Korai eritroid sejtek osztódásának, túlélésének és differenciációjának vizsgálata: Az ERK1/2 mitogén aktivált protein kináz szerepe

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Méret: px
Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Korai eritroid sejtek osztódásának, túlélésének és differenciációjának vizsgálata: Az ERK1/2 mitogén aktivált protein kináz szerepe"

Átírás

1 Korai eritroid sejtek osztódásának, túlélésének és differenciációjának vizsgálata: Az ERK1/2 mitogén aktivált protein kináz szerepe Doktori (Ph.D.) értekezés Apáti Ágota Témavezetők: Dr. Magócsi Mária Dr. Sarkadi Balázs Készült az Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetének Molekuláris Sejtbiológia Osztályán. Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Elméleti és Klinikai Immunológia program Szigorlati bizottság: Elnök: Dr. Ligeti Erzsébet Tagok: Dr. Buday László Dr. Tompa Péter Hivatalos bírálók: 1

2 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 2 RÖVIDÍTÉSEK BEVEZETÉS A MAP kináz útvonalak A sejtosztódás szabályozása Az apoptózis és a túlélési jelek Az ERK MAPK szerepe a hemopoetikus sejtek érésében A [Ca 2+ ] i változása és annak hatásai A TF-1 sejtvonal jellemzése CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK EREDMÉNYEK Az ERK1/2 MAPK szerepe a növekedésben és túlélésben A [Ca 2+ ] i emelkedése és ennek hatása TF-1 sejtekben A [Ca 2+ ] i emelkedés és a GM-CSF hatására bekövetkező sejtszám változások A [Ca 2+ ] i emelkedés jellemzése Az apoptózisban szerepet játszó fehérjék vizsgálata Az ERK1/2 aktivációjának jellemzése Az [Ca 2+ ] i emelkedés hatása a c-fos, Egr-1 és AP-1 transzkripciós faktorokra A MEK gátlásának hatása az ERK1/2 és Elk-1 foszforilációjára és a c-fos és Egr-1 fehérjék mennyiségére A MEK gátlásának hatása a hormon-független túlélésre Az ERK1/2 MAPK szerepe az eritroid differenciációban Az Epo hatására bekövetkező sejtszám változások Az Epo hatása az eritroid differenciációra Az Epo és a GM-CSF hatása a MAPK-ok aktivációjára Az Epo és a GM-CSF hatása az ERK1/2 aktivációjára Az Epo és a GM-CSF hatása az azonnali válaszadó korai gének aktivációjára Az Epo és a GM-CSF hatása az AP-1, NF-κB és STAT5 transzkripciós faktorok DNSkötődésére Az ERK1/2 aktiválódás hatása az eritroid differenciációra MEGBESZÉLÉS KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY

3 RÖVIDÍTÉSEK A23187 AP-1 BFU-E BIM [Ca 2+ ] i CaM CAMK CPA CRE CREB DFF45 Elk-1 Egr-1 Epo ERK1/2 GM-CSF MAPK MEK p90rsk PD98059 UO126 PARP PI3K PI PLCγ PMA PKC SERCA SRE STAT-5 Ca 2+ ionofór Activator Protein-1 Burst-Forming Unit-Erythroid bisz-indolil-maleinimid szabad citoplazmatikus kálcium koncentráció kalmodulin kálcium/kalmodulin függő kináz ciklopiánsav camp Response Element camp Response Element Binding protein a kaszpáz-aktivált dezoxiribonukleáz dajkafehérjéje Ets domén fehérje-1 Early growth response protein-1 eritropoietin Extracellular signal-regulated Kinase Granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktor Mitogen Activated Protein Kinase MAPK/ERK kináz 90 kda Ribosomal S6 Kinase 2 -amino-3-methoxiflavon (MEK-1 gátlószer) 1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis[2-aminofeniltio]butadién (MEK1/2 gátlószer) poli-adp-ribóz polimeráz foszfatidil-inozitol-3-kináz propidium jodid foszfolipáz C gamma forbol-12-mirisztát-13-acetát protein kináz C szarko-endoplazmatikus retikulum Ca 2+ -ATPáz Serum Response Element Signal Transducer and Activator of Transcription-5 3

4 1. BEVEZETÉS A hematopoézis során a csontvelői őssejtből keletkeznek a különböző sejtvonalak irányába elkötelezett elősejtek (limfoid-, mieloid-progenitorok ). Ezekből az elősejtekből különböző hemopoetikus növekedési faktorok hatására jönnek létre az éretlen, majd az érett hemopoetikus sejtek (1. ábra). A csontvelői eritroid elősejtek vörösvértestté érésének legfontosabb szabályozója az eritropoetin (Epo) hormon [1-5]. Az Epo egy 34 kda molekulatömegű glikoprotein, amely hipoxia hatására a vesében keletkezik [2-5]. Az Epo receptora (EpoR) a citokin I receptorcsalád tagja. Az Epo és az Epo-R gének in vivo inaktiválása bizonyította, hogy mindkét géntermék nélkülözhetetlen a normál eritroid érés folyamán [6, 7]. Ezek az eredmények rámutattak arra, hogy az Epo-R jelátviteli útjai központi szerepet játszanak az eritroid elősejtek túlélésében, osztódásában és differenciációjában [8-11]. 1. ábra A hematopoézis Őssejt Progenitor sejtek Éretlen sejtek Érett sejtek CFU-MEG Limfoid CFU-GM Mieloid CFU-Eo BFU-E CFU-E normoblast retikulocita vörösvérsejt GM-CSF és IL-3 SCF Eritropoetin Kutatócsoportunk évek óta tanulmányozza az eritroid éréshez vezető jelpályákat. Ez részben az Epo által aktiválható jelátviteli utak vizsgálatából, részben eritroid differenciációt okozó kémiai szerek hatásának elemzéséből áll különböző sejtvonalakon és humán csontvelői mintákon. Ebben a dolgozatban a TF-1 sejteken végzett kísérleteink eredményét mutatjuk be. Ez a humán, hormon-függő, korai, mielo-eritroid 4

