Pektin enzimes hidrolízise kapilláris membrán bioreaktorban Enzymatic hydrolysis of pectin in a hollow fiber membrane bioreactor Keszey Zs., Csanádi Zs., Bélafiné Bakó K. Pannon Egyetem, Műszaki Kémiai Kutató Intézet Veszprém, Egyetem u. 10. Summary In processing of fruits, vegetables to manufacture juices, pectin may make juice extraction difficult due to its water retaining ability. This problem can be solved by enzymatic degradation of pectin. Moreover galacturonic acid obtained as a product may be applied in the food and cosmetic industry. Polygalacturonase enzyme from Aspergillus niger was used in the experiments. During the kinetical studies of the reaction, strong product inhibition was found. Therefore it should be removed continuously during the reaction. In this work hollow fiber membrane bioreactor was applied to carry out the bioconversion and separation step simultaneously. In this way pectin hydrolysis was realised in higher productivity. Bevezetés A pektin régóta ismert makromolekula, elsősorban gélesítő hatása miatt. A pektin növények sejtfalában megtalálható vegyület, olyan heterogén poliszacharid, melynek egyik fő alkotóeleme a galakturonsav [1]. A pektin régebben víz-visszatartó hatása révén elsősorban, mint megoldandó probléma jelentkezett a gyümölcs- és zöldséglevek gyártásában, hiszen jelentősen megnehezítette a lé kinyerését, megnövelve ezzel az egységnyi termék előállításához szükséges alapanyag- és a feldolgozáskor keletkező melléktermék mennyiségét [2]. Az 1930-as években felfedezték, hogy bizonyos enzimek (pektinázok) felhasználásával a pektin szerkezete megbontható, ezáltal víz-visszatartó hatása megszüntethető, a gyümölcslé kinyerésének hatásfoka pedig maximalizálható [3]. Az előbbi bekezdésben kiemelt negatív tulajdonsága mellett azonban a pektin számos kedvező tulajdonsággal is rendelkezik. Mivel könnyen gélt képez és kedvező élettani hatásokkal is rendelkezik, a pektint, valamint az azt felépítő galakturonsavat az élelmiszeripar mellett a gyógyszer- és a kozmetikai ipar is előszeretettel használja egyes termékei adalék- és alapanyagaként [4]. A munkám során megoldandó probléma az volt, hogy a pektin enzimes hidrolízisével történő galakturonsav előállítása során jelentős termékinhibíció lép fel. Ezt próbáltuk elkerülni a galakturonsav folyamatos elvételével, melyet egy membrán bioreaktorban valósítottunk meg. A membránokat elsősorban szeparációs célokra: koncentrálásra, tisztításra, frakcionálásra szokták használni. A kíméletes membránszeparáció műveletek [5-7] és a bioreaktorok kombinálásából születtek a membrán bioreaktorok [8]. A membrán modulnak kapilláris membránt választottunk azért, mert így sokkal nagyobb felület érhető el a többi típusú membránhoz képest és jobb membrán kitöltési sűrűséggel rendelkezik. A kísérletek során vizsgáltuk, hogy melyek azok az optimális paraméterek, ahol nagy mennyiségű permeátumot sikerül elvennünk, hogy ez által csökkentsük a membránban kialakuló eltömődést (fouling), és közel maximális legyen a galakturonsav kinyerés hatásfoka. Anyagok és módszerek A pektin enzimes hidrolízise során felhasznált enzim a poligalakturonáz enzim Aspergillus nigerből (Fluka). Standard aktivitása 1,7 U/mg, ahol az aktivitás 1 egysége megfelel annak a mennyiségnek, ami percenként 1 µmol galakturonsavat szabadít fel poligalakturonsavból ph=4,1 és 50 C-on. A reakciót membrán bioreaktorban végeztem el. Enzimet tartalmazó híg szubsztrát oldatot
