Segédanyag a Bevezetés a laboratóriumi gyakorlatba és biológiai számítások GY kurzushoz

Átírás

1 Segédanyag a Bevezetés a laboratóriumi gyakorlatba és biológiai számítások GY kurzushoz 1. Biológiai eredetű minták és vegyszerek a laboratóriumban A minta, amellyel dolgozunk, valamilyen élőlényből származó szövet-, vagy sejtminta, esetleg mesterséges körülmények között tenyésztett sejttömeg, az ezekből készült homogenizátum, vagy kivonat, ill. az ezekből izolált, bizonyos mértékben tisztított komponens (fehérje, nukleinsav, stb.) lehet. Mivel az élet közege a víz, így mintánk az esetek jelentős hányadában egy vagy többkomponensű vizes oldat, kolloidális rendszer, vagy szuszpenzió (pl. baktériumsejtek a tenyésztésükre használt médiumban). Méréseink legtöbbje szintén vizes közegben történik. Az elmondottakat figyelembe véve nem meglepő, hogy számos olyan eszközzel fogunk megismerkedni, mely folyadékok kezelését, tárolását, térfogatának mérését teszi lehetővé. Természetesen gyakran végzünk munkát szilárd anyagokkal, főként különböző kereskedelmi forgalomban megvásárolható vegyszerekkel, vagy szintetikus biomolekulákkal (peptidek, oligonukleotidok), ám ezeket majdnem minden esetben oldott állapotban használjuk fel kísérleteink során. A két legfontosabb gyakorlati ismeret ez esetben tehát az oldat elkészítésének módja, illetve az ehhez szükséges tömeg pontos kimérése. Gáz halmazállapotú anyagokkal ritkán végzünk munkát; ezeket tárolhatjuk palackozva (pl. O 2 ), cseppfolyós állapotban (pl. folyékony nitrogén), vagy oldat formájában (pl: HCl sósavoldat, NH 3 szalmiákszesz). Kezelésükkor nagyon fontos a biztonsági előírások betartása az esetleges robbanás, tűz, fagyási sérülések, ill. belélegzés esetén a fulladás vagy mérgezés elkerülése érdekében. 2. Folyadékok tárolására szolgáló műanyag és üvegcsövek Folyadékok tárolására a laborgyakorlatban legtöbbször átlátszó műanyagból készült eszközöket használunk. A műanyag széles hőmérsékleti tartományban rugalmas marad, míg az üveg kisebb ütés, vagy hőváltozás hatására is könnyen elreped. Olcsó és könnyen alakítható, így pl. a belőle készült edények zárhatósága különböző (csavaros vagy pattintós ) kupakokkal megoldható. Folyadékok tárolása esetén ez utóbbi kritérium nagyon fontos, hiszen meg kell óvnunk a mintát az oldószer párolgásától, a környezetből a mintába hulló por, baktériumok, penészspórák és egyéb szennyeződések káros hatásaitól, a levegő gázainak mintába oldódásától (pl. a levegő oxigénje a fehérjék cisztein oldalláncait oxidálva diszulfidhidakat hozhat létre az egyes fehérjemolekulák között), vagy az ennek következtében kialakuló változásoktól (pl. a szén-dioxid a mintában feloldódva szénsavvá alakul, a minta ph-ja csökken; ez fehérjék kicsapódását okozhatja). Az eszközök készítésére használt műanyagok további előnyös tulajdonsága, hogy a kísérleteink túlnyomó többségében használt vegyületekkel nem lépnek reakcióba. Előfordulhat azonban, hogy egyes kísérletekben szerves oldószereket használunk. Az ilyen kísérlet előtt nagyon fontos ellenőrizni, hogy az adott műanyag oldódik-e az oldószerben! Nagyobb térfogatú laboratóriumi minták tárolására szolgálnak a csavaros kupakkal záródó Falcon-csövek (1. ábra). Általában 50 és 15 ml-es térfogatban készülnek. A csövek alja kúposan elkeskenyedik, ami előnyös, ha csak kis térfogatú folyadék található a csőben (hiszen így egy helyre gyűlik össze), ám emiatt sajnos a cső nem áll meg a talpán, használatához állvány szükséges. Egyes 50 ml-es Falcon-csövek alján egy körkörös műanyag perem található; ezek állvány nélkül is megállnak az asztalon. Ügyelnünk kell azonban arra, hogy könnyen felborulnak! A csövek oldalán feliratok és beosztások segítik a csőben található 1

