Az oxidatív stressz, szubklinikus inflammáció és fehérje O- GlcNAciláció szerepe diabetes mellitusban, iszkémiareperfúzióban

Átírás

1 Az oxidatív stressz, szubklinikus inflammáció és fehérje O- GlcNAciláció szerepe diabetes mellitusban, iszkémiareperfúzióban és krónikus vesebetegségben Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Laczy Boglárka Témavezetők: Prof. Dr. Wittmann István Prof. Dr. John C. Chatham Programvezető: Prof. Dr. Nagy Judit Doktori Iskola Vezetője: Prof. Dr. Komoly Sámuel Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, II. sz. Belgyógyászati Klinika és Nephrologiai Centrum, Pécs University of Alabama at Birmingham, School of Medicine Division of Cardiovascular Disease, Birmingham Pécs, 2011

2 RÖVIDÍTÉSEK ACC: acetil-koenzima-karboxiláz ACE-I: angiotenzin-konvertáló-enziminhibitor ACO: aconitáz 2 ACR: albumin-kreatinin-hányados AMPK: AMP(adenozin monofoszfát)- aktivált protein kináz ARB: angiotenzin-receptor-blokkoló ASA: acetil-szalicilsav ATP: adenozin-5 -trifoszfát BMI: testtömeg index CA-N: kardiovaszkuláris autonóm neuropathia cgmp: ciklikus guanozin-monofoszfát CKD: krónikus vesebetegség CRP: C-reaktív protein CFP: cigarettafüst puffer ctni: kardiális troponin I DAPI: 4,6 diamidin-2-fenilindol EDP: vég-diasztolés nyomás enos: endoteliális nitrogén-monoxidszintáz EPO: erythropoetin FAT: zsírsav transzlokáz/transzporter; CD36 GFAT: glutamin: fruktóz-6-foszfát amidotranszferáz GFR: glomeruláris filtrációs ráta GP: glikogén foszforiláz GSH: redukált glutation H 2 O 2 : hidrogén-peroxid HBP: hexózamin-bioszintézis útvonal HIF: hipoxia indukálta transzkripciós faktor HPLC: nagy teljesítményű folyadékkromatográfia IL: interleukin I/R: iszkémia-reperfúzió KHB: Krebs-Henseleit bikarbonát LDH: laktát-dehidrogenáz LVDP: balkamrai nyomáskifejlődés MALDI-TOF/MS: mátrix-asszisztált lézer deszorpció ionizáció-repülési idő analízis/tömegspektrométer NADP: nikotinamid adenin dinukleotidfoszfát NAG-tiazolin: 1,2 didezoxi-2`-metil-α- D-glükopiranozo(2,1-d)- 2`-tiazolin NMR: mágneses mag-rezonancia NO: nitrogén-monoxid OGA: β-n-acetil-glükozidáz; O- GlcNAc-áz O-GlcNAc: O-típusú β-n-acetilglükózamin OGT: O-GlcNAc transzferáz PF: pentoxifyllin PI3-K: foszfatidil-inozitol 3-kináz PKA: camp (ciklikus adenozinmonofoszfát) függő proteinkináz PKB: proteinkináz B/Akt PKC: proteinkináz C PPS: pentozán poliszulfát PUGNAc: O-(2-acetamido-2-deoxi-dglükopiranozilidén amino-nfenilkarbamát) RAS: renin-angiotenzin-rendszer ROS: reaktív oxigén termék(ek) RPP: pulzusnyomás-munka Ser/Thr: szerin/threonin T2DM: 2-es típusú diabetes mellitus TCA: trikarbonsav TNF: tumor nekrózis faktor UDP-GlcNAc: uridin difoszfo-n-acetilglükózamin UDP-HexNAc: uridin difoszfo-n-acetilhexózamin ZDF: zucker diabetic fatty 1

3 BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK 1. Oxidatív stressz és endoteliális diszfunkció: In vitro kísérletek a cigarettafüst okozta elváltozások vizsgálatára endotélsejtben. A károsodott endotélfunkció meghatározó szereppel bír számos, fokozott ateroszklerózissal összefüggő makrovaszkuláris megbetegedésben, például ischaemiás szívbetegségben, hypertoniában, diabetes mellitusban, krónikus vesebetegségben (CKD). A mikrovaszkuláris szintű endotél-diszfunkció pedig szoros összefüggést mutat az inzulin-rezisztencia és a mikroalbuminuria kialakulásával. A dohányzás számottevő kockázati tényező a makro- és a mikroangiopátiás szövődmények progressziójában. A cigarettafüst reaktív oxigén termékek (ROS) fokozott felszabadulásán keresztül oxidatív stresszt indukál az érfali endotélsejtekben ezáltal funkcionális károsodásokhoz vezet, amelyek közül az egyik legjelentősebb az endotélfüggő vazodilatáció elégtelensége a nitrogén-monoxid (NO) csökkent hozzáférhetősége következtében; ennek hátterében többnyire csökkent enos (endoteliális nitrogén-monoxid-szintáz) enzim-aktivitás áll. Az enos aktivitásának szabályozása meglehetősen összetett, azonban jól ismert, hogy azt a poszttranszlációs foszforilációs folyamatok jelentősen befolyásolják; míg az enos Ser(1177) oldalláncán történő foszforiláció növeli, addig a Thr(495) foszforilációja csökkenti az enos-aktivitást és így az NO termelődését. Amíg mások és általunk is jól demonstrált tény, hogy a cigarettafüst endotél-diszfunkcióhoz vezet az enos - NO - cgmp/ciklikus guanozin-monofoszfát/ útvonal integritásának különböző pontokon történő megzavarásával, addig az enos poszttranszlációs módosulásaira kifejtett hatásai, valamint a résztvevő proteinkinázok szerepe nem tisztázott. Célkitűzések: (i) (ii) (iii) (iv) cigarettafüst puffer (CFP) akut hatásának vizsgálata az enos foszforilációjára és dimerizációjára; meghatározni, hogy redukált glutationnal (GSH) kivédhetők-e ezek a CFP indukálta változások; proteinkinázok közvetítő szerepének vizsgálata a CFP indukálta enos foszforilációk létrejöttében szelektív proteinkináz (PK) inhibitorok (PKA-, PI3-K (foszfatidil-inozitol 3-kináz)/PKB-, és PKC-inhibitorok) felhasználásával; PKCβII-specifikus inhibitor (ruboxistaurin) esetleges védő hatásának vizsgálata a CFP indukálta enos foszforilációk hátterében; 2

4 2. Oxidatív stressz és kardiális diszfunkció: Ex vivo kísérletek a fehérje O- GlcNAciláció kardioprotektív szerepének vizsgálatára iszkémia-reperfúzióban izolált, perfundált patkányszívben. A hexózamin-bioszintézis útvonal (HBP) krónikus aktivációját és annak következtében megnövekedett szöveti O-GlcNAc (O-típusú β-n-acetilglükózamin)- szinteket károsnak vélik a glükóztoxicitás és inzulin-rezisztencia patogenezisében. Ugyanakkor, egyre több bizonyítek szól amellett, hogy ezen anyagcsereutak akut aktivációja védő hatású számos, kardiovaszkuláris rendszert érintő károsodással szemben. A fehérjék O-GlcNAciláció-s poszttranszlációs módosulása, mint jelátviteli mechanizmus egyre elfogadottabbá válik a sejtfunkció sokrétű szabályozásában (pl. nukleáris transzport, transzláció, transzkripció, citoszkeletális reorganizáció, proteoszomális degradáció, apoptosis). Ezt a folyamatot, vagyis egyetlen O-GlcNAc molekula reverzibilis kötődését a sejtmagban és citoszolban elhelyezkedő fehérjék Ser/Thr oldalláncain két enzim szabályozza: O-GlcNAc transzferáz (OGT) az O- GlcNAc kötődését, míg a β-n-acetilglükózaminidáz (O-GlcNAc-áz, OGA) a leválasztását katalizálja. Az OGT katalitikus aktivitása igen érzékeny az UDP-GlcNAc (uridin difoszfo-n-acetil-glükózamin) sejten belüli koncentrációjára, ami a HBP végterméke. Az intracelluláris glükóz kis hányadának HBP-n keresztüli metabolizmusát és így az UDP-GlcNAc szintézisét a GFAT (L-glutamin-D-fruktóz 6- foszfát amidotranszferáz) enzim szabályozza. A glükózamin, amely a glükóz transzporter rendszeren át jut be a sejtekbe, az UDP-GlcNAc- és így az O-GlcNAcszintek gyors emelkedését idézi elő, azáltal, hogy glükózamin-6-foszfáttá foszforilálódik hexokinázok hatására, vagyis képes megkerülni a HBP sebességét meghatározó GFAT enzimet. A fehérjék O-GlcNAcilációja fokozható OGA-gátlókkal, például PUGNAc-val (O-(2-acetamido-2-deoxi-d-glükopiranozilidén amino-nfenilkarbamát) vagy NAG-tiazolin származékokkal [pl. NBt: 1,2 didezoxi-2`-propil-α-dglükopiranozo(2,1-d)- 2`-tiazolin; NAe: 1,2 dideoxi-2`-etilamino-α-dglükopiranozo(2,1-d)- 2`-tiazolin]. Több ex vivo és in vivo vizsgálatban glükózamin vagy PUGNAc adása az O- GlcNAc-szintek növelésével védőhatású volt iszkémia-reperfúziós (I/R) károsodással szemben. Azonban alacsony specificitásuk és egyéb hatásaik miatt eltérő fiziológiás hatásaik is lehetnek, amelyek befolyásolhatják eredményességüket és esetleges használhatóságukat. Közelmúltban kerültek kifejlesztésre új, nagy-szelektivitású OGA- 3

