A TRICHODERMA REESEI GOMBA CELLULÁZ Z ENZIM TERMELÉSÉNEK BIOKÉMI MIÁJA ÉS S GENETIKÁJA KARAFFA LEVENTE Debreceni Egyetem Természettudom szettudományi és s Technológiai Kar Genetikai és s Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszék 2009
Trichoderma reesei (teleomorf: Hypocrea jecorina)
A CELLULÁZ Z ENZIMEK cellobiohidroláz z I (Cel7A( fehérje, cbh1 gén), cellobiohidroláz z II (Cel6A( fehérje, cbh2 gén) Papíripar; második m generáci ciós bioalkoholgyárt rtás; heterológ g fehérjetermel rjetermelés Legfontosabb ipari termelőjük k a Trichoderma reesei fonalas gomba Ipari körülmk lmények között k a celluláz z enzimeket laktóz szénforr nforráson állítják k elő.
A T. REESEI LAKTÓZ Z ANYAGCSERÉJE A Trichoderma reesei a laktózt extracellulárisan risan hidrolizálja. lja. Laktóz β-galaktozidáz Glükóz Galaktóz SEJTMEMBRÁN glükóz permeáz galaktóz permeáz CITOSZOL Glükóz Galaktóz
D-Galaktóz Galaktitol Galaktokináz ATP Aldóz NADPH reduktáz NADP + ADP Leloir D-galaktóz- 1-foszfát UDP Glükóz Gal-1-P-uridilil transzferáz Foszfoglükomutáz UDP- Galaktóz-4- epimeráz UDP Galaktóz D-glükóz- 1-foszfát L-Arabinitol dehidrogenáz L-Xilo-3-hexulóz?? L-Szorbóz Szorbóz reduktáz L-Szorbitol Reduktív NAD + NADH NADPH NADP + NAD + Xilitol dehidrogenáz A Trichoderma reesei NADH D-galaktóz anyagcseréjének áttekintése D-Fruktóz ATP ADP Hexokináz D-Fruktóz- 6-foszfát D-glükóz- 6-foszfát GLIKOLíZIS
A BÉTAB TA-GALAKTOZIDÁZ Z ENZIM D-galaktozidok (pl. laktóz) terminális, nem-reduk redukáló β-d-galaktóz monomerjeit hidrolizálja lja (EC 3.2.1.23). Négy különbk nböző Glikozid Hidroláz z családnak (GH1,( GH2, GH35, GH42) ) is vannak béta-galaktozidáz tagjai strukturális, funkcionális diverzitás. Biotechnológiai jelentőség g (tejipar [laktóz z hidrolízis], transzgalaktoziláci ciós s reakciók) k)
BÉTA-GALAKTOZIDÁZ Z A T. REESEI-BEN Két t db független bétab ta-galaktozidáz z gén g n (bga1,( bga2) Az összes bétab ta-galaktozidáz z aktivitás 90 %-ért% a bga1 terméke (BGA1( BGA1; ; GH 35 család) a felelős. Bga1 kifejeződése: batch fermentáci ció során L- arabinózon és L-arabinitolon on a legerősebb, de laktózon, D-galaktózon, D-xilózon és s polioljaikon is.
MUNKAHIPOTÉZIS A D-galaktD galaktóz z két k útvonalon (Leloir,( reduktív) ) is metabolizálódhat. Melyik út t generálja a bga1 de facto inducerét? A D-galaktD galaktóz z poliolja, a galaktitol (dulcitol) képes indukálni a bga1 gén n kifejeződését. A reduktív útvonal működése m meghatároz rozó a bga1 gén n indukciója szempontjából
KíSÉRLETI STRATÉGIA 1) Olyan T. reesei hiánymut nymutáns ns törzs t fenotípus pus- analízise, melyben a D-galaktD galaktóz z hasznosítás Leloir útvonalánaknak első lépése hiányzik.
D-Galaktóz Galaktitol Galaktokináz ATP Aldóz NADPH reduktáz NADP + ADP D-galaktóz- 1-foszfát UDP Glükóz Gal-1-P-uridilil transzferáz Foszfoglükomutáz UDP- Galaktóz-4- epimeráz UDP Galaktóz D-glükóz- 1-foszfát L-Arabinitol dehidrogenáz L-Xilo-3-hexulóz L-Szorbóz Szorbóz reduktáz?? L-Szorbitol NAD + NADH NADPH NADP + NAD + Xilitol dehidrogenáz A Trichoderma reesei NADH D-galaktóz anyagcseréjének áttekintése D-Fruktóz ATP ADP Hexokináz D-Fruktóz- 6-foszfát D-glükóz- 6-foszfát GLIKOLíZIS
KíSÉRLETI STRATÉGIA 1) Olyan T. reesei hiánymut nymutáns ns törzs t fenotípus pus- analízise, melyben a D-galaktD galaktóz z hasznosítás Leloir útvonalánaknak első lépése hiányzik. 2) Olyan T. reesei hiánymut nymutáns ns törzs t fenotípus pus- analízise, melyben a D-galaktD galaktóz z hasznosítás reduktív útvonalánaknak első lépése hiányzik.
