Gastrointestinalis daganatok szabad gyök, tumormarker és háromdimenziós ultrahangvizsgálata

Átírás

1 Gastrointestinalis daganatok szabad gyök, tumormarker és háromdimenziós ultrahangvizsgálata Dr. Szilvás Ágnes Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Blázovics Anna PhD. Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika Budapest,

2 Gastrointestinalis daganatok szabad gyök, tumormarker és háromdimenziós ultrahangvizsgálata Dr. Szilvás Ágnes Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Blázovics Anna PhD. Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika Budapest, A téma háttere: Évente a világon mintegy kétmillió gastrointestinalis tumor kerül diagnosztizálásra. Magyarországon minden évben megközelítőleg új daganatos eset kerül felismerésre és daganatos halál fordul elő. A vizsgálat célja: A tumoros folyamatok a tumormarkerek szintjének növekedéséhez, és a szabad-gyökös status megváltozásához vezetnek. Komplex vizsgálatuk és értékelésük ezért indokolt a gastrointestinalis daganatokban. A háromdimenziós ultrahangvizsgálat, mint új diagnosztikai módszer értékelése fontos a rákmegelőző állapotokban és a gastrointestinalis tumorokban. Eredmények: Különböző típusú és stádiumú gastrointestinalis tumoros, ellenőrzött és kontroll beteg került vizsgálatra, 214 esetben. A tumor markerek (CEA, CA 19-9, CA 72-4, AFP, TPA, AGP) és a szabad-gyökös status (total scavenger kapacitás) éhgyomri vénás vérből (LIA-kitekkel és kemiluminescenciás metodikával, LIA-mAT és Lumat Berthold készülékkel) került meghatározásra. Hagyományos és háromdimenziós ultrahangvizsgálatot alkalmaztunk a praecancerosus állapotokban és a tumor igazolására (Kretz Voluson típusú készülék). Az eredmények azt mutatták, hogy a tumormarkerek közül a TPA és az AGP jelezte legjobban a tumoros folyamatot. A szabad-gyökös status nagyon érzékeny vizsgáló módszernek bizonyult a tumor-diagnosztikában. A háromdimenziós ultrahangvizsgálat értékét emeli, hogy a daganatot a tumormarkerek normál szintje mellett jelezte. Következtetés: Kutatásaink alapján a hagyományos tumormarkerek mellett más, új diagnosztikus módszerek is hasznosak a gastrointestinalis daganatok diagnosztikájában, és követésében. 2

3 Free radical state, tumour markers and three-dimensional ultrasound examinations in gastrointestinal malignancies Ágnes Szilvás MD. Supervisors: Prof. János Fehér Anna Blázovics Ph.D. Second Dept. of Int. Med. Semmelweis University Budapest, Backgroung: Two million gastrointestinal tumours are diagnosed in the world yearly. In Hungary, every year approximately new cases are discovered and patients die of cancer. Aims of the study: The tumorous processes lead to a growing level of the tumourmarkers and change in the free radical state. This explains the applying a complex examination and evaluation in gastrointestinal tumours. The three-dimensional ultrasound examinations, as a new diagnostic method was evaluated in gastrointestinal praecancerous and tumorous processes. Results: Different types and stadia of gastrointestinal malignancies, controlled patients and control cases were investigated in 214 cases. The tumour markers (CEA, CA 19-9, CA 72-4, AFP, TPA, AGP) and free radical state (total scavenger capacity) were investigated in the malignancies. The venous blood was taken after an overnight fast and the tumourmarkers were detected by the LIA-kit method, while the free radical state was analysed by the chemiluminescent method (LIA-mat and Lumat Berthold equipment were used). Conventional and three-dimensional ultrasonography were applied in the praecancerous stages and to prove the tumorous processes. The results detected that among the tumour markers the TPA and AGP showed the best correlation with the tumorous process. The free radical state being a very sensitive method for the detection of the tumour. In some cases the three-dimensional ultrasonography could find the tumorous process when the markers showed normal values. Conclusion: Based on our results in addition to the traditional tumour markers the other diagnostic methods are useful both in the diagnosis of the gastrointestinal malignancies, and in the follow up. 3

4 TARTALOMJEGYZÉK 1 BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A szabad-gyökös folyamatok szerepe a szervezetben A szabad-gyökös folyamatok a rákmegelőző állapotokban A szabad-gyökös folyamatok és a karcinogenezis A gastrointestinalis rendszer természetes gyökfogó védelme Az akutfázis fehérjék és tumormarkerek a gastrointestinalis rendszer daganataiban A szérum alfa-1-savanyú glycoprotein mint tumormarker Tumormarkerek a gastrointestinalis rendszer malignus betegségeiben A gastrointestinalis rendszer daganatainak vizsgálatában alkalmazott tumormarkerek A gastrointestinalis daganatok ultrahangvizsgálata A kétdimenziós (2D) hasi ultrahangvizsgálat A háromdimenziós (3D) hasi ultrahangvizsgálat A háromdimenziós rectalis ultrahangvizsgálat BETEGEK ÉS MÓDSZEREK A betegek beválasztása A rákmegelőző állapot vizsgálata A gastrointestinalis daganatos csoport A kontroll csoport Anyagok és módszerek A rutin laboratóriumi paraméterek vizsgálata

5 4.2.2 Tumormarkerek meghatározása Szabad-gyökös vizsgálatok Citológiai és szövettani vizsgáló módszerek Ultrahangos vizsgáló módszerek Kétdimenziós (2D) hasi ultrahangvizsgálat Háromdimenziós (3D) hasi ultrahangvizsgálat Háromdimenziós (3D) rectalis ultrahangvizsgálat Statisztikai módszerek EREDMÉNYEK A rutin laboratóriumi vizsgálatok eredményei A tumormarker vizsgálatok eredményei A tumormarkerek összefüggése a daganat lokalizációjával A tumormarkerek és a stádiumok összefüggése gastrointestinalis daganatokban A tumormarkerek alakulása a gastrointestinalis daganatok szövettana alapján A tumormarkerek és az akutfázis fehérje (AGP) összefüggései A tumormarkerek együttes vizsgálata gastrointestinalis tumoros és ellenőrzött betegekben a metastasisok ill. recidíva jelzésére A szabad-gyökös folyamatok aktivitásának eredményei gastrointestinalis daganatokban A szabad-gyökös folyamatok aktivitása a gastrointestinalis daganatok lokalizációjával összefüggésben A szabad-gyökös folyamatok aktivitása stádiumok szerint gastrointestinalis tumorokban A szabad-gyökös folyamatok aktivitása a plazmában és a szérumban gastrointestinalis tumorokban a szövettani típus alapján A szabad-gyökös folyamatok aktivitása és a tumormarkerek összehasonlító értékelése

6 5.5 A háromdimenziós ultrahangvizsgálat értéke gastrointestinalis daganatokban és rákmegelőző állapotban MEGBESZÉLÉS KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK TÁBLÁZATOK, ÁBRÁK JEGYZÉKE KÉPEK JEGYZÉKE KÖZLEMÉNYEK, ELŐADÁSOK JEGYZÉKE