5 gátlók, a NAG-tiazolinok; például a NBt ~1500-szor specifikusabb OGA-gátló, mint a PUGNAc, vagy a NAe még hatékonyabb, mint a NBt (~30-szor). Bár egyiket sem tesztelték szervszinten I/R károsodásban. Több patológiás stresszre már ismerjük a szívben az O-GlcNAc-szintek teljes változásait, azonban keveset tudunk a sejten belüli O-GlcNAc-megoszlásról akár intakt szívben, vagy iszkémiát és I/R-t követően. Szintén nem ismertek I/R során azok az O-GlcNAc-célfehérjék, melyek képesek hozzájárulni a miokardium megőrzéséhez. Célkitűzések: (i) (ii) (iii) (iv) igazolni, hogy reperfúzió során az OGA szelektív gátlása NBt-vel és NAe-vel csökkenti az izolált szív I/R-okozta károsodását; meghatározni az iszkémia, I/R és OGA-gátlás hatását az O-GlcNAc-szintek kardiális eloszlására; meghatározni, hogy OGA-gátlással kivédhetők-e az iszkémia és I/R okozta elváltozások a miokardiális integritásban és a Z-vonal fehérjékben; iszkémia és I/R során módosult O-GlcNAc-célfehérjék identifikálása; 3. Tanulmányok a fokozott HBP és protein O-GlcNAciláció, mikro-inflammáció és oxidatív stressz patogenetikai szerepének vizsgálatára diabeteses szövődményekben és krónikus vesebetegségben Ex vivo kísérletek a fokozott HBP és a fehérje O-GlcNAciláció szívanyagcserét befolyásoló hatásainak vizsgálatára. A szív- és érrendszeri szövődmények a diabeteses betegek magas korai morbiditásának és mortalitásának vezető oka. Inzulin-rezisztencia és diabetes következtében a szívben az anyagcsere maladaptív zavara - megnövekedett zsírsavés lecsökkent glükóz-felhasználás - jön létre, ami hozzájárul a diabeteses kardiomiopátia kialakulásához. A diabetes számos szövetben (pl. vese, szív) az O-GlcNAc-szintek emelkedését idézi elő. A fokozott oxidatív stressz következtében kialakuló vaszkuláris-endoteliális diszfunkció hátterében jelentős szerepet tulajdonítanak a HBP és a fehérje O- GlcNAciláció tartós aktivációjának. A glükózaminnal serkentett HBP és O-GlcNAciláció hatására szívben is kimutatható néhány diabetesre jellemző elváltozás, azonban a metabolizmust érintő hatásokról keveset tudunk. Zsírsejtekben glükózamin a palmitát- 4

6 oxidáció növekedését idézte elő az AMPK/AMP-aktivált proteinkináz/ és ACC/acetil- KoA-karboxiláz/ O-GlcNAc függő aktivációja révén. Célkitűzések: (i) (ii) (iii) meghatározni, hogy a glükózaminnal aktivált HBP és O-GlcNAciláció a szívanyagcsere diabeteses fenotípusú változását eredményezi-e; meghatározni, hogy az AMPK, ACC vagy FAT(zsírsav transporter)/cd36 aktivációja volt-e felelős a megváltozott szubsztrát-felhasználásért; megvizsgálni, hogy a membrán asszociált FAT/CD36 szintjének növekedése lehet-e direkt O-GlcNAc módusulás következménye; 3.2. Klinikai tanulmány az anti-inflammatórikus pentoxifyllin és pentozán poliszulfát kombinációs kezelés hatékonyságának vizsgálatára diabeteses neuropathiában és albuminuriában 2-es típusú diabetes mellitusban. A diabetes mellitus késői vaszkuláris szövődményeinek hátterében számos tényező játszik szerepet, azonban az oxidatív stressz és krónikus gyulladás patogenetikai szerepe, legfőképp 2-es típusú diabetes mellitusban (T2DM) különösen nagy jelentőséggel bír. A fokozott gyulladás szoros összefüggést mutat mind a szívés érrendszeri autonóm diszfunkció, mind az albuminuria kialakulásával és progressziójával, melyek a diabeteses neuropathia és nephropathia vezető tüneteiként ismeretesek. Gyulladásos folyamatok (citokinek, növekedési faktorok, adhéziós molekulák felszaporodása) káros hatásai megváltozott vazoregulációs válaszban, fokozott vaszkuláris permeabilitásban, leukocyta-adhézióban és facilitált thrombusképződésben nyilvánulhatnak meg, ily módon a vasa nervorum vagy a glomerulusok szintjén is mikrovaszkuláris diszfunkciót okoznak. Ezen túlmenően, a kedvezőtlen hemorheológiai körülmények (pl. hypercoagulabilitás, hyperviszkozitás) és vörösvértest abnormalitások (pl. csökkent deformabilitás, -O 2 -kötő kapacitás, fokozott aggregáció) szintén rontják a mikroangiopátiát. A diabeteses neuropathia és nephropathia specifikus kezelése, többek között a multifaktoriális patomechanizmus miatt nem kivitelezhető. Újabban, néhány ígéretesnek tűnő szer, mint a pentoxifyllin (PF), vagy pentozán poliszulfát (PPS) került az érdeklődés középpontjába, melyek potenciálisan késleltethetik a diabeteses nephropathia progresszióját; azonban esetleges jótékony hatásukat neuropathiában nem vizsgálták. PF és PPS köztudottan jelentős keringésjavító, anti-inflammatórikus 5