5 sejtvonal modellül szolgálhat a csontvelői eritroid elősejtek jelpályáinak feltérképezéséhez. Munkacsoportunk korábbi vizsgálatai azt mutatták, hogy Epo, illetve [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatására eritroid differenciáció játszódik le egér eritroid-leukémia sejtekben (F4-6 és ELM-I-1) [12, 13]. A [Ca 2+ ] i -emelő szerek és az Epo egymástól függetlenül és additívan hatottak a sejtek hemoglobin termelésére. Ezért TF-1 sejteken is vizsgáltuk az Epo, illetve a [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatását. Az Epo a TF-1 sejtekben is eritroid differenciációt okozott, a [Ca 2+ ] i emelkedése viszont nem. Ugyanakkor a [Ca 2+ ] i emelkedése hormon-független túléléshez és osztódáshoz vezetett. Mivel hasonló jelenségről eddig csak elektromosan ingerelhető sejteknél számoltak be, figyelmünket a jelenség hátterében álló folyamatok feltárására irányítottuk. A növekedési jelek rendszerint az ERK1/2 mitogén aktivált protein kináz (MAPK) aktiválódását okozzák, ezért vizsgáltuk az ERK1/2 aktiválódását [Ca 2+ ] i emelkedés hatására. Eredményeink azt mutatták, hogy az ERK1/2 MAP kináznak kulcsszerepe van a [Ca 2+ ] i emelkedés okozta hormon-független túlélésben. Ugyanakkor az ERK1/2 aktiválódása gátolja az Epo hormonnal előidézhető differenciációt. Eredményeink részletes ismertetése előtt rövid áttekintést nyújtunk az ERK1/2 MAPK szerepéről az osztódásban, túlélésben és differenciációban. Mivel nemcsak a receptor-közvetített utakat, hanem a [Ca 2+ ] i emelkedés hatására létrejövő jeleket is vizsgáltuk, ezért külön alfejezetben tekintjük át a [Ca 2+ ] i megemelkedés hatásait és az ERK1/2 MAP kinázzal való kapcsolatát. Végül a modellként használt TF-1 sejtvonalról meglévő ismereteinket foglaljuk össze A MAP kináz útvonalak A MAP kináz útvonalak egymást követő szerin/treonin kinázokból állnak, amelyek képesek foszforilálni és ezáltal aktiválni az utánuk következő kinázt. A három legfontosabb MAP kináz útvonal az ERK, a p38 és a JNK út, amelyek az utolsóként aktiválódó kinázról kapták a nevüket (lásd 2. ábra MAPK ábra) [14]. Ebben a munkában az ERK1/2 MAP kináz szerepét vizsgáltuk a hemopoetikus sejtek szaporodásában, túlélésében és differenciációjában. Az ERK MAP kináz út több módon is aktiválódhat, elsősorban növekedési faktor receptorokon keresztül, de különböző kémiai indukálószerek, vagy a [Ca 2+ ] i megemelkedése is aktiválhatja. Az ERK1/2 aktiválódása a következő általános séma szerint zajlik: a növekedési faktor-, illetve 5

6 citokin-receptorok ligandkötése után egy tirozin kináz aktiválódik, amely a receptor citoszolikus részén lévő tirozinok foszforilálásával kötőhelyeket biztosít különböző adapter molekulák számára. Az ilyen adapter molekulákhoz kötődnek olyan faktorok, amelyek elősegítik a Ras GTP kötött formájának kialakulását. A Ras-GTP közvetlenül kapcsolódik a Raf szerin/treonin kinázhoz, amely így kikötődik a plazmamembránhoz és aktiválódik [15]. Az aktív Raf foszforilálja a MEK kettős specificitású kinázt, a szerin 218 és szerin 222 aminosavakon, ami a MEK kináz aktiválódásához vezet [16]. Ezután a MEK a treonin 183 és tirozin 185 aminosavakon foszforilálja és így aktiválja az ERK1 és ERK2 kinázokat [17]. A Raf/MEK/ERK út aktiválódása kulcsfontosságú a sejt osztódásában és túlélésében [18]. Jelentőségét mutatja, hogy mutációit gyakran megtalálják transzformált sejtvonalakban és humán rákos megbetegedésekben [19, 20]. Az útvonal gátlószerei rákellenes gyógyszerfejlesztések kiindulópontjai lehetnek. 2. ábra A MAP kináz utak áttekintése Növekedési faktorok Stressz Gyulladási citokinek Növekedési faktorok MAPKKK c-raf Ser259 P MEKK4, TAK,ASK1 MEKK1,4, TAK,ASK1 Ser217 P Ser221 P MAPKK MEK1/2 MKK3/6 MKK4/7 Thr202 P Tyr204 P MAPK ERK1/2 p38 JNK Osztódás Differenciáció Gyulladás Apoptózis Osztódás Differenciáció 6