7 1. Bevezetés 1 BEVEZETÉS Évente mintegy kétmillió gastrointestinalis tumor kerül diagnosztizálásra a világon, és ezzel a második helyen szerepel a halálozási okok között. Magyarországon a daganatos betegségek okozta halálozás közismerten magas, és jelentősen emelkedik, ezen belül az utóbbi három évtizedben a gastrointestinalis eredetű mortalitás megduplázódott. Az 1990-es években a demográfiai adatok szerint a gyomorbélrendszeri daganatos eredetű halálozás hazánkban meghaladja a es nagyságrendet. A gastrointestinalis daganatos megbetegedések előfordulásának növekedése 1995-ben Magyarországon kormányszintű szűrőprogram bevezetését is indokolttá tette a Daganatos betegségek másodlagos megelőzése terén. A riasztó statisztikai adatok alapján feladatul tűztük ki a gastrointestinalis daganatok, a praecancerosus állapotok vizsgálatát. A praecancerosus betegségnek tekinthető gyulladásos bélbetegségben (IBD-ben) a folyamat diagnosztikájával, szövődményeivel, differenciálásával, ezen belül az egyes IBD típusok jelentőségével foglalkoztunk. A rutin laboratóriumi diagnosztika vizsgáló módszereit alkalmazva kerestük azokat a paramétereket, amelyek legjobban jellemzik a malignus folyamatot. A kapott eredményeket kombináltuk a többi általunk használt, ill. kifejlesztett módszerrel. Ismert tény, hogy a tumoros folyamatok a szabadgyök-status megváltozásához vezetnek. A karcinogén anyagok, amelyek egymástól különböznek, azzal a közös tulajdonsággal rendelkeznek, hogy lehetnek önmagukban szabad gyökök vagy a szervezetben szabad gyökké alakulnak, ill. szabad gyökök felszabadításával fejtik ki hatásukat. E folyamatok detektálására új metodikát alkalmaztunk. A diagnózis felállításához a keringő tumormarkerek bizonyultak hasznosnak, azonban a mindennapi gyakorlatban alkalmazásuk nem tekinthető problémamentesnek. A korábbiak mellett újabb tumormarkerek kifejlesztése is lehetővé, ill. szükségessé vált. Az utóbbi két évtizedben a modern képalkotó eljárások nagy előrelépést hoztak a tumor-diagnosztikában. Ezen belül a három-dimenziós ultrahangvizsgálatok alkalmazása révén a tumorok részletesebb vizsgálata, stádiumának jobb megítélése, 7

8 1. Bevezetés ellenőrzése is lehetővé válik a tumor méretének meghatározásával. A diagnosztikai lehetőségek mellett a terápia megtervezésében fontos szerepe lehet. A digitális képtárolás révén a beteg távollétében is tarthatóak konzíliumok, internetes kapcsolat segítségével nemzetközi megbeszélések válnak lehetővé. A tumor kezelésének követésével és a terápia megválasztásával fontos segítséget nyerhetünk. A rákmegelőző állapotokban, pl. a gyulladásos bélbetegségben is hasznos ellenőrző vizsgálat. 8

9 2. Célkitűzés 2 CÉLKITŰZÉS Célunk a gastrointestinalis daganatok és rákmegelőző állapotok komplex vizsgálata volt. Ehhez hagyományos, új laboratóriumi és eszközös vizsgálatokat alkalmaztunk, ill. fejlesztettünk ki. Arra kerestük a választ, hogy a hagyományos eszközök mennyiben tükrözik a malignus folyamatot, ill. az új módszerek mennyiben alkalmazhatók, és mely kombinációk a legkedvezőbbek. Hasonló felmérést az irodalmi adatok alapján nem találtunk. Vizsgálataink a gastrointestinalis tumorok optimális diagnosztikai és követési lehetőségeire irányultak, mely a magyarországi bevezetés eredményeként a halálozás csökkentését segítené elő. Az optimális diagnosztikai eljárások és a célzott kezelés nyomán költség-megtakarítás érhető el a daganatos megbetegedéseknél. A vizsgálat célja: 1. A gastrointestinalis daganatokban a rutin laboratóriumi vizsgálatok jelentősége. 2. A tumormarkerek kombinált vizsgálata a gastrointestinalis daganatokban Mi az optimális az egyes daganatok diagnosztikájában lokalizáció, stadium, metastasis szempontjából? 2.2. Milyen az egyes markerek és kombinációjuk értéke a daganatok vizsgálatában? 3. A szérum alfa-1-savanyú glycoprotein (AGP) vizsgálata különféle gastrointestinalis tumorokban, a tumor típusával, kiterjedésével való összefüggése. 9

10 2. Célkitűzés 3.1. Informatívabbak-e a szérum AGP meghatározással és a tumormarkerekkel végzett vizsgálatok együttes eredményei a tumor jelzésében? (Vizsgálatához új metodikát alkalmaztunk, melynek alapján kifejlesztett teszt használata gyors, és széles körben felhasználható) A szérum AGP szintje a rákmegelőző állapotokban (IBD-ben), mutat-e összefüggést az IBD formájával, kiterjedésével, aktivitásával és a lehetséges szövődményekkel? 4. A szabad-gyökös vizsgálatokban a total scavenger kapacitás (TSC) meghatározása - mely kifejezi a szervezet szabadgyök-statusát, és védekező képességét alkalmas-e a rákos folyamat vizsgálatára? Új, gyors és költségkímélő kemiluminometriás módszer alkalmazása, és helye a rutin diagnosztikában. 5. Milyen lehetőséget nyújtanak a hagyományos vizsgálatok mellett a háromdimenziós hasi és rectalis ultrahangvizsgálatok a rákmegelőző állapotokban és tumorokban? 10

11 3. Irodalmi áttekintés 3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1 A SZABAD-GYÖKÖS FOLYAMATOK SZEREPE A SZERVEZETBEN A szabad gyökök olyan atomok vagy atomcsoportok, melyek külső pályájukon ún. párosítatlan elektront tartalmaznak - fontos szerepet játszanak a szabályos sejtfunkcióban (pl. fagocitósis, antimikrobiális védelem, immunreguláció), másrészt kóros állapotokban (gyulladás, ischaemia, rákképződés). Alapvető szerepük van a lipidperoxidációs láncreakcióban, amely a többszörösen telítetlen zsírsavak autooxidációjával kapcsolatos. A szabad gyökök és a lipidperoxidáció károsítja a biomembránok telítetlen zsírsavait, és a sejtekben található bármely molekulát, proteineket, DNS, RNS-láncokat, a sejtek matrix molekuláit A SZABAD-GYÖKÖS FOLYAMATOK A RÁKMEGELŐZŐ ÁLLAPOTOKBAN A szabad-gyökös folyamatoknak fontos szerepe van anyagcserefüggésük miatt az olyan gyorsult metabolizmusú helyeken, mint pl. a gastrointestinális nyálkahártya. Szabad gyökök szabadulnak fel a bél gyulladásos állapotaiban, ilyenkor a gyulladás helyszínén -. levő fagocitákból nagymennyiségű O 2 anion kerül az extracellularis térbe, a sejteken belül pedig a felborult sejtmetabolizmus során keletkező toxikus lebontási termékek indukálhatnak kóros szabadgyök-képződést, így elősegítik a sejt malignus átalakulását. A colitis ulcerosához és a Crohn-betegséghez társuló szövetkárosodást és működési zavart nagy valószínűséggel a bél kötőszövetében a betegség aktiválódása során felszaporodó fehérvérsejtekből (fagocitákból) felszabaduló solubilis mediátorok hozzák létre. A mikroorganizmusok elpusztítására a neutrofil, eozinofil sejtek, monociták, makrofágok jelentős mennyiségű reaktív oxigén intermediert (ROI) szintetizálnak és szabadítanak fel. A ROI-ok tartós képződése, pl. krónikus gyulladás során a természetes védőgátat (védő enzimek és nem enzim antioxidánsok) áttöri, és a szövetek oxidatív 11