7 és anti-proteinuriás hatásokkal bírnak, így részben tüneti, részben oki terápiás lehetőséget kínálhatnak ezen mikrovaszkuláris károsodások javításában. Célkitűzésünk volt a kombinált PF-PPS infúziós kezelés hatásának vizsgálata T2DMes betegekben: (i) (ii) a kardiovaszkuláris autonóm és perifériás szenzoros funkcióra (neuropathia vonatkozásában); a vizeletalbumin-kiválasztás mértékére (nephropathia vonatkozásában); 3.3. Klinikai tanulmány az erythropoetin-rezisztencia és az anti-inflammatórikus acetil-szalicilsav anaemiára gyakorolt hatásának vizsgálatára 2-es típusú diabetes mellitusban és krónikus vesebetegségben. T2DM-ben és CKD-ben gyakran megfigyelhető anaemia egyik legfontosabb etiológiai tényezője az erythropoetin (EPO) csökkent termelődése a peritubuláris intersticiális sejtek károsodása következtében. Ugyanakkor az EPO hatástalansága is szerepet játszhat, melynek létrejöttében a T2DM-ben és CKD-ben is fennálló fokozott oxidatív stressznek és szubklinikus gyulladásnak tulajdonítanak jelentőséget. Diabeteses nephropathiás betegekben ily módon még fokozottabb lehet az EPOrezisztencia mértéke. Az EPO elérhetőségének és az anaemia javításának céljából elterjedten alkalmazzák a hormonszubsztitúciós kezelést, azonban a gyulladáscsökkentők szérum EPO-szintekre és erythropoesisre gyakorolt hatásai nem ismeretesek. A ROS redox-szenzitív intracelluláris jelátvivő és transzkripciós folyamatokban betöltött közvetítő szerepére példa a renális EPO-szekréció HIF-1-en (hypoxia indukálta transzkripciós faktor) és hydroxil szabad gyökön keresztüli szabályozása. Lehetséges, hogy T2DM-ben és CKD-ben a ROS felszaporodása következtében zavarttá válik a HIF-1 aktivációja, ami szuppresszált EPO-szintézishez vezethet. Így feltételezhető, hogy a gyulladáscsökkentő és hydroxil gyökfogó ASA (acetil-szalicilsav) hatásos lehet az EPO-termelődés és az anaemia korrekciójában T2DM-es és CKD-s betegekben. Célkitűzések: (i) (ii) az EPO-rezisztencia vizsgálata T2DM-es és/vagy CKD-s betegekben; az ASA hatásának vizsgálata az EPO szérumszintjére és az erythropoesis markereire T2DM-es és CKD-s betegekben; 6

8 BETEGEK, ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 1) Egér endothelioma sejt-vonalból származó endotélsejteket inkubáltunk Krebs- Henseleit bikarbonát (KHB) pufferrel (Kontroll) vagy növekvő koncentrációjú (5-50%) CFP-vel különböző időtartamokig (5-30 perc) a dohányfüst koncentráció- és időfüggő akut hatásának vizsgálatára. A CFP elkészítéséhez vákuumcső-szivattyúval ellátott berendezést használtunk, amelynek segítségével a cigarettákat (Camel ) konstans vákuummal (-5 vízcm) egységes ideig (5 perc) szívattuk el, és a cigerattafüstöt 5 ml KHB pufferban nyelettük el. Antioxidáns kísérletekben KHB pufferben oldott GSH (5 mm; 15 perc) előkezeléseket használtunk. A proteinkináz útvonalak szerepének tisztázásához a következő inhibitorokat alkalmaztuk: 1) szelektív PKA-inhibitor (H-89; 10 μm); 2) szelektív PI3-K/PKB-inhibitor (LY ; 100 μm); 3) szelektív PKCinhibitor (Ro ; 1 μm); és 4) izoforma-specifikus PKCβII-inhibitor (Ruboxistaurin; 30 nm). Immunblot analízisekben meghatároztuk a P(foszfo)-Ser(1177) és P-Thr(495) enos, total enos, P-Ser(473) és total Akt, valamint a dimer enos szintjeit, majd denzitmetriás és statisztikai elemzéseket végeztünk (ANOVA-Dunnett`s posthoc teszt, párosítatlan t-teszt, Jonckheere-Terpstra teszt; SPSS 10.0, SPSS Inc.) Az alább felsorolt állatkísérletek a University of Alabama at Birmingham Helyi Állatgondozási és Alkalmazási Bizottságának (Institutional Animal Care and Use Committee) engedélyével történtek és megfeleltek a Guide for the Care and Usage of Laboratory Animals (NIH Publication No , 1996) követelményeinek. 2) Hím, nem-éheztetett Sprague-Dawley patkányszíveket ketamin altatás után izoláltunk és Langendorff-módszerrel retrograd úton perfundáltuk csak glükóz szubsztrátot tartalmazó KHB pufferrel, konstans nyomással (75 Hgmm). A szívfunkciókat nyomásmérő transzducerhez csatlakoztatott balkamrai folyadékballonon keresztül monitoroztuk, melynek felfújásával a vég-diasztolés nyomást (EDP) 5 Hgmm-en tartottuk. Az alábbi származtatott paraméterekkel határoztuk meg a szívteljesítményt: balkamrai nyomáskifejlődés (LVDP = max. szisztolés nyomás EDP), nyomásgörbe-függvény időre vetített deriváltja (± dp/dt = maximum/ minimum rate of LVDP), és pulzusnyomás munka (RPP, rate pressure product = szívfrekvencia X LVDP). Stabilizálás (30 perc) után a szívek random kerültek idő-kontroll, normoxia csoportba (Norm) vagy a négy I/R csoport egyikébe, ahol 20 perc globális iszkémiát követően a 60 perces reperfúzió ideje alatt: 1) kezelést nem (Control) vagy 2) 50 μm NBt (NBt50), 3) 100 μm NBt (NBt100), 4) 50 μm NAe (NAe) kezeléseket kaptak. Reperfúzió alatt nyomásgörbéken figyeltük a kamrai tachycardiát (VT, négy vagy több 7

9 egymásutáni ektópiás ütés) és fibrillációt (VF, gyors mechanikus aktivitás minimális LVDP mellett). A kardiális troponin I (ctni) szintjét a (reperfúzió 15., 30., 45. és 60. percében gyűjtött) koronária-effluensből mértük ELISA-val. Az ATP- és UDP-HexNAcszinteket a fagyasztott szívek perklórsavas extraktumából mértük HPLC-vel. Az O-GlcNAc, desmin és vinculin szöveti eloszlását indirekt immunofluoreszenciával detektáltuk epifluoreszcens mikroszkóppal. Iszkémia indukálta különbségek vizsgálatára egyes szíveket csak 20 perces iszkémiának tettünk ki. A paraffinba-ágyazott metszeteket O-GlcNAc- (CTD110.6), desmin-, és vinculin-ellenes elsődleges antitestekkel inkubáltuk és Alexa Fluor-konjugált másodlagos antitestekkel vizualizáltuk a sejtmagokra specifikus DAPI-val (4,6 diamidino-2-fenilindol) együtt. Az immunblot analízisekhez fagyasztott szívek homogenizátumait, teljes szöveti, valamint sejtmag-, citoszol-, membrán- és mitokondriális-frakciók lizátumait használtuk. A membránokat O-GlcNAc (CTD110.6), OGT, P-Tyr(822) és total vinculin, desmin, glikogén-foszforiláz (GP), aconitáz 2 (ACO) fehérjékre jelöltük és vizualizáltuk. Az O-GlcNAc-asszociált fehérjéket Western blottal (CTD 110.6) jelöltük, majd a Coomassieval festett gél megfelelő fehérjesávjait kimetszettük és tripszines emésztés után MALDI-TOF tömegspektrometriás detektáláshoz készítettük elő. A peptid tömegspektrumokat analízáltuk (Voyager Explorer) és összevetettük a Swiss-Prot adatbázissal (Mascot software). Szívperfúziós csoportok voltak: 1) idő-kontroll, normoxiás; 2) iszkémiás (10 perc); és 3) 10 perc iszkémia utáni reperfúziós (60 perc). A vinculin, GP és ACO fehérjék O-GlcNAc módosulását és asszociációjukat OGT-vel immunoprecipitációval vizsgáltuk. Az ACO aktivitását a NADP-redukciójához kapcsolt citrát és α-ketoglutarát átalakulási reakcióban mértük spektrofotometriásan (340 nm). Statisztikai elemzések ANOVA-Bonferroni s posthoc teszt, Pearson s korreláció, Χ 2 -teszt, párosítatlan t-teszt voltak (Prism 4.0, GraphPad Inc.). 3.1) Nem-éheztetett, hím Sprague Dawley patkányok szívét a 2. pont-ban leírtak szerint perfundáltuk standard körülmények között. A perfúziós KHB puffer tartalmazott (mm) glükózt 5,0, laktátot 1,0, piruvátot 0,1, palmitátot 0,32, glutamint 0,5 és 50 μu/ml inzulint. Az izolált szíveket random módon osztottuk a hat csoport egyikébe és perfundáltuk 60 percig normoxiásan a következő glükózamin koncentrációkkal: 1) 0 mm (n=8); 2) 0,05 mm (n=5); 3) 0,1 mm (n=8); 4) 1,0 mm (n=4); 5) 5,0 mm (n=8); és 6) 10,0 mm (n=7). A szíveket a protokoll utolsó 40 percében [U- 13 C]-palmitáttal, [3-13 C]-laktáttal és [2-13 C]-piruváttal perfundáltuk. 13 C-NMR izotopomer analízissel 8

