Trendek az ökotoxikológiában

Átírás

1 Trendek az ökotoxikológiában - A környezeti toxikológia jelentős fejlődésen ment keresztül az elmúlt 50 évben (Hart et al.,1945) Ökotoxikológiai tesztek és azok használhatóságai - Kialakul az első sztenderd eljárás víztoxikológiára Észak-Amerikában Gyulai István Ökológiai Tanszék - Természetes vizeink védelme előtérbe kerül - Kezdetben a laboratóriumi tesztek kis figyelmet kaptak? A multifaj tesztek egyértelmű eredményeket tudnak szolgáltatni olyan esetekben amikor az egyszintű tesztek nem megfelelőek Miért lehetett ez? Sajnos mint minden kutatásban a számos paradigma gátolta az egyértelmű fejlődések előrehaladását - Préda zsákmány kapcsolat - Versengés - Táplálkozási kapcsolatok - Holisztikus mérések 1

2 Egyszerű vizsgálatokra elterjedtek az egyváltozós (egyszerű tesztek) - Elsősorban növekedési vagy gátlási tesztek (egyedszám, biomassza, szaporodási képesség) - A multitesztek nem használhatóak a magasabb szerveződési szinteken Kritikus pontjai a multiteszteknek - Érzékenyebbek-e a toxikus hatásokkal szemben mint az egyszerű tesztek? - A laboratóriumi multitesztek reprezentálják-e természetes ökoszisztémákat? - Hogyan lehet reprodukálni a multiteszteket? - A természetes ökoszisztémák tényleg hatásmentesek? Tényleg elég a laboratóriumi tesztek ksi zavarait elfogadnunk? - Az ökoszisztémák tényleg egyenlően reagálnak a kialakult stressz helyzetekre? Egyszerű toxikológiai tesztek előnyök: olcsó, nem feltétlenül kell magasabb rendű élőlényt elpusztítani, könnyen reprodukálható, egyszerű szabályozni a körülményeket, laboratóriumban könnyen véghezvihető hátrányok: specifikusan egy dologra ad választ, legfőképp egyszerű mérgezési tünetek kimutatására alkalmasak Teszt időtartama alapján lehet: Akut rövid időtartam (24, 48 illetve 72 óra) Krónikus hosszabb időtartam Tesztfajok: Single test (egy fajt alkalmazó teszt) Szárazföldi tesztorganizmust Vízi tesztorganizmust Üledéklakó tesztorganizmust Multispecies test (több fajt alkalmazó teszt) Több fajt alkalmaz együtt 2

3 Lemna tesztek Jól használható tesztnövények? Apró békalencse (Lemna minor) és a púpos békalencse (Lemna gibba) Módszer elve: növekedés vagy gátlás megfigyelése Környezeti minták esetében Koncentráció meghatározásnál Daphnia teszt Daphnia magna teszt Kis vizibolha, az ágascsápú rákok közé tartozik. Jelentősége, hogy a nőstény 3-4 mm nagyságúra is megnő (szabad szemmel látható) Algafogyasztó, növekedésüket és szaporodásukat az algák mennyisége nagyban befolyásolja A teszt célja Daphnia magna szaporodási teljesítményével felmérni a vegyi anyagok hatását (egy krónikus teszt során, adott anyag hatására mennyi utód marad a teszt végére) A reprodukciós teljesítményt a kontroll mintához viszonyítjuk megahtározva a: LOEC és a NOEC koncentrációt. Majd ebből számoljuk az EC20 és EC50 értékeket. Az eredmények az akut toxicitási vizsgálatból (lásd OECD 202: Daphnia akut immobilizációs teszt) felhasználhatóak, hogy megfelelő koncentráció tartományt tudjunk kiválasztani a reprodukciós teszthez. 3