12 3. Irodalmi áttekintés károsodását okozza (oxidatív stress). Ha a gyulladáskeltő anyagok (pl. leukotrién, PAF, IC, komplementfaktorok) a fagocita plazmamembránjának specifikus receptoraihoz kötődnek, aktiválódik a plazmamembrán-asszociált NADPH oxidáz. Ennek eredményeképpen nagymennyiségű szuperoxid anion, hidrogén-peroxid, valamint a mieloperoxidáz által képzett oxidáló vegyületek, mint pl. a hipoklórsav és klóraminok keletkeznek, ill. szabadulnak fel. A hidrogén-peroxid és számos klóramin fokozza a mutagenezist. Kerhavarzian és Simmonds kemilumineszcenciás vizsgálatai bizonyították a ROI-ok túltermelődését colitis ulcerosában (1). Az eritrociták antioxidáns kapacitásának kimerülése IBD-ben Blázovics A. és mtsai közlése nyomán igazolt (2) A SZABAD-GYÖKÖS FOLYAMATOK ÉS A KARCINOGENEZIS A daganatok képződése, kialakulása vagy megjelenése a környezeti faktorokkal kapcsolatos. A karcinogén vegyületek döntő többsége maga is szabad gyök, szabadgyökös mechanizmussal hat, vagy indirekt úton patológiás szabad-gyökös reakciókat indukál. Ennek során a membrán-aktív anyagok aktiválják az arachidonsavmetabolizmust, melynek reakciólépései során az aktív oxigén hordozóinak tekinthető endogén lipidperoxidok keletkeznek, ill. ROI-ok szabadulnak fel. A LPO egyes stabil, diffuzibilis végtermékei képesek a genetikai anyag károsítására, ezáltal a tumorok iniciációjában és promóciójában szerepük lehet (3, 4, 5). A karcinogenezisben ma már elfogadott a szabad gyökök szerepe. A lipidperoxidáció egyik végterméke a malondialdehid, karcinogén és mutagén hatású vegyület, mely szerkezetileg is hasonlít más mutagén vegyületekhez. Emellett a mitokondriális légzési lánc működése során keletkező reaktív oxigén termékek is létrejönnek. A tumorképződést a csökkent vagy hiányzó MnSOD miatt kiszabaduló O 2 károsító hatásának. tulajdonítják. Kontrollálatlan malignus folyamatok kialakulását a SH-enzimek inaktiválása révén a camp-szint csökkenése, ugyanakkor a cgmp emelkedése kíséri a sejtekben. A ciklikus nukleotidok a sejtosztódás szabályozásában játszanak szerepet, indukálják a kontrollálatlan tumoros folyamatokat. 12

13 3. Irodalmi áttekintés A GASTROINTESTINALIS RENDSZER TERMÉSZETES GYÖKFOGÓ VÉDELME A szabad gyökök okozta károsodások kivédésére, ún. természetes antioxidáns (gyökfogó) rendszer alakult ki a prokaryota és eukaryota szervezetekben (5). E gyökfogó rendszer intracelluláris elemei az egyes enzimek, pl. a szuperoxid-dizmutázok (SOD), kataláz, glutation-peroxidáz, valamint más fehérjék SH csoportjai, melyek a sejt belső miliőjének védelmét biztosítják. E védelem legfontosabb elemei az emberi plazmában a coeruloplasmin, az albumin, az albuminhoz kötött bilirubin, C-vitamin, traszferrin, haptoglobin, hemopexin ezen anyagok koncentrációja jóval kisebb, vagy elhanyagolható a gasztrointesztinális nyálkahártya felszínén (6, 7). Tehát az intra és extracelluláris térben keletkező szabad gyökök elleni védelmet enzimek és antioxidáns vegyületek biztosítják, melyek együttes működésének eredménye az antioxidáns vagy gyökfogó kapacitás (8, 9). 3.2 AZ AKUTFÁZIS FEHÉRJÉK ÉS TUMORMARKEREK A GASTROINTESTINALIS RENDSZER DAGANATAIBAN A szérum fehérjéinek változása jellemző több patológiás elváltozásra, beleértve a tumoros folyamatokat (8, 11, 12). Az akutfázis fehérjék szintézise fokozódik és emellett a tumoros betegségekre jellemző fehérjék (CEA, AFP) is termelődnek (13). A daganatos betegek szérumában az alfa-1-antitripszin, coeruloplasmin, haptoglobin és hemopexin szignifikánsan emelkedik, míg az albumin szignifikánsan csökken. A tumor kiterjedése és az akutfázis proteinek (alfa-1-savanyú glycoprotein, alfa-1 - antitripszin, coeruloplasmin, haptoglobin) között direkt kapcsolat mutatható ki. Szignifikáns csökkenés mutatható ki az albumin, alfa- 2 -makroglobulin és transzferrin között disszeminált tumorokban, míg nem szignifikáns csökkenés igazolható az alfa-2-hs glycoproteinnel. Egyértelmű pozitív korreláció mutatható ki a tumoros betegeknél az akutfázis proteinekkel, míg leginkább negatív korreláció az alfa-2-hs glycoprotein és az albumin esetében (10). Synder és Ashwell különböző típusú daganatos betegekben 13

14 3. Irodalmi áttekintés kimutatták az alfa-1-savanyú glycoprotein, coeruloplasmin, hemopexin, alfa-1- antitripszin, haptoglobin emelkedését. Az akutfázis proteinek szérum szintje a tumor kiterjedésével függ össze. Szoros korreláció mutatható ki a szénhidrátok és az akut fázis proteinek között, melyekről ismert, hogy nagy mennyiségű szénhidrátot tartalmaznak (12). A fehérjéhez kötött szénhidrát fukóz-tartalmának növekedését mutatták ki tumoros megbetegedésekben (13-18). Az akutfázis fehérjék a szöveti károsodás (infekció, trauma, gyulladás) után óra múlva jelennek meg a plazmában, emiatt a tumormegelőző állapotban, IBD-ben is alkalmas lehet a betegség aktivitásának, szövődményeinek megítélésére, a terápia monitorozására. Annál is inkább, mivel e betegségcsoportnak sincs ideális markere, ami egyértelműen jelezné a fenti elváltozásokat (19) A SZÉRUM ALFA-1-SAVANYÚ GLYCOPROTEIN MINT TUMORMARKER A alfa-1-savanyú glycoprotein (AGP) a humán szérum egyik jellegzetes, igen magas (45%) szénhidrát tartalmú, 40 kd molekulatömegű un. akutfázis fehérje frakciója. A közel 50 éve ismert fehérje szerkezetét az 1970-es években Schmid és munkatársai írták le (20). Az AGP szénhidráttartalma a peptidlánchoz N-glikozidos kötéssel kapcsolódó 5 oligoszacharid (glikán) egységből áll, amelyekben neutrális monoszacharidok (galaktóz, mannóz, fukóz) mellett jelentős mennyiségű hexózamin (N-acetil glukózamin) és sziálsav található (21, 22). Az oligoszacharid alegységek összetételének és antennáris szerkezetének mikroheterogenitása miatt az AGP a molekulavariánsok keverékével jellemezhető (23-26). A szérum AGP tartalma elsősorban a hepatocytákban és a leukocitákban keletkezik, de különböző kórfolyamatokban (pl. nekrotizáló tumoroknál) szöveti eredetű is lehet (32, 37). A humán szérum normális AGP koncentrációja mg/dl. Különböző exogén és endogén tényezők a szérum AGP koncentrációjának és szerkezetének változását idézhetik elő (23, 24, 26, 30). Trauma, infekciók, továbbá daganatos megbetegedések a szérum AGP koncentrációját megemelik (28, 29, 30). Ezt a hatást akut gyulladásokban elsősorban az interleukin-1 mediálja. Interleukin-1 hatására az AGP transzkripciója megnövekszik a hepatocytákban (23). Krónikus májbetegségekben feltehetően a máj fehérjeszintézisének károsodása miatt csökken a 14

