emberi maradványok vizsgálatakor sikerült mitokondriális DNS-t izolálni a csontokból, és a szekvenciavizsgálatok bizonyították (eltér hipervariábilis mtdns szakaszok), hogy a neandervölgyi és a ma él ember nincs közvetlen kapcsolatban (Krings et al., 1997; Schmitz et al., 2002). Az eredmények ugyan nem zárják ki a 40000 évvel ezel tt Európába érkez emberek, és a neandervölgyiek keveredését, és ezáltal a genetikai háttérre vonatkozó hatást, de erre konkrét molekuláris bizonyítékot nem találtak (Enflo et al., 2001; Serre et al., 2004). A jöv beni kutatásokkal, és új módszerekkel lehet vé válik az sibb korból származó emberi maradványok sikeres molekuláris vizsgálata, és talán választ kapunk az semberek között lezajlott keveredésre és a korai semberek mtdns génkészletére. A legújabb, Ausztráliából származó csontokon végzett mtdns vizsgálatok során különböz, a mai emberek variabilitásától eltér szekvenciát izoláltak, amely az semberb l modern emberré válás során drift hatására elt nt (Adcock et al., 2001). A mai emberek között található alacsony mtdns szekvenciavariabilitás az 50 000 évvel ezel tti kis populációból történ elterjedést támasztja alá (Rogers et al.,

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 23 1992). A mai ember származásának és az semberek keveredésének egyéb vizsgálati módjai közé tartoznak a nukleáris gének, és az Y-kromoszóma vizsgálata. A technikai problémákat kiküszöbölve a nukleáris gének vizsgálatai rendkívül sok információt adhatnak a neandervölgyi és más sember evolúciójáról és elkülönülésér l (500000 év). Az els nukleáris DNS szekvenciákat 1991-ben izolálták a 7500 éves pleisztocén kori maradványokból az emberrel kapcsolatos vizsgálatok során. 1989-ben, Németországban 2400 éves múmiából izoláltak sikeresen DNS-t (Pääbo et al., 1985). A Neandervölgyi emberi maradványok vizsgálata során kapott variabilitás a nukleáris gének lókuszain nem tér el a mai embernél tapasztalhatónál (Pääbo, 1999), ezért a Neandervölgyi és a mai ember inkább tekinthet a ma él emberszabású majmokból kialakult alfajnak, mint külön fajnak (Krings et al., 1999; Kaessmann et al., 2001). A Kaukázusból (30 000 év), és Horvátországból (42 000 év) származó Neandervölgyi maradványok mtdns szekvenciáinak meghatározása lehet séget ad a különböz emberpopulációk vizsgálatára (Ovchinikov et al., 2000; Krings et al., 2000). A mai ember és az emberszabású majmok eltérését jól mutatja az ember kevesebb szekvencia variabilitása a mitokondriális és nukleáris DNS-ben (Kaessmann et al., 2001). Az emberi archeogenetikai kutatáshoz kapcsolódik a patogén vírusok, baktériumok, mint a Mycobacterium tubercolosis (Arriaza et al., 1995; Donoghue et al., 1998; Fletcher et al., 2003; Haas et al., 2000), és a Yersinia pestis (Drancourt et al., 1998; Raoult et al., 2000), valamint az 1920-ban világjárványt okozó influenza (Reid et al., 1999) vírus vizsgálata. A humán fekáliákkal a jöv ben végzett kísérletekben nemcsak a táplálkozás során fogyasztott növények körér l felmerül kérdésre kaphatunk választ, hanem az elfogyasztott hússal kapcsolatban is (Poinar et al., 2001).

