Diagnosztikus immunhisztokémia: Problémák, megoldások és minőségbiztosítás

Diagnosztikus immunhisztokémia: Problémák, megoldások és minőségbiztosítás Dr. Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Budapest 2012. December 07.

Immunhisztokémia Szöveti molekulák in situ kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével

Immunhisztokémia Szöveti molekulák in situ kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével Specifikus térszerkezetbe koncentrált Kulcs a zárba illeszkedés NEM-KOVALENS Kötőerők Ionos -CH 2 -CH 2 -NH + - 3 O van der Waals -CH 2 -CH-CH 3 O Hidofób CH 3 -CH 2 -CH 2 - C-CH 2 -CH 2 - -CH 2 -OH H (+) (-) O O=C-CH 2 - H - híd

Immunhisztokémia A színes reakcióterméket a jelzőrendszerek katalitikus enzimreakciója pl. peroxidáz- H 2 O 2 -DAB reakció; fluorokrómok, vagy fémkolloidok (félvezető nanokristályok) adják A módszer érzékenységét a specifikusan kötött jelzőanyagok mennyisége határozza meg, ami standard körülmények között arányos a kimutatott antigén koncentrációjával

Immunhisztokémia A színes reakcióterméket a jelzőrendszerek katalitikus enzimreakciója pl. peroxidáz- H 2 O 2 -DAB reakció; fluorokrómok, vagy fémkolloidok (félvezető nanokristályok) adják A módszer érzékenységét a specifikusan kötött jelzőanyagok mennyisége határozza meg, ami standard körülmények között arányos a kimutatott antigén koncentrációjával Jelző-rendszerek: - enzim: PO, AP (több színben), stb. - fémkolloid: kolloid arany/+ezüst - fluoreszcens festék: FITC, TRITC, AMCA, Cy5, stb. Alexa-sorozat - qvantum dot - félvezető fluoreszkáló nanokristályok (szín: méret és összetétel függő)

Immunhisztokémia A színes reakcióterméket a jelzőrendszerek katalitikus enzimreakciója pl. peroxidáz- H 2 O 2 -DAB reakció; fluorokrómok, vagy fémkolloidok (félvezető nanokristályok) adják A módszer érzékenységét a specifikusan kötött jelzőanyagok mennyisége határozza meg, ami standard körülmények között arányos a kimutatott antigén koncentrációjával Prostata specifikus antigén (PSA) - Prostatarák Peroxidáz DAB Alkalikus foszfatáz Fast Red Immunfluoreszcencia Rodamin

Immunglobulinok IgG (7S) NH3 + V L Fab V H C H1 zsanér hinge régió diszulfid híd C H2 szénhidrát C H3 Fc COO http://pathmicro.med.sc.edu/mayer (Gene Mayer)

Immunglobulinok IgG (7S) NH3 + V L Fab V H Antigének felépítése C H1 zsanér hinge régió diszulfid híd C H2 szénhidrát C H3 Fc COO http://pathmicro.med.sc.edu/mayer (Gene Mayer) Antigén amit az adaptív immunrendszer felismer (antiszomatogén - Detre László, 1899)

Immunglobulinok mint reagensek Antigén-determináns: (epitóp) Az antigén molekula azon szakaszai melyekhez az antitest közvetlenül kapcsolódik Fab-fragmensének hipervariábilis régiójával. Általában 8-15 aminósav (fehérje antigén), ill. oligoszacharidok (szénhidrát antigén) határoz meg egy epitópot.