15 3. Irodalmi áttekintés szérum AGP tartalma. Fehér és Jakab kimutatták, hogy a szérum AGP szintje krónikus hepatitisben és cirrhosisban csökken (28, 29). Magas dózisú oestrogen-kezelés (pl. prostata cc. esetén) csökkenti a szérum AGP tartalmát, ami megerősíti azt a nézetet, hogy a fehérje bioszintézisének szabályozásában a nemi hormonok is szerepet játszanak (33). Daganatos megbetegedésekben a szérum AGP koncentrációja szignifikánsan növekszik és a folyamat prognosztikai jelzője lehet (34). Magas specificitást találtak gasztrointesztinális tumoroknál (35). Colorectális tumoroknál a szérum AGP mérése relative specifikus, bár kevésbé szenzitívnek bizonyult (34). Egyre több megfigyelés utal arra, hogy különböző (malignus) kórfolyamatok megváltoztatják az AGP molekula mikroheterogenitását (23, 25, 26). Fehér és Jakab chr. hepatitisben vizsgálták a szérum glycoproteinek szénhidrát-komponenseinek változását. Szignifikánsan magasabb glükóz tartalmat mértek a daganatos betegeknél, amely a malignitás indikátora lehet (31). Hasonlóképpen a szérum sziálsav szintje összefüggésbe hozható a betegség stádiumával, a metasztázis fokával és a tumor recidívával (30, 32). A magasabb szérum sziálsavtartalom a malignus tumor sejtek metabolizmusával, szöveti nekrózisra, ill. a keringésben felszaporodott szialoglikoproteinekre vezethető vissza. Általában a szérum mukoidok meghatározását a béltumorok jelzőjeként, az AGP és praealbumin hányadosát a prostata cc. markereként használják (33, 35) TUMORMARKEREK A GASTROINTESTINALIS RENDSZER MALIGNUS BETEGSÉGEIBEN 1890-ben Hanselmann leírásában már szerepel, hogy a daganatos betegek abnormális sejtjei összefüggésbe hozhatók biológiai anyagokkal, klinikai jelenségekkel (36). Nagy gyakorisággal, a kórképpel összefüggő változások, tumormarkerek megjelenése mutatható ki, amelyeket biológiai markereknek is neveznek. Tumormarkernek tekinthető minden olyan anyag, amelynek megjelenése, vagy koncentrációjának jellegzetes megváltozása az emberi testnedvekben, korrelációba hozható a malignus folyamattal (37). Tumorspecifikus, csak rosszindulatú gastrointestinalis daganatos betegekben előforduló markereket a mai napig nem tudtak kimutatni (38). A tumormarkerek (TM) elsődleges származási helye a malignus sejt. A tumorsejtekben létrejövő szerkezeti és funkcionális változások potenciálisan TM-anyagokat 15

16 3. Irodalmi áttekintés termelhetnek, ezáltal tükrözik a sejtben létrejövő változásokat, azok részfolyamatait. A biológiai markerek többsége egészséges emberben is kimutatható alacsony szinten, de gyakran emelkedett lehet számos nem malignus folyamatnál is, vagy a szervezet válaszreakcióját tükrözi a malignus elváltozás esetén. Az ideális biológiai markernek kifejezetten specifikusnak és érzékenynek kell lennie az adott daganatféleséggel szemben, és elvárható, hogy alkalmas legyen a rák korai diagnózisára és a progresszió monitorozására is. A tumormarkerek osztályozása többféle szempont szerint lehetséges. A felosztás történhet a származási hely alapján, eszerint megkülönböztethetünk tumorból származó (szintézis termékek, anyagcserétől függő anyagok), és tumorhoz társuló anyagokat (mennyiségileg megváltozott szérumproteinek, enzimek és izoenzimek), melyek nem a malignus szövetekből, hanem a tumor, vagy áttétei okozta infiltráció miatt jutnak a keringésbe, valamint szérumparamétereket, melyek a tumor által produkált szubsztanciák hatására változnak meg. A biokémiai típus alapján a tumormarkerek lehetnek tumor asszociált antigének, enzimek, hormonok, szérum- proteinek, metabolitok. Bates és mtsai 6 kategóriába osztották a tumormarkereket (39). Ismeretük néhány évtizedre, egyes esetekben a múlt századra nyúlik vissza (40, 41). Az első marker a Bence-Jones protein volt, melyet 1846-ban egy myeloma multiplexes betegnél fedeztek fel ben fedezték fel a karcinoembrionális antigént (CEA), mely fontos mérföldkő volt a tumor-diagnosztikában (42). A tumormarkerek alkalmazása a klinikumban sokirányú, a diagnosztikán kívül a kezelésben is jelentősége van. Egyes irodalmi adatok szerint ez az egyik fő terület alkalmazásában, mivel a diagnosztikában a specificitás viszonylag alacsony szintje miatt értéke korlátozott, bár a diagnosztika megerősítésében és a stádium-meghatározásban szerepe lehet. A kezelésben jelentősége, hogy információt ad a prognózisról, a terápiára bekövetkező válasz várható kimeneteléről, a reziduális betegség fennálltáról pl. a CEA szint praeoperativ szintje korrelál a túlélési aránnyal colorectalis rákban, és emelkedése recidívát jelezhet (40). Szűrésben a ráfordított költségek magas aránya miatt a kiemelkedően magas incidenciájú populációkban javasolják elvégzését pl. Kínában a krónikus virális hepatitises endémiás területeken a hepatocellularis carcinoma veszélye miatt végeztek szérum alfa-foetoprotein vizsgálatot. Ennek hatékonysága lemérhető az időben 16