7 1. 2. A sejtosztódás szabályozása A sejtek osztódását növekedési jelek szabályozzák. Nyugalmi állapotban a sejtek a G0 fázisban várakoznak, ami a sejt állapotától, illetve környezetétől függően rövidebb vagy hosszabb ideig tart (a folyamatosan osztódó sejtek nem lépnek ki G0 fázisba). A G0 fázisban lévő sejtek növekedési jelek hatására jutnak el a G1 fázison keresztül az S fázisba, ahol a DNS állomány megkettőződik. Az S fázist követő G2 fázisban előkészülnek az osztódásra és az M fázisban lejátszódik a mitózis. A növekedési jeleket a növekedési faktorok a megfelelő receptorukhoz kötődve indítják el. Ezek a receptorok vagy a saját tirozin kináz aktivitásukon, vagy egy citoszolikus tirozin kináz aktiválásán keresztül aktiválják a növekedési útvonalakat [21, 22]. A növekedési faktorok, mint az általunk tanulmányozott a GM-CSF és az Epo is, egyidejűleg többféle jelpályát aktiválnak (a Ras/Raf/MEK/ERK, a STAT-5, a PI3K, a PLCγ és a PKC utakat) [23-26] (3. ábra). 3. ábra A növekedési faktorok receptoráról induló jelátviteli utak összefoglalása ligand P- JAK JAK -P P-STAT P- P-STAT P- P- P- PI3K PDK P- P- -P -P -P -P -P -P PLCγ Ras Raf MEK ERK PKB Ca 2+ CaMK CN DAG PKC 7

8 A különböző jelpályák kölcsönhatásai tovább növelik a szabályozás lehetőségeit. Ennek a finoman összehangolt és szigorúan szabályozott rendszernek a működése szabja meg a sejt növekedési faktorra adott válaszát. Ezek közül a növekedési jelpályák közül a legismertebb, az általunk is vizsgált, ERK MAPkináz útvonal. Az ERK MAPK aktiválódása további fehérjék foszforilációval történő aktiválódásához vezet, ilyenek a p90rsk, a CREB és az Elk-1 [27-29]. Az aktivált CREB és Elk-1 transzkripciós faktorok azonnali válaszadó korai gének, a c-fos és egr-1 átírásához vezetnek [30, 31]. Ezen gének fehérjetermékei, mint transzkripciós faktorok, funkcionális gének átírását segítik elő. A keletkezett új fehérjék elősegítik a sejtek osztódását [32, 33], továbbá az apoptótikus folyamatok gátlásán [34, 35] keresztül a sejtek túlélését. A korai gének termékei közül a c-fos az egyik legelső transzkripciós faktor, amelynek megemelkedik a mennyisége a sejtciklus indulásakor [36, 37]. Ennek a génnek a promoter régiójában több cisz-aktivációs elem helyezkedik el: a v-sis inducible elem (SIE) [38, 39], a serum response elem (SRE) [30], a camp response elem (CRE) [40] és a Fos AP-1-szerű helye [41, 42]. A transzkripciós faktorok ezekre az elemekre kötődve segítik elő a gén átírását. Egy adott növekedési jel a c-fos promoter majdnem minden elemét képes aktiválni (4. ábra). 4. ábra A c-fos gén aktivációjához vezető receptor- közvetített jelátviteli utak P-Stat-5 P-Stat-5 Ras Raf MEK ERK Ca 2+ CaMK PLCγ DAG PKC P-STAT-5 P-STAT-5 SIE Elk-1 SRE SRF FAP-1 CREB CRE c-fos A STAT-5 fehérje a receptorhoz kötődik és foszforilálódik az aktivált tirozin kináz által. A foszforilálódást követően dimerizálódik és bejut a magba, ahol a SIE elemre kötődik 8

9 [38, 39]. A PLCγ által indított inozitol-lipid jelpálya a [Ca 2+ ] i átmeneti növekedéséhez és a PKC aktiválódásához vezet. A [Ca 2+ ] i emelkedés a CaMK aktiválódásán keresztül az SRE [43], míg a PKC a CREB foszforilációján át a CRE elemen keresztül [44] vezethet a c-fos gén átírásához. Az ERK MAPK útvonalon keresztül az Elk-1 és a CREB transzkripciós faktor is aktiválódhat. Az aktiválódott Elk-1 az SRE, míg a CREB a már említett CRE helyre kötődik [31]. A c-fos-hoz hasonlóan, az egr-1 is jellegzetes azonnali válaszadó korai gén, amely többnyire növekedési jelek útján aktiválódik [45]. Többféle szövetben megfigyelték a c-fos és az egr-1 gének közös szabályozását, ami feltehetően a közös szabályozó elemeknek (CRE és SRE) köszönhető [45] Az apoptózis és a túlélési jelek Az apoptózis a természetes sejthalál egyik formája, arra szolgál, hogy a szervezet számára feleslegessé vált vagy veszélyes sejteket eltávolítsa. Az apoptózis receptorközvetített vagy mitokondrium-függő úton indulhat el [46]. Mindkét esetben egy proteáz kaszkád aktiválódik. Ezek a cisztein proteázok, a kaszpázok, inaktív formában képződnek és az apoptotikus jel hatására aktiválódnak. A receptor-közvetített (Fas, TNFR) út a kaszpáz-8 és 10 [47], míg a stressz aktivált út (éhezés, DNS károsodás, ER illetve mitokondriális stressz stb.) a kaszpáz-9 és 12 aktiválódásához [48, 49] vezet. Ezek a proteázok hasítják és aktiválják a végrehajtó kaszpázokat, a kaszpáz-3, 6 és 7 enzimeket [50]. A végrehajtó kaszpázok olyan fehérjéket hasítanak, amelyek többek között felelősek a citoszkeleton és a DNS integritásáért. (PARP [51], DFF45 [52], lamin A [53], α-fodrin [54]) (5. ábra). A sejtek apoptózisának kimutatására alkalmasak például azok a módszerek, amelyek a végrehajtó kaszpázok aktiválódását vagy a DNS feldarabolódását tükrözik. A sejtek apoptózisa szigorúan szabályozott folyamat. A receptor-közvetített vagy stressz aktivált jelpályákat különböző hatások erősíthetik vagy gátolhatják. Ezek közül kiemelkedő fontosságú a Bcl-2 fehérjecsalád, amelynek tagjai gátolhatják, vagy elősegíthetik az apoptózist [55]. A fehérjecsalád apoptózist elősegítő tagjai (Bax, Bak, Bid, Bad) az apoptotikus jel hatására a citoszolból a mitokondriumhoz kötődve elősegítik a citokróm c kiáramlását, ami szükséges a kaszpáz-9 aktiválódásához. A fehérjecsalád apoptózist gátló tagjai (Bcl-2, Bcl-xl) ugyanakkor a citokróm c kiáramlást 9

