Új kutatási eredmények madár orthoreovírusokról Magyarországi és Kelet-Európai izolátumokvirológiai és molekuláris genetikai jellemzése Farkas L. Szilvia, Gál Bence, Tóth-Ihász Katalin, Varga-Kugler Renáta, Lengyel György, Kemenesi Gábor, Bányai Krisztián MTA ATK ÁOTI Derzsy-napok, Bükfürdő, 2017. június 2.
Kutatásunk célja Saját és nemzetközi kutatási eredmények alapján: A klinikai esetekből izolált reovírusokegyre nagyobb genetikai változékonyságot mutatnak Újonnan izolált reovírusok ellen egyre nehezebb védekezni Kutatásunk célja: Minél nagyobb számú izolátum gyűjtése, genetikai diverzitásának meghatározása (szekvenálás), a vírustörzsek patogenitásának megismerése (állatkísérlet) és szerotípusának meghatározása. Válaszokat keresünk: Genetikai evolúciós folyamatokra Patogenitásra Szerológiai tulajdonságokra
A madár orthoreovírusok: 1940-es években írták le először, azóta világszerte elterjedt, nagyüzemi, intenzív tartási körülmények között Elsősorban brojlerekben. Bár a törzsek 80%-a apatogén, 20%-uk jelentős gazdasági veszteségeket okoz (megnövekedett elhullás, megbetegedés, kezelési költségek emelkedése, csökkent takarmányhasznosítás és értékesíthetőség) A fertőzés kimenetele a törzs virulenciájától, a fertőzés módjától (légutak, bőr, per os), a fertőzött madár ellenállóképességétől, korától, és egyéb kórokozók jelenlététől, immunszuppresszív hatásától függ
4-16 hetes csirkében virálisarthritis/ tenosnovitis: tibiotarsalis-tarsometatarsalis ízületek gyulladása és a gastrocnemius szakadása, sántaság, duzzadt ízületek, M. synoviaevagy a staphylococcusok súlyosbítják a tüneteket 2-3 hetes csirkékben satnyaság- és törpenövés tünetegyüttese (runting-stunting tünetegyüttese): levertség vagy nyugtalanság, hasmenés, bélgyulladás (bélhámsejtek károsodása, bélbohyhokrövidülése, enzimek termelődése csökken, emésztési és következményes felszívódási zavarok), növekedés lelassulása, szétnövés, csontfejlődési (combcsontfej elhalása) és tollasodási zavar ( helikopter betegség ), sápadtság ( pale bird syndrome ),mozgászavarok, légzőszervi tünetek, idegrendszeri tünetek, immunszuppresszió: limfoidképletek sorvadása, másodlagos fertőzések, bélflóra eltolódása, coliform baktériumok elszaporodása Mándoki M., Gál J.: Brojlercsirkék satnyaság és törpenövés kórképével kapcsolatos újabb hazai adatok. MÁL 2014/7
A madár orthoreovírusok: Reoviridae család Emlős orthoreovírus Madár orthoreovírus Pávián orthoreovírus Nelson Bay orthoreovírus Hüllő orthoreovírus nemzetség Újonnan kimutatott madár eredetű törzsek: Varjú orthoreovírus Bülbül orthoreovírus Steller-oroszlánfóka reovírus és Papagáj reovírus törzs Ge01
A madár orthoreovírusokgenetikája Duplaszálú, szegmentált RNS genom Evolúciós mechanizmusok: Pont mutációk: RNS függő RNS polimeráz Reasszortáció: szegmentált genom Rekombináció Inzerciók, deléciók A genom jellegéből adódik, hogy meglehetősen könnyen alakulnak ki újabb vírusvariánsok
S1 tricisztronosgenom szegmens felépítése: FAST PROTEIN FIBER Óriássejt-képződéssel járó sejtkárosító hatás Készítette: Pop Renáta és Ihász Katalin