4 Ideális tesztalanyok és kritériumok: A vizsgálat kezdetén olyan fiatal Daphnia nőstényeket használunk, amelyek 24 óránál fiatalabbak Egészséges állományból kell származniuk A vizsgálat végén az összes élő utódot összeszámoljuk (külön az egyes szülőkre számolva). A fiatalok akiket a felnőtt egyedek hoztak létre és meghalnak a vizsgálat során ki kell zárni a számításból. A teszt végén a reprodukciós teljesítményt több módon is ki lehet fejezni (pl.: hány db élő utód jött létre naponta egy daphniára vetítve, ahol az első naptól kezdve megfigyelték az új egyedeket), de ezeket is jelenteni kell az utódok teljes száma mellett (élő szülőkre vonatkoztatva). Le kell jegyezni a szülők túlélését és az első utód megjelenéséig eltelt időt A vizsgálat akkor érvényes, ha a következő teljesítmény-kritériumok teljesülnek a kontroll mintában: - A szülők mortalitása (nőstény Daphnia) nem haladja meg a 20%-ot a vizsgálat végén - Az élő utódok átlagos száma szülőkre viszonyítva a teszt végén több mint 60 Teszt időtartama 21 nap A szülőket egyenként érdemes tartani, ml tesztoldattal (statikus teszt, Daphnia egy csoportban. Dinamikus mérésnél néha nagyobb mennyiséggel kell dolgozni (adott analitikai méréshez mérten) Ekkor ha több mint 100 ml mintával dolgozunk, több tesztorganizmusra van szükség (40 Daphnia szétosztva 4 db 10-es csoportra, vagy 20 szétosztva 4x5 Daphnia-ra Ha csoportban van tartva akkor nem lehet kifejezni az egy Daphnia által szült utódokat a teszt végén. Ebben az esetben az összes utód számát kell kifejezni az összes megmaradt szülőre a teszt végén Fény: 16 órás megvilágítási időszak Hőmérséklet: A vizsgálati közeget C-os tartományon belül javasolt tartani Levegőztetés: A vizsgálati edényeket nem szabad levegőztetni. Tesztfolyadék frissítése: A vizsgált anyag stabilitásától függ, de legalább hetente háromszor el kell végezni. Ha új Daphnia szülőket használunk, akkor 3 hetes akklimatizálódási periódus szükséges Előre meghatározott tápoldattal javasolt dolgozni, hogy ne legyen benne semmi adalékanyag (amiket nehéz mérni) Etetés: A statikus vizsgálatoknál az etetést lehetőleg naponta kell elvégezni, de legalább hetente háromszor. Az ettől való eltéréseket a jegyzőkönyvben jelezni kell. - élő algasejtek: Chlorella spirulina, Selenastrum capricornutum, Pseudokirchneriella subcapitata, Scenedesmus subspicatus A mindkét szülő által termelt utódokat lehetőleg el kell távolítani és egszámolni naponta az első szaporulat megjelenésétől, emellett a halott szülőket is meg kell számolni. A teszt során a megmaradt tojásokat és az elhalt utódok számát is fel kell jegyezni. Az oxigén koncentrációt, hőmérsékletet, keménységet és a ph-t meg kell mérni legalább hetente egyszer, egyrészt a friss és régi tesztoldatban és másrészt a kontroll mintában. Az összes utód számát egy szülő állatra vonatkozóan ki kell számítani az egyes méréseknél. Ha bármelyik párhuzamos mérésnél a szülő állat elpusztul a vizsgálat során vagy kiderül, hogy hím egyed, akkor ki kell zárni az elemzésből és értékelésből. 4