D-Galaktóz Galaktitol Galaktokináz ATP Aldóz NADPH reduktáz NADP + ADP D-galaktóz- 1-foszfát UDP Glükóz Gal-1-P-uridilil transzferáz Foszfoglükomutáz UDP- Galaktóz-4- epimeráz UDP Galaktóz D-glükóz- 1-foszfát L-Arabinitol dehidrogenáz L-Xilo-3-hexulóz L-Szorbóz Szorbóz reduktáz?? L-Szorbitol NAD + NADH NADPH NADP + NAD + Xilitol dehidrogenáz A Trichoderma reesei NADH D-galaktóz anyagcseréjének áttekintése D-Fruktóz ATP ADP Hexokináz D-Fruktóz- 6-foszfát D-glükóz- 6-foszfát GLIKOLíZIS
MELYIK ÚT T GENERÁLJA AZ INDUCERT? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml -1 ] a bga1 kifejeződés riportere!!! T. reesei törzsek D-galaktóz Galaktitol D-glükóz Vad típus (QM 9414) Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns) 4,12 2,97 < 0,01
MELYIK ÚT T GENERÁLJA AZ INDUCERT? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml -1 ] a bga1 kifejeződés riportere!!! T. reesei törzsek D-galaktóz Galaktitol D-glükóz Vad típus (QM 9414) Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns) 4,12 2,97 < 0,01 0,06 3,19 < 0,01
MELYIK ÚT T GENERÁLJA AZ INDUCERT? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml -1 ] a bga1 kifejeződés riportere!!! T. reesei törzsek D-galaktóz Galaktitol D-glükóz Vad típus (QM 9414) Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns) Δgal1 (galaktokináz mutáns) 4,12 2,97 < 0,01 0,06 3,19 < 0,01
MELYIK ÚT T GENERÁLJA AZ INDUCERT? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml -1 ] a bga1 kifejeződés riportere!!! T. reesei törzsek D-galaktóz Galaktitol D-glükóz Vad típus (QM 9414) Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns) Δgal1 (galaktokináz mutáns) 4,12 2,97 < 0,01 0,06 3,19 < 0,01 3,15 4,23 < 0,01
MELYIK KÖZTES K AZ INDUCER? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml -1 ] a bga1 kifejeződés riportere!!! T. reesei törzsek D-galaktóz Galaktitol D-glükóz Vad típus (QM 9414) Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns) Δgal1 (galaktokináz mutáns) Δlad1 (L-arabinitol dehidrogenáz mutáns) 4,12 2,97 < 0,01 0,06 3,19 < 0,01 3,15 4,23 < 0,01
D-Galaktóz Galaktitol Galaktokináz ATP Aldóz NADPH reduktáz NADP + ADP D-galaktóz- 1-foszfát UDP Glükóz Gal-1-P-uridilil transzferáz Foszfoglükomutáz UDP- Galaktóz-4- epimeráz UDP Galaktóz D-glükóz- 1-foszfát L-Arabinitol dehidrogenáz L-Xilo-3-hexulóz L-Szorbóz Szorbóz reduktáz?? L-Szorbitol NAD + NADH NADPH NADP + NAD + Xilitol dehidrogenáz A Trichoderma reesei NADH D-galaktóz anyagcseréjének áttekintése D-Fruktóz ATP ADP Hexokináz D-Fruktóz- 6-foszfát D-glükóz- 6-foszfát GLIKOLíZIS
MELYIK KÖZTES K AZ INDUCER? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml -1 ] a bga1 kifejeződés riportere!!! T. reesei törzsek D-galaktóz Galaktitol D-glükóz Vad típus (QM 9414) Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns) Δgal1 (galaktokináz mutáns) Δlad1 (L-arabinitol dehidrogenáz mutáns) 4,12 2,97 < 0,01 0,06 3,19 < 0,01 3,15 4,23 < 0,01 3,56 6,88 < 0,01
TANULSÁGOK A Leloir-útvonal nélkülözhető a T. reesei béta-galaktozidáz z enzimet kódolk doló bga1 génjének nek indukciójában. A reduktív útvonal nélkülözhetetlen a bga1 gén indukciójában. A bga1 gén de facto inducere a reduktív út első köztese, a galaktitol.