10 határoztuk meg az egyes energiaszubsztrátok trikarbonsav (TCA) ciklusba való belépésének arányát a teljes acetil KoA-ban. 1 H-NMR spektrométerrel határoztuk meg a laktát-kiáramlás és -felvétel mértékét. ATP és UDP-HexNAc szintjét HPLC-vel mértük. Fagyasztott, porított szívekből teljes szöveti és membránfrakciót tartalmazó homogenizátumokat készítettünk. A membránokat O-GlcNAc-re (CTD110.6), valamint P-Ser(79) és total ACC, P-Thr(172) AMPK-α és total AMPK-α, illetve FAT/CD36 fehérjékre jelöltük és vizualizáltuk. A FAT/CD36 immunoprecipitációját O-GlcNAc (CTD 110.6), OGT és FAT/CD36 jelölésekkel komplettáltuk. Statisztikai elemzésekhez ANOVA-t (Dunnett`s posthoc teszt) és párosítatlan t-tesztet használtunk (Prism 4.0, GraphPad Inc). Az alább felsorolt klinikai vizsgálatok a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kara Regionális Etikai Bizottságának engedélyével és a résztvevők írásos beleegyezésével történtek. 3.2) Placebo-kontrollált tanulmányunkban T2DM-es ( 1 év tartam) és disztális szenzoros neuropathia tüneteit mutató betegek két csoportját vizsgáltuk: 1) kezelt betegek (Verum; n=77) naponta egyszer kaptak kombinált PF (100 mg, Trental ) és PPS (100 mg, SP54 ) infúziókat 5 napon át; 2) kezeletlen, kontroll egyének (Placebo; n=12) Salsol infúziókban (500 ml) részesültek. A kontroll betegek csoportja illesztett volt korra, nemre, T2DM tartamra, BMI-re, hemoglobin A 1c -re és vesefunkcióra. Az ACE-I és/vagy ARB, statin, vagy trombocita-gátló kezelésben nem volt különbség a csoportok között. A kizárási kritériumok a következők voltak: egyéb etiológiájú neuropathia, súlyos máj- és szívelégtelenség, CKD (szérum kreatinin >200 μmol/l), ritmuszavar, hypertonia (>160 Hgmm), előrehaladott retinopathia, vérzés, mozgás- és együttműködési képtelenség. A vizsgálatok a hospitalizáció első napján (terápia előtt) és az ötödik napján (terápia után) történtek. A CA-N-t (kardiovaszkuláris autonóm neuropathia) a Ewing-féle, öt standardizált reflex-teszttel vizsgáltuk, melyek a szívfrekvencia-változásokat [mélylégzés (ki/belégzési hányados), Valsalva manőver (Valsalva hányados), és felállás (30/15 hányados)] és a vérnyomás-változásokat detektálják (poszturális szisztolés-esés és a diasztolés-emelkedés handgrip-teszt során). Az egyes teszteket és azok összesített eredményét (autonóm score), életkorfüggő kategóriákban is megadva, EKG-hoz csatlakoztatott software (Innobase 3.1) segítségével értékeltük. Vibrációérzést az alsó végtagokon 128 Hz-es Riedel-Seiffer kalibrált hangvillával mértük. Albuminuria mérése (nefelometriásan) egyszeri vizeletmintából történt és albumin/kreatinin hányadost (ACR) számoltunk. Statisztikai 9

11 analízishez nem-paraméteres (Wilcoxon, Mann Whitney U) és paraméteres (párosítatlan- és párosított-t) teszteket, Χ 2 -tesztet, Spearman s korrelációt használtunk (SPSS 10.0, SPSS Inc.). 3.3) Az EPO-rezisztenciát keresztmetszeti tanulmányban vizsgáltuk négy, azonos szérum EPO-szinttel bíró csoport összehasonlításával: 1) T2DM-es betegek normális glomeruláris funkcióval (szérum kreatinin: μmol/l és GFR: ml/perc) [DM; n=15]; 2) T2DM-es betegek nephropathiával (DM+CKD; n=15); 3) nemdiabeteses CKD-s betegek (CKD; n=15); 4) egészséges, életkorban és nemben illesztett egyének (KONTR; n=10). A DM és a DM+CKD csoport nem különbözött a szénhidrátháztartás tekintetében (hemoglobin A 1c, fruktózamin, plazma glükóz). Nem volt különbség a szérumkreatinin- és GFR-értékekben a DM+CKD és a CKD, illetve a KONTR és a DM csoportok között. A CKD csoportban szerepelt hypertenzív nephropathia (n=9), krónikus pyelonephritis (n=3), analgetikum nephropathia (n=1), krónikus glomerulonephritis (n=1), policisztás vesebetegség (n=1). A malignitásban, autoimmun-betegségben és hiányállapotban szenvedő anaemiás betegeket kizártuk. Az intervenciós fázisban alacsony EPO-szintekkel bíró anaemiás betegek (DM: n=3; DM+CKD: n=4; CKD: n=3) per os 1 gram ASA-t (Aspirin ) kaptak. Kizárási kritériumok voltak: dohányzás, hyperaciditás, fekélybetegség, gasztrointesztinális vérzés, malignitás, krónikus tüdőbetegség. Az éhomi vérvételek az ASA adása előtt és után 4, 8, 24, és 48 óra elteltével történtek. A szérum EPO, reticulocyta-szám és -arány, vörösvértest-szám, hematocrit, hemoglobin, és az LDH meghatározása rutin laboratóriumi módszerrel történt. Statisztikai elemzésekhez ANOVA-t (Bonferroni`s posthoc teszt), párosítatlan- és párosított t-tesztet, Χ 2 -tesztet, Pearson`s korrelációt használtunk (SPSS 10.0, SPSS Inc.). EREDMÉNYEK 1. (i) A CFP koncentráció- (p<0,05) és idő-függő módon (p<0,05) növelte mind a P- Ser(1177)-, mind a P-Thr(495)-eNOS szintjét a kezeletlen kontroll-sejtekhez képest; a növekedés maximuma 50%-os CFP esetén volt megfigyelhető 30 perces kezelés után. A P-Thr(495)-eNOS szintje szignifikánsan magasabb volt minden vizsgált CFPkoncentráció és kezelési időtartam esetén (p<0,05 vs. P-Ser(1177)). A CFP-kezelések koncentráció- (p<0,05) és idő-függő módon (p<0,05) vezettek a homodimer enos felbomlásához, amit a szignifikánsan csökkent dimer/monomer enos hányados értékek jeleztek. 10