keringettem egy mágnes kevertetésű termosztált reaktorból a membrán modulon át. A berendezés vázlatát az 1. ábra mutatja. A kapilláris típusú ultraszűrő membrán anyaga 30.000 Da cut-off értékű poliakrilnitril volt. A membrán pórusméretéhez képest nagyméretű enzimet visszatartotta, viszont az alacsony molekulatömegű anyagok, mint a galakturonsav, könnyen átjuthattak rajta. 1. ábra. A szakaszos üzemmódú MBR berendezés vázlata A membrán bioreaktoros kísérleteknél a reakciókörülmények a következők voltak: 45 C, 4,1-es ph (citrát puffer oldat segítségével). A 45 Cos hőmérséklet az a felső hőmérsékleti intervallum, ami felett a membrán már nem működik biztonsággal. A membrán felülete 0,21 m 2 volt. Az enzimes hidrolízis nyomon követése a Shoorl által kidolgozott redukáló cukor meghatározással történt [9]. Eredmények A pektin enzimes hidrolízise vizes közegű, egy szubsztrátos reakciónak tekinthető. A víz végtelen feleslegben van jelen. A méréseknél alkalmazott enzim tisztított endo-poligalakturonáz volt. Ez az enzimtípus a pektinlánc bármely szakaszán képes kötéseket hasítani, így előfordulhat, hogy a keletkezett termék nem galakturonsav, hanem oligo-galakturonát lesz. A reakciók nyomonkövetése redukáló cukor tartalom méréssel történt, ami pontosan mutatja a pektin molekula fokozatos lebontását. Rázatott lombikos és kevert reaktoros vizsgálatokat végeztünk a korábbi enzimkinetikai mérések ellenőrzése céljából. A rázatott lombikos kísérleteknél T=50 C-on, ph=4,1 150 rpm 2 g/l-es és 30 dm 3 citrus pektin oldatot alkalmaztunk a kísérletek elvégzéséhez. Poligalakturonáz enzimmel végeztük el a kísérletet, ahol az enzimmennyisége 0,1 g/l volt. A kevert reaktoros kísérletek, amelyet a MBRhoz beépíteni tervezett reaktorban végeztünk, a 3 hőmérséklet 45 C, ph=4,1, 2 g/l és 500 dm -es pektin oldatot használtunk és ebben vizsgáltuk az enzimes hidrolízist. Az enzim mennyisége azonos volt a rázatott lombikos reakcióval (0,1 g/l). Az eredményeket a 2. ábra mutatja. Redukáló cukor koncentrációja (g/l) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 250 Eltelt idő(min) kevert reaktor rázatott lombik 2. ábra. A redukáló cukor koncentrációja a permeátumban az idő függvényében kevert reaktorban (500 cm 3 ) és rázatott lombikban (30 cm 3 ) (2 g/l pektin-oldat, 4,1 ph, 45 C) A 2. ábrán látható, hogy a két reakció lefutása hasonló, a kevert reaktoros méréseknél némileg gyengébb konverziót kaptunk, amely annak tudható be, hogy alacsonyabb hőmérsékletet alkalmaztunk a membrán gyengébb hőtűrése miatt. A pektint bontó enzimeket évtizedek óta sikeresen alkalmazzák az iparban. A cukorrépa pektin lebontását komplex enzimkészítménnyel már vizsgálták kutatók [2], és arra az eredményre jutottak, hogy termékinhibíció lép fel a reakció során. A termékinhibíció kimérést Kiss K. végezte el korábban [5] és meghatározta többek között a citrus pektinre vonatkozó kinetikai állandókat.
A citrus pektin hidrolízisénél kapott poligalakturonáz enzimmel történő a reakció Michealis-Menten állandója 8,3 g/l, a v max =1,06 g/l*min és az inhibícós állandója 3,13 g/l [10]. Korábban sikeresen alkalmaztak lapmembrán modult a termékinhibíció visszaszorítására, azonban az ipari megvalósítást célzó méretnöveléshez a síklap modul nem tűnt célravezetőnek. A nagyobb felület, se egyben a jobb membrán kitöltési sűrűség eléréséhez kapilláris membrán modult szándékoztunk beépíteni. Kimértem adott térfogatáramnál és TMP értékeknél a fluxust. Desztillált vizet és pektin oldatot (2 g/l) cirkuláltattam a kapilláris membránon keresztül, s mértem a keletkező permeátum mennyiségét illetve sebességét. Ebből a membrán felületének ismeretében számoltam ki a fluxus értékeket. A pektin hidrolízisét először egy olyan MBR rendszerben vizsgáltuk, ahol a bioreaktor térfogata 500 ml volt. A mérési körülmények: 2 g/l-es kiindulási szubsztrát-oldatot használtunk, enzim működése szempontjából ph=4,1 (citrát puffer) és 45 C-ot állítottunk be a reakciótérben. Az 0,1 g/l koncentrációjú poligalakturonázt (Aspergillus niger) szabad formában adtuk a rendszerhez. Kimértük, milyen hatása van a térfogatáramnak, a TMP-nek a galakturonsav képződésére. Nagyobb térfogatárammal és a transzmembrán nyomás növelése pozitív hatással van a galakturonsav képződésre. Ezért úgy döntöttünk, hogy v=9,7 dm 3 /h és TMP alkalmazásával p=0,0195 bar-ral dolgozunk. Az anyagmérleget is figyelembe véve azonban a termékhozam adatok nem bizonyultak kedvezőnek. Ennek oka, hogy termékképződés sebessége kisebbnek tűnt, mint a termékelvétel sebesség. Ezért gondoltunk arra a megoldásra, hogy az enzimes reakció elindítása és a keringtetés elindítása között legalább egy órát várunk. Így az egy óra alatt keletkezik annyi galakturonsav amit már érdemes elvenni. Ez a rázatott lombikos kísérletekből is látszik (3. ábra). 