17 3. Irodalmi áttekintés diagnosztizálható tumorok méretcsökkenésében, és a tumor reszekálhatóságban, valamint a több mint húsz éves túlélésben (39). Az utóbbi időkben a biztosító társaságok részéről is megnőtt az igény a tumormarkerek meghatározása iránt az élet-és egészségbiztosítási szerződések megkötésekor. A rákhalálozások jelentős növekedésével a biztosítók főleg az 55 év feletti népesség várható élettartamának megítélésében érdekeltek, mivel ez a populáció a leginkább veszélyeztetett. Olyan diagnosztikai teszt, mely prioritást élvezne a gastrointestinalis daganatokban (vö. vércukor-meghatározás diabetes mellitusban, ill. EKG a kardiológiai szűrővizsgálatokban) nem létezik. A CEA 1965-ben történt felfedezését követően úgy gondolták, hogy megjelent egy olyan marker, mely szenzitív és specifikus mutatója a gastrointestinalis daganatoknak. Néhány év után több ezer cikk és 1977 és 1980-ban megtartott kongresszus anyagában is bizonyított, hogy a CEA gyenge hatékonyságú a rákszűrésben (43). A probléma egyik részét a nem megfelelően alkalmazott protokollok, a különböző laboratóriumi technikák és KIT-ek adják annak ellenére, hogy a legtöbb tumormarker stabil glycoprotein vegyület (44). Jelenleg nem áll rendelkezésünkre 100%-os specificitású és szenzitivitású tumormarker egyrészt, mert nem ismerünk olyan markert melyet csak a malignus elváltozás termel, másrészt az egészséges szervezetben, ill. jóindulatú betegségben is előfordulnak ezen anyagok. Emellett a TM koncentráció aktuális értékét több tényező befolyásolja. Ál-pozitivitást okozhat jóindulatú, degeneratív gyulladásos betegség, a metabolizmus és a kiválasztás zavara, pl. májbetegségben (AFP, CEA, CA19-9, TPA), a veseműködés zavara (CA 19-9, CEA), terápiás beavatkozások (műtét, kemo- és sugárterápia, sejtszétesés, sejtképződés, tumornekrózis, tumorlízis), terhesség (AFP), rectális digitális vizsgálat (PSA). Ál-negativitást okozhat, ha kevés a markert szintetizáló tumorsejtek száma, a TM nem vagy csak részlegesen szecernálódik, a sejtben vagy a sejt felszínén marad az immunkomplexképzést létrehozó keringő antitestekkel. Oka lehet az álnegativitásnak, ha a TM szintézis blokkolt (pl. Lewis antigén-negatív személyeknél a CA 19-9), a tumorszövet gyengén vascularizált így elégtelen az átvitel a keringésbe. Gyorsult lehet a TM lebomlási, ill. kiürülési sebessége. Sokszor helytelen a TM választás, a tumorsejt más TM-t szecernál. Gyakran a mutáció, metasztázis, vagy terápiás 17

18 3. Irodalmi áttekintés beavatkozás hatására változik a domináns TM itt van jelentősége a multiparametrikus tumormarker vizsgálatoknak (37). A TM értékelésének problémái miatt célszerű ezeket úgy egységesíteni, hogy növelje a klinikai megbízhatóságot és a felhasználás lehetőségeit (45). E meggondolásból a gasztrointesztinális rendszer tumoraira alkalmazható multiparametrikus TM-vizsgálatot végeztünk, mivel az irodalomban sincs egyértelmű, egységes konszenzus erre vonatkozóan (37, 38) A GASTROINTESTINALIS RENDSZER DAGANATAINAK VIZSGÁLATÁBAN ALKALMAZOTT TUMORMARKEREK A carcinoembrionalis antigén (CEA) első leírása Gold és Freedmantól származik ből molekulasúlyú glycoprotein, kb. 40% proteint és 65% szénhidrátot tartalmaz. Termelődése, melyet legkevesebb gén (CEA-gén család) indukál, születés után visszaszorul. Pontos működése nem ismert, feltételezik, hogy a receptorfunkciókban és immunszuppresszióban lehet szerepe. Több mint 90%-ban adenocarcinoma esetében mutatható ki, és kb. 80%-ban gastrointestinalis eredetű (46). Colorectalis carcinomában 57%, gyomor carcinomában 41%, hepatocellularis tumorban 45%, pancreas carcinomában 59%-ban, biliáris carcinomában 59%-ban emelkedett az értéke. Benignus elváltozásokban is kaphatunk magasabb értéket gyulladásos bélbetegségekben (17%), chronicus gastritisben és pepticus fekélyben (14%), cirrhosisban és hepatitisben (17%), pancreatitisben (21%-ban) (47). Emelkedett értéket írnak le (3 ng/ml felett) 10-28%-ban Dukes A, 45%-ban Dukes B, és 70%-ban Dukes C stádiumú colon-carcinomában (47, 48, 49). Monitorozásban 60-95% között jelzi a tumor recidívát (50). A CA 19-9, 1979-ben Koprowski és mtsai által izolált tumormarker. Sejtfelszíni szialoglycoprotein, mely Lewis negatív vércsoportú egyénekben nem expresszálódik, ebből következően szenzitivitása maximum 95% lehet a populációban, mivel a Lewis negatív egyének mintegy 5%-ot tesznek ki. Közvetlen prekurzora a CA 50 marker, Lewis negatív vércsoportú betegekben és prekurzor volta miatt kombinációban vizsgálata nem javasolt (51, 52, 53). 18

19 3. Irodalmi áttekintés Szérum koncentrációja (normál érték: 37 U/ml) pancreas carcinomában %-ban, hepatocellularis carcinomában 67%-ban, gyomorcarcinomában 62%-ban, colorectalis carcinomában 19%-ban emelkedett (54-60.). Benignus állapotokban pancreatitis, sárgaság 18%-ban mutat magasabb értéket (54-58). Fő felhasználási területe a pancreas carcinoma operabilitásának eldöntése, 1000 U/ml fölé emelkedett értéke 5 cmnél nagyobb tumor-átmérőt jelez, és csak 5%-ban rezekálható ilyen esetben a daganat (58, 61, 62, 63). A kezelés előtti 1000 U/ml alatti értékeknél a betegek felénél rezekálható a tumor (63). Monitorozásban emelkedő értéke relapsust jelez (64). A CA 72-4 tumor asszociált mucin-szerű glycoprotein, mely sziálsavat tartalmaz magas, Dalton molekulasúllyal (65). A TAG-72-t Colecher 1981-ben, Johnson ban vizsgálta különféle adenocarcinomákban (66, 67). Emelkedése (norm. érték: 4 U/ml), a legkülönbözőbb adenocarcinomákban várható (68). A teszt továbbfejlesztett változata a legjobb szenzitivitást a gyomor carcinomával mutatja, értéke korrelál a tumor kiterjedésével (65, 69, 70). Praecancerosus betegségekben ritkán észlelünk emelkedést ilyen esetek pl. a Crohn-betegség, colitis ulcerosa (71). A Szöveti Polypeptid Antigént (TPA) 1957-ben Björklund mutatta ki carcinomás betegeken. A TPA kb molekulasúlyú polypeptid. A TPA a legtöbb epithelialis sejtben kimutatható, kivéve a squamosus és kis-sejtes carcinomát. A keratinok alkotórésze, mely a normál és malignus epithelialis sejtek között helyezkedik el. A TPA nem biztos jelzője a tumornak, inkább a proliferáció markere. A gastrointestinalis daganatok közül főleg a colorectális carcinomában emelkedik, és jó monitor a recidívák jelzésére. Nem specificus marker, gyulladásokban is nőhet az értéke (norm.érték:95 ng/ml-ig). 19