12 (ii) GSH jelentősen csökentette a CFP hatására megnövekedett P-Ser(1177)- és P-Thr(495)-eNOS szintjét a GSH-kezeletlen sejtekhez viszonyítva (p<0,05). Az enos foszforilációjában bekövetkezett csökkenés kifejezettebb (p<0,05) volt a Thr(495)- oldalláncon (~45%), mint a Ser(1177) helyen (~20%). GSH kivédte a homodimer enos disszociációját (p<0,05) és a megtartott dimer/monomer enos arányban nem volt különbség a CFP-hatás maximumán (50%, 20 perc) a CFP-kezeletlen kontroll sejtekhez képest (NS). (iii) A CFP koncentráció- (p<0,05) és időfüggően (p<0,05) gátolta a PKB/Aktfoszforilációját a Ser(473) helyen. A CFP-kezeléshez képest a szelektív PI3-K/Aktinhibitor (LY ) tovább növelte a P-Ser(1177)-eNOS szintjét (p<0,05) és nem befolyásolta a P-Thr(495)-eNOS-szinteket (NS). Szelektív PKA-inhibitorral (H-89) nem találtunk változást a CFP hatására bekövetkező enos foszforilációkban sem a Thr(495)-, sem a Ser(1177)-oldalláncon (NS). Szelektív PKC-inhibitor (Ro ) szignifikánsan csökkentette a P-Thr(495)-eNOS szintjét minden vizsgált CFPkoncentráció esetén (10%, 20%, 50%; p<0,05), és növelte a P-Ser(1177)-eNOS szintjét 50%-os CFP esetén (p<0,05). (iv) Izoforma specifikus PKCβII-inhibitor (ruboxistaurin) szignifikánsan csökkentette P-Thr(495)-eNOS-szinteket függetlenül a CFP-kezelések koncentrációjától (p<0,05) és növelte a P-Ser(1177)-eNOS szintjét 50%-os CFP esetén (p<0,05). Ruboxistaurin szignifikánsan növelte a P-Ser(1177)-eNOS/P-Thr(495)-eNOS arányát koncentrációfüggő módon (10 és 20% CFP: p<0,05; 50% CFP: p<0,001). 2. (i) I/R-szívekben a szívfunkciók (LVDP, ± dp/dt, RPP), UDP-HexNAc- és ATPszintek jelentős csökkenést, míg a ctni-szintek növekedést mutattak (p<0,05 vs. Norm); mindez a kardiális O-GlcNAc-szintek ~50%-os csökkenésével járt (p<0,05 vs. Norm). A kiindulási, I/R előtti szívfunkciókban nem volt különbség a reperfúzió során kezeletlen (Control) és kezelt NBt50, NBt100, NAe csoportok között. Az RPP, LVDP és max dp/dt funkciók visszatérése reperfúzió alatt jobb volt a NBt100 és NAe csoportokban (p<0,05 vs. Control); ez a NAe-szívekben 5 perc után és a reperfúzió ideje alatt mindvégig látható volt. A reperfúzió végén az RPP, LVDP és ± dp/dt értékei magasabbak voltak a NBt100- és NAe-szívekben (p<0,05 vs.control), és magasabbak voltak a NAe-szívekben mind a NBt50, mind a NBt100 csoporthoz képest (p<0,05). NBt100- és NAe-szívekben jelentősen csökkent a ctni szintje (p<0,05 vs. Control), és a NAe-szívek ctni kibocsátása alacsonyabb volt mind a NBt50, mind a NBt100 csoporthoz viszonyítva (p<0,05). Reperfúziós VT és/vagy VF incidenciája 86% volt a 11

13 kezeletlen Control szívekben, 14% a NBt50-szívekben, és nem fordult elő sem a NBt100, sem a NAe csoportban (p<0,05). Az UDP-HexNAc- és ATP-szintekben nem volt különbség az I/R csoportok között. A NAG-tiazolinok minden kezelt csoportban (NBt50, NBt100 and NAe) növelték az O-GlcNAc szintjét (p<0,001 vs. Control). Az O- GlcNAciláció magasabb volt a NBt100 csoportban (p<0,05 vs. NBt50), és magasabb volt NAe-szívekben mind a NBt50, mind a NBt100 csoporthoz képest (p<0,05). Szignifikáns korrelációt találtunk az O-GlcNAc és az RPP (R 2 = 0,82; p<0,05), a max dp/dt (R 2 = 0,77; p<0,05) és a ctni (R 2 = 0,65; p<0,05), valamint az RPP és a ctni (R 2 = 0,83; p<0,05) között. (ii) Normoxiás szívekben az O-GlcNAc intenzív immunfluoreszcenciát mutatott a kardiomiociták sejtmagjában, a citoszolban pedig egyértelmű kereszt-csíkozott mintázat látszott. Az iszkémia alig volt hatással az O-GlcNAc festődésére, változatlan maradt a citoszolban a csíkozott elrendeződés is, azonban prominens változásokhoz vezetett a nukleáris O-GlcNAc eloszlásában (punktátumok és egyébként O-GlcNAcnegatív sejtmagok perinukleáris festődésű megjelenésével). Az I/R-szívekben az O- GlcNAc fluoreszcenciája lecsökkent mind a citoszolban, mind a sejtmagban, és a csíkozott mintázat jelentős vesztését láttuk, a nukleáris O-GlcNAc-festődésbeli eltérések, hasonlóan az iszkémiás szívekhez, itt is szembetűnőek voltak. Az NBt50- perfúzió az O-GlcNAc fluoreszcenciáját fokozta, a citoszolban megőrizte az O-GlcNAc kereszt-csíkozott mintázatát a kezeletlen I/R-szívekhez képest, azonban a sejtmag O- GlcNAc festődése gyenge maradt, valamint a punktátumok és perinukleáris O- GlcNAc-festődések továbbra is jelen voltak. Immunblot vizsgálatokban Az I/R az O- GlcNAc-szintekben ~50%-os csökkenést eredményezett mind a sejtmag, mind a citoszol frakcióban (p<0,05 vs. Norm). Az NBt50-perfúzió növelte az O-GlcNAc szintjét a citoszolban (p<0,05 vs. Control), de a sejtmag O-GlcNAc szintjét nem változtatta (NS). Az NBt100 és a NAe mindkét frakcióban az O-GlcNAc-szintek növekedését eredményezte (p<0,05 vs. Control), azonban a nukleáris O-GlcNAc-szintek növekedése kisebb mértékű volt (p<0,05 vs. Citoszolikus). Az I/R az OGT szintjét erősen csökkentette mind a sejtmagban, mind a citoszolikus frakcióban (p<0,05 vs. Norm). Az NBt50-, NBt100- és NAe-perfúziók csökkentették az OGT-vesztést a citoszolfrakcióban (p<0,05 vs. Control) de nem befolyásolták a sejtmagfrakcióban (NS). A citoszolban észlelt nagy molekulasúlyú ( kda) OGT sávok intenzitásának I/R-okozta növekedését is mérsékelte az NBt50-, NBt100- és NAeperfúzió (p<0,05 vs. Control). 12

14 (iii) Azt találtuk, hogy az O-GlcNAc co-lokalizálódik desminnel és vinculinnal, amelyek a Z-vonalat alkotó citoszkeletális fehérjék közé tartoznak, megerősítvén ezzel, hogy kardiomiocitákban a Z-vonalaknak megfelelő régiók igen gazdagok O- GlcNAc-asszociált fehérjékben. Iszkémia nem okozott szembetűnő változást a desmin, vagy a vinculin fluoreszcenciájában. Az I/R-szívekben a desmin-fluoreszcencia kifejezett csökkenését és a Z-vonalaktól való diszrupcióját láttuk, míg vinculin festődése és intenzitása viszonylag változatlan maradt. Az NBt50-szívekben a szerkezeti szétesesés mértéke nagymértékben csökkent, a desmin és a vinculin csíkozott mintázatú rendezettsége, illetve co-lokalizációjuk O-GlcNAc-val megtartott maradt. Immunblot vizsgálatokban, az I/R a desmin szintjében erős csökkenést okozott, főként a membránfrakcióban (>50%-kal). Az NBt50-, NBt100- és NAe-perfúzió a desmin-vesztést kivédte (p<0,05 vs. Control). A total vinculin szintjében egyik csoportban sem volt szignifikáns változás, azonban az NBt50-, NBt100- és NAeperfúzió megakadályozta a vinculin Tyr(822)-foszforilációjának I/R-okozta növekedését a teljes szöveti lizátumban és a membránfrakcióban is (p<0,05 vs. Control). (iv) Iszkémia (10 perc) növelte az O-GlcNAc és az UDP-HexNAc szintjét (p<0,05 vs. Normoxia), míg 60 perces reperfúzió mindkettőt lecsökkentette (p<0,05 vs. Ischemia). Az ATP csökkent az ischaemiával (p<0,05 vs. Normoxia) és szintje nem állt vissza a reperfúzió után. A MALDI-TOF, amivel olyan fehérjecsoportokat analizáltunk, amelyek iszkémia és/vagy reperfúzió során emelkedett vagy csökkent O-GlcNAcimmunreaktivitást mutattak, három fehérjére utalt. Az iszkémiában növekvő és a reperfúzióval csökkenő O-GlcNAc-szinteket mutató fehérjesávban identifikált két fehérje a GP (glikogén-foszforiláz b; 97 kda) és az ACO (aconitáz 2; 85 kda) volt. A harmadik fehérjéhez (vinculin; 125 kda) tartozó sávban csak reperfúzióban láttunk O- GlcNAc-emelkedést iszkémiához és normoxiához viszonyítva is. A vinculin, a GP és az ACO összfehérje szintjében nem volt különbség az iszkémiás vagy reperfúziósszívekben. Immunprecipitációval mindhárom fehérje pozitivitást adott anti-o-glcnac antitesttel és a stressz kondíciónak megfelelő változásokat mutatták (vinculin reperfúzió utáni O-GlcNAc fokozódását; a GP és az ACO O-GlcNAc fokozódását iszkémiában és csökkenését reperfúzióban). Az NBt100 és a NAe kivédte a vinculin, GP és ACO fehérjék O-GlcNAcilációjának I/R-okozta csökkenését úgy, hogy nem volt különbség (stressztől és kezelésektől függetlenül) a fehérjék összmennyiségében a szövetlizátumokban, illetve immunprecipitáció után. β-n-acetil-glükózaminnal történő inkubáció az anti-o-glcnac antitest kötődésének teljes fokú gátlását okozta. Vinculin, 13