24 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.1.4 Archeológiai leletek: növények Az archeogenetikai vizsgálatoknál a növények esetében is a legnagyobb problémát a mintavételezés jelenti, hisz rendkívül nehéz jó megtartású DNS izolálásra alkalmas növénymaradványt feltárni. A száraz körülmények között fennmaradt kukoricamagokból (4.5. ábra) sikerült nukleáris DNS szekvenciákat izolálni, és a kukorica evolúciót, valamint domesztikációt vizsgálni (Goloubinof et al., 1993; Jaenicke-Despres et al., 2003). 4.5. ábra: Közel 4000 éves teozinte-kukorica (Zea mays ssp. parviglumis ) csutka (Jaenicke-Despres et al., 2003). A kukorica származását különböz archeológiai bizonyítékok alapján a Mexikóban shonos vad f b l, a teozintéb l 6300 évvel ezel ttre teszik. A kezdetleges domesztikációt követ en a kedvez morfológiai és biokémiai tulajdonságok szelekciója folytatódott, ami a feltárások során talált kukoricacsöveken is látható. A már azonosított növényszerkezetért, a raktározó fehérjékért, és a rosttermelésért felel s gének szekvenciájának variabilitása (allélikus diverzitás) a kukoricán belül alacsonyabb, mint a teozintében, ami a korai szelekciónak köszönhet (Wang et al., 1999; Whitt et al., 2002).

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 25 A DNS szekvenciák pontos ismerete alapján meghatározták a domesztikációban bekövetkezett fordulat (allél variabilitás csökkenése) pontos idejét (~4400 éve), és id tartamát (2500 év) (Jaenicke-Despres et al., 2003). A sz l gazdasági és kulturális jelent sége i.e. 1. évszázadban vált fontossá, köszönhet en az Európa mediterrán részén kialakuló bortermelésnek és kereskedelemnek. Az archeobotanika régi, de ma is aktuális kérdése a sz l eredete, domesztikációja, elterjedése, és nemesítése. Mikroszatellita markerekkel sikerült nukleáris DNS szekvenciákat felszaporítani 1700, és 2600 éves sz l magvakból, ami kiindulópontot adhat az si és ma termesztett fajták eredetéhez (Manen et al., 2003). Kutatóknak sikerült feny pollenszemb l (kb 100 000 éves) DNS-t izolálni, és az rbcl szekvenciákat amplifikálni (Suyama et al., 1996). A régészeti feltárások során talált szenesedett, vagy anaerob körülmények között deszikkálódott növénymaradványokon kívül a különböz fekáliák nyújthatnak segítséget a növényi maradványok archeogenetikai vizsgálatában (Höss et al., 1992). A radiokarbon kormeghatározást követ en (11 000; 20 000; 28500 éves) sikerült egy 157 bp nagyságú szakaszt, az rbcl gén nagy alegységének fragmentumát amplifikálni a lajhár (Nothrotheriops shastensis) ürülékéb l, és összehasonlítani a GenBank-ból származó szekvenciákkal, valamint a környezetben található növényzet hasonló amplifikátumaival (Hofreiter et al., 2000). A földilajhár táplálkozási szokásait tanulmányozva 13 növényi családot, vagy rendet határoztak meg (füvek, gyógynövények). Továbbá sikerült megállapítaniuk, hogy 11 000 évvel ezel tt szárazabbak voltak a klimatikus körülmények, mint korábban. Az üledékek esetében (10 000-400 000 éves) a maradványok molekuláris genetikai vizsgálatával sikerült cpdns

26 IRODALMI ÁTTEKINTÉS fragmentumokat izolálni 19 különböz növényi taxonból (Poales, Liliales, Ericales, Malvales, Brassicales, Fagales, Fabales, Rosales) (Willerslev et al., 2003). A szekvenciák korának meghatározását nehézkessé teszi az egyes makromolekulák, fázisok közti felfelé, ill. lefelé irányuló vándorlása (Hofreiter et al., 2003). Az ürülékb l és rétegekb l kapott DNS szekvenciák taxonómiai meghatározásokban történ felhasználását tovább sz kíti a DNS degradáció, ill. a szekvencia-eredet összetettsége (Hofreiter et al., 2000; Hofreiter et al., 2003). 4.6. ábra: 18 millió éves magnólia (Magnolia sp.)levéllenyomata (www. fossilmall. com). Els ként 1988-ban sikerült egy 18 millió éves liliomfa (magnólia) kövületeib l (fossziliákban) fennmaradt DNS-t izolálni (Golenberg et al., 1990). Viszont a kés bbiek során nem sikerült bizonyítani, a több millió éves kövületekb l (4.6. ábra) és más növénymaradványokból (4.7. ábra) izolált DNS szekvenciák reprodukálhatóságát (Soltis et al., 1992), mint ahogy a miocén korból származó tündérkürt (Clarkia amoena L.) lenyomatából sem sikerült örökít anyagot izolálni a kísérletek megismétlésekor (Sidow et al., 1991). Ugyanezt támasztja alá, hogy nem maradtak fenn az évmilliók során olyan molekulák, mint pl., a lignin (Logan et al., 1995). (a) (b) (c) 4.7. ábra: Borostyánk be zárt (a, c) növénylevelek, és (b) virágok (www.uky.edu).