20 3. Irodalmi áttekintés Az Alfa-Foeto-Proteint (AFP) 1954-ben Bergstrand és Czar foetalis szérumban fedezte fel, és először Tatrinov írta le 1964-ben mint tumor-asszociált proteint. Szintézise főleg a májban a foetális életben fordul elő Dalton molekulasúlyú glycoprotein, 2,5% szénhidráttartalommal. Több mint 90%-ban emelkedett primer májtumorban. A gastrointestinalis daganatok közül előfordulhat emelkedése gyomorcarcinomában, colorectalis carcinomában, biliaris és pancreas carcinomában valamint májmetastasisban. A primer májcarcinoma differenciálása az egyéb carcinomák metastasisától a kombinált AFP és CEA vizsgálattal lehetséges. Alacsony AFP szint emelkedett CEA értékkel májmetastasist jelez. Egyéb elváltozásokban is emelkedhet hepatitis, májcirrhosis, Crohn-betegség, polyposis (norm. érték: 6 ng/ml-ig). 3.3 A GASTROINTESTINALIS DAGANATOK ULTRAHANGVIZSGÁLATA A hasi ultrahangvizsgálatok kb. 80%-át gastroenterológiai betegség gyanújával kérik, s a vizsgálat jellegéből adódóan rendszerint az elsők között van (72). A transabdominális ultrahangvizsgálat során jól ábrázolható a gyomor-bélfal vastagsága, jó felbontóképességű készülékkel a falszerkezet is megítélhető. Megállapítható az elváltozás kiterjedése, lokalizációja és az esetleges kísérő betegségek, szövődmények, melyek a további lépéseket módosíthatják. A vizsgálat hozzáférhetőbb, kevésbé költségigényes, mint a CT és MRI, idős, leromlott állapotú beteg számára nem olyan mértékben megterhelő, mint az egyéb eszközös vizsgálatok. A mai gastroenterológiai diagnosztikában nem vitatható létjogosultsága A KÉTDIMENZIÓS (2D) HASI ULTRAHANGVIZSGÁLAT A gastrointestinalis tumorok és rákmegelőző állapotok fontos szűrő és diagnosztikai vizsgáló módszere. A 2D ábrázolással a praecancerosus állapotok (cholelithiasis, cirrhosis, IBD) egyéb kiegészítő vizsgálatokkal együtti felismerését, nyomonkövetését végezhetjük. A 2D ábrázolással a tumorok körülírt, echodús, echoszegény, cystosus 20

21 3. Irodalmi áttekintés terimeként ábrázolhatók. A vizsgálatot color és Doppler vizsgálattal kiegészítve az elváltozás benignus vagy malignus jellegére következtethetünk A HÁROMDIMENZIÓS (3D) HASI ULTRAHANGVIZSGÁLAT A háromdimenziós hasi ultrahangvizsgálattal háromdimenziós (3D) leképezésre nyílik lehetőség a computeres adatfeldolgozás segítségével, sugárterhelés nélkül noninvazív úton (73-78, 79 ). A térbeli ábrázolást egy microprocessor-computer rendszer, ultrahang és video-jel digitalizáló rendszer, egy magas felbontású monitor és a 3D transducer teszi lehetővé. A 3D technika sorozatmetszeteket hoz létre, melyet 3 ortogonális metszet, ún. A, B, C síkok alkotnak. A rendszer az aktuális metszeteket a lineáris algoritmikus interpoláció segítségével dolgozza fel. Ennek alapján készíti a sorozatmetszeteket, melyek egy csonkagúla-alakú információhalmazt hoznak létre. A sorozatmetszetek computeres feldolgozásával térbeli formát nyerhetünk. A síkok térbeli pozíciója a transducer vezérlőegységében kerül tárolásra és bármikor előhívható a memóriából, a síkok léptethetők, tengely körül elforgathatók, mely által részletesebb megfigyelésre nyílik lehetőség. Ezt még fokozza a jó felbontóképesség, mely meghaladja a hagyományos vizsgálatokét (80, 81, 82). Klinikai felhasználásának egyik fő területe az onkológia, mivel alkalmas a tumor-volumen meghatározására, térbeli lokalizáció, környéki nyirokcsomók, érstruktúra érintettségének megítélésére (83-89). A WHO által meghatározott kritériumokat figyelembe véve a tumor-volumen meghatározása nagy fontosságú (parciális válasznak tekintik, ha a méretredukció 50%-os 4 héttel a terápiát követően és progresszió, ha 25%-kal növekszik a méret). A 3D-s meghatározás abszolút volument mér, a szabálytalan képletek megítélésére alkalmasabb, követéses vizsgálatra használható (90, 94). 21

22 3. Irodalmi áttekintés A HÁROMDIMENZIÓS RECTALIS ULTRAHANGVIZSGÁLAT A kétdimenziós rectalis ultrahang-technikát 1950-ben Wild és Reid használta a prostata vizsgálatára (92). Az 1970-es évek végétől a gastrointestinalis tumorok diagnosztikájában alkalmaztak endoluminalis ultrahangvizsgálatokat, amelynek a 3- dimenziós technika egy speciális alkalmazási területe. A 3-dimenziós endosonographia pontossága 88%, a hagyományos vizsgálatokét meghaladja az invázió megítélésében, összevetve azok 82%-os találati értékével. A nyirokcsomó-érintettségre vonatkozó találati biztonsága 79% a kétdimenziós endosonographia 74%-val szemben. Előnye, hogy a 3-dimenziós reconstructiós technika lehetővé teszi az obstructio mögötti területek vizualizálását is. Obstructív tumorokban ez az esetek mintegy 76%-ában lehetséges, ezért első választandó vizsgáló módszernek tartják ezekben az esetekben (93, 94). A magas frekvenciájú (5-12 MHz) transducerek révén a gastrointestinalis falszerkezet és környezet ábrázolására is lehetőség nyílt, ezáltal a tumor staging, főleg a T-stádium meghatározásában, a terápia megtervezésében nyert fontos szerepet (95). Ezzel az új technikával lehetőség adódik a betegek kiválogatására, a praeoperativ adjuváns terápia, irradiáció megtervezésére (96, 97). Jelentősége van nem csak a diagnosztikában, hanem a nyomonkövetésben is, a recidíváló, pl. rectum-tumorok esetében. A lokális recidíva kimutatásán túl a 3-dimenziós reconstructio segítségével a transmuralis terjedés, a környéki nyirokcsomók meghatározására, célzott biopsziájára is alkalmas, adott esetben a fibrotikus benignus és a malignus elváltozás elkülönítésére. Követéses vizsgálatban kuratív rezekció után mintegy 17%-ban észleltek perirectalis elváltozást (98). Az ultrahangvizsgálat létjogosultsága a praecancerosus IBD-ben sem kétséges. Azokban az esetekben, mikor az egyéb eszközös vizsgálatok már nem segítenek, ill. nem kivitelezhetők akár a lokalizáció, akár a beteg általános állapota miatt, az ultrahangos vizsgálat az a választható eljárás, amely ennek megoldását hozhatja. A bélfal megvastagodását, és elkülönítésének lehetőségeit számos szerző tanulmányozta. Dubbins 1984-ben, Kimi 1990-ben tett kísérletet arra, hogy elkülönítse a falszerkezet tanulmányozásával az ultrahang-kép alapján a colitis ulcerosát és a Crohn-betegséget (99, 100). 22