Immunglobulinok mint reagensek Antigén-determináns: (epitóp) Az antigén molekula azon szakaszai melyekhez az antitest közvetlenül kapcsolódik Fab-fragmensének hipervariábilis régiójával. Általában 8-15 aminósav (fehérje antigén), ill. oligoszacharidok (szénhidrát antigén) határoz meg egy epitópot. Stabilitás(tárolás): - Tömény antitestek, 1% BSA+0,1% Na-azid-TBS-ben 4 o C-on hónapokig (az RTU antitestek is), akár évekig igen stabil. - Munkahígítások hasonló módon tartva 1-2 hétig, de van amelyik antitestet csak frissen hígítva használhatunk. - Érzékeny antitestek, -20 o C-on aliquot-okban (csak egyszer)

Immunglobulinok mint reagensek Antigén-determináns: (epitóp) Az antigén molekula azon szakaszai melyekhez az antitest közvetlenül kapcsolódik Fab-fragmensének hipervariábilis régiójával. Általában 8-15 aminósav (fehérje antigén), ill. oligoszacharidok (szénhidrát antigén) határoz meg egy epitópot. Stabilitás(tárolás): - Tömény antitestek, 1% BSA+0,1% Na-azid-Tris, ph7,4 4 o C-on. hónapokig (az RTU antitestek is), akár évekig igen stabil. - Munkahígítások hasonló módon tartva néhány hétig, de van amelyik antitestet csak frissen hígítva használhatunk. - Érzékeny antitestek, -20 o C-on aliquot-okban (csak egyszer) Destabilizál: 1) alacsony/magas ph; 2) hő; 3) magas sókoncentráció; 4) fény

Diagnosztikus immunhisztokémia Összetett Szövet kimetszés Diagnosztikus riport Immunhisztokémia eredménye

Diagnosztikus immunhisztokémia Összetett Szövet kimetszés Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Antigénfeltárás hatékonysága eszköze módja Diagnosztikus riport Immunhisztokémia eredménye

Diagnosztikus immunhisztokémia Összetett Szövet kimetszés Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Analitika Antigénfeltárás hatékonysága Reagens eszköze minőség/ módja affinitás Jelző-/előhívórendszer Diagnosztikus riport Immunhisztokémia eredménye Reagenshígítás Inkubációs idő hőmérséklet

Diagnosztikus immunhisztokémia Összetett Szövet kimetszés Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Analitika Antigénfeltárás hatékonysága Reagens eszköze minőség/ módja affinitás Jelző-/előhívórendszer Diagnosztikus riport Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Poszt-analitika Immunhisztokémia eredménye Inkubációs idő hőmérséklet Reagenshígítás

Diagnosztikus immunhisztokémia Összetett Szövet kimetszés Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Analitika Antigénfeltárás hatékonysága Reagens eszköze minőség/ módja affinitás Jelző-/előhívórendszer Diagnosztikus riport Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Poszt-analitika Automatizálás Immunhisztokémia eredménye (Standard kit-ek) Inkubációs idő hőmérséklet Reagenshígítás

Szövetrögzítés Célja: A szövetstruktúra megőrzése A lyzosomális enzimek denaturálása, gátlása A mikroorganizmusok (baktériumok, gombák) pusztítása, szaporodásuk gátlása A szöveti molekulák in situ helyhez kötése A szövetek fizikai keményítése - metszéshez 4%-os formaldehid = ~ 10%-os formalin (a formaldehid telített vizes oldata)

Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó

Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál Túlrögzítés: - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! gátolt antigéndetektálás (DNS fragmentáció) Antigénfeltáró módszerek

Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál Túlrögzítés: - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! Víztelenítés: Beágyazás: Metszés: gátolt antigéndetektálás (DNS fragmentáció) Antigénfeltáró módszerek utolsó absz. alkohol vizes gyakoribb csere/forgás orientációs hiba blokk öntés gyűrött vagy szakadozott metszet (terítés) Pre-analitika: Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok

Optimális szövetrögzítés!

Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET IDŐ 1 h = ~1 mm Penetráció Rögzítés = 16-24 h 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin

Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET IDŐ 1 h = ~1 mm Penetráció Rögzítés = 16-24 h Időben: Méret: <10 percen belül < 3 mm 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin Időtartam: 16-24h

Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET IDŐ 1 h = ~1 mm Penetráció Rögzítés = 16-24 h Időben: Méret: <10 percen belül < 3 mm 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin Időtartam: 16-24h Rögzítés Egymás ellen ható követelmények Struktúra Antigenitás Kompromisszum! Antigénfeltárás