2 folyadék térfogatának becslését. Pontos térfogatmérésre azonban a Falcon-cső nem alkalmas! A kupakok tetején, illetve a csövek oldalán található fehér területek a minták feliratozását teszik lehetővé. Rendkívül fontos, hogy a laboratóriumi mintákat minden esetben egyértelmű, jól olvasható feliratokkal lássuk el. Meg kell neveznünk a minta komponenseit, ezek koncentrációját, a használt oldószert, puffert, egyéb fontos paramétereket (pl. ph), továbbá célszerű dátummal ellátni a mintát (egyes komponensek bomlékonyak lehetnek), illetve a kísérletet végző nevét feltüntetni. Ha a minta veszélyes (pl. mérgező) fontos ezt is jelezni! A műanyag csövek feliratozását általában alkoholos filctoll segítségével végezzük. Az elkészült feliratot a lekopástól egy darab átlátszó cellux ragasztószalag segítségével védjük meg. 1. ábra: Falcon-csövek, kémcső és Wasserman-cső műanyag állványban. Az üvegből készült kémcsöveket, illetve az ezeknél keskenyebb Wasserman-csöveket (lásd 1. ábra) zárhatóságuk hiányában általában csak ideiglenes jelleggel (reakcióelegyek összemérésére, kromatográfiás módszereknél frakciók gyűjtésére, stb.) használjuk. Szükség esetén zárásuk egy darab parafilm segítségével megoldható (2. ábra). A parafilmből egy megfelelő méretű darabot vágva lefedhetjük a cső nyílását, majd a lelógó végeket megfeszítve a nyílás köré tekerjük. Ezzel az eljárással akár légmentes zárást is biztosíthatunk, így a parfilmet gyakran használjuk egyéb csövek, edények esetén is. (Gyakran még a kupakkal rendelkező csövek zárását is ilyen módon erősítjük meg.) Az üvegeszközök előnye, hogy a legtöbb vegyszernek, oldószernek ellenállnak. (A biokémiai laborgyakorlatban ez alól talán csak a tömény lúgok képeznek kivételt.) 2

3 2. ábra: A: Parafilm tekercs dobozban; B: A parafilmből megfelelő méretű darabot vágunk; C: A parafilm réteg leválasztása a papírról; D: Wasserman-cső nyílásának lezárása; E: A parafilm lelógó végét megfeszítve a cső szája köré tekerjük; F: Lezárt cső; G: A lezárt csőből a folyadék még annak felfordítása esetén sem folyik ki. Kisebb térfogatok tárolására szolgálnak az Eppendorf-csövek (3. ábra). Ezek általában 1,5 ml-es térfogatban készülnek, bár vásárolhatunk ennél nagyobbakat (2 ml, 5 ml), illetve kisebbeket (0,5 ml) is. Használatukhoz szintén állvány szükséges. Az Eppendorf-cső tetején egy hajlékony összeköttetéssel a csőhöz kapcsolt, be- és kipattintható kupak biztosítja a zárhatóságot. A feliratozásra a cső oldalán, illetve a kupak tetején van lehetőség. Az úgynevezett PCR-csövek (lásd 3. ábra) általában maximum 200 μl minta befogadására képesek. Főként a rekombináns DNS technikák során használatos enzimatikus reakciók összeméréséhez használjuk őket. Nevüket a talán legismertebb ilyen eljárásról a PCR-ről (polimeráz-láncreakció) kapták, mely egy lineáris, kettős szálú DNS darab célzott, specifikus módon történő felszaporítására szolgál. A PCR-csövek az Eppendorf-csövekhez hasonlóan záródnak. 3

4 3. ábra:1,5 ml es és 0,5 ml es Eppendorf-csövek, valamint 200 μl-es PCR csövek. 3. Főzőpoharak és lombikok Oldatok elkészítésére és a kísérlet idejére történő tárolására főzőpoharakat (4. ábra) használunk. Méretük 10 ml és néhány liter között változhat. A folyadék térfogatának becslését beosztások és feliratok segítik, ám pontos térfogatmérésre ezek sem alkalmasak. A főzőpohár készülhet üvegből, vagy műanyagból. Amennyiben üvegből készül, alkalmas a benne található oldat láng felett történő melegítésére. 4. ábra: Üvegből és műanyagból készült, különböző méretű főzőpoharak. A biokémiai laborgyakorlatban gyakran találkozhatunk különböző lombikokkal, melyek szintén alkalmasak oldatok tárolására. (Zárásuk csiszolt dugó, vagy parafilm segítségével megoldható.) Méretük általában ~50 ml és néhány liter között változik. A főzőpoharakhoz hasonlóan üvegből, vagy műanyagból készülhetnek. Pontos térfogatmérésre csak a mérőlombik alkalmas, ám ennek használata a biokémiai laborgyakorlatban ritka. Leggyakrabban az Erlenmeyer-lombikot (5.A ábra) használjuk, főként baktériumok (esetleg egyéb sejtek) rázatott folyadékkultúrában történő tenyésztésre (5.B ábra). Az Erlenmeyerlombik alsó része széles, míg nyaka elkeskenyedik. Ez a forma biztosítja a lombik alján található folyadékréteg nagy felületét, mely a tenyésztett sejtek gázcseréjéhez igen fontos, lehetővé teszi a lombik rögzítését a megfelelő (fűthető és/vagy hűthető) rázó inkubátorban, továbbá megvédi a folyadékot a keveredés közbeni esetleges kilöttyenéstől. A megfelelő 4