10 akadályozzák a mitokondriumból [56] (5. ábra). A pro- és anti-apoptotikus fehérjék aránya szabja meg, hogy a citokróm c milyen mennyiségben áramlik ki a mitokondriumból, ami meghatározó az apoptózis végbemenetele szempontjából. Az apoptótikus folyamatok elemzésénél tehát több információt nyújt, ha a Bcl-2 fehérjecsaládnak nemcsak egy tagját, hanem a fehérjecsalád pro- és anti-apoptotikus tagjainak arányát vizsgáljuk. 5. ábra Az apoptózis folyamatainak vázlatos áttekintése TNF, FasL stressz Kaszpáz-8,-10 Bcl-2 Bcl-xl Kaszpáz-3,-6,-7 Kaszpáz-9 citokróm c Bax Bak Bid Lamin A α-fodrin PARP DFF45 Citoszkeleton változásai DNS repair gátlása DNS darabolódása A túlélési jelpályák jelentős része a Bcl-2 fehérjecsalád mennyiségének illetve foszforilációjának szabályozásán keresztül gátolja az apoptózist. Ilyen a PI3K aktiválódása, amely elősegíti a PKB aktiválását. A PKB egyrészt a kaszpáz-9 enzim közvetlen gátlásával [57], másrészt a Bad fehérje foszforilálásával [58] akadályozza az apoptotikus folyamatokat. A Bad fehérje szintén a Bcl-2 család tagja, foszforilálatlan állapotban elősegíti az apoptózist, míg foszforilált formája kötődik egy citoszolikus fehérjéhez, és így nem juthat a mitokondrium közelébe. A foszforilálódott STAT-5 fehérje a Bcl-xl antiapoptótikus fehérje átírását segíti elő [59]. Az aktiválódott ERK1/2 10

11 a p90rsk aktiválásán keresztül foszforilálja a CREB transzkripciós faktort, ami a Bcl-2 és Bcl-xl fehérjék mennyiségének növekedéséhez vezet [35, 60] Az ERK MAPK szerepe a hemopoetikus sejtek érésében A sejtosztódás és az apoptózis minden sejtben hasonló jelpályák aktiválódásán keresztül valósul meg (mint az osztódásnál a ciklin-cdk rendszer és az ERK MAP kináz útvonal, vagy az apoptózisnál a kaszpáz kaszkád). A differenciáció ezzel szemben különböző irányokba különböző jelpályákon futhat és nem rendelhető hozzá egy vagy több kiemelt jelpálya. Nagymértékben függ a sejtek típusától és érettségi állapotától, ezért az eredmények általánosítása nagy körültekintést igényel. A természetes érési folyamatok során a differenciációt előidéző faktorok (pl. a GM-CSF és az Epo) túlélési és növekedési jeleket is közvetítenek, így a jelpályák kölcsönhatásai tovább gazdagítják a képet. A differenciációhoz vezető jelpályák feltérképezése komoly haszonnal járhat a betegségek kezelése szempontjából [61]. Az általunk vizsgált ERK MAPK út elsősorban a sejtek szaporodásában fontos, ugyanakkor aktiválódása, más MAPK utakkal (JNK vagy p38) együtt szerepet játszhat különböző hemopoetikus sejtek differenciálódásában is [62]. Az ERK útvonal szabályozza a timociták érését [63]. Az ERK jel erőssége befolyásolja, hogy a T sejtek helper vagy citotoxikus irányba érnek [64]. Elősegíti humán mieloid leukémia sejtek monocita [65] és a K562 eritroleukémia sejtek megakariocita irányú differenciációját [66]. Dimetil-sulfoxid (DMSO) hatására egér eritro-leukémia sejtek hemoglobint termelnek, és ehhez szükséges az NF-E2 transzkripciós faktor [67]. Ebben a munkában kimutatták, hogy az NF-E2 aktiválódásában szerepet játszik az ERK 1/2 MAP kináz. Különböző endogén vagy transzfektált Epo receptort hordozó sejtvonalakban is kimutatták, hogy az Epo aktiválja a Raf-1 és ERK1/2 kinázokat [68-71], de nem vizsgálták, hogy ennek az eritroid differenciációban milyen szerepe van. Ugyanakkor leírták, hogy az ERK1/2 gátlása elősegíti a megakariociták eritroid irányú differenciációját [72]. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az ERK 1/2 aktiválódását több helyen is leírták a hemopoetikus sejtek differenciációjával kapcsolatban, de szerepe az eritroid differenciációban még nem tisztázott. 11