5 Guppi teszt Az elsődleges teszthal a Szivárványos guppi (Poecilia reticulata) A nőstények 4-5 cm hosszúak, általában jellegtelen szürkés színezetűek. A hímek tarkák, 3-4 cm hosszúak. Manapság már a legtöbb tenyésztörzs nőstényeinek farokúszója is tarkázott, de nem olyan élénk színű, mint a hímeké. Könnyen szaporodik, tartása könnyű, igénytelen hal Név Ajánlott fajok Latin név Ajánlott tesztelési hőmérséklet ( C) zebradánió Brachydanio rerio ,0 + 1,0 ponty féle Pimephales promelas ,0 + 1,0 ponty féle Cyprinus carpio ,0 + 1,0 rizshal Oryzias latipes ,0 + 1,0 szivárványos guppi Poecilia reticulata ,0 + 1,0 kékkopoltyús naphal Lepomis macrochirus ,0 + 1,0 szivárványos pisztráng Oncorhynchus mykiss ,0 + 1,0 A teszteléshez használt halak ajánlott teljes testhossza (cm) A halakat a vizsgálat előtt legalább 12 napig karanténba kell helyezni Célszerű 2-3 hónapos halakat használni A vizsgálatot megelőző hét napban olyan minőségű vízben kell tartani a halakat, amilyenben a teszt is zajlani fog és az alábbi feltételeknek kell teljesülni: világítás: napi órás megvilágítás hőmérséklet: az adott fajnak megfelelő oldott oxigén koncentrációja: a levegőtelítettségi érték legalább 80 %-a Érvényességi feltételek: Nem szabad 10%-nál nagyobbnak lennie a halpusztulásnak a kontrollcsoportban a kísérlet végéig. Állandó feltételeket kell fenntartani amennyire csak lehet az egész vizsgálat során, és ha szükséges, félig statikus vagy átfolyásos eljárásokat kell alkalmazni. Az oldott oxigén koncentrációjának mindvégig nagyobbnak kell lennie, mint a levegőtelítettségi érték 60%-a. A vizsgált anyag koncentrációit a kísérlet során mindvégig a kezdeti koncentráció 80%-án belüli értéken kell tartani. etetés: háromszor hetente vagy naponta, 24 órával a teszt megkezdéséig 5

6 Háromféle eljárás használható típusfüggően: A vizsgált oldat nem áramlik (az oldatok mindvégig változatlanok maradnak) Statikus vizsgálat. A vizsgált oldat áramlása nélküli vizsgálat, amelynél rendszeresen, adagonként ki kell cserélni a vizsgált oldatokat hosszabb időtartamok (pl.: 24 óra) eltelte után - Félstatikus vizsgálat Olyan toxicitásvizsgálat, amelyben a vizet állandóan cserélik a vizsgálati kamrákban - Átfolyásos vizsgálat Teszt időtartam: 96 óra, állatok száma: koncentrációnként és a kontrollban is legalább 7 egyed, ügyelni kell a megfelelő méretű akváriumokra is (stressz mentes környezet liter/cm) vagy 1 g hal/liter vizsgált koncentráció: legalább 5 olyan koncentráció esetén szükséges a vizsgálat, amelyek mértani sorozatának tényezője nem haladja meg a 2,2-et és szükséges a kontroll minta vizsgálata is világítás: órás megvilágítás naponta, hőmérséklet: a használt fajtáknak megfelelő, de minden esetben ± 1 C-on belül, oldott oxigén koncentrációja: a levegőtelítettségi érték nem kevesebb, mint 60 %-a, levegőztetés használható, ha nem okoz veszteséget a vizsgált anyag mennyiségében etetés: nincs zavarás: a halak viselkedését befolyásoló tényezőket ki kell zárni. A halakat a teszt megkezdését követő 3. és 6. órában, majd 24., 48., 72. és 96. órában meg kell vizsgálni, a pusztulásokat feljegyezni és az elpusztult halakat el kell távolítani. A halak akkor tekinthetők élettelennek, ha a farokúszó érintése nem vált ki reakciót, és nem látható semmilyen mozgás. Medaka Rizshal (Oryzias latipes) Nyilvántartást kell vezetni a látható rendellenességekről (például egyensúlyvesztés, az úszási viselkedés és a légzés változásai, pigmentáció stb.). Naponta mérni kell a ph-értéket, az oldott oxigén koncentrációt és a hőmérsékletet. 6