15 GP és ACO co-immunprecipitálódott OGT-vel. Az NBt100 és a NAe kivédte a mitokondriális ACO és OGT szintjének és az ACO aktivitásának I/R-okozta csökkenését (p<0,05 vs. Control) (i) A glükózamin-perfúziók (0,05, 0,1, 1,0, 5,0 és 10,0 mm) nem voltak hatással sem a szívfunkcióra, sem az ATP-szintekre (NS vs. 0 mm). A glükózamin dózisfüggő módon emelte mind az UDP-GlcNAc, mind az O-GlcNAc szintjét (p<0,05 vs. 0 mm). Már 0,1 mm glükózamin szignifikánsan növelte (40-50%-kal) az UDP-GlcNAc és O- GlcNAc szintjét (p<0,05 vs. 0 mm). A glükózamin minden koncentrációban szignifikánsan növelte a palmitát oxidációját (p<0,05 vs. 0 mm) és egyidejűleg a teljes szénhidrát-oxidációban csökkenéshez vezetett (p<0,05 vs. 0 mm). A legnagyobb mértékű változást 0,1 mm glükózamin mellett láttuk, ahol a palmitát-oxidáció növekedését (46±4 és 67±2) csökkent laktát-oxidáció (30±3 és 14±1) és csökkent piruvát-oxidáció (8±2 és 3±1) kísérte (p<0,05 vs. 0 mm). Míg magasabb glükózamin koncentrációk érdemben nem befolyásolták a szubsztrát-felhasználást, az UDP- GlcNAc- és O-GlcNAc-szintek további emelkedést mutattak. A legnagyobb (2-szeres) növekedést 1 mm glükózamin mellett láttuk, amit az 5,0 és 10,0 mm glükózamin koncentrácók már nem fokoztak tovább. A glükóz oxidációja nem változott a glükózamin-perfúziók hatására egyik koncentrációnál sem (NS vs. 0 mm). A laktátoxidációban észlelt 2-szeres csökkenésnek megfelelően az exogén laktátfelvétel mértéke hozzávetőlegesen a felére csökkent 0,1 mm glükózamin koncentrációnál (p<0,05 vs. 0 mm), míg 0,1 mm glükózamin nem volt hatással a glikolítikus laktátkibocsátás mértékére. (ii) Glükózamin a szívben nem befolyásolta sem az AMPK, sem az ACC foszforilációját, még 0,1 mm glükózamin esetén sem, ahol a palmitát-oxidáció fokozódását láttuk. Ezzel szemben glükózamin (0,1, 1,0, 5,0 és 10,0 mm) dózisfüggő módon növelte a membrán asszociált FAT/CD36 szintjét (p<0,05 vs. 0 mm). (iii) A FAT/CD36 fehérjét immunprecipitáltuk olyan patkányszívek teljes szöveti és membránfrakciós lizátumaiban, ahol az O-GlcNAcilációt közel 3-szorosára növeltük glükózamin és NBt (OGA-gátló) együttes adásával 60 perces normoxiás perfúzió során. Nemcsak a FAT/CD36 fehérje O-GlcNAc-módosulását találtuk, ami különösen a membránfrakcióban volt nyilvánvaló, hanem annak OGT-vel való asszociációját is (i) Az autonóm score korrelációt mutatott a T2DM-tartammal (r=0,270, p<0,05). A vibrációs küszöbérték fordított összefüggést mutatott a fruktózamin szintjével (r= - 14

16 0,317, p<0,05) és az autonóm score-val (r= -0,195, p<0,05), viszont a hemoglobin A 1c - vel (r= -0,179, p=0,172), vagy a T2DM-tartammal (r= -0,027, p=0,330) nem korrelált. A PF-PPS infúziókat a betegek jól tolerálták, káros mellékhatást vagy infúziós szövődményt nem észleltünk. A PF-PPS-kezelés csökentette az autonóm score-t a Verum csoportban (3,8±0,2 és 2,8±0,2; p<0,001). A PF-PPS után jelentősen csökkent azoknak a betegeknek a száma, akik terápia előtt enyhe (n=36), mérsékelt (n=37), vagy kifejezett (n=3) károsodást mutattak, és az autonóm score normalizálódott (károsodás nélküli kategória) 20 beteg esetén (p<0,001). A PF-PPS javította a mélylégzési hányadost a Verum csoportban (13,9±1,5 és 18,2±1,7; p<0,001). Azoknak a betegeknek a száma, akik terápia előtt kóros mélylégzési tesztet mutattak (n=47) jelentősen (23,3%-kal) csökkent a PF-PPS-infúziók után (n=29) (p<0,001). A PF-PPS növelte a diasztolés vérnyomás-emelkedést a handgrip teszt során a Verum csoportban (10±1 és 14±1 (Hgmm); p<0,001). Azoknak a betegeknek a száma, akiknek terápia előtt kóros volt a handgrip tesztre adott válaszuk (n=48) jelentősen (29,9%-kal) csökkent a PF-PPS infúziók után (n=25) (p<0,001). A PF-PPS-kezelés nem befolyásolta az egyéb standard reflex-teszt (Valsalva, 30/15 hányados, poszturális vérnyomás-esés) eredményét. A Placebo csoportban ál-infúziókat követően nem volt változás egyik autonóm teszt eredményében sem. A betegcsoportokban nem volt különbség a kóros reflexeket mutató betegek arányában infúziók adása előtt [(Verum/Placebo) mélylégzési hányados: 47/9; Valsalva hányados: 5/1; 30/15 hányados: 1/0; poszturális hypotenzió: 9/3; handgrip teszt: 48/4]. Szintén nem volt különbség az infúziók előtti (pe) és utáni (pu) mélylégzési hányados (pe=0,543; pu=0,063), Valsalva hányados (pe=0,805; pu=0,227), 30/15 hányados (pe=0,339; pu=0,718), poszturális hypotenzió (pe=0,199; pu=0,052), diasztolés vérnyomás-emelkedés (pe=0,227; pu=0,087) értékeiben a két betegcsoport között. Amíg az infúziók előtti autonóm score értékben nem volt különbség a Verum és Placebo csoportok között (3,8±0,2 és 3,9±0,5; pe=0,673), addig infúziók után az alacsonyabb volt a Verum csoportban (2,8±0,2 és 4,5±0,5; pu<0,001 vs. Placebo). A PF-PPS növelte a vibrációs küszöbértéket a Verum csoportban (10,5±0,4 és 11,9±0,4; p<0,001), míg a Placebo csoportban nem változott (11,6±1,2 és 10,7±1,2) ál-infúziók után. A betegcsoportok között nem volt különbség sem a kiindulási, sem az infúziók utáni, egyik alsó végtagon mért értékekben sem (jobb: pe=0,157, pu=0,571; bal: pe=0,272, pu=0,671). 15