27 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.2 ARCHEOLÓGIAI NÖVÉNYANYAG FELTÁRÁSA Az ásatásokból el került növényi leletanyag a középkori ember növénytermesztésének, növényismeretének pontos és h tükre. A leletek felhasználhatók a helyi írott és ikonográfiai források ellen rzésére, továbbá segítségükkel következtethetünk a táplálkozási szokásokra, a növényfelhasználásra és az egykori természeti környezetre (Willerding, 1984). Az írott és ikonográfiai forrásokból tudjuk, hogy a középkori Magyarország milyen gazdag volt endemikus gyümölcsfajtákban. A megszilárduló feudális rend egységes növénytermesztést alakított ki a királyi Magyarországon (De Candolle, 1894). Mindenhol többé-kevésbé ugyanazokat a növényeket termesztették. A forrásokat messzemen kig igazolni látszanak az utóbbi években el került középkori kutak karpológiai leletei. A középkori kutak folyamatos vízborításának köszönhet en egyre több gyümölcsmaradvánnyal rendelkezünk. A gyümölcsmaradványok alapján azonban még korai lenne a termesztett fajtákra következtetni, bár ilyen irányú kezdeményezések is vannak (Gyulai, 1999). A középkori magvak és termések többnyire emészt gödrökb l, kutakból, szemétgödrökb l kerülnek el, ahová a háztartások egykori szemete is került. Különösen a kutak, ciszternák, kloákák rizték meg jó állapotban a magvakat és terméseket. Az innen származó diaspórák, az anaerob körülményeknek köszönhet en, viszonylag jó állapotban maradtak fenn, bár esetenként a felületi korrodálódás jelent s lehet.

28 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.3 A SÁRGADINNYE 4.3.1 A sárgadinnye (Cucumis melo L.) domesztikációja (mikroevolúció) A Cucurbitaceae családon belül a legfontosabb termesztett fajok az uborka (Cucumis sativus L.), a sárgadinnye (Cucumis melo L.), a tök (Cucurbita pepo L.) és a görögdinnye (Citrullus lanatus L.). Annak ellenére, hogy azonos családba tartoznak, évmilliók óta szeparáltan fejl dtek, hiszen az afrikai és indiai Cucumis fajok közel 90 millió éve különültek el (Perl-Treves et al., 1985). Az uborkát Indiából, a sárgadinnyét és görögdinnyét Afrikából, a tököt Közép-Amerikából származtatják (Jeffrey, 1990). A sárgadinnye faj domesztikációja egészen az i.e. 4. és 3. évezredig követhet vissza (Pangalo, 1929). A fajra jellemz nagyszámú fenotípusos változatosságát valószín leg kiterjedt géncentrumának köszönheti, amely Afrikából kiindulva a Földközi-tengert l egészen Kelet-Ázsia partvidékéig tartott, több különböz domesztikációs központtal. A dinnye eredetvizsgálatát számos régészeti lelettel, és írásos emlékkel támasztották alá egészen az i.e. 5800-as évekt l (Nílus völgye) (Pangalo, 1929). Az archeológiai kutatások során két f forrásból származnak a feltárások eredményei. Az afrikai, f leg egyiptomi leletek (temetkezési helyek, királyi sírok, Tutankhamon sírja) az i.e. 5800-t l egészen i.e. 2000-ig jól mutatják a sárgadinnye, a görögdinnye, és legfontosabb származási seik (Afrika - Kalahári sivatag) a Cucumis lanatus L., és a Citrullus colocynthis L. domesztikációját (mikroevolocióját). A sírokban talált korabeli illusztrációk egy zöldhúsú flexuosus csoportba tartozó dinnyefélét ábrázolnak. Az Ázsiában talált legid sebb lelet Perzsiából i.e. 3500-ból származik, míg az si Kínából származó leletek (Shih Ching i.e. 1000; Zhejiand és Shaanxi tartomány i.e. 3000-2000)(Walters, 1989) a sárgadinnye, és görögdinnye