A Sigma C (σc) fehérje (fiber) felelős a vírus sejthez való kapcsolódásért, ezért az immunválasz kiváltásában (típus specifikus ellenanyagok) és ezen keresztül a vírus elleni védekezésben kulcsszerepe van. A SigmaC fehérje nagymértékű változékonysága megnehezíti a vírus elleni védekezést (vakcina) SciRep. 2016; 6: 36960. Published online 2016 Nov10. doi: 10.1038/srep36960 PMCID: PMC5103266 Lineage diversification, homo- and heterologous reassortment and recombination shape the evolution of chicken orthoreoviruses Szilvia L. Farkas, Szilvia Marton, Eszter Dandár, Renáta Kugler, Bence Gál, Ferenc Jakab, Ádám Bálint, Sándor Kecskeméti, and Krisztián Bányai
Védekezés: Szülőpár állományok vakcinázása Élő és inaktivált vakcinák: S1133, 2408, 1733 törzsek Cél: i) a vertikális transzmisszió megakadályozása, ii) tojók megfelelő vakcinázása maternális ellenanyagokkal látja el az utódokat (brojler) 3 5 hetes korukig (szikimmunitás) iii) a betegség kialakulásának megelőzése a vakcinázott szülőknél és az utódokban Az utóbbi évtizedben, 2012-től pedig ugrásszerűen megnőtt az ízületgyulladásos esetek száma a vakcinázott állományokban új variánsoknak bizonyultak Inaktivált telepspecifikus autogén vakcinák
Mintagyűjtés 2016-ban Magyarország Románia, Oroszország, Ukrajna Csirke, pulyka, kacsa Elsősorban bél(+vakbél nyirokcsomó), illetve ín (+synovia, ízület-csánk) Saját Közreműködő állatorvos kolléga Egészséges és beteg állományból is! Nem diagnosztikai céllal, ezért nem vizsgáltunk más betegségre/kórokozóra
A minták feldolgozása: Vírusizolálás BHK vagy LMH sejtvonalon: ÓRIÁSSEJTEK=> CPE+ / CPE- RT-PCR a σc génre tervezett specifikus primerek segítségével (fiber; vírusneutralizáció) Szekvenálás Új generációs szekvenálás: teljes genom meghatározása Szekvencia-elemzés, filogenetikai számítások
Több fajból, több szervből, szinte minden életkorban vettünk mintát! Darab / mintaszám 1 2 4 5 6 11 20 24 25 27 31 35 38 47 53 55 árutojó bél 6 broiler bél 39 25 65 32 38 ín 1 2 2 légcső 2 máj 1 mirigyes 5 hús szülőpár bél 11 6 18 2 10 5 10 10 5 4 ín 11 10 10 5 6 sziktömlő 5 kacsa bél 5 2 1 3 ín 2 3 3 1 lép 1 1 1 pulyka bél 7 ín 10
Magyarországi minták 11 megyéből Darab / mintaszám árutojó broiler hús szülőpár kacsa pulyka Végösszeg Bács-Kiskun 20 5 25 Baranya 43 10 53 Békés 6 18 15 39 Borsod-Abaúj-Zemplén 30 10 40 Csongrád 9 9 Győr-Moson-Sopron 30 30 Hajdú-Bihar 32 8 40 Szabolcs-Szatmár-Bereg 88 2 90 Vas 7 7 Veszprém 50 10 60 Külföld 46 7 53
Minták megoszlása Legtöbb bél és ín minta Brojler és Hús-szülőpár brojler
Eredmények -Vírusizolálás Bélminták 39%-ából izoláltunk élő reovírust 7 db ín minta lett pozitív, ezek pulyka eredetű minták CPE negatív: légcső, máj, vese, sziktömlő
Eredmények -Vírusizolálás Élő reovírust izoláltunk (CPE+): Specifikus tüneteket nem mutató állományok esetében 24% Runting-stunting tünetegyüttest mutató (helikopter tollazat, szórtság/szétnövés, hasmenés, satnyaság-törpenövés) állományok esetében 65% Szórt állományok esetében 62 % Runting-stunting és szórtság esetén nagy valószínűséggel izolálni tudunk élő reovírust Sántaság esetén a bélminták egy részéből sikerült izolálni reovírust. Ínból csak pulyka esetében.