17 (ii) A betegek többsége normalbuminuriásnak bizonyult a Verum (n=47; 70%) és a Placebo csoportban (n=9; 82%) is. Az ACR (mg/mm) értéke nem változott a PF-PPSinfúziók után a Verum csoportban (3,5±1,4 és 4,3±1,3; p=0,364), sem a Placebo csoportban az ál-infúziók után (6,39±4,71 és 9,34±8,22; p=0,436). A betegcsoportok ACR értékei nem különböztek az infúziók előtt (pe=0,449) vagy után (pu=0,278) (i) Vizsgálati csoportok között (DM, DM+CKD, CKD, és KONTR) nem volt különbség az EPO szintjében, nemben, életkorban, lipidekben, vérnyomásértékekben. Nem volt különbség a vesefunkció-romlás mértékében a DM+CKD és CKD csoportok között (kreatinin: p=0,795; GFR: p=0,820), illetve a szénhidrát-háztartásban a DM és DM+CKD csoportok között (fruktózamin: p=0,797; hemoglobin A 1c : p=0,298). A T2DM időtartama hosszabb volt a DM+CKD csoportban a DM csoporthoz képest (20±3 és 13±2 év, p<0,05). Az ACE-I-kezelések aránya nem tért el a beteg-csoportokban. Azonos szérum-epo-szintek mellett, a hematocrit- és hemoglobin-értékek alacsonyabbak voltak a DM, DM+CKD, és CKD csoportokban (p<0,05 vs. KONTR). A DM+CKD betegekben találtuk a legalacsonyabb hematocrit- és hemoglobin-értékeket, amelyek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a szénhidrát-háztartásban illesztett DM betegekhez képest (p<0,05), és az azonos vese-károsodással bíró DM+CKD betegekhez képest is (p<0,05). A vörösvértest-tulajdonságok normál tartományban voltak és nem külünböztek a csoportokban. Korrelációs elemzésekkel egyik csoportban sem találtunk összefüggést az EPO-szintek és a hematocrit [DM: R 2 =0,025, p=0,575; DM+CKD: R 2 =0,106, p=0,236; CKD: R 2 =0,000, p=0,949], illetve a hemoglobin között [DM: R 2 =0,000, p=0,956; DM+CKD: R 2 =0,100, p=0,316; CKD: R 2 =0,000, p=0,960]. A korrekciók során (kor, kreatinin, hemoglobin A 1c, fruktózamin, szérum glükóz, total és HDL-koleszterin, vérnyomás változókat vizsgálva) csak a DM csoportban találtunk összefüggést az EPO-szintek és a hematocrit között BMI-re (R 2 =0,410, p<0,05) és trigliceridre (R 2 =0,285, p<0,05) történt korrekciók után. (ii) Alacsony szérum EPO-jú anaemiás betegekben a nagy-dózisban adott ASA 59%-kal növelte az EPO szintjét (7,71±5,41 és 12,26±8,73), 33%-kal a reticulocytaszámot (42±12 és 56±16), 14%-kal a reticulocyta-arányt (0,81±0,49 és 0,92±0,68), 7%-kal a vörösvértest-számot (3,75±0,26 és 4,01±0,29), 6%-kal a hemoglobint (111,1±7,6 és 118,3±8,6) és 8%-kal a hematocritot (33,0±2,6 és 35,8±2,6) (p<0,01). Az ASA ugyanakkor 12%-kal csökentette az LDH-t (319±36 és 280±35; p<0,01). 16

18 MEGBESZÉLÉS 1. (i) Kimutattuk, hogy a rövid idejű cigarettafüst-kezelés endotélsejtekben növeli az enos foszforilációs módosulását és annak gátló irányba történő eltolódását okozza, továbbá fokozza a katalitikusan aktív dimer enos szétesését. Eredményeink alátámasztják azt a tényt, hogy a cigarettafüst csökkent enos aktivitáshoz, ezáltal az NO csökkent biológiai hozzáférhetőségéhez vezet, amely fontos tényező a makro- és mikrovaszkuláris betegségek progressziójában. A CFP növelte az enos-foszforilációt mind a serkentő Ser(1177)-, mind a gátló Thr(495)-helyen. Ez ellentmond annak a szemléletnek, amely szerint ezeken a reziduumokon egyidőben reciprok jellegű foszforiláció-defoszforiláció zajlik. Másrészt elképzelhető, hogy cigarettafüst hatására egymástól független upstream szabályozó tényezők aktiválódnak és vezetnek egyidejűleg mindkét enos-oldallánc megnövekedett foszforilációjához. (ii) Kimutattuk, hogy GSH (potens szabadgyök- és aldehid-fogó antioxidáns) kivédi az enos cigerattafüst indukálta inaktiváló módosulásait, megelőzvén egyrészt annak gátló foszforilációját, másrészt homodimer formájának disszociációját egy inaktív állapotú, főként szuperoxid-gyököt termelő monomer formává. Ezáltal a GSH jótékonynak tűnik az enos-aktivitás és NO-termelődés megőrzésében, feltehetően az aldehideket semlegesítő hatása réven, melyek különösen nagy mennyiségben (főként a formaldehid) vannak jelen a CFP-ben (Mazák és mtsai.). A CFP kiváltotta oxidáns stressz enos-foszforilációkra gyakorolt hatásában felvetődik továbbá az aldehidek közvetítő szerepe, és az is, hogy a homodimer enos konzerválásában fontos tényező az enos-tiolcsoportok oxidatív károsodásának kivédése. (iii) Számos proteinkináz szerepe jól ismert az enos-aktivitás különböző hatásokra bekövetkező szabályozásában. Például fiziológiás körülmények között (nyíróerők, bradykinin) a PKB/Akt és a PKA is képes az enos-t aktiválni Ser(1177)- foszforilációval, így az NO-termelést fokozni. A CFP koncentráció- és időfüggően okozta a PKB/Akt inaktivációját, továbbá CFP hatására a P-Ser(473)-Akt és a P- Ser(1177)-eNOS szintjének ellentétes változását láttuk, és az utóbbi további növekedést mutatott szelektív PI3-K-inhibitor kezelés során. Így megállapítható, hogy PI3-K/PKB/Akt jelátviteli út nem lehet felelős a CFP hatására létrejött Ser(1177)- foszforilációért. Szelektív PKA-inhibitor (H-89) nem befolyásolta a CFP hatására bekövetkező enos-foszforilációt egyik oldalláncon sem, így a CFP enosfoszforilációra gyakorolt hatása szintén függetlennek bizonyult a PKA jelátviteli úttól. 17

19 (iv) A PKC jelátviteli út, amely szerteágazó celluláris hatások közvetítésében vesz részt, szintén szerepet játszik az enos-aktivitás szabályozásában a Thr(495)- foszforiláció fenntartásával, melyet ezidáig csak nem-stimulált endotélsejtekben mutattak ki. A PKC, különösen a PKCβII altípus aktivációjának szerepet tulajdonítanak a diabetes vaszkuláris-endoteliális diszfunkciót előidéző hatásának mediálásában, míg ruboxistaurin (PKCßII-inhibitor) megelőzte ezeknek a szövődményeknek a kialakulását és megőrizte az endotél-függő vazodilatációt. A PKC-út gátlásával (Ro ) azt találtuk, hogy jelentősen csökkent a CFP hatására megnövekedett Thr(495)- foszforiláció és ruboxistaurin, hasonlóan a szelektív PKC-inhibitor hatásához, koncentrációfüggő módon csökkentette a P-Thr(495)-eNOS szintjét. Elmondható, hogy a PKC-, azon belül is a PKCβII-aktivációnak kulcsszerepe lehet a cigarettafüst hatására létrejövő enos-foszforilációk közvetítésében, valószínűbb, hogy a gátló Thr(495)-foszforiláció fokozásán, mint a serkentő Ser(1177)-foszforiláció növelésén keresztül. A PKCßII gátlása ruboxistaurinnal ígéretes stratégiának tűnik a cigarettafüst okozta káros hatások kivédésében. 2. (i) Kimutattuk, hogy a NAG-tiazolinok, melyek nagyobb szelektivitású OGA-gátlók, mint a PUGNAc, szintén védőhatásúak az izolált szív I/R károsodásával szemben. Reperfúzió során javították a szív teljesítményét, csökkentették pro-arritmiás aktivitását és a szöveti károsodást. A NAG-tiazolinok dózisfüggő módon növelték a szívben az O-GlcNAc szintjét és a protekció mértéke arányban állt a szerek O- GlcNAc-szintet fokozó hatásával (NAe > NBt azonos koncentrációknál). A szívfunkciók javulása és a szöveti károsodás csökkenése nem a bioenergetikai állapot javulásának vagy a HBP fokozódásának a következtében jött létre, mivel a NAG-tiazolinok nem befolyásolták az ATP- és UDP-HexNAc-szinteket. Szignifikáns korreláció az O- GlcNAc-szintek növekedése és a szívteljesítmény javulása, illetve a szöveti károsodás csökkenése között szintén arra utal, hogy az OGA-gátlás mértéke szoros összefüggést mutat a protekció mértékével, így elmondható, hogy a NAG-tiazolinok kardioprotektív hatása a megnövekedett fehérje O-GlcNAciláción keresztül érvényesült. Mindezt a reperfúzió ideje alatt történő alkalmazással láttuk és már 5 perc után bekövetkezett a szívfunkciók javulása, aminek potenciálisan olyan helyzetekben lehet klinikai jelentősége, ahol a nagyon korai revaszkularizációs kezelési eljárások praktikusak. Az O-GlcNAc fokozása NAG-tiazolinokkal hasznos kardioprotektív stratégiának tűnik, jóllehet esetleges használhatóságuk I/R károsodással szemben in vivo még tisztázandó. 18