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 29 másik domesztikációs centrumát támasztják alá. Az uborka sének, eredetének, domesztikációjának vizsgálata alátámasztotta, hogy a sárgadinnye, az uborka és a többi Cucumis nemzetségen belüli faj azonos st l származik. Az els archeológiai lelet a cantaloupe dinnyér l, amely a dinnye széleskör termesztését is alátámasztotta Egyiptomból i.e. 2400-ból származik (Pangalo, 1929), igaz ekkor még nem tettek különbséget a hálózatos és nem-hálózatos típusok között. A görög és római id kb l különböz írásos dokumentumok az édes dinnyefélék utazók általi behozatalát igazolta (Pangalo, 1929). Számtalan bizonyítékot találtak a dinnye elterjedésére Európában az 1500-as évekig, így Franciaországban (9.sz), Portugáliában, Angliában (1327), és Olaszországban, ahonnan a cantaloupe elnevezés is származik (Cantaloupe várkert - pápák sárgadinnyéje). A spanyolok atlanti-óceáni felfedezéseit követ en került át az amerikai kontinensre, ahol az észak-amerikai indiánok vonták használatba, és az 1600- as évekre már nagy területeken termesztették. Magyarországi elterjedése a 14. századra, a dinnyészkedés virágkora a 15.- 16. századra tehet. Írásos emlékekben különféle leírásokat találunk a sárgadinnye-termesztés korabeli helyzetér l, mivel hazánk jelent s helyet foglalt el a különböz dinnyefélék európai termesztésében. A f úri és kolostori kertekb l kikerülve, a sárgadinnye a 16.-18. századra vált általánosan ismerté. A dinnye megnevezés számtalan különböz formában található meg az ország egyes tájain, de a helyes elnevezés a dinnye, vagy a sárgadinnye, ami az éréskor bekövetkez terméshéj világosodására utal.

30 IRODALMI ÁTTEKINTÉS A növényföldrajzi tanulmányok és a gazda-parazita kapcsolatok a nemzetség észak-kelet-afrikai géncentrumát és eredetét támasztják alá, a másodlagos géncentrumának Dél-Afrikát, a harmadlagosnak Indiát tartják, az uborkával és a nemzetség egyéb vad képvisel jével együtt (Leppic, 1966; Kerje és Grum, 2000). A sárgadinnye els dleges géncentrumának Afrikát, a másodlagosnak Indiát és a Közel-Keletet tartják (Jeffrey, 1980; Harlan et al., 1997; Trentini et al., 1998; Silberstein et al., 1999). A görögdinnye és sárgadinnye faj elkülönülésének folyamatát jól mutatja a Cucumis nemzetség harmadlagos géncentrumában, Indiában talált átmeneti alak amely a Citrullus és Melo nemzetség közös se lehet. A faj kialakulását tekintve több elmélet létezik, köztük a kromoszómafragmentáció (Leppic, 1966) és új centroméra kialakulása, de a magasabb kromatintartalom éppen az ellenkez jét bizonyítják (Ramachandran és Naryan, 1985) csakúgy, mint a sikeres keresztezési eredmények (Ruiter, 1973). 4.3.2 A sárgadinnye (Cucumis melo L.) rendszertani besorolása A trópusi, szubtrópusi és mérsékelt éghajlati területeken széles körben elterjedt tökfélék családjába (Cucurbitaceae) tartozó (4.8. ábra) 118 nemzetség (825 faj) közül a legjelent sebbek a következ k: Cayaponia (60 faj) Citrullus (4 faj) Coccinia (30 faj), Corallocarpus (15 faj) Cucumella (11 faj) Cucumis (33 faj), Gurania (40 faj) Kedrostis (25 faj) Momordica (45 faj), Peponium (20 faj), Sicyos (40 faj), Trichosanthes (40 faj) Zehneria (30 faj).