12 Az ERK MAPK aktiválódásához hasonlóan a c-fos és egr-1 géneket is összefüggésbe hozták a differenciációval. Így a c-fos kulcsszerepet játszik a hemopoetikus sejtek érésében [73] és bizonyították, hogy az egr-1 génnel együtt részt vesz a normál mieloid sejtek differenciációjában is [74]. Normál BFU-E sejtekben az Epo hatására in vitro bekövetkezett eritroid differenciáció során a c-fos fehérje kifejeződését figyelték meg [75]. Mivel az ERK1/2 aktiválódása mindkét gén átírását elősegítheti, aktiválódásukat érdemes együtt vizsgálni az ERK1/2 MAP kinázéval A [Ca 2+ ] i változása és annak hatásai A [Ca 2+ ] i változása nagyon sokféle és egymástól különböző folyamatot szabályoz a sejt működése során. Részt vesz az osztódás, érés, összehúzódás, valamint a kiválasztás folyamataiban, ugyanakkor a mértékében vagy időtartamában szabályozhatatlan Ca 2+ - jel a sejt halálát okozza [76]. A Ca 2+ csatornák és transzporterek kapcsolatban állnak a nagy, dinamikusan és gyorsan változó Ca 2+ raktárakkal. Bonyolult és összehangolt működésük lehetővé teszi, hogy a hormonok és növekedési faktorok meghatározott amplitúdójú és frekvenciájú Ca 2+ jeleket hozzanak létre [77]. A [Ca 2+ ] i emelkedés előidézhető különböző receptor által közvetített úton (adrenerg-, purinerg-, proteáz aktivált-, növekedési hormon- és citokin-receptorok). Ilyenkor a ligand kötődése után a receptor aktiválja a foszfolipáz C enzimet, amely hidrolizálja a foszfatidil-inozitol-4,5-difoszfátot diacil-glicerollá és inozitol-1,4,5-triszfoszfáttá (IP3). A keletkezett IP3 az ER raktáraiból az IP3 receptorokon keresztül Ca 2+ -ot szabadít fel [78]. Ebben az esetben a [Ca 2+ ] i emelkedés hatását a receptorról induló többi jelpálya is befolyásolja. Ezért a Ca 2+ jelek vizsgálatához gyakran használnak [Ca 2+ ] i -mobilizáló szereket (ciklopiánsav (CPA), tapszigargin (TG), ionomicin, A23187). Ezekkel a szerekkel a [Ca 2+ ] i emelkedés hatása a receptorokon át aktiválódó, Ca 2+ -függetelen jelpályáktól elkülönítve vizsgálható. A sejt nyugalmi állapotában az ER/SR raktáraiból folyamatosan szivárog kis mennyiségű Ca 2+ a citoplazmába. Az ER/SR Ca 2+ -ATPáz (SERCA) fehérjék visszapumpálják a kiszivárgott Ca 2+ -ot a raktárakba. Így a SERCApumpák gátlása (CPA vagy TG segítségével), az ER/SR Ca 2+ -raktárak ürülését okozza. A belső Ca 2+ raktárak ürülése nyitja a plazmamembránban található store-operated Ca 2+ csatornákat és ezeken keresztül további Ca 2+ áramlik be a külső térből [79]. A 12

13 Ca 2+ -ionofórok (az A23187 vagy az ionomycin) olyan Ca 2+ -kelátorok, amelyek segítségével a Ca 2+ a koncentráció gradiens irányában jut át a membránokon [80]. A sejtek osztódása során ismétlődő Ca 2+ csúcsok figyelhetők meg, amelyek létrejöttéhez mind a belső raktárakból, mind a külső térből származó Ca 2+ elengedhetetlen. Ezek a Ca 2+ -jelek aktiválják azokat az azonnali válaszadó korai géneket, amelyek a nyugvó sejtek (G0) sejtciklusba való belépéséért felelősek [81]. Ugyanakkor elősegíthetik a DNS szintézis elindulását a G1/S átmenetben [82], és hozzájárulnak a sejtciklus befejezéséhez [83]. A Ca 2+ sejtosztódásban betöltött szerepének fontosságát az is kiemeli, hogy egyre bővül azoknak a rákellenes szereknek a száma, amelyek közvetlenül a Ca 2+ -jelpályát célozzák meg [81, 84]. A [Ca 2+ ] i emelkedése a sejtek túlélését is elősegítheti, régóta ismert tény, hogy az elektromosan ingerelhető sejtek esetében [Ca 2+ ] i emelésével kivédhető a növekedési faktor megvonás hatására bekövetkező apoptózis [85], ami annak köszönhető, hogy a [Ca 2+ ] i emelkedés túlélési jelpályákat aktivál. Ugyanakkor a [Ca 2+ ] i emelkedését a sejtek pusztulása közben is megfigyelték [86, 87]. Általánosan elfogadott, hogy az elektromosan nem ingerelhető sejtek esetében a nagymértékben megemelkedett [Ca 2+ ] i hatására a sejtek megduzzadnak, és nekrózissal elpusztulnak[88, 89], míg apoptóziskor a [Ca 2+ ] i mérsékelt emelkedését figyelték meg [90-92]. A sejtek Ca 2+ -függő apoptózisához két fő út vezethet, az egyik a halál receptorok (pl.cd59) ligandjainak (Fas, APO-1) Ca 2+ -függő átírásán, a másik a Ca 2+ közvetlen toxikus hatásán keresztül [77]. Ez utóbbi az ER és a mitokondrium Ca 2+ szintjével hozható összefüggésbe. Több munka is felhívja a figyelmet arra, hogy az ER Ca 2+ raktárak ürülése a [Ca 2+ ] i emelkedéséhez és apoptózishoz vezet. Az ER raktárak ürülése előidézhető növekedési faktor megvonással vagy a már említett SERCA-pumpa gátlószerekkel [93-95]. Hosszabb távon (több óra) a külső [Ca 2+ ] alacsony szinten tartása is a belső raktárak ürüléséhez vezet [96-98]. Mivel az ER raktárak Ca 2+ szintje és a mitokondrium Ca 2+ szintje között szoros kapcsolat áll fenn [99, 100], továbbá a citokróm c kiáramlásás függ a mitokondrium Ca 2+ szintjétől [96, 97], így az ER állapota fontos szabályozója a citokróm c kiáramlásának és ezen keresztül az apoptózisnak [ ]. A sejtek [Ca 2+ ] i változása nemcsak a sejt osztódását és túlélését, hanem a differenciációját is szabályozhatja. Monociták, bizonyos leukémia sejtvonalak és CD34 13