23 3. Irodalmi áttekintés Khaw 1991-ben specificus jelként írta le a Crohn-betegségben talált izom-réteg megvastagodást gyulladással, oedemával és fibrosissal, mely egy tipikus képet okoz, míg colitis ulcerosás jelként a nehezen meghatározható, inhomogen falat és lument, szabálytalan levegőárnyékkal (a mucosa-réteg és fekély között) jellemezte (101). Gyde és mtsai közlése szerint a bal oldali lokalizációjú betegség (colitis ulcerosa) rákrizikója négyszerese az átlagos populációénak (102). Az IBD rákrizikójával foglalkozó közlemények közül Connell és mtsai 1994-es közlése alapján a tumoroknak vagy dysplasticus elváltozásoknak legkevesebb kétharmada a rectosigmoidealis régióban fordul elő (103). A témával azért is indokolt foglalkozni, mert köztudomású, hogy ebben az esetben a rák diagnosztikája nehéz a tünetek hasonlósága miatt. Emellett az IBD előfordulása növekszik, s bár csak mintegy 1%-át adják a colorectalis carcinoma előzményének, évenkénti szaporodása a rákrizikónak kb. 0,5-1%-os növekedést mutat a betegség fennállása során, s ez 30 év alatt 34%-ra tehető (103, 104, 105). Az általánosan ismert hasonlóságok és különbségek közül a sporadicus colon rákot (SCC) és a colitishez társuló colon rákot (CAC) illetően említést érdemel, hogy a SCC főleg a protrudáló adenomatosus polypokból, míg a CAC flat dysplasiából, vagy dysplasiaassociált laesioból vagy masszából (DALM) alakul ki. SCC-ben a synchron colon rákok előfordulása 3-5%, míg CAC-ben 12% körüli (106). A flat laesiok és submucosus elváltozások diagnosztikájában pedig a rectalis ultrahang-vizsgálat első helyen áll. A Crohn-betegségben fennálló stricturák miatt a betegek kb. 11%-ban a coloscopia nem végezhető el. Ismert tény, hogy a stricturák mintegy 12%-a malignus (106, 107). A stricturák mögötti terület ábrázolásában az ultrahang szerepe vitathatatlan. Ezen nehézségek elhárítására indokolt az új metodikák alkalmazása, kombinálása Melville szerint is (108). A 3-dimenziós rectalis ultrahangvizsgálat alkalmazható a rectalis lokalizációjú IBD diagnosztikájában, differenciálásában és szövődményeinek kimutatásában azáltal, hogy a falvastagságot, a fal rétegződését, környezetét (fistula, abscessus, nyirokcsomó) ábrázolja. Ezek leképezésében a módszer érzékenyebb a CT vizsgálatnál (109, 110). Crohn-betegségben mintegy 22-54%-ban fordul elő perirectalis szövődmény, melyek megállapítására a rectalis ultrahang-vizsgálat a legjobb diagnosztikus módszer (109, 111, 112). Segítségével lehetséges a gyulladásos elváltozás térbeli kiterjedésének 23

24 3. Irodalmi áttekintés meghatározása, célzott punctios kezelése, és a sebészeti feltárás elkerülése (113). A célzott biopsiákban találati pontossága mintegy 98% (93). A háromdimenziós ultrahang előnye sorozatos ismételhetősége és a CT, MRI-vel szemben a rövidebb vizsgálati idő és alacsonyabb vizsgálati költsége (94). 24

25 4. Betegek és módszerek 4 BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 4.1 A BETEGEK BEVÁLASZTÁSA A vizsgálatokat előzetes informálás és beleegyezés alapján a TUKEB 167/1997-es számú engedélyével végeztük. A vizsgálatokba a Szt. János Kórház, a Semmelweis Egyetem I. sz. Sebészeti Klinika, az Országos Onkológiai Intézet, az ORFI belgyógyászati és sebészeti osztálya, a B.M. Kórház IV. sz. belgyógyászati osztálya, a Szőnyi Gyula Kórház belgyógyászati osztálya, az Uzsoki utcai Kórház sebészeti osztálya betegeit vontuk be. A felosztás praecancerosus, gastrointestinalis tumoros, ellenőrzésre visszahívott (korábban már kezelt, operált tumoros), és kontroll alapján történt A RÁKMEGELŐZŐ ÁLLAPOT VIZSGÁLATA A rákmegelőző állapotok közül a krónikus gyulladásos bélbetegséget (IBD-t) vizsgáltuk. Az IBD-s csoportban a szérum AGP diagnosztikai jelentőségét értékeltük. Az endoscopos vizsgálatok és a klinikum alapján az eredményeket összevetettük. Colitis ulcerosában a stádium-meghatározást a klinikum alapján (Truelove és Witts), Crohn-betegségben a Crohn Aktivitási Index meghatározásával (CDAI) végeztük (114). Elemeztük az eredmények összefüggését a lokalizációval, a betegség kiterjedésével, aktivitásával, és a szövődményekkel. A gyulladásos bélbetegségek mintegy 25-36%-ban fordul elő extraintestinális manifesztáció (115, 116). Vizsgáltuk, hogy mennyiben befolyásolják a talált eltérések, valamint a szövődmények a laboratóriumi, azon belül a szérum AGP értékét. A colitis ulcerosás csoportba 13 beteg, 8 férfi és 5 nő került, a Crohn-beteg csoportban 2 nőbeteget vizsgáltunk. Az átlagéletkor colitis ulcerosában a férfiaknál 51, a nőknél 37 év, átlagosan év volt, a Crohn-csoportban 27+3 év. Az IBD-s betegek közül rectalis ultrahangvizsgálattal a rectumot érintő idült gyulladásos bélbetegségben szenvedők közül 24 beteget vizsgáltunk, 8 esetben kontroll 25

26 4. Betegek és módszerek vizsgálat is történt. Rectoscopiát minden esetben végeztünk a 3D rectalis ultrahangvizsgálat előtt. Proctitis ulcerosa miatt 19 beteg, rectalis lokalizációjú Crohn-betegség miatt 5 beteg került rectalis ultrahangvizsgálatra. A colitis ulcerosás csoportban 12 férfit és 7 nőt (átlagos életkor 41 év), a Crohn-beteg csoportban 2 esetben kontrolláltuk a betegeket A GASTROINTESTINALIS DAGANATOS CSOPORT A kiválasztás feltétele a tumoros csoportban a gastrointestinalis daganatos előzmény, vagy a vizsgálat idején kimutatott igazolt daganat volt. A betegeket nem, kor, a daganat fennállásának ideje, lokalizációja, típusa, stádiuma, metastasisok jelenléte szerint csoportosítottuk. Ennek alapján egy beteg több csoportban is előfordulhat. Az összes vizsgálat közül tumoros eset 61 alkalommal (28,50%), ebből 34 (55,73%) férfi, 27 (44,27%) nő, átlagos életkoruk: (64,3+11,2 év) került vizsgálatra. 108 kontrollra visszahívott (előzőleg gastrointestinalis daganatos előzményű) beteg (71,50%), ebből 60 (55,55%) férfi és 48 (44,45%) nő került vizsgálatra.a daganat lokalizációja szerint 12 féle felosztást vettünk figyelembe. Ebből a legtöbb a rectum területi daganat volt. A daganat szövettani típusa alapján öt-féle típust, a daganat diagnózisa idején igazolt állapot szerint 5 féle stádiumot vizsgáltunk TNM, Dukes és operábilis-inoperábilis beosztás alapján. A tumormarkerek vizsgálatára a kontroll csoporttal együtt a CEA esetében 211, CA 19-9= 193, CA 72-4= 186, AFP= 210, TPA= 205, az AGP= 182 alkalommal került sor. Szövettani vizsgálat 139 esetben volt. Aspiratios cytologiai vizsgálat 22 alkalommal történt. Ultrahangvizsgálatot 127 esetben (45 esetben a daganatos, 70 esetben az ellenőrzött betegeknél és 12 esetben a kontrolloknál) végeztünk A KONTROLL CSOPORT A kontroll csoportot önkéntes, nem daganatos egyének alkották alkották. Ebben a csoportban 45 egyén került vizsgálatra, ebből 17 (38%) férfi és 28 (62%) nő, átlagos életkoruk: 48,7+24,3 év. 26