3. ábra. A desztillált víz (v=9,7 dm 3 /h) és pektin oldat (v=9,1 dm 3 /h) fluxus értékeinek változása a transzmembrán nyomás változás függvényében A desztillált víz esetében TMP növelésével arányosan nőtt a fluxus értéke. A kapott egyenes meredekségéből meghatároztam a hidraulikus 2 membrán permeábilitási értéket, ami 98 l/h*bar*m adódott. A pektin oldat esetében is egyenesen arányosan nőtt a fluxus értéke a nyomáskülönbség függvényében az adott meglehetősen szűk nyomástartományban. Az is látszik azonban, hogy a fluxus értékek kisebbek, mint a desztillált víz esetében. 4. ábra. Kapcsolat a TMP nagysága és a galakturonsav mennyisége között az idő függvényében
5. ábra. A késleltetés nélküli és az egy órás várakozással lejátszatott kísérlet (2 g/l pektin (citrus)-oldat, hőmérséklet 45 C, 4,1 ph; v=9,2 dm 3 /h) Jól látható, hogy drasztikus növekedést sikerült elérnünk a redukáló cukortartalom értékeknél ezzel a módszerrel. A végső koncentrációk és anyagmérleg alapján azonban még mindig nem tudtuk annyi galakturonsav terméket kivenni a rendszerből, ami jobb, mint a rázatott lombikos eredményünk. Mivel a kapilláris membrán modult fél üzemi rendszerre tervezték, ezért a méretnövelés mellett döntöttünk. Az 500 ml bioreaktor helyett áttértünk egy 10 literes termosztálható edényre. A méretnövelés során minden paraméterünk hasonló maradt, tehát a kiindulási reakcióelegyünk 2 g/l, t=45 C, ph=4,1, szubsztrát-enzim arány 20, keringetési sebesség 9,4 dm 3 /h, és a ráadott fojtás mértéke TMP=0,0195 bar, és 1 órát vártunk a cirkuláltatás beindítása és az enzimes reakció elindítása között. A kísérlet 8 órán keresztül zajlott és 6,27 liter permeátumot sikerült elvennünk. 6. ábra: MBR és a kevert reaktorban lévő reakció összehasonlítása (2g/l pektin oldat, t=45 C, ph=4,1; v=9,2 dm 3 /h) Jól látszik az ábrán, hogy a MBR alkalmazásával egyértelműen több galakturonsavat tudtunk kinyerni, s permeátumból, ez a rendszer hatékonyabban működtethető, mint a kevert bioreaktor. A 10 literes térfogatú MBR működtetése során nagyobb termékkihozatalt értünk el. Kevert reaktor esetén a termékkihozatal 54,5 % és MBR esetén pedig 68,2 % volt. A hosszabb reakció idő során itt már jelentős foulingot tapasztaltunk az idővel arányosan, amint azt a 7. ábra is mutatja. 7. ábra: A fluxus és az idő összefüggése állandó TMP=0,0195 bar mellett Megfigyelhető, hogy a fluxus fokozatosan csökkent az idő előrehaladtával, ennek kiküszöbölése miatt is terveztük a félfolyamatos rendszert. Irodalomjegyzék [1] Schols, H. A., Voragen, A. G. J., Occurence of pectic hairy regions in various plant cell wall materials and their degradability by rhamnogalacturonase, Carbohydrate Research, 256 (1994) 83 95 [2] Voragen, A. G. J., Pilnik, W., Thibault, J. F., Axelos, M. A. V., Renart, C. M. G. C., Pectins. In A. M. Stephen (Ed.), Food polysaccharides and their applications 287-396 (1995) [3] Fogarty, W.M., Kelly C.T., Pectic Enzymes, 131-182, In Fogarty, W.M ed. [4] Ginter, E., Kubec, f. J., Vozár, J., Bobek, P., Natural hypocholesterolemic agent: pectin plus ascorbic acid. International, Journal of Viticulture and Natural Resource, 49 406-408 (1979)
[5] Gergely, S., Bekassy-Molnar E., Vatai Gy., Journal of Food Engineering 58, 311-316 (2003) [6] László, Zs. Hodúr, C., Desalination, 206, 333-340 (2007) [7] Rektor A., Pap, N., Kókai Z., Szabó R., Vatai Gy., Békássy-Molnár E., Desalination, 162, 271-277 (2004) [8] Bélafiné Bakó K., Membrános Műveletek, Veszprémi Egyetemi Kiadó, 115-122, 2002 [9] Erdey L., Bevezetés a Kémiai Analízisbe; II. rész; Tankönyvkiadó, Budapest; 1958 [10] Kiss K., Pektin kinyerése és enzimes hidrolízise, PhD értekezés, Pannon Egyetem, Veszprém, 2009