5 gázcsere érdekében a lombikot egy darab alufólia segítségével fedjük le, mely nem zár légmentesen, viszont véd a külvilágból a táplevesbe jutó baktériumok, spórák ellen. 5. ábra: A: Különböző méretű Erlenmeyer lombikok; B: Erlenmeyer lombikok használata E. coli sejtek tenyésztésére. 4. Folyadékok térfogatának mérése: mérőhengerek és automata pipetták Folyadékok térfogatának pontos mérésére mérőhengereket (6. ábra) használunk. Különböző méretekben készülnek, egészen a milliliterestől a néhány literesig. A legkisebbekkel már néhány ml folyadék pontos mérése is lehetséges. Oldatok elkészítésére, össze-, ill. kimérésére használjuk őket. 6. ábra: A: Különböző méretű, üvegből és műanyagból készült mérőhengerek; B: Kisebb mérőhengerek (100 ml - 10 ml). 5

6 Gyakran szükséges azonban a milliliternél kisebb térfogatok pontos mérése is. Ehhez automata pipettákat használunk. (7. ábra) A pipetta belsejébe egy dugattyút építenek, melyet egy fém rúdon keresztül, a pipetta tetején található nyomógomb segítségével mozgathatunk. A dugattyú lenyomásakor levegő áramlik ki az eszközből, míg felengedésekor vákuum keletkezik. A vákuum szívó ereje a pipetta alján található üreges szárra rögzített, eldobható, műanyag hegybe juttatja a folyadékot. A mozgatni kívánt térfogat állítható, mégpedig a dugattyú által bejárható út megváltoztatásával. Ezt egy csavaros mechanizmus segítségével tehetjük meg, egy erre szolgáló állítógomb eltekerésével. (Gyakran a dugattyút mozgató nyomógomb szolgál erre a célra is.) Az aktuálisan beállított térfogatot az eszköz oldalán található számlálóról olvashatjuk le. Fontos, hogy nem szabad a pipetta maximális kapacitásánál nagyobb, ill. a minimálisnál kisebb térfogatértéket beállítani, ugyanis ez az eszköz károsodását okozhatja! Az adott pipettára érvényes határértékeket (a pipetta mérési tartományát) annak műanyag burkolatán, esetleg tetején felirat jelzi. A nagyobb pipettákat általában 1 és 5 ml között használhatjuk. Az 1 ml és 1 μl között több különböző méretű pipetta segítségével dolgozhatunk. A legkisebb pipetták a 0,1 μl és néhány μl közötti térfogatok kezelésére alkalmasak. 7. ábra: A: Automata pipetták és méréstartományuk. B: Pipetták a pipettaállványon és különböző pipettahegyek pipettahegy-tartó dobozokban. A különböző méretű pipettákra különböző méretű hegyeket csatlakoztathatunk. Több, speciális célra kifejlesztett pipettahegy is létezik, így pl. steril szűrővel felszerelt (steril munkához), vagy hosszított hegyeket is használhatunk. (8.A ábra) A pipettahegyek átlátszó műanyagból készülnek, ami lehetővé teszi a pipettázás folyamatának ellenőrzését (pl. a hegybe jutó buborék meghamisítja a mérést). Fontos, hogy minden használat után eldobjuk, ill. lecseréljük a használt hegyet, hiszen a rajtuk maradó folyadékcseppek beszennyezhetik tiszta törzsoldatainkat. (A nagy tisztaságú fehérje, enzim, nukleinsav, stb. mintákat de egyes vegyszereket is általában rendkívül költséges, munka és időigényes előállítani, így igen fontos tisztaságukra ügyelni. Beszennyezett mintákkal nem lehet megbízható kísérleteket végezni!) A hegy eltávolítása a pipetták többségén egy külön nyomógomb segítségével végezhető el, mely egy kar segítségével lelöki a hegyet a pipettáról. A hegyeket 6