Immunhisztokémia Dekalcinálás MW citrát ph6,0 Nincs HCOOH Időigény Szövet-extrakció 1) Sósav: gyors erőteljes extrakció szövetkárosodás antigénvesztés -Ig könnyűlánc 2) Hangyasav: közepes némi extrakció megfelelő morfológia antigenitás (ecetsav - ultrahanggal gyorsítható)

Immunhisztokémia Dekalcinálás MW citrát ph6,0 Nincs CH 2 OH Időigény Szövet-extrakció 1) Sósav: gyors erőteljes extrakció szövetkárosodás antigénvesztés Nincs -Ig könnyűlánc EDTA 2) Hangyasav: közepes némi extrakció megfelelő morfológia antigenitás (ecetsav - ultrahanggal gyorsítható) 3) EDTA lassú nincs extrakció optimális morfológia antigénfeltárás! CD35 4) Elektromos: gyors - erős extrakció sósav-hangyasav - hőképződés

Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus

Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket, idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes Vízfürdő ~48-50 o C - Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 o C-on ~2h

Diagnosztikus immunhisztokémia Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Analitika Antigénfeltárás hatékonysága Reagens eszköze minőség/ módja affinitás Jelző-/előhívórendszer Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Poszt-analitika Immunhisztokémia eredménye Inkubációs idő hőmérséklet Reagenshígítás

Optimalizás Immunhisztokémia Primer antitest Inkubáció Antigénfeltárás

Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés)? Trypsin 8 15 20 17 Proteáz emésztés: Rögzítés-függő Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin

Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés)? Trypsin 8 15 20 17 Proteáz emésztés: Rögzítés-függő Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin HIER TRS ph6.1 Nedves hővel (HIER = heat-induced epitope retrieval )

Antigénfetárás főzéssel (HIER) Általános hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása Ca 2+ eltávolítás Pan-cytokeratin: AE1/AE3 Nincs Proteáz HIER

Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása Ca 2+ eltávolítás Pan-cytokeratin: AE1/AE3 Nincs Proteáz HIER Puffer: Hatékonyság ~ szövetkárosítás Ca++ Ca++ Ca++ Tris-EDTA ph9 > Citát ph6 Kálcium kelátok eltávolítása Citrát ph 6 ++ EDTA ph 6 (+) EDTA ph 8 +++ Tris/EDTA ph 9* ++++ Javasolt! - Morgan et al. J. Pathol. 182 233-237 1997 - *Vyberg M és Nielsen S. NORDIQC

Hőközlés Antigénfeltárás Professzionális MW <120 o C MW ~100 o C PC <120 o C

Hőközlés Professzionális MW <120 o C 1. Csoport Antigénfeltárás ANTIGÉNFELTÁRÓ PUFFEREK JELLEMZŐI Hatékonyabb pufferek Rövidebb főzés igényelnek Erősen szövet-destruktívak - EDTA, ph 8.0 (1-100 mm) - TRS high, ph 9.9 (0.1 M, Dako) - TRIS-EDTA, ph 9.0 (10 mm /1 mm) -TRIS, ph 10.0 (10-200 mm) MW 2. Csoport Kevésbé hatékony pufferek Hosszabb főzést igényelnek Kevésbé szövet-destruktívak - TRS, ph 6.1 (0.1M, Dako) - Bórsav, ph 7.0 (20 mm) - Citrát, ph 6.0 (10 mm) ~100 o C PC <120 o C