7 Emrióvizsgálatok Hőmérséklet 27 fok C Tenyészedény 100 ml (tisztavízzel vagy tengervízzel feltöltve) 5 embrió / tenyészet 20 szívütésig számolnak Kikelés 9 naptól egy hónapig Csíranövény tesztek Sinapis alba fehér mustár érzékeny tesztnövény, melynek növekedése gátolt, amennyiben toxikus anyaggal érintkezik. A gyökér- és szárhosszak mérése alapján becsülhető a toxikus hatás. A Felföldy-féle csíranövény-teszt elsősorban mezőgazdasági öntözővizek csírázásgátló hatásának kimutatására lett megalkotva, de más szennyezőanyagok is vizsgálhatók vele Vizsgálat menete: - Szűrőpapír belevágása a petricsészékbe (sterilizálás) - Hígítási sor készítése - 3 cm 3 oldat pipettázása - 30 mag használata - 20 fok C termosztát, teljes sötétségben - 72 óra tenyészidő 7

8 Kiértékelés Német féle módszer Kiértékelés 0 5 % igen mérgező 6 50 % mérgező 51-90% kissé mérgező % nem mérgező > 120% serkentő 0,0 9,9 % közötti értéket mutat, a minta vagy az alkalmazott hígítás a gyökérnövekedésre igen erősen gátló (igen erősen mérgező) hatású; 10,0 29,9 % közötti érték esetében a minta vagy az alkalmazott hígítás a gyökérnövekedésre erősen gátló (erősen mérgező) hatású; 30,0 59,9 % közötti érték esetében a minta vagy az alkalmazott hígítás a gyökérnövekedésre gátló (közepesen mérgező) hatású; 60,0 84,8 % közötti érték esetében a minta vagy az alkalmazott hígítás a gyökérnövekedésre gyengén gátló (gyengén mérgező) hatású; 85,0 114,9 % közötti érték esetében a minta vagy az alkalmazott hígítás a gyökérnövekedést nem befolyásoló (nem mérgező) hatású; Illetve 115 %-nál nagyobb érték esetében a Sinapis alba növekesédésére serkentő hatású - Magokat tesztelni kell EPA szabvány - 65 %-os csírázás felett tekinthetőek jónak a magvak - 72 órás tenyészidő - 25 fok C inkubátor - Magszám változó Lycopersicon esculentum (paradicsom). Cucumis sativus (uborka). Lactuca sativa (saláta). Glycine max (szójabab). Brassica oleracea (káposzta). Avena sativa (zab) Lolium perenne (angolperje). Allium cepa (vöröshagyma). Daucus carota (sárgarépa). Ajánlott növények Zea mays (kukorica). 8

9 Magyar szabavány - 90 % -os csírázás fölött - Tesztmagvak gyökérhossza mm között változik - 72 órás teszt petricsésze - 20 fok C termosztát hiányában fok C-os sötét helyiség Üledék toxikológia - Szárított homogenizált mintát használunk vagy tömegarányú oldatot készítünk - Az oldatot rázatjuk - Állni hagyjuk - Leszűrjük - Fizikai paramétereket megmérjük - Teszt végrehajtása 9

10 Felhasznált irodalom Caiirns, J. Jr. and Pratt, J. R Trends in ecotoxikology. The Science of the Total Environment. Supplement Hart, W.B., Doudoroff, P. and Greenbank, J The evaulation of teh Toxicity of Industrial Wastes, Chemicals and Other Substances to Freshwater Fishes. Waste Control Laboratory, Atlantic Refining Co., Phyladelphia, Pennsylvania. Ohayo-Mitoko, G.J.A. and Deneer J.W Lethal body burdens of four organophosphorous pesticides in the guppy (Poecilia reticulata). The Science of the Total Environment. Supplement OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS 203 Fish, Acute Toxicity Test Pomucz Anna Boglárka hal toxicitási tesz