Eredmények Tünetek Brojler csirkében a tünetek jellemzően 4 hetes korban jelennek meg Szülőpár állományban a sántaság átlagosan 18 hetes kor (0-35 hét) környékén jelenik meg. Szülőpárállományban a Runtng-stuntingtünetegyüttes5 hetes korban jelentkezik Egy ín mintából két különböző reovírust sikerült izolálni: ko-infekció Átlag / állat kora (hét) egészséges elhullás hasmenés runting-stunting tünetegyüttes sántaság szórtság broiler 4 4 1 4 3 4 hús szülőpár 13 5 18
Csánkízület savós-vérzéses-fibrines gyulladása HUN-117M HUN-129 HUN-131
NC/98-USA-PULYKA OS-161-JPN 0.2
S1133VAKCINA S1133VAKCINA HUN168 HUN168 HUN276 HUN276 HUN279 HUN279 HUN280 HUN280 HUN281 HUN281 HUN284 HUN284 HUN283 HUN283 HUN282 HUN282 HUN287 HUN287 HUN122 HUN122 HUN121 HUN121 HUN114 HUN114 HUN112 HUN112 HUN109 HUN109 HUN117 HUN117 HUN107 HUN107 HUN113 HUN113 HUN292 HUN292 HUN295 HUN295 HUN298 HUN298 HUN294 HUN294 HUN297 HUN297 HUN133 HUN133 HUN274 HUN274 HUN209 HUN209 HUN290 HUN290 HUN312 HUN312_ HUN117M HUN117M HUN129 HUN129 HUN131 HUN131 HUN218 HUN218 HUN142 HUN142 HUN143 HUN143 HUN144 HUN144 HUN130 HUN130 HUN266_ HUN266_ HUN296 HUN296 HUN317 HUN317 HUN344_ HUN344_ HUN340_ HUN340_ HUN338_ HUN338_ HUN335 HUN335 HUN334 HUN334 HUN330 HUN330 HUN35 HUN35 HUN90 HUN90 HUN95 HUN95 Pairwise identity (%) 100 96 91 87 83 79 74 70 66 61 57 PAIRWISE DISTANCE S1133 Nukleotid szinten: HUN-117M HUN-129 74-76% HUN-131 További törzsekkel: 50-57% SDT V1.2
SDT V1.2 PAIRWISE DISTANCE S1133 Aminosav szinten: HUN-117M HUN-129 75-79% HUN-131 További törzsekkel: 45-52% S1133VAKCINA S1133VAKCINA HUN168 HUN168 HUN276 HUN276 HUN279 HUN279 HUN280 HUN280 HUN281 HUN281 HUN284 HUN284 HUN283 HUN283 HUN282 HUN282 HUN287 HUN287 HUN122 HUN122 HUN121 HUN121 HUN114 HUN114 HUN112 HUN112 HUN109 HUN109 HUN117 HUN117 HUN107 HUN107 HUN113 HUN113 HUN292 HUN292 HUN295 HUN295 HUN298 HUN298 HUN294 HUN294 HUN297 HUN297 HUN133 HUN133 HUN274 HUN274 HUN209 HUN209 HUN290 HUN290 HUN312 HUN312 HUN117M HUN117M HUN129 HUN129 HUN131 HUN131 HUN218 HUN218 HUN142 HUN142 HUN143 HUN143 HUN144 HUN144 HUN130 HUN130 HUN266 HUN266 HUN296 HUN296 HUN317 HUN317 HUN344 HUN344 HUN340 HUN340 HUN338 HUN338 HUN335 HUN335 HUN334 HUN334 HUN330 HUN330 HUN35 HUN35 HUN90 HUN90 HUN95 HUN95 Pairwise identity (%) 100 94 89 83 78 72 67 61 56 50 45 SDT V1.2
Érdekes megfigyelés a gyakorlatból A korábbi képeken látott madarak egy 5 hetes szülőpár állományból származnak Sántaság, szórtság, satnyaság-törpenövés állomány szinten Ínból nem sikerült izolálni élő reovírust Bélből sikerült izolálni élő reovírusokat(hun-117m, HUN-129, HUN-131) Szekvencia adatok alapján ezek 74-76 %-ban hasonlítanak S1133 törzsre 6 hetes korban történő S1133 élő vakcinázás után megszűntek a tünetek
Eredmények -összefoglaló Összesen n=446 mintát gyűjtöttünk, vírusizolálás n=402 esetben történt, n=113 vírusizolátum, n=47 részleges szekvencia adat, n=3 teljes genom szekvencia A vírus kimutatható volt egészséges és beteg állományokból is Nincs földrajzi elkülönülés az izolátumok részleges szekvenciája alapján Runting-stuntingtünetegyüttes, szórtság esetén gyakran volt jelen a mintákban az élő reovírus Jellemzően 4-6 hetes korú brojler állatok bél mintáibólsikerült kimutatni a vírust 7 napos kor alatt nem sikerült Csak pulyka esetében tudtunk ízületi mintákból vírusokat kimutatni Az izolátumok mindössze ~50%-os hasonlóságot mutatottak a vakcina törzsekkel (σc gén részleges aminosav ill. nukleotid szekvencia alapján)
Köszönöm a figyelmet! Köszönet illeti minden állatorvos kollégát aki a mintagyűjtéshez segítséget nyújtott! Köszönet illeti dr. Horváth-Papp Imrét a külföldi mintákért! Támogatta: OTKA K108727, Bolyai János Kutatási Ösztöndíj, Lendület program