7 megvásárolhatjuk előre csomagolva, az adott hegy megfelelő tárolását, és a pipetta végére rögzítését elősegítő dobozokban is (8.B ábra). (Elég az eszköz végét a kiválasztott hegy nyílásába nyomni, így az megszorul a pipettán. Fontos a szoros, légmentes kapcsolódás; ennek hiányában a hegybe nem a megfelelő mennyiségű folyadék jut, ill. a bejutott folyadék kicsöpög az átvitel közben.) 8. ábra: A: Különböző méretű, valamint speciális (steril szűrővel ellátott és hosszított) pipettahegyek; B: Pipettahegy rögzítése a pipettán, közvetlenül a dobozból. A pipetta kezelése egyszerű, bár némi gyakorlást igénylő feladat. (9. A-H ábra) A pipetta dugattyújának három állása lehetséges. Alaphelyzetben ( 1. állás ) a dugattyút és a hozzá kapcsolt nyomógombot egy rugós mechanizmus felfelé nyomja. Amennyiben hüvelykujjunkkal, finom mozdulattal, nem túl nagy erőt kifejtve lenyomjuk a dugattyút, levegő áramlik ki a pipettából (a korábban rögzített) pipettahegyen át. Miután a beállított térfogatnak megfelelő levegőmennyiség távozott, a dugattyú érezhetően megáll ( 2. állás ). Ekkor a pipetta hegyét a kiválasztott folyadék felszíne alá merítjük, majd lassan felengedjük a dugattyút, így a megfelelő mennyiségű anyag a hegybe jut. Ezt követően a hegyet kiemelhetjük, a felszívott folyadékot pedig átvihetjük egy másik csőbe, vagy edénybe. A nyomógombot ismételten lenyomjuk a 2. állásig, így a folyadék új helyére kerül. Gyakran előfordul, hogy egy kis csepp a pipettahegy végében marad. Ennek eltávolítása a pontosság miatt nagyon fontos; a dugattyú nagyobb erővel történő, további lenyomásával lehetséges (ekkor levegő áramlik ki a pipettából) ( 3. állás ). A pipettahegyet a folyadékból a dugattyú felengedése nélkül kell kiemelni; célszerűen a második állásból a harmadik állásba történő lenyomás közben, vagy azt megelőzően kerül erre sor. Nagyon fontos, hogy amíg a hegyben folyadék van, a pipettát nem dönthetjük oldalra; közel függőleges állásban kell tartani, ezzel elkerülve a folyadék dugattyúba jutását és az eszköz károsodását! Főként kis térfogatok pipettázásánál (pl. enzimoldatok) kell ügyelnünk arra, hogy a hegyet ne merítsük túl mélyen a pipettázandó folyadékba, ugyanis a hegy külső felületére tapadó folyadékcseppek jelentős pontatlanságokat okozhatnak! 7

8 9. ábra: A-B: A pipetta dugattyújának három állása; D-H: A pipettázás folyamata (D: térfogat beállítása, E: pipettahegy rögzítése, F: a folyadék felszívása, G: a hegy áthelyezése egy új csőbe, H: a folyadék leeresztése). 5. Folyadékok keverése Amennyiben több, különböző folyadékot, vagy oldatot mérünk össze, gondoskodnunk kell azok alapos összekeveréséről. Pipettáink erre is alkalmasak: a hegyet a keverendő folyadékba merítve, majd a dugattyút az 1. és 2. állások között többször fel-le mozgatva elérhető a megfelelő keveredés. Alternatív megoldásként alkalmazhatjuk az úgynevezett Vortex-keverőt (10.A ábra). A készülék működtetéséhez a tetején található gumipárnát a keverendő folyadékot tartalmazó cső (ált. Falcon-, Eppendorf-, vagy kémcső) aljával lenyomjuk. Ekkor a gumipárna gyors, körkörös, mozgásba kezd, ami a folyadék rázkódásához, illetve forgásához vezet. Ez hatékony keveredést biztosít meglehetősen kis (10-50 μl) térfogatok esetén is. Fontos, hogy a folyadék a csőben addig a pontig szökik fel, ahol azt fogjuk. Ha egy nyitott cső tetején tartjuk ujjainkat vortexelés közben, akkor a folyadék könnyen kifröccsenhet! Nagyobb térfogatú oldatok keverésére mágneses keverőt használhatunk (10.B ábra). A készülék belsejében szabályozható sebességgel forgó motor egy erős mágnest forgat. A fedőlemezre helyezett főzőpohárba, vagy lombiba egy teflonbevonatú, szintén erős mágnest 8