14 pozitív hemopoetikus progenitor sejtek is képesek dendritikus irányba differenciálódni Ca 2+ ionofórral való kezelés hatására [104]. Akut mieloid leukémiás betegek csontvelői sejtjeit is sikerült dendritikus irányba differenciáltatni Ca 2+ ionofórral [105]. Munkacsoportunk korábbi munkái azt mutatták, hogy egér eritroid-leukémia sejtek (F4-6 és ELM-I-1) hemoglobin tartalma [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatására megemelkedett [12, 13]. A Ca 2+ mint másodlagos hírvivő több jelátviteli út aktiválásában is szerepet játszik, elsősorban Ca 2+ függő enzimek aktiválásán keresztül. Aktiválhat kinázokat (CAMKI-VI és a PKC klasszikus izoformái), foszfatázokat (kalcineurin, MAPK foszfatáz-1) és proteázokat (kalpainok), de a többi jelátviteli úttal (PKA, MAPK és PI3K) való kölcsönhatása sem elhanyagolható (részletes áttekintését lásd [76]). Az ERK/MAPK út aktiválódását Ca 2+ -jelet okozó szerek hatására több rendszerben is leírták. A membrán depolarizációt követő Ca 2+ beáramlás aktiválja a Ras/MEK/ERK útvonalat PC12 sejtekben [ ]. A kadmiummal előidézhető [Ca 2+ ] i emelkedés az ERK ugyancsak Ras-függő aktiválódását okozza makrofágokban [109]. Simaizom [110] sejtekben és T-limfocitákban [111] viszont CAMK-II-függően aktiválódik az ERK1/2. Humán trombocitákban [95] és osteoclastokban [112] is képes a megemelkedett [Ca 2+ ] i aktiválni az ERK1/2 MAP kináz utat, azt azonban még nem derítették ki, hogy milyen jelpályán keresztül. A [Ca 2+ ] i emelkedése az ERK1/2 út gátlásában is részt vehet. Tenyésztett fibroblasztokban a kalmodulin nélkülözhetetlen az ERK1/2 aktiváció lecsengésében [113]. Az ERK1/2 defoszforilálását végző egyik foszfatázról (MAPK foszfatáz-1) pedig kimutatták, hogy Ca 2+ -függően szabályozódik [114]. Több irodalmi adat utal arra, hogy az ERK1/2 aktivitás Ca 2+ -függő úton szabályozódik, azonban az ERK1/2 aktiválódás és a biológiai hatásai közötti kapcsolatot csak néhány esetben vizsgálták [107, 109, 112] A TF-1 sejtvonal jellemzése Vizsgálatainkhoz egy olyan sejtvonalat (TF-1) használtunk, amelyet egy eritroid leukémiás beteg csontvelői sejtjeiből stabilizálak. A TF-1 sejtek növekedéséhez GM- CSF vagy IL-3 szükséges, a hormon-megvonás a sejtek halálát okozza [115]. Ezek a korai, mielo-eritroid sejtek CD34 pozitívak és kémiai indukálószerekkel több irányba is 14

15 differenciáltathatóak (eritroid, makrofág [115] és megakariocita [116]). Az Epo hatását TF-1 sejteken többen is vizsgálták. A GM-CSF kezeléssel szemben az Epo csak rövidtávon segítette elő a sejtek növekedését [69, ]. Két munkacsoport is beszámolt az Epo hatásra bekövetkező eritroid differenciációról [121, 122], ugyanakkor több olyan közlemény is megjelent, amelyben azt mutatták be, hogy az Epo nem okozott eritroid differenciációt [117, 118, 123]. Az egymásnak ellentmondó irodalmi adatok az Epo hatásának részletes vizsgálatára késztettek bennünket. A humán epo-r génről két, különböző hosszúságú, működőképes receptor fehérje is keletkezhet (EpoR- F és EpoR-T) [124, 125]. A teljes Epo receptor (EpoR-F) két prolinban gazdag szekvenciát (box1 és box2) és ezt követően kilenc tirozin aminosavat tartalmaz a citoszolikus részében. A receptor az Epo kötése után dimerizálódik, ezután a receptor citoplazmatikus részéhez kötődik, és ezáltal aktiválódik egy tirozin kináz enzim (a JAK2). Ez a tirozin kináz foszforilálja a receptor citoplazmatikus részében található tirozinokat, ami Src homológia domént (SH2) tartalmazó jelátvivő molekulák kikötődését teszi lehetővé és ezáltal több jelpálya aktiválódását eredményezheti [126] (lásd még 3 ábra). A rövidebb receptornak (EpoR-T) hiányzik, a jelátvitelben igen fontos, kilenc tirozin aminosavat tartalmazó része. A korai eritroid elősejtek (BFU-E) felszínén túlnyomórészt a rövidebb receptor fordul elő, amely nem közvetít növekedési és túlélési jeleket [125]. 6. ábra A különböző Epo receptorok vázlatos felépítése 15