A CELLULÁZOK INDUKCIÓJA LAKTÓZZAL A Trichoderma reesei a laktózt extracellulárisan risan hidrolizálja, lja, viszont: Sem a D-glD glükóz, sem a D-galaktD galaktóz, sem a kettő együtt nem képes k indukálni a cellulázokat (cellobiohidrol( cellobiohidroláz z I [CBH I] és s cellobiohidroláz z II [CBH II]) A T. reesei maximális specifikus növekedési rátája (1/h) minimál táptalajon D-glükóz D-galaktóz laktóz 0,110 0,088 0,042
Lehet, hogy lassú D-galaktóz z lebontásra van szüks kség? Kemosztát típusú folytonos tenyészetek elemzése D-galaktóz, D-glükóz, laktóz és glükóz z + galaktóz szénforr nforrások használat latával. A CBH I illetve CBH II fehérj rjék extracelluláris ris felhalmozódásának mérése. m
CELLULÁZ Z KÉPZK PZŐDÉS
A T. REESEI LAKTÓZ Z ANYAGCSERÉJE A Trichoderma reesei a laktózt extracellulárisan risan hidrolizálja. lja. Laktóz β-galaktozidáz Glükóz Galaktóz SEJTMEMBRÁN glükóz permeáz galaktóz permeáz CITOSZOL Glükóz Galaktóz
MIÉRT JOBB INDUCER A LAKTÓZ Z MÉG M KIS NÖVEKEDN VEKEDÉSI RÁTA R ESETÉN N IS? Mi a különbsk nbség g a laktózb zból l felszabaduló galaktóz és a D-galaktD galaktóz z szénforr nforrás s között? k tt? Laktóz: 1,4-O-β-D-galaktopiranozil galaktopiranozil-d-glükóz
AZ ANOMÉRIA JELENTŐSÉGE α-d-galaktóz β-d-galaktóz Az α és β formák aránya vízben 1 : 2 (cca. 6 óra)
α / β-d-galaktóz Galaktóz z permeáz β-d-galaktóz R E D U K T í V galaktitol mutarotáz aldóz z reduktáz D-fruktóz-6-P SEJTMEMBRÁN α-d-galaktóz galaktokináz D-galaktóz-1-P D-glükóz-6-P GLIKOLíZIS L E L O I R
MUTAROTÁZ Z AKTIVITÁS A β-d-galaktóz α-d-galaktóz átalakulást Saccharomyces cerevisiae élesztőben az UDP- galaktóz-4-epimer epimeráz enzim mutarotáz doménje katalizálja. lja. Trichoderma reesei-ben NINCS mutarotáz z domén! Az α-forma kialakulása a laktóz β-d-galaktopiranóz monomerjéból l enzimes katalízis nélkn lkül, l, spontán, n, ezért más m s fajokhoz képest k LASSAN megy végbe. v gbe. A galaktokináznak CSAK az α-d-galaktóz, az aldóz reduktáznak mindkét t anomer a szubsztrátuma. tuma.
MUNKAHIPOTÉZIS A β-d-galaktóz α-d-galaktóz átalakulás lassúsága és s a galaktokináz z illetve az aldóz z reduktáz enzimek eltérő szubsztrátum tum-kötése miatt a D-D galaktóz z anyagcsere fluxusa T. reesei-ben a reduktív útvonal felé tolódik laktóz z szénforr nforráson. A reduktív útvonal fokozott működése m T. reesei-ben előny nyös a cellulázok indukciója szempontjából l (L-( szorbóz? z?).
D-Galaktóz Galaktitol Galaktokináz ATP Aldóz NADPH reduktáz NADP + ADP D-galaktóz- 1-foszfát UDP Glükóz Gal-1-P-uridilil transzferáz Foszfoglükomutáz UDP- Galaktóz-4- epimeráz UDP Galaktóz D-glükóz- 1-foszfát L-Arabinitol dehidrogenáz L-Xilo-3-hexulóz L-Szorbóz Szorbóz reduktáz?? L-Szorbitol NAD + NADH NADPH NADP + NAD + Xilitol dehidrogenáz A Trichoderma reesei NADH D-galaktóz anyagcseréjének áttekintése D-Fruktóz ATP ADP Hexokináz D-Fruktóz- 6-foszfát D-glükóz- 6-foszfát GLIKOLíZIS
KíSÉRLETI STRATÉGIA Ha a reduktív út t relatív v erősödése se előny nyös, akkor a Leloir-útvonal relatív v erősödése se hátrh trányos a cellulázok indukciója szempontjából. Hozzunk létre l egy T. reesei gain-of-function mutarotáz z mutánst (melyben a galaktokináz kizárólagos szubsztrátum tumának számító α-d- galaktóz z intracelluláris ris keletkezése felgyorsul) és teszteljük k a fenotípust. Ha a mutánsban a celluláz z génexpresszig nexpresszió visszaesik a re-transzform transzformált törzsht rzshöz z képest, k a munka- hipotézis bizonyítást nyer.