20 (ii) Immunhisztokémiával kimutattuk, hogy normoxiás szívekben magasabb O- GlcNAc-szint található a kardiomiociták sejtmagjában, hasonlóan egyéb sejttípusokhoz; valamint a citoszolban a Z-vonalaknak megfelelően, kereszt-csíkozott elrendeződésben. Elsőként demonstráltuk, hogy a Z-vonalbeli fehérjék gazdagok O- GlcNAc módosulásban; figyelembe véve a Z-fehérjék fontosságát a hemodinamikai és mechanikai ingerek közvetítésében és így a kardiomiocita-funkciók szabályozásában, a kardioprotektív hatásokon túlmenően a fehérje O-GlcNAciláció még nagyobb jelentőséggel bírhat a szívben. Iszkémia és I/R a sejtmagokon belül az O-GlcNAc csökkenését eredményezte annak pontszerű és perinukleáris halmozódása mellett, tehát az iszkémia és I/R okozta hatások egyik következménye a citoszolban és sejtmagban található kardiális O-GlcNAc-szintek redisztribúciója. Míg az OGA-gátlás megakadályozta az I/R során bekövetkező O-GlcNAc-vesztést és a szerkezetbeli károsodást (szétroncsolt myofibrillaris és kereszt-csíkozott O-GlcNAc struktúra), addig az iszkémia és I/R indukálta nukleáris O-GlcNAciláció csökkenésére (i.e. O-GlcNAc negatív sejtmagok) nem volt hatással. Immunblot vizsgálatok szintén azt mutatták, hogy az NBt- és a NAe-szívekben a sejtmag O-GlcNAc szintjének emelkedése elmaradt a citoszol szintjéhez képest, ami persze azt is tükrözheti, hogy az OGA túlnyomórészt (~90%) a citoszolban lokalizálódik. (iii) Kimutattuk az O-GlcNAc co-lokalizációját két Z-vonal asszociált citoszkeletális fehérjével, desminnel és vinculinnal. Kimutattuk, hogy az OGA-gátlás kivédte az I/R okozta desminvesztést és annak disszociációját a Z-vonalaktól. I/R során az NBt és a NAe nagyban megakadályozta a desmin szintjének csökkenését teljes és főként a membránfrakciós szívlizátumokban. A desminnek fontos szerepe van a szerkezeti egység és kontraktilitás megőrzésében, ily módon reperfúzió során az OGA-gátlók desmin megőrzésére kifejtett hatása hozzájárulhat a szívfunkciók javulásához és a szöveti károsodás csökkenéséhez. Míg korábbi vizsgálatokban leírták a vinculin csökkenését és/vagy megváltozott szubcelluláris lokalizációját I/R során, addig a vinculin szintjében nem találtunk változást, csak néhány apróbb eltérést a fluoreszcenciájában (diszlokált Z-vonalak, nagyobb intenzitás az interkalált lemezekben), és a Z-vonalakhoz és az interkalált lemezekhez való viszonya is relatíve sértetlen maradt. Ezzel szemben azt találtuk, hogy az OGA-gátlás mérsékelte a vinculin I/R során megnövekedett Tyr(822) foszforilációját. A vinculin foszforilációjának fiziológiás következményeiről a szívben keveset tudunk. A fokális adhéziós komplexek és az interakciós fehérjék (pl. vinculin) szétesése súlyosbítja a szívizomsejtek I/R 19

21 károsodását. Elképzelhető, hogy OGA-gátlók hatására a vinculin-foszforiláció csökkenése I/R során szerepet játszthat a fokális adhéziós komplexek fenntartásában. A vinculinról sikerült kimutatnunk, hogy OGT-hez asszociáltan fordul elő és O- GlcNAcilálódik. A továbbiakban tisztázandó, hogy a vinculin O- GlcNAciláció/foszforiláció-ja miként befolyásolja funkcionálisan a szív I/R válaszát. (iv) Kimutattuk, hogy amíg a rövid, 10 perces iszkémia fokozza az O-GlcNAc szintjét, addig I/R jelentősen csökkenti az O-GlcNAcilációt a szívben. Ez ellentétesnek tűnik azzal a nézettel, mely szerint az O-GlcNAc növekedése a sejtek endogén, stressz-aktiválta válaszreakciója (Zachara és mtsai.). Az I/R során kialakuló O- GlcNAc-csökkenés oka nem ismert. Fülöp és mtsai. is azt találták, hogy iszkémiával nőtt, reperfúzió során viszont csökkent az O-GlcNAc szintje izolált szívekben. Nőt és mtsai. hasonló jelenséget észleltek in vivo kivérzéses shock-ot követően, ahol újraélesztés után 24 óra múlva is fennállt a szövetek csökkent O-GlcNAcilációja. H 2 O 2 - kezelés kardiomiocitákban ugyancsak az O-GlcNAc csökkenéséhez vezetett, amit az OGA-gátló PUGNAc kivédett (Jones és mtsai.). Ezek alapján feltételezhető, hogy az oxidatív stressznek, ami a reperfúzió, reszuszcitáció, vagy H 2 O 2 -kezelés velejárója szerepe lehet a gátolt O-GlcNAciláció létrejöttében. Az I/R jelentősen csökkentette az aktív OGT (110 kda) szintjét teljes szövetlizátumban és az egyes szubcelluláris frakciókban (sejtmag, mitokondriális, citoszol), melyek közül a citoszolfrakcióban nagy molekulasúlyú OGT-immunreaktív sávokat ( kda) is láttunk. Az NBt és a NAe nemcsak az aktív OGT csökkenését mérsékelte, hanem a nagy molekulasúlyú OGT-k intenzitását is csökkentette, amelyek inaktív OGT-aggregátumok, vagy -multimerek lehetnek; azonban nem kizárt az OGT poszttranszlációs módosulása sem (~ kda sáv alapján) talán a ROS okozta károsodásának következtében. Kimutattuk, hogy iszkémia és/vagy I/R változást okozott bizonyos célfehérjék úgy, mint GP, ACO és vinculin O-GlcNAcilációs módosulásában és hogy ezen fehérjék O- GlcNAcilációja növelhető volt NAG-tiazolinokkal, azonban pontosan nem tudjuk, hogy ezek hogyan járultak hozzá a kardioprotekcióhoz. Figyelembe véve, hogy rengeteg fehérje képes O-GlcNAcilálódni, nem valószínű, hogy egyetlen fehérje O-GlcNAc módosulása lenne felelős az I/R károsodás elleni védőhatás létrejöttéért. A NAG-tiazolinok és az O-GlcNAciláció fokozódásával kapcsolatos kardioprotekció pontos mechanizmusát nem ismerjük. Az NBt- és NAe-szívekben már a reperfúzió kezdetén, 5-10 percen belül javultak a szívfunkciók, ami transzkripciótól eltérő mechanizmust valószínűsít. A reperfúziós károsodás velejárói a felborult Ca