Hőközlés Professzionális MW <120 o C 1. Csoport Antigénfeltárás ANTIGÉNFELTÁRÓ PUFFEREK JELLEMZŐI Hatékonyabb pufferek Rövidebb főzés igényelnek Erősen szövet-destruktívak - EDTA, ph 8.0 (1-100 mm) - TRS high, ph 9.9 (0.1 M, Dako) - TRIS-EDTA, ph 9.0 (10 mm /1 mm) - TRIS, ph 10.0 (10-200 mm) MW 2. Csoport Kevésbé hatékony pufferek Hosszabb főzést igényelnek Kevésbé szövet-destruktívak - TRS, ph 6.1 (0.1M, Dako) - Bórsav, ph 7.0 (20 mm) - Citrát, ph 6.0 (10 mm) ~100 o C ANTIGÉNFELTÁRÁS AJÁNLOTT KÖRÜLMÉNYEI Hőközlő eszköz Puffer típusa Puffer térfogat Hőmérséklet Idő Megjegyzés PC Konyhai mikrohullám MW, 700-1200W 1. Csoport 2. Csoport 600-800ml 100 o C 20-25 25-35 Teljes melegítési idő (szobahőről) <120 o C Konyhai mikrohullám MW, 300W (30-40%) Konyhai fém kukta PC (5 liter) 1. Csoport 2. Csoport 1. Csoport 2. Csoport 100-150 ml 3 liter, vagy 150 ml műanyag edény 100 o C ~120 o C 30-35 35-45 2-3 3-4 Teljes melegítési idő (szonbahőről) Idő teljes nyomáson Vízfürdő 1. Csoport 2. Csoport Festőedény előmelegített puffer 95-99 o C 30-35 35-45 Idő munkahőmérsékleten

Antigénfeltárás Jelentősége Nincs feltárás Tonzilla Tris-EDTA Vimentin

Immunhisztokémia Antigénfetárás beállítása Sorozatmetszetek napi reprezentatív/túlrögzített anyagból Vimentin (V9): - HIER sorozat eltérő időkkel - Standard immunhisztokémia Elvárás: Minden lymphocyta pozitív!

Immunhisztokémia Antigénfetárás beállítása Sorozatmetszetek napi reprezentatív/túlrögzített anyagból Vimentin (V9): - HIER sorozat eltérő időkkel - Standard immunhisztokémia Elvárás: Minden lymphocyta pozitív! 30 citrát ph6,0 40 citrát ph6,0 elégtelen optimális HIER hatékonyság = hőmennyiség (idő+hőmérséklet) + puffer/ph

Antigénfeltárási idő Metszetadhézió Lab code run: Test: Si Hőaktiválás! + + EGFR SuperFrost Ultra Plus 10 citrát 40 citrát

Rögzítési idő (4% formaldehid- Antigénfeltárás 120 o C, 1 min 0.01M citrát, ph6 04h CD79a 48h FÉM KUKTA 120 o C, 1 min 0,01 M Tris-EDTA, ph9 04h 48h

Késleltetett 4%-os formaldehid rögzítés CD79a - Antigenitás (morfológia) 1 perc 0.01M citrát, ph6 2h késés 6h késés 1 perc 0,01 M Tris-EDTA, ph9 2h késés 6h késés

Antigénfeltárás (Hígítás!) Jelentősége Normál citrát, ph 6.0 Erős citrát, ph 6,0 Normál Tris-EDTA, ph9,0 HER2 2+ emlőrák

IHC HIER - Műtermékek -Technológiai HIER CD3

IHC HIER - Műtermékek CD79a CD79a Metszetszéli heterogenitás Nemspecifikus magreakció Tris-EDTA ph 9 Váltani kell!

Antigénfeltárás - rögzítés 1. Túlrögzítés: - Kompenzálható megfelelő antigénfeltárással - TRIS/EDTA ph9 lényegesen jobb, mint a citrát ph6

Antigénfeltárás - rögzítés 1. Túlrögzítés: - Kompenzálható megfelelő antigénfeltárással - TRIS/EDTA ph9 lényegesen jobb, mint a citrát ph6 2. Késleltetett rögzítés: - Rövid (2h) autolízis antigénfeltáró hatású - Hosszú (6h) autolízis destruálja az antigéneket és a szövetstruktúrát

Antigénfeltárás - rögzítés 1. Túlrögzítés: - Kompenzálható megfelelő antigénfeltárással - TRIS/EDTA ph9 lényegesen jobb, mint a citrát ph6 2. Késleltetett rögzítés: - Rövid (2h) autolízis antigénfeltáró hatású - Hosszú (6h) autolízis destruálja az antigéneket és a szövetstruktúrát 3. Eltérő szövetrögzítés: - Ecetsav a formalinban, HIER nélkül is van reakció - Methacarn és a B5 is reagál HIER nélkül - Nem-keresztkötő rögzítők HIER igénye alacsony - Messze a legjobb morfológia = pufferelt formalin - Túl agresszív főzés nem idokolt - szövetkárosodás