9 tartalmazó keverőbabát helyezünk. A belső mágnes forgó mozgását leköveti a keverőbaba mozgása, ezáltal az oldat is forgásba jön. Számos különböző méretű és alakú keverőbaba közül választhatunk (10.C ábra) a folyadék térfogatának, az edény alakjának és térfogatának függvényében. A mágneses keverőt gyakran használjuk különböző szilárd anyagok oldódásának elősegítéséhez, gyorsításához, illetve akkor, ha az oldat intenzív, állandó keverése szükséges. Utóbbi esetre példa a pufferoldatok ph-jának beállítása. Ekkor egy digitális ph mérő berendezés segítségével követjük a ph változását, miközben erős sav, vagy bázis oldatát adagoljuk a pufferhez, egészen addig. míg a kívánt ph értéket elérjük. A berendezéshez egy üvegelektród csatlakozik, mely az oldat oxóniumion-koncentrációjára érzékeny. 10. ábra: A: Folyadék keverése Vortex keverővel; B: Folyadék keverése ph mérés közben, mágneses keverő segítségével (a folyadékba fentről belemerül a ph mérő berendezés üvegelektródja); C: Különböző méretű és alakú, teflonnal bevont, mágneses keverőbabák. 6. Tömegmérés Az oldatok készítéséhez használt szilárd anyagok kimérését különböző pontosságú digitális mérlegek segítségével végezzük. Az egyszerűbb mérlegek 0,1 g pontossággal dolgoznak; mérési tartományuk a néhány grammos mennyiségektől a néhány száz grammos mennyiségekig terjed. (11.A ábra) Kisebb tömegek, akár tizedmilligrammos mennyiségek (századmilligrammos pontossággal) mérése analitikai mérlegeken lehetséges. Ezeket rezgésmentes asztalon kell elhelyezni, továbbá a mérés közbeni légmozgások zavaró hatását is ki kell küszöbölni. Utóbbi célra a mérlegre épített, átlátszó, nyitható búra szolgál (11.B ábra). A különböző vegyszerek kimérését a mérlegre helyezett, eldobható, műanyag tálca (esetleg egy főzőpohár, ill. egyéb edény), valamint vegyszereskanál, vagy spatula segítségével végezhetjük. Nagyon fontos a mérésre használt edény tömegét először üres állapotban lemérni, majd a mérleg kijelzőjét az erre szolgáló gomb segítségével lenullázni ( tárázni ), így csak a kimért anyag tömegét mutatja a mérleg. 9

10 11. ábra: A: Digitális mérleg kimérő edénykével, spatulákkal és vegyszereskanalakkal; B: Analitikai mérleg rezgésmentes asztalon. 7. Centrifugák A rázatott folyadékkultúrából a sejteket különböző centrifugák segítségével távolíthatjuk el (12. ábra). Ugyanígy tulajdonképpen bármilyen szuszpenziót, vagy kolloidális rendszert (pl. kicsapódott fehérjék egy oldatban) szétválaszthatunk két frakcióra, melyeket általánosságban felülúszónak (oldat) és csapadéknak, vagy pelletnek (a centrifugacső alján összetömörödött anyag) nevezünk. A centrifuga felépítése alapvetően egyszerű: egy álló és egy forgó részből (rotorból) áll. Az álló rész tartalmaz egy elektromos motort, mely a rotor forgatásáért felelős. A rotor feladata a mintákat tartalmazó centrifugacsövek befogadása. Mivel mintáink sok esetben hőérzékenyek (pl. fehérjék hődenaturációja), a centrifugák jelentős része hűthető belső térrel rendelkezik. Számos különböző méretű laboratóriumi centrifuga létezik, az egyszerű asztali készülékektől melyek általában Eppendorf-csövek befogadására képesek a több literes mintatérfogatok esetén alkalmazott preparatív centrifugákig. A nagyobb méretű készülékeket általában több, különböző rotorral is használhatjuk, így a centrifugálás paramétereit a mintákhoz szabhatjuk. A centrifugacsöveket mindig a rotor típusának megfelelően kell megválasztani (13. ábra). Nagyon fontos, hogy a mintákkal feltöltött centrifugacsöveket úgy helyezzük el a rotorban, hogy a szemközti csövek tömege azonos legyen, vagyis minden esetben alkalmazzunk ellensúlyokat (pl. vízzel töltött centrifugacső a mintával szemben). Ha a tömegeloszlás a forgástengely körül nem szimmetrikus, az az 10

11 alkalmazott igen nagy forgási sebességek mellett a készülék tengelyének töréséhez, a rotor és az egész berendezés károsodásához, súlyosabb esetben balesethez vezethet. 12. ábra: A: Asztali Eppendorf-centrifuga a rotorban szimmetrikusan elhelyezett Eppendorf csövekkel (maximális fordulatszám: /perc); B: Szemipreparatív, hűthető centrifuga, Eppendorf rotorral; C: Preparatív centrifuga és rotorja, mely több liter folyadék egyszerre történő centrifugálására képes; D: Szemipreparatív rotor és fedele; E: Preparatív rotor és fedele. 13. ábra: Különböző méretű centrifugacsövek. A centrifugák forgási sebességét általában a percenként megtett fordulatok számával adjuk meg. Ennél azonban a kísérlet szempontjából sokkal informatívabb a relatív centrifugális gyorsulás megadása, ugyanis a mintában található, adott tömegű részecskékre ható erőt ez határozza meg. (Az erőt a gyorsulás és a tömeg szorzataként kapjuk.) A relatív centrifugális 11