16 A TF-1 sejteken főként a rövidebb receptorhoz hasonló Epo receptor (EpoR-TF-1) található, amelyben csak két tirozin marad az eredeti kilencből, és ezek közvetlen környezete is több mutációt tartalmaz [119] (6. ábra). Ez a receptor képes kötni az Epo-t és aktiválni a JAK2 kinázt, de a STAT-5 aktiváció elmarad [121]. Mivel a TF-1 sejtek Epo receptorán számottevően csökken a jelátvivő molekulák kikötési lehetősége feltételezhető, hogy kevesebb jelpálya aktiválható, mint a teljes receptoron. Ennek ellenőrzése érdekében összehasonlítottuk az Epo és egy másik citokin, a GM-CSF által aktiválható jelpályákat. A GM-CSF receptora (GM-CSF-R) az EpoR-hoz hasonlóan az I citokin-receptor családba tartozik, és megegyezik a humán sejtekben leírt GM-CSF receptorral [127, 128]. Az irodalmi adatok szerint a GM-CSF receptorról induló jelpályák és a teljes EpoR receptor által aktiválható jelpályák hasonlóak. A következő jelpályák aktiválódását írták már le TF-1 sejtekben GM-CSF hatására: PLC/PKC [129], JAK/STAT [130], NF-κB [120], MEK/ERK1/2/p90RSK- CREB [131]. Mivel a GM-CSF biztosítja a TF-1 sejtek növekedését és túlélését, de nem okoz differenciációt, az Epo és a GM-CSF receptorról induló jelpályák összehasonlító vizsgálatával ki lehet szűrni az eritroid differenciációhoz vezető jelátviteli utakat. 2. CÉLKITŰZÉSEK Egér eritroid-leukémia sejteken (F4-6 és ELM-I-1) végzett korábbi kísérleteink azt mutatták, hogy különböző [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatására eritroid differenciáció játszódik le [12, 13]. Vizsgálatainkat ki kívántuk terjeszteni humán sejtvonalakra, ezért vizsgáltuk különböző [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatását TF-1 sejteken. Vizsgálni kívántuk továbbá, hogy a TF-1 sejtek felszínén található rövidebb, mutáns Epo-R milyen hatással van az Epo szabályozta osztódási, túlélési és differenciációs folyamatokra. A következő kérdésekre kerestünk választ: Lehet-e differenciáltatni a TF-1 sejteket [Ca 2+ ] i -emelő szerekkel? Milyen egyéb hatásuk van a [Ca 2+ ] i -emelő szereknek a TF-1 sejtekre? Milyen jelpályák aktiválódnak a különböző mértékű [Ca 2+ ] i emelkedés hatására? Képes-e az Epo a TF-1 sejtek eritroid differenciációját előidézni? Ha igen, mely jelpályák játszanak fontos szerepet a folyamatban? 16

17 Milyen különbségek vannak a GM-CSF és az Epo által aktivált jelpályák között? Ezek hogyan függenek össze a különböző fiziológiás válasszal? Hogyan befolyásolja az osztódásban legfontosabb jelpálya, a Raf/MEK/ERK útvonal az eritroid differenciációt? 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A felhasznált anyagok forrásai: Humán rekombináns eritropoetin (hrepo) Boehringer-Mannheim, GM-CSF (granulocita-makrofág-stimuláló faktor), MEK-1/2 gátlószer PD98059 és UO126, PKC gátlószer BIM New England Biolabs, Ionomycin és A23187 ionofórok, ciklopiánsav (CPA), tapszigargin SERCA-pumpagátlók, PKC aktiválószer PMA (forbol-12-mirisztát-13-acetát) és minden más vegyszer, ahol nincs külön jelezve Sigma. A sejtvonal jellemzése, a sejtkultúra fenntartása és a kezelések körülményei: A TF-1 [115] hormon-függő, humán mielo-eritroid leukémia sejtvonalat Dr.C.Braun (Heinrich Pette Institute for Experimental Virology and Immunology Hamburg, F.R.G.) bocsátotta rendelkezésünkre. Sejtvonalunkat sejtfelszíni markerek meghatározásával jellemeztük, anti- CD34, CD38, CD33, CD14, CD15, és GPA monoklonális ellenanyagokkal (Immunotech, Marseille), FACS segítségével. A TF-1 sejtvonalat 2,5 ng/ml hrgm-csf jelenlétében nukleozid mentes RPMI médiumban növesztettük, amelyet 10% FCS-sel, 50µg/ml streptomycinnel, 50 U/ml penicillinnel és 2 nm glutaminnal egészítettünk ki. A sejteket 5% CO 2 és 100% páratartalom mellett 37 o C-os termosztátban tartottuk. Minden kísérlet előtt 16 órás GM-CSF megvonással szinkronizáltuk a sejteket és ezután kezeltük a következő anyagokkal: GM-CSF, hr Epo, ionomycin, CPA és PMA. A külső Ca 2+ megkötésére EGTA-t, a PKC gátlásra BIM-et használtunk. A MEK1 és MEK2 kinázok szelektív gátlószereit (PD98059 és az UO126) használtuk az ERK1/2 útvonal vizsgálatánál. Az UO126 egyforma hatékonysággal gátolja mindkét MEK fehérjét [132], míg a PD98059 hatékonyabb a MEK-1 fehérjére [133]. A sejtek hemoglobin tartalmát 72 órával a kezelés után benzidines festéssel határoztuk meg [134], standardként borjú hemoglobint használtunk. Minden ettől eltérő 17