Primer antitest megválasztása

Primer antitestek Kiválasztás Az irodalomban referált, paraffinon validált antitestek Technikai: www.ukneqasicc.ac.uk www.nordiqc.org Interpretációs: www.dako.co.uk/asp/algo www.immunoquery.com

ANTIBODY ALGORITHM Primer antitestek

Primer antitestek - hígítás Optimális hígítás: Maximális jel/háttér arány JEL MÉRTÉKE Jó FP FN Primer antitest hígítása

Primer antitest Inkubációs idő Szobahő 120 Szobahő 30 EGFR Oesophagus SSC

Jelző/Detektáló rendszer ABC módszer pcd3 1:200 Citrát ph6 Tris-EDTA ph9

Jelző/Detektáló rendszer ABC módszer pcd3 1:200 Citrát ph6 Tris-EDTA ph9 Hatékony HIER (Tris-EDTA; EDTA stb ) Endogén biotin! Metabolikusan erősen aktív sejtekben: FALS POZITIVITÁS! máj, vese, mellékvese, emlő gasztointesztinális hám

Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! 2-lépéses módszer: Primer egér antitest Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO

Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Újabb polimerek 3. generációs 2-lépcsős módszer: Primer egér antitest Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO

Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! 3-lépéses módszer 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) Egér IgG 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! 3-lépéses módszer Nyúl anti-egér IgG Egér IgG 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! Anti-egér 3-lépéses módszer Anti-nyúl Nyúl anti-egér IgG Egér IgG 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum 3-5 x érzékenyebb! Mint a 2 lépéses

Immunhisztokémia Erősített polimer Jelzőrendszer érzékenysége Polimer Melanoma: CollagenXVII

Polimer-enzim detektálók Kettős jelölés CD1a - CD68 Reaktív nyirokcsomó

Antigénfeltárás Jelzőrendszer mérete Polimer-konjugátum ABC komplex Anti-IgG-PO Penetráció

Antigénfeltárás Jelzőrendszer mérete Polimer-konjugátum ABC komplex Anti-IgG-PO Penetráció Nagyobb méret hosszabb antigénfeltárás!

Immunhisztokémia Mosó puffer ph-ja TBS ph 7,4

Immunhisztokémia Mosó puffer ph-ja TBS ph 8,0 TBS ph 7,4

Immunhisztokémia Tumor heterogenitás CK20 EGFR

CD20 B-sejt marker - QC CD79a

c-erbb2, saját Endogén biotin 3+ Alul/elkésett rögzítés

Immunhisztokémia Kontrollok Antigén kimerítés (negatív) Alacsony antigénszint (pozitív) Endogén beépített pozitív kontroll ER

Immunhisztokémia Alapszabályok BLOKK MÉRET - egyik dimenzió < 3 mm RÖGZÍTÉS - időben = <10 ; megfelelő ideig = 16-24h Hatékony ANTIGÉNFELTÁRÁS (ph 9, Tris-EDTA) Referált PRIMER ANTITEST ( paraffinos klónok ) Stabil ph-jú MOSÓ PUFFER (+ 0,1 % detergens) Biotin-mentes DETEKTÁLÓ (Jelerősített, 3 lépéses) ELŐHÍVÁS standard DAB kit KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) Gazdaságosság (érzékeny módszer <Ab hígítás) Automatizálás (a standardizálás preferált módja) Finomhangolás (minden új primer Ab - titrálás)

Patológiai minőségbiztosítás MINŐSÉGÜGYI RENDSZER MŰKÖDTETÉSE, pl. ISO 9001 TECHNOLÓGIAI BELSŐ KÜLSŐ ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS

Patológiai minőségbiztosítás BELSŐ TECHNOLÓGIAI Standard protokollok Szövetfeldolgozási és festési módszerek lépéseinek monitorozása Festett metszetek ellenőrzése Hibás minták kigyűjtése Hiba meghatározása Hiba javítása A folyamat rögzítése, a tapasztalat megosztása ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS Standard protokollok - szövetindítás - leletezés Belső konzultációs rendszer milyen esetekben célszerű Diagnosztikus leletek (1-2%) random újraértékelése Egyezés, eltérés okainak elemzése, javítása

Patológiai minőségbiztosítás KÜLSŐ TECHNOLÓGIAI 1996 Kft ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS MIT MPT MLDT MKMT MHT Jogosítvány 2001. óta tanúsított In vitro orvosdiagnosztikai laboratóriumok külső minőségértékelése és szakmai támogatása. 2009. június: MSZ EN ISO 9001:2009 (ISO 9001:2008) Cél Folyamatos külső minőségértékeléssel a vizsgálati eredmények összehasonlító elemzésével az egészségügyi diagnosztikai tevékenység megbízhatóságának javítása Nem a szankcionál, hanem támogatja a laboratóriumok tevékenységét a minőség fenntartása és javítása céljából.

Festetetlen metszetek Pathológia 1. Forduló : 1996 61. Forduló: 2012 december Hisztotechnológia H-E Speciális festés Immunhistokémia ~40 Labor (57) ~30 Labor (45) Ismétlődő Általános marker QualiCont metszet 2-féle Vékonybél Saját metszet 2-féle Bőr pl. Reticulin PAS Giemsa Trikróm Elasztika stb ER Melanoma Carcinoma B-sejt marker Izom Endothel Proliferáció stb

Összesített egyéni teljesítmények 2006-2010 között

I HER2 - Paraméteres elemzés

A leggyakoribb hibalehetőségek NORDIQC (Skandináv országok) 13-14. forduló Fals negatív: 2559 (Slides) metszetből 740 ( 29 %) Túlhígított primer antitest Overdiluted primary antibody 247 ( 33 %) Elégtelen HIER Insuffiecient HIER 243 ( 33 %) Nem megfelelő primer antitest 107 ( 14 %) Nem értelmezhető ok 41 ( 6 %) Fals pozitív: 102 ( 4%) Túl tömény primer antitest Concentrated primary antibody 51 ( 50 %) Nem megfelelő minőségű primer antitest 16 (16 %) Túlzott antiténfeltárás 13 (13 %) A detektáló rendszer nemspecifikus reakciója 19 (19 %) Nem értelmezhető ok 3 ( 2 %)

Her2 QC QualiCont Értékelés Standard kritériumok 1+ 2+ 3+

Her-2 IHC - Primer antitest rp-cerbb2 rm-sp3 m-cb11

Her-2 IHC Módszertani kritika Erős háttér Vector antigénfeltáró Érzékeny detektáló Negatív

HER2 - emlőrák QualiCont 55. Forduló normál mirígy pozitív

HER2 - gyomorrák QualiCont 55. Forduló Jelölés, saját értékelés

Her-2 QualiCont 54. Forduló 3+ Túlrögzített szövet Primer antitest antigénfeltárás

QualiCont 54. Forduló Melanoma marker Primer antitest Kromogén, hígítás

H-E bőr QualiCont 54. Forduló Szövetstruktúra Magrészletek, zsírszövet

Her-2 Értékelés standard kritériumok 3+ Erős, komplett membrán festés >30%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 2+ Mérsékelt, komplett membrán festés >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1+ Gyenge, részleges membrán festés >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1-2+ Mérsékelt, (in)komplett membrán festés >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1-2+ Halvány, részleges membrán festés >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 0 Nincs sejtmembrán festődés, vagy alig < 10%

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1+ Gyenge, részleges membrán festés, >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 0 Csak citpolazma, nincs sejtmembrán festődés

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1+ Gyenge, membrán festés, >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1+ Gyenge, komplett membrán festés, akár >10%-ban

Her-2 Értékelés standard kritériumok 1-2+ Gyenge, komplett membrán festés, akár >10%-ban

Festések értékelésének szubjektivitása Optikai csalódás

Digitális mikroszkópia kép analízis Szín dekonvolúció HER2 DAB MembraneQuant HER2 Hematoxylin NuclearQuant ER További adat analyízis