27 4. Betegek és módszerek 4.2 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A laboratóriumi vizsgálatok közül a tumormarker vizsgálatokat az Országos Onkológiai Intézet BYK-BÜRO Laboratóriumában, a szabad-gyökös méréseket a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Biokémiai Kutatólaboratóriumában végeztük A RUTIN LABORATÓRIUMI PARAMÉTEREK VIZSGÁLATA A rutin laboratóriumi vizsgálatokhoz éhgyomri vénás vért vettünk. A süllyedést (We) hagyományos módon Westegreen szerint határoztuk meg, és mm/h-ban adtuk meg (norm. értéke: 5-8 mm/h). A vérképet TOA-Sysmex 4000-es automata vérkép analizátorral adtuk meg (norm. értéke fvs: sejt/l, vvt: 4,5-5,5 12 sejt/l, TCT sejt/l). A C-reaktív proteint (CRP) AG-AT-reakción alapuló Immunturbiditási módszerrel határoztuk meg (norm. értéke: 1-5 g/l). A fibrinogént STA automata mérővel Clauss módszere szerint mértük (norm. értéke: 2-4 g/l). A bilirubint DCAmetodikával (NOBIS) határoztuk meg (norm. értéke 17 µmol/l-ig). A szérum vas meghatározást a Diagnosztikum Rt. által gyártott vasferrozinos teszt alapján végeztük (norm. értéke µmol/l). A húgysav mérésére enzimatikus, kolorimetriás módszert használtunk (REANAL termék), (norm. értéke: µmol/l). Az enzimdiagnosztikára a REANAL diagnosztikai reagens készletét alkalmaztuk az AST és az ALT esetén az IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) módszert, míg a tejsav-dehidrogenáz (LDH) meghatározáshoz az optimalizált UV kinetikus módszert. Az AST (norm. értéke: 3-37 U/l), az ALT (norm. érték: 3-40 U/l), az LDH (norm. érték: U/l), a GGT meghatározást a NOBIS reagens-készlete alapján a Szász-metodika szerint végeztük (norm. értéke: 7-32U/l). A fehérjék elektroforetikus meghatározását SEBIA KIT felhasználásával végeztük (norm.érték: Albumin: 52-65, alfa 1 - globulin: 2-4,5, alfa 2 - globulin: 11-15, beta -globulin: 6-13, gamma-globulin: %). A denzitometrálás DVSE denzitométerben történt. 27

28 4. Betegek és módszerek TUMORMARKEREK MEGHATÁROZÁSA A tumormarkerek meghatározása luminescens immunkémiai módszerekkel történt. A KIT-eket a BYK BURO magyarországi képviselete szolgáltatta. A méréshez LIA-mat 300 automata analizátort alkalmaztunk (gyártó: BYK SANGTEC DIAGNOSTICA, Németország). Valamennyi mérés kontroll méréssel volt validálva. A CEA (karcinoembrionális antigén) mérése LIA-mAT CEA KIT-tel szérumból és plazmából történt immunoluminometriás meghatározásához kifejlesztett teszt alkalmazásával. Ehhez 50µl standard, kontroll vagy betegmintát pipettáztunk a tesztcső aljára, 150 µl anti-cea tracer konjugátumot adtunk hozzá, összeráztuk. 4 óráig, inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd ezt követően a felülúszót leszívtuk és 4x2 ml desztillált vízzel vagy NaCl oldattal mostuk. A mérést luminométerben, 5 sec mérési idő alatt végeztük. Detektálási határ: 0,5 ng/ml. Referencia tartomány 95%-ban egészséges egyéneknél 3,5 ng/ml alatt van. Normál értékek: CEA: 0-4 ng/ml. A CA 19-9 detektálása a LIA-mAT CA 19-9 KIT-tel szérumból és plazmából immunoluminometriás meghatározással történt. Ennek során 200 µl mérési oldatot, puffert pipettáztunk a tesztcső aljára, 100 µl standard, kontroll vagy betegminta hozzáadása és összerázás következett. Inkubáltuk, majd 2 órát rázattuk szobahőmérsékleten, majd leszívtuk. Mostuk 3x2 ml 0,9 %-os NaCl oldattal. 300 µl anti-ca 19-9 tracer konjugátum hozzáadásával, ismét inkubáltuk, 1 óra rázás után szobahőmérsékleten és ismételt leszívás következett. Az újbóli mosást 3x2 ml 0,9 %-os NaCl oldattal, ezt követően a mérést luminométerben végeztük, a mérési idő 5 sec. Detektálási határ: 2 U/ml alatt. Referencia tartomány: 37 U/ml alatt. A CA 72-4 mérése LIA-mAT CA 72-4 KIT-tel szérumból és plazmából történt immunoluminometriás meghatározással. A mérés kivitelezésére 100 µl standard, kontrollt vagy betegmintát használtunk, melyet tesztcsövekbe pipettáztunk, majd 100 µl anti-ca 72-4 tracer konjugátumot adtunk hozzá. Inkubáltuk és 5 óra szobahőmérsékleten való rázatás után a felülúszót leszívtuk. A mosást 3x2 ml desztillált vízzel, vagy 0,9 % NaCl oldattal végeztük. A méréshez luminométert alkalmaztunk, 5 sec volt a mérési idő. Detektálási határ: 0,3 U/ml alatt. Referencia tartomány: 4 U/ml. 28

29 4. Betegek és módszerek Az AFP (alfa-foetoprotein) meghatározása LIA-mAT AFP KIT-tel szérumból immunoluminometriás teszttel történt. A teszt-eljárás során 25 µl standard, kontroll vagy betegmintát pipettáztunk a tesztcső aljára. 300 µl anti- AFP tracer konjugátum hozzáadása után inkubálás következett. 1 órán át szobahőmérsékleten síkrázógépen történt ráztuk, majd leszívtuk és mostuk 3x2 ml desztillált vízzel vagy 0,9 %-os NaCl oldattal. A mérést luminométerben végeztük. A mérési idő 5 sec. Detektálási határ: 0,5U/ml. Referencia tartomány: 6 ng/ml. A TPA (szöveti polipeptid antigén) meghatározása a LIA-mAT TPA PROLIFIGEN KIT-tel szérumból és plazmából immunoluminometriás meghatározással történt. Az eljáráshoz 100 µl standard vagy betegmintát mértünk a tesztcső aljára, 200 µl oldószert adtunk hozzá és 3 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd leszívtuk. Mosáshoz 2x2 ml NaCl oldatot használtunk. 300 µl anti-tpa tracer konjugátum hozzáadása után. A mintákat inkubáltuk 2 óra rázatással szobahőmérsékleten. A leszívás után 2x2 ml mosó oldattal történt a lemosás. A mérést luminométerrel végeztük. A mérési idő 5 sec. Detektálási határ 2 U/l alatt. Referencia tartomány: az egészséges személyek 95%-nál megfigyelt TPA koncentrációk 95 ng/ml alatt vannak. A szérum alfa-1-savanyú glycoproteint (AGP), Kremmer és mtsai által kifejlesztett ioncserélő kromatográfiával, mikro-módszerrel mértük (124). A mérés során 400 µl alvadásgátló nélkül nyert szérumból nem elegyedő fázisú oldószeres extrakciót (mintaelőkészítést) követően a szérum AGP tartalom elválasztása FPLC (Pharmacia) rendszerrel Fractogel EMD TMAE-650 (Merck Dtch.) oszlopon (5 x 0,5 cm) 25 mmol bis-tris- propán pufferrel, lineáris ph(7,5-9,5) és NaCl gradiens (0-350mM) elúcióval történt. Detektálás 280 nm. A módszer kalibrálására tisztított humán szérum AGP-t (Sigma) alkalmaztunk. A szérum (AGP) szintje mg/dl. Az 5-hydroxyindolecetsav (5-HIAA) meghatározását 24 órán át gyűjtött vizeletből kromatográfiás, spektrofotometriás módszerrel a BIOSYSTEM S.A. alapján végeztük el. Normál értéke 10,4 46,8 µmol/24 h alatt. 29