12 gyorsulást a Föld felszínén tapasztalható nehézségi gyorsuláshoz (g ~9,8 m/s 2 ) viszonyítjuk. Állandó szögsebesség, vagyis fordulatszám mellett a centrifugális gyorsulás a forgástengelytől számított távolságtól (vagyis a sugártól) függ. A sugarat a centrifuga rotorjának geometriája határozza meg. Ha két különböző centrifugában ugyanolyan fordulatszámon pörgetjük mintáinkat, teljesen eltérő eredményre juthatunk, ugyanis a részecskékre ható erő jelentősen különbözhet, s ez más-más ülepedési sebességet eredményez. Éppen ezért nem a fordulatszámot, hanem a relatív centrifugális gyorsulást (azt, hogy hány g -vel centrifugálunk) szokás megadni a kísérletek leírásában. Az egyszerűbb centrifugák maximum néhány tízezer g relatív centrifugális gyorsulással jellemezhetőek, míg az ultracentrifugáknál (14. ábra) ez az érték már több százezres nagyságrendbe is eshet. Az ehhez szükséges nagy fordulatszám könnyebb elérése érdekében a rotor körüli térben egy szivattyú segítségével vákuumot hozunk létre. Az ultracentrifugák preparatív felhasználásán túl (pl. sejtlizátumból membrántörmelékek eltávolítása valamilyen fehérje izolálása előtt) számos analitikai alkalmazás is ismert. Tanulmányozhatunk velük például fehérje-fehérje interakciókat, vagy fehérje-oligomerizációt. (A DNS szemikonzervatív replikációját is ultracentrifugával végzett, sűrűség-gradiens centrifugálásos kísérletekben sikerült megfigyelni először.) 14. ábra: A: Mikro ultracentrifuga (maximális fordulatszám: min 1, maximális gyorsulás: g); B: A mikro ultracentrifugához tartozó rotorok; C: Szemipreparatív ultracentrifuga (maximális fordulatszám: min 1, maximális gyorsulás: g); D: A szemipreparatív ultracentrifugához tartozó rotorok. 12

13 8. Az oldatokról 8.1. Az oldatok meghatározása és főbb formái A valódi oldatok két vagy több komponensű, homogén keverékek, amelyekben a legnagyobb mennyiségű komponenst nevezzük oldószernek, a többit oldott anyagnak. A homogén keverékek szabad szemmel egyfázisúak. (Nem tudunk pl. két folyadék fázist megkülönböztetni bennük, nem úgy, mint pl. az emulziókban, ami ezért nem valódi oldat.) Valódi oldatokban az oldott anyagnak atomjai, molekulái, vagy ionjai vannak diszpergálva az oldószerben. Speciális esetet képviselnek azok az oldatok, amelyekben az oldott anyag nem molekulárisan van diszpergálva, de szabad szemmel mégsem látható (pl. micellák). Ezek ugyan nem molekuláris diszperziók, de mégsem képeznek külön fázist. Az ilyen oldatokat kolloid oldatnak nevezzük. Más meghatározás szerint az oldat kolloid, ha az oldott anyag részecske mérete nagyobb, mint 1000 nanométer. A nagyobb fehérjék ebbe a kategóriába esnek, azaz kolloid oldatot képeznek, noha abban a fehérjék molekulárisan vannak diszpergálva. A laborgyakorlatban oldatok alatt általában folyadék halmazállapotú keveréket értünk. A biokémiában az esetek többségében vizes oldatokat készítünk, tehát olyat, amelyben az oldószer a víz. Ennek fő oka az, hogy általában fehérjékkel dolgozunk, amelyeknek vizes környezetben stabil a natív szerkezete. Kisebb vegyületek (pl. enzim szubsztrátok) oldására, vagy HPLC-s elválasztásakor gyakran készítünk szerves oldószeres oldatokat. Az oldatokat félkvantitaívan jellemezve beszélhetünk telítetlen, telített és túltelített oldatról, amelyek, rendre, a maximális lehetségesnél kevesebb, azzal megegyező, vagy annál több oldott anyagot tartalmaznak. (Ezek a jellemzők az oldhatóság okán hőmérséklet függők.) 8.2. Az oldatok mennyiségi leírása koncentráció egységek Elegyek komponenseinek mennyiségét kvantitatívan azok arányaiként adjuk meg. Ezeknek pontos kifejezései a koncentráció egységek segítségével írjuk le. Folyadék halmazállapotú keverékek - azaz oldatok - esetén többnyire az oldat valamilyen mennyiségére vonatkoztatjuk a komponensek mennyiségét, a mértékegységtől függően. A mólkoncentráció (molaritás, M) esetén például, amely a kémiában használatos mértékegység, az oldat 1 literére vonatkoztatunk a következőképpen: egy liter oldatban levő mólok száma. (Pl. 0,2 M az 0,2 mólnyi anyagot jelent 1 liter oldatban.) A kémiában is használatos (noha nem SI) koncentráció mértékegységek a különböző százalékok (%, amikor valaminek 100 egységnyi mennyiségére vonatkoztatunk). A térfogat és a vegyes százalék esetén 100 ml oldatra, míg súlyszázalék esetén 100 gr oldatra vonatkoztatunk. Térfogat százaléknál az oldott anyag millilitereit, vegyes százaléknál és súlyszázaléknál grammjait vonatkoztatjuk. (Pl. 15 vegyes %-os oldat 15 gramm oldott anyagot jelent 100 ml oldatban.) A súlyszázalékra, vagy súlyszázalékról történő átszámítások esetén az oldat sűrűségét is figyelembe kell venni, amennyiben az nem egy g/ml. Híg (néhány %-os) oldatok sűrűsége elhanyagolható mértékben különbözik egytől, ezért ezek esetében pl. a súly és a vegyes % gyakorlatilag azonosnak vehető (azaz 3 vegyes % ~ 3 súly %). Fontos tudni azt, hogy gyakorlati okok miatt a biokémiai kísérletekhez használt oldatok esetén a fentiektől eltérő, mg/ml, vagy μg/ml biokémikus koncentrációegység is használatos. 13