Köszönet Parsch Edit Dr. Teleki Ivett Dr. Kiszner Gergő Dr. Meggyesházi Nóra Balla Péter Tamási Anna Kiss Renáta

Az immunhisztokémiai asszisztensek fontos kiegészítő tevékenységei Új antitestek tesztelése Pozitív kontrollok regisztrálása, metszése Új módszerek, antigénfeltáró pufferek tesztelése A reakciók eredményének technikai monitorozása (belső minőségbiztosítás) Részvétel külső minőségbiztosításban A reagensek és módszerek gondozása (standard protokollok) Kutatási célú reakciók Tanácsadás, asszisztens oktatás Adminisztráció: ISO, immunkérések, TB elszámolás stb. Automatizálás feladatai

Immunhisztokémia Automatizálás STANDARDIZÁLÁS Pre-analitika (?) - rögzítést nem! Analitika - teljes Poszt-analitika (-/+) - támogathat (képanalízis)

Automatizált immunfestés előnyei Az inkubáció/mosás/előhívás kontrollja - standard körülményei: - NINCS: kávé/ebéd szünet, szabadság, csúszás - az eredmények reprodukálhatósága jelentősen javul Immunigények és a munkaerő ritkán van szinkronban - a vizsgálat átfutási ideje csökken és egyenletesebbé válik Érzékeny és standardizált jelző és előhívó rendszer - rövid inkubációk, az automata naponta többször indítható Az asszisztensek tapasztalatbeli különbségei kevésbé dominálnak - javulhat a hatékonyság, a minőség és a megbízhatóság is Automatizálással a munkaerő ~30-40 %-a felszabadítható - javul a munkaerő kihasználtsága egyéb fontos teendők

Automatizált immunfestés Költséghatékonyság Tulajdonság Manuális immunfestés Automatizált immunfestés Berendezés költségei + +++ Fogyóanyagok költsége ++ +++ Reagensek költsége ++ +++ Időmegtakarítás ++ +++ Antigénfeltárás Egyedileg szükséges Automatizált folyamat Primer antitest költsége ++ (kisebb térfogat) ++ (továbbhígítható) Detektáló rendszer költsége Ismétlések szükségessége Reprodukálhatóság esélye ++ +++ + +++ (de érzékenyebb) + +++

Köszönet! Parsch Edit

Rutin immunhisztokémia Gyakori technikai hibalehetőségek Rögzítés - Elégtelen/késleltetett Beágyazás - Elégtelen víztelenítés Antigénfeltárás - Elégtelen/túlzott Reagensek - Tárolási hiba, hígítás Előhívás - túl hosszú (>10 ), csapadékos Felülfestés - túlzott (cytoplazma, mag)

Polimer-enzim detektálók Kettős jelölés CSAK ELTÉRŐ SEJT, vagy SEJT-KOMPARTMENT sejtmag+cytoplazma; sejtmag+membrán; membrán+cytoplazma Blokkolás a 2 festés között: 1) 0,1 N HCl-5 ; 2) ~100 o C 5 1. 2. PO/DAB AP/F-Red Ha a 2 primer Ab, azonos fajú: - szekvenciálisan, egymás után - első a PO/DAB jelölés Kappa ill. lambda Ig-könnyűlánc Ha a 2 primer Ab, eltérő fajú: - szimultán inkubálások - primer ill. a jelző antitestek saját lépésükben keverhetők (egymást hígítják!)