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 31 (a) (b) (c) (d) (e) 4.8. ábra A Cucurbitacea családba tartozó fajok virág morfológiai változatosságát szemléltet fajok: (a) Telfairia pedata, (b) Sicyos lanceoloidea, (c) Sicyos pachycarpus, (d) Sicyos hispidusc, (e) Trichosantes cucumerina (www.botany.hawaii.edu). A Cucumis nemzetségen (4.9. ábra) belül 37 különböz fajt azonosítottak taxonómiai bélyegek és habitus alapján (Cogniaux és Harms, 1924).

32 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Meeuse 1962-ben Dél-Afrikában 17 (Meeuse 1962), Jeffrey (1967) Kelet- Afrikában 13 fajt írt le. A 17 Cucumis fajon elvégzett interspecifikus hibridizációs tanulmány bebizonyította, hogy a C. anguira számtalan tüskés fajjal keresztez dik, de a C. metuliferus, és C. melo fajok az összes többi fajjal nem keresztez dnek (Deakin et al., 1971). A C. sativus és C. hystrix fajok között sikeres volt az interspecifikus keresztezés (Chen et al., 1997). A nemzetségen belüli pontos rendszertani besoroláshoz citológiai (Dane et al., 1980) és keresztezéses (Nijs és Visser 1985) vizsgálatot végeztek. A nemzetségen belül egy és kétlaki, diploid tetraploid (C. heptadactylus, C. ficifolius - Shimotsuma, 1965) és hexaploid (C. figarei - Jeffrey, 1967) fajokat írtak le. Az afrikai fajokra 2n=2x=24, vagy 48 az indiai fajokra jellemz 2n=2x=14 kromoszómaszám jellemz. A dinnyefélék (Cucumis) nemzetségén belül 2 alnemzetséget (Cucumis, Melo) azonosítottak. A Melo alnemzetséget a Melo (Melo, Humifructosi, Hirsuti) és Aculeatosi (Myriocarpi, Angurioidei, Metuliferi) szekcióra osztották. A Melo sorozatba tartozik a C. melo, és a C. sagittatus (Kirkbride, 1993). Az afrikai szarvas uborka (Cucumis metuliferus L.) egzotikumnak számít, míg az uborka (Cucumis sativus L.) és a sárgadinnye (Cucumis melo L.) rendelkezik gazdasági jelent séggel.

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 33 (a) (b) (c) (d) (e) (f) (e) 4.9. ábra: A diverz Cucumis nemzetségbe tartozó néhány faj terméstípusa (d) (C. anguira, (a) C. hystrix, (e) C. heptadactylus, (c) C. ficifolius, (b, f) C. dispaceus (aquiya.skr.jp/zukan/; www.rojaussodai.lt; www.botany.hawaii.edu). A sárgadinnye (Cucumis melo L.) a Cucurbitaceae családba, azon belül a Cucumis nemzetségbe tartozó, morfológiailag a legváltozatosabb egylaki, diploid faj (2n = 2x = 24): Plantae (Növények országa) Tracheobionta (Edényes növények) Spermatophyta (Magvas növények) Magnoliophyta (Virágos növények ) Magnoliopsida (Kétszik ek osztálya) Dilleniidae (ágazat) Violales (rend) Cucurbitaceae (Uborkafélék családja) Cucumis (dinnyefélék nemzetsége) Melo (alnemzetség, szekció, sorozat) Cucumis melo L. (faj)