14 8.3. Oldatok készítése Miután a homogenitás alapvető kritérium, oldatkészítéskor fontos tudnunk az oldani kívánt vegyület oldhatóságát, amely hőmérsékletfüggő tulajdonság. A vegyületek oldhatóságát táblázatokból (szervetlen vegyületek esetén), vagy a gyártótól (pl. katalógusokban megadva) tudhatjuk meg. Az oldhatóságot a hőmérsékleten kívül az oldószer kémhatása (ph-ja), azaz az oldandó anyag sav-bázis tulajdonsága is befolyásolja. Bázisok savas, savak lúgos oldatban hajlandók jól oldódni, ezért ennek megfelelően gyakran kell változtatnunk az oldat kémhatását. Ezt legegyszerűbben valamilyen szervetlen sav, vagy bázis (rendszerint HCl, NaOH, KOH) adásával, ritkábban puffer rendszer alkalmazásával érjük el. Mindkét esetben tudatában kell lennünk annak, hogy a kapott oldat több komponensű, azaz az oldani kívánt anyagon kívül a ph-t befolyásoló anyagot is tartalmaz. A pontos koncentrációk elérése érdekében mindig olyan mérőeszközöket (mérőhenger, pipetta, mérleg stb.) használunk, amelyeknek méréstartományába esik a mérendő mennyiség. (Pl. 70 ml oldatot nem 250 ml maximális méréstérfogatú mérőhengerben készítünk, hanem 100 ml-esben.) Mivel a leggyakrabban használt koncentrációegységek (molaritás, vegyes és térfogat %) az oldott anyag mennyiségét az oldat térfogatára vonatkoztatják (lásd fent), mindig a kész oldat térfogatának kell a kívántnak (számítottnak) lennie, azaz annak nem csak az oldószert, hanem az oldott anyagokat is tartalmaznia kell. Ha pl. egy liter 4 M-os CaCl 2 oldatot kell készítenünk, akkor a kimért CaCl 2 -ot nem egy liter vízhez adjuk, hanem jóval kevesebbhez (pl ml-hez - akár feloldódott akár nem), majd ezután egészítjük ki a térfogatot egy literre. Csak így érhetjük el, hogy az oldat (teljes) térfogata, azaz a CaCl 2 és a víz együttesen lesz egy liter. Eszerint az eljárás szerint figyelembe vesszük azt a tényt, hogy az oldott anyagnak is van hozzájárulása az összes térfogathoz (a végtérfogathoz). Egy másik ok, ami miatt mindig a kívánt végtérfogatnál kisebb térfogatú oldószerbe tesszük az oldani kívánt anyagot az lehet, hogy állítanunk kell a ph-t az oldódás elősegítése, vagy egy kívánt érték elérése érdekében. A ph állításhoz sav vagy lúg oldatot használunk, amelynek térfogata többnyire előre nem ismert, és nem elhanyagolható. Ha az oldani kívánt anyagot a végtérfogatnak megfelelő mennyiségű oldószerben oldanánk, akkor (még ha az oldott anyag térfogata elhanyagolható is) a ph állítása során ezt a térfogatot biztosan túllépnénk, így oldatunk nem a kívánt (hanem kisebb és többnyire ismeretlen) koncentrációjú lenne. A helyes eljárás szerint tehát figyelembe kell vennünk azt a tényt, hogy a pufferoló (adalék) anyag térfogatát is tartalmaznia kell a végtérfogatnak. Összekeveréskor jó, ha tudjuk mit mihez célszerű, vagy biztonságos adni. A tömény kénsav hígítása jó példa a néha kötelező elővigyázatosságra: mindig a kénsavat adjuk a vízhez, mert fordított esetben a nagy oldáshő miatt felforró és szétfröcskölődő kénsavas forró víz súlyos balesetet okozhat. A célszerű sorrend fontosságára példa a szilárd anyagok oldása: jó, ha az oldószerhez adjuk az oldandó anyagot, és nem fordítva, az oldószert öntjük a szilárd anyagra. Ez különösen követendő eljárás fehérjék oldásakor, ellenkező esetben előfordulhat, hogy a lassan oldódó fehérje leragad az edény aljára, ami nagyon lelassítja az oldódást. Az oldódás sebességét többféleképpen gyorsíthatjuk: keveréssel, hőmérséklet emeléssel, ultrahang alkalmazásával, vagy a komponensek megfelelő sorrendben történő oldásával (pl. az akrilamid gélek festéséhez használt Coomassie oldat készítése esetén). Az első szokásos és veszélytelen módszer. Az ultrahangos kezelés, de különösen a hőmérséklet emelés azonban körültekintést igényel: figyelemmel kell lenni az oldandó anyag (hő)stabilitására. Tipikusan érzékeny anyagok a fehérjék, akárcsak számos egyszerűbb szerves vegyület. Ha oldáskor a ph-t is állítanunk kell, gyakran tekintetbe kell vennünk az oldandó anyag sav-bázis érzékenységét. A nem kívánt változásokat úgy előzhetjük meg, hogy 14