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Mikroszatelliták Egyszerű repetitív DNS szekvenciák, 1-6 bázispár (pl. CA) akár 100x ismétlődve DNS duplikáció (replikáció) során sérülékenyek (elcsúszás, inzerció, deléció) Mismatch repair (MMR) fehérjék a bázisillesztési hibákat kivágják Az MMR gének mutációja (epigenetika) mikroszatellita instabilitás (MSI-High/Low) Következmény: daganatgátló gének mutációja CARCINOMAGENEZIS

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Mismatch repair - MMR fehérjék 9 DNS hibajavító gén Nukleáris enzimek - Heterodimerek DNS replikációs bázis hibák korrekciója MSH2-MSH6: szimpla DNS bázis korrekciók - MLH1-PMS2 - későbbi lépés MSH2-MSH3: hosszabb 2-8 bázishibák korrigálása MSH6-nak ill. PMS2-nek csak 1-1 partnere van (labilisabbak) Mutáció: Promóter hipermetiláció MMR fehérje hiánya/funkció kiesése Mikroszatellita instabilitás - MSI

Érzékeny szövetelőkészítésre Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest MMR - IHC MLH1 - PMS2 - Endogén kontroll! MUTÁLT MUTÁLT MLH1? MSH2 + MSH6 + VAD VAD

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Colorectális carcinoma CIN - kromoszóma instabilitás HNPCC Sporadikus CIN ~83% Öröklött MSI Ly nch CRC HNPCC ~3% Sporadikus MSI 12% MSI - mikroszatellita instabilitás CIN FAP <1% CIN MUTYH <1% 2/3 jobboldalon mucinosus necrosis alacsonyan differenciált lymphoid infiltráció Lynch szindróma CRC: Öröklődő nem-polipózis típusú colorectális carcinoma (HNPCC)

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Colorectális carcinoma - MSI típus Sporadikus MSI CRC MLH1 promóter hipermetiláció MLH1 fehérje hiánya, ill. funkció kiesése (+BRAF V600E mutáció) Idősebb korban, női predominancia Szűrés Genetikai gondozás - Követés Lynch szinrómához társuló HNPCC: MMR gének (MLH1, MSH2, MSH6, ill. PMS2) csírasejtes mutációja -konstitutív (minden utódsejtben) Autoszómális domináns öröklődés (utódok 50% érintett) Fokozott hajlam (~70%): synchron, metachron CRC; endometrium carcinoma (egyéb cc.) Korábbi életkorban, mint az MSS CRC, felgyorsult carcinogenzis (2 év adenomatosus polyp - carcinoma) Rosszul reagál cytotoxikus szerekre (5-FU) Kedvezőbb prognózis, mint a MSS daganatok (stádium-független)

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Lynch-szindróma diagnózisa Családtörténet Daganat tesztje (MMR-IHC, MSI) Genetikai teszt (MMR gének) MIKOR? AJÁNLÁS: Amszerdam I-II, módosított Bethesda Családi halmozódás: CRC és más Lynch-carcinomák (synchron, metachron) Fiatalabb életkor (<50 év CRC, <60 év HNPCC jelleg) Két, első- másodági rokon MSI carcinomája kortól függetlenül Előszűrés: IHC, vagy MSI

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Lynch szinróma Genetikai szűrés MSI teszt - PCR 5-féle mikroszatellita (Bat 25, Bat 26, D2S123, D5S346, D17S250) Legalább 3-féle+: MSI-High Kontroll paraffinos normál szövet v. vér Normális - MSS Bat 25 CRC - MSI IMMUNHISZTOKÉMIA (IHC) MLH1, ill. MSH2 mutáció felelős az MSI 90%-ért, ilyen 2-es panel mutáció szűrő érzékenysége ~85% MLH1 MSH6 és PMS2-vel a 4-es panel érzékenysége ~94% Shia és mtsai. J Mol Diagn 2008;10:293 300. Az MSH6 és PMS2 2-es panel érzékenysége a 4-eshez hasonló >90%; mert az MMR partner is destabilizálódik Mojtahed és mtsai. Modern Pathology 2011; 24: 1004-1014.

Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest MMR genetikai teszt algoritmus CRC - HNPCC gyanú Amsterdam/Bethesda IMMUNHISZTOKÉMIA MSI analízis Csírasejtes mutáció MMR fehérje kimutatás MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 MLH1 - + + - MSH2 MSH6 PMS2 + + + - + + - - + + + - IHC + MSS Nincs MMR mutáció analízis MSH2 - IHC - MSI-H/L MMR mutáció analízis HNPCC / Lynch szindróma MMR mutáció negatív Sporadikus MSI CRC (BRAF mutáció)