34 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.3.3 A sárgadinnye (Cucumis melo L.) fajtatípusai A termesztett típusokba tartozó dinnyefajták intraspecifikus és rendszertani besorolását nehézkessé teszi, hogy morfológiai (termésalak, termésméret, hússzín, húsíz, hússzerkezet) és biokémiai tulajdonságok (aroma, cukortartalom, cukorszerkezet, ph) különbségén túl, köszönhet en a sz k nemesítési alapanyagháttérnek, valamint a vad és termesztett fajták közötti szabad keresztez déseknek (Stepansky et al., 1999) DNS szinten nagyon közeli rokonságot mutatnak (Shattuck-Eidens et al., 1990). A fajon belül ismertek vad és termesztett változatok, édes vagy desszert típusok, nem édes zöldség típusok és aromás nem ehet típusok. Az 1750-es évekig a dinnyéket különféle besorolás nélkül azonosították (Combes, 1752), míg a 19. század közepéig három, a termés küls, és bels karakterei alapján felállított csoportosítást használtak (Jacquin, 1832; Noisette, 1824; Séringe, 1828). Naudin (1859) a dinnye intraspecifikus besorolásakor 9 külön fajba sorolta a sárgadinnyéket, amit Cogniaux és Harms (1924) hárommal b vített: conomon, mormodica, utilissimus. Az elmúlt hetven évben 7 különböz rendszertani besorolás készült a dinnyefajták csoportosítására. Pangalo 1928-ban tovább növelte a fajon belüli alfajok, fajták számát, kés bb a Cucumis fajokat b vítette fajokkal, és alfajokkal (Pangalo, 1933), végül a Melo nemzetséget osztotta 4 szekcióra, 2 sorozatra, 12 fajra és egyéb intraspecifikus faj alatti csoportra, mint a fészek (Pangalo, 1958). Filov (1960) már nem csak a termés tulajdonságait, hanem a földrajzi származást is figyelembe vette a 6 alfaj és 19 termesztett fajta azonosításakor. A különböz kémiai alkotókat, mint a cucurbitacinokat, vagy a flavonoidokat

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 35 vizsgálva próbálták tovább finomítani a besorolást is (Brown et al., 1969). A termés magházának sz rözöttsége alapján két alfajt azonosított Jeffrey (1980). Grebenš ikov (1986) osztotta el ször vad és termesztett fajokra és változatokra a dinnyefélék családját, és a C. melo fajon belüli csoportosításkor 11 változatot definiált. Whitaker és Davis lecsökkentették Naudin 9 faját, és 6 termesztett csoportba sorolták a sárgadinnyéket és kiegészítették a conomon-nal, egy Ázsiából származó típussal (Whitaker és Davis 1962). A legújabb rendszertani besorolások a cantalupensis és a reticulatus csoportot a cantalupensis-ben, a chito és a dudaim csoportot a dudaim-ban egyesítették, és a mormodica csoporttal 6-ra b vítették a besorolást (Robinson és Decker- Walters, 1997). Az utolsó, és jelenleg elfogadott besorolásban 16 csoportot két alfajhoz, az agrestis-hez, és melo-hoz társítottak (Pitrat, Hanelt és Hammer, 2000) (4.1. táblázat): 1. alfaj agrestis (Jeffrey) (rövid sz rök a magházon) 1.1 conomon változat (Thunberg): sötétzöld lombozat, andromonoikus megnyúlt gyümölcs, sima vékony fehér, vagy világos zöld héj, fehér kemény hús, nem édes, nem illatos hidegkedvel, apró sárga magok. Termesztik: Kelet Ázsia. 1.2 makuwa változat (Makino): sötétzöld lombozat, andromonoikus, lapostól a kereken át ovális, vagy barack-alakú gyümölcs, sima, vékony, fehér, vagy élénk sárga, esetleg világos zöld héj varratokkal, vagy anélkül, fehér hús, édes, enyhén illatos, korai érés melegkedvel, apró sárga magok. Termesztik: Kelet Ázsia.