A MEGVALÓSíTÁS S LÉPÉSEIL A S. cerevisiae élesztő UDP-gl glükóz-4-epimeráz génjének nek mutarotáz z domént kódolk doló szakaszát izoláljuk ljuk és s plazmidba (prlm EX 30) klónozzuk nozzuk. Egy konstitutív, erős T. reesei promóter (piruvát kináz, pki1) ) irány nyítása alá helyezzük. T. reesei-be transzformáljuk (pyr4( uridin auxotrófia). Fenotípus pus-vizsgálat: cbh1 és cbh2 gének Northern analízise, laktóz z hasznosítás, s, növekedn vekedés
MUTAROTÁZ Z EXPRESSZIÓS S KAZETTA A S. cerevisiae élesztő Gal10 fehérje C-terminC terminális része (GAL10( 1068 2100 ) felelős s a D-galaktopiranóz mutarotáz z aktivitásért
AZ ÉLESZTŐ GAL10 1068 1068 2100 2100 KIFEJEZŐDÉSE M1: egy kópiás törzs M2a és M2b: két kópiás törzsek
INTRACELLULARIS MUTAROTÁZ Z AKTIVITÁS Specifikus aktivitás U (mg protein)-1 4 3 2 1 0 S. cerevisiae H. jecorina QM H. jecorina M1 H. jecorina M2a H. jecorina M2b M1: egy kópiás törzs M2a és M2b: két kópiás törzsek QM: referencia törzs Sem extracelluláris, sem sejtfalhoz kötött mutarotáz aktivitást nem találtunk!
SZÉNFORR NFORRÁS S FELVÉTEL Laktóz koncentráció (g/l) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 QM 9414 Mut_cn I. Mut_cn IIa Mut_cn IIb 0 20 40 60 80 Fermentációs idő (h) Glükóz koncentráció (g/l) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 QM 9414 Mut_cn I. Mut_cn IIa Mut_cn IIb 0 20 40 60 80 Fermentációs idő (h) D-fruktóz, glicerin és D-xilóz szénforrásokon sem volt eltérés a felvétel időprofiljában
NÖVEKEDÉS S LAKTÓZON Biomassza (DCW; g/l) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 QM 9414 Mut_cn I Mut_cn IIa Mut_cn IIb 0 20 40 60 80 100 Minden más szénforráson (glükóz,galaktóz, fruktóz, glicerol. L-arabinóz, xilóz) a T. reesei mutánsok és a retranszformált törzs növekedése azonos volt Fermentációs idő (h)
CELLULÁZOK EXPRESSZIÓJA RNS lak lak lak
CELLULÁZOK EXPRESSZIÓJA RNS A celluláz génkifejeződés gyengülése a mutarotáz jelenlétében specifikus a laktózra!!! lak lak lak
TANULSÁGOK A S. cerevisiae UDP-gl glükóz-4-epimeráz gén mutarotáz egységének jelenléte megváltoztatja a T. reesei laktóz fenotípus pusát. A laktóz z hasznosítás s (és( s a rajta törtt rténő növekedés) gyorsabbá válik. A cbh1 és cbh2 gének kifejeződése visszaesik. A D-galaktóz mutarotáci ciója fontos szerepet játszik a T. reesei celluláz génjeinek kifejeződésében és s (vélhet lhetően) en) a celluláz enzimek termelődésében is.
ÖSSZEFOGLALÁS A laktóz z lassan hasznosuló szénforr nforrás (derepresszió!), de a T. reesei cellulázai esetében indukciós szerepe is van. A laktóz z hidrolízise során n felszabaduló D- galaktóz reduktív útvonala kulcsfontosságú: a laktózt hasító béta-galaktozidázt kódoló bga1 gén n induktorát t ez az útvonal generálja; a celluláz gének indukciójában is döntd ntő szerepe van, mivel a mutarotáz enzim hiánya miatt a szénv nváz z fluxusa a reduktív útvonalra terelődik (L-szorbóz?).
HIVATKOZÁSOK Fekete és mtsai (2004): Archives of Microbiology 18: 35-44. Ilyés és mtsai (2004): FEMS Microbiology Letters 235: 147-151. 151. Karaffa és mtsai (2006): Microbiology-SGM 152: 1507-1514. Fekete és mtsai (2007): Microbiology-SGM 153: 507-512. 512. Fekete és mtsai (2008): Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. (PNAS) 105: 7141-7146. 7146.
KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS Fekete Erzsébet Christian P. Kubicek (TU Wien) Szentirmai Attila OTKA F042602, OTKA D048617 és s TÉT T T 25/2005 támogatt mogatásával
Debreceni Egyetem