15 kerüljük nagy mennyiségű illetve töménységű sav, vagy lúg oldat adását. Inkább hígabb sav, vagy lúg oldatot használunk, kis részletekben adagolva. Néha speciális követelményeknek kell megfelelni, mint pl. fény, vagy oxigén érzékenység, illetve sterilitás. Az utóbbi esetben, ha az oldandó anyag hőérzékeny, az elkészült oldatot nem lehet hővel sterilezni. Ehelyett szűrést kell alkalmazni. Az elkészített oldatnak tisztának kell lennie az oldandó anyag teljes feloldódása után. Ha ez nem teljesül, akkor a kész oldatot le kell szűrni. Ehhez hagyományos eszközöket (szűrőpapírt, zsugorított üvegszűrőt), vagy egyszer-használatos, eldobható, különböző anyagú és pórusméretű szűrőmembránokat használhatunk az oldat tisztaságával szemben állított követelményeknek megfelelően. Az elkészített oldatokat jól záró műanyag, vagy üveg edénybe (cső, vagy üveg) tároljuk, mert csak így tudjuk megakadályozni azt, hogy az oldószer lassú párolgása következtében a koncentráció megváltozzon. (Ezt illékonyabb szerves oldószerek esetén sokkal nehezebb elérni.) Ezért a főzőpoharak, Erlenmeyer és más lombikok, vagy mérőhengerek (amelyeket az oldat elkészítésekor használunk) teljesen alkalmatlanok oldatok tárolására, mert még vizes oldatok esetén sem teljesítik a biztonságos tárolással kapcsolatos fenti követelményt. A legtöbb szervetlen és szerves vegyület oldatát szobahőmérsékleten tárolhatjuk, de a biokémiában vannak oldatok, amelyeket hűtőszekrényben, vagy fagyasztva kell tárolni. Az utóbbi a kémiai és mikrobiológiai stabilitás érdekében szükséges. Amennyiben nem sterileztük őket, a fehérjék oldata, de még olyan egyszerű szervetlen vegyület oldata is, mint a foszfát sóké igen kedvelt megtelepedési helye baktériumoknak és gombáknak. (Ezek megjelenését az oldat lassú megzavarosodása és gyakran kellemetlen szagúvá válása jelzi). Az is előfordulhat, hogy az enzimek (pl. proteázok) oldatban lassan aktivitásukat vesztik. A hűtés, amely esetükben többnyire 0 ºC alá történő hűtést jelent, ha teljesen megakadályozni nem is tudja ezeket a folyamatokat, de jelentősen lassítani igen. Az oldatokat tároló edényeket mindig felirattal kell ellátni, amelynek legalább addig kell olvashatónak maradnia, amíg az oldatra szükségünk van, vagy el nem fogy. Egy-egy oldott anyagot tartalmazó oldat esetén a koncentráció mellett az anyag nevét, szervetlen vegyület esetén képletét írjuk az üvegre. A legtöbb esetben azonban az oldat sokkomponensű. Ilyenkor csak akkor van módunkban minden komponens nevét és koncentrációját feltüntetni, ha azok egyszerűen (pl. képlettel) jelölhetők. A sokkomponensű oldatoknak többnyire saját, megkülönböztető nevük van, ami legalább a laboron belül egyértelmű (pl. aktiváló oldat, szonikáló puffer, 10 reakciókeverék, stb.). Számos esetben ezek az oldatnevek nemzetköziek, mert valamilyen széles körben alkalmazott eljáráshoz tartoznak. Tipikusan ilyenek a reagensek (pl. Bradford reagens, amelyet fehérjekoncentráció mérésre használunk), és a tápoldatok nevei (pl. LB, vagy 2YT stb., amelyeket baktériumok növesztésére használunk). Az oldat készítésének az időpontja is fontos lehet, ezért célszerű azt is feltüntetni. 15