18 körülményt valamint a használt anyagok koncentrációit feltüntettük az ábra aláírásokban. A sejtszám és életképesség meghatározása: Az élő és az élettelen sejtek számát és az élő sejtek összes sejthez való arányát tripánkék kizárás alapján határoztuk meg sejtszámolással. Az élő sejtek százalékos arányát ( viability, azaz életképesség) MTT teszttel [135] illetve FACS-on propidium-jodidos módszerrel [136] is meghatároztuk néhány esetben. Sejtciklus vizsgálata: A sejtciklus vizsgálatát propidium jodidos (PI) festéssel határoztuk meg [137]. A sejtciklus vizsgálatának ez a módszere azon alapul, hogy a propidium-jodid (PI) a DNShez kötődve fluoreszcenssé válik. Az így jelölt sejtmagok fluoreszcenciája arányos DNS tartalmukkal. A G0 és G1 fázisokban lévő magok DNS tartalma pontosan fele a G2 és M fázisban lévő magokénak. Az S fázisú magok DNS tartalma e két érték között van. Áramlási-citométerrel mérhető a sejtmagok fluoreszcenciája, és ebből számítható a sejtek G0/G1, S, illetve G2/M fázisok közötti megoszlása. Ennek megfelelően, 10 6 kezelt sejtet PBS-ben mostunk, 70% etanolban fixáltunk egy éjszakán át, mostuk PBSben, majd 100µg/ml RNáz és 10µg/ml PI tartalmú PBS-ben állni hagytuk 30 percig, 37C -on. A sejtek DNS tartalmát FACS Calibur (Beckton Dickinson) áramlási citométerrel határoztuk meg. Az adatokat ModFit program segítségével értékeltük. Az intracelluláris szabad [Ca 2+ ] meghatározása: A sejteket (0,5-1x10 6 sejt/ml) 30 percig töltöttük 1,5 μm fura-2am fluoreszcens festékkel 37 o C-on 1% FCS tartalmú friss médiumban. Ezután az extracelluláris fura- 2AM festéket centrifugálással eltávolítottuk és a sejteket 1% FCS tartalmú friss médiumban felszuszpendáltuk. Ezután az ábrákon feltüntetett anyagokkal különböző inkubációs ideig kezeltük a sejteket. A sejtek fluoreszcenciáját HPMI oldatban, 37 o C- on, enyhe keverés mellett mértük Hitachi F4000 fluoreszcens spektrofluoriméterrel [138]. Az intracelluláris szabad [Ca 2+ ] meghatározása a Tsien által leírt módszerrel történt [139]. Az extracelluláris fura-2 fluoreszcenciáját EGTA (0,5 mm) majd ezt követően CaCl 2 (1 mm) adásával ellenőriztük a kontroll sejtekben. Bár a külső fura-2 mennyisége elég alacsony volt a vizsgált időtartamban, mégis figyelembe vettük a kalibrációs eljárás során. A sejtek lizálása és a fehérje preparátumok készítése 18

19 A különböző fehérje frakciók készítése a lizáló oldatok hozzáadásáig azonos módon történt. A Petri-csészékből a kezeléstől számított megfelelő idő elteltével 15 ml-es Falcon csövekbe vittük át a mintánként 4x10 6 sejtet és 1000 g-n 5 percig centrifugáltuk. A médium leöntése után 1,4 ml PBS-mix oldatban (PBS, 5 mm EDTA, 5 mm NaF, 100 μm Na 3 VO 4 ) Eppendorf csövekbe vittük át a sejteket. Gyors centrifugálást követően a felülúszót gondosan eltávolítottuk. A). Oldható fehérje frakció preparálása Western-blothoz A fent leírt módon kapott üledéket, annak mennyiségétől függően µl lizáló oldattal felszuszpendáltuk, majd 10 percig jégen erősen rázattuk, amit 12 perc centrifugálás követett, rpm-en, 4 o C-on. A felülúszót Eppendorf csövekbe vittük át és egyharmad térfogatnyi háromszoros töménységű mintafelvivő pufferben 5 percen át forraltuk, majd 20 o C-on tároltuk felhasználásig. A lizáló oldat összetétele : 250 mm NaCl, 50 mm HEPES-Na (ph 7,4), 1 mm EDTA- Na, 1mM EGTA-Na, 1,5 mm MgCl 2, 0,1% Nonidet-P-40, proteáz inhibitorok: 10µg/ml aprotinin, 10µg/ml leupeptin, 10µg/ml antipain, 10µg/ml pepsztatin és foszfatáz inhibitorok: 1 mm Na 3 VO 4, 10 mm benzamidin, 20 mm NaF, 1 mm PMSF és 40 mm β-glicerofoszfát. A mintafelvivő puffer összetétele : 20% SDS, 10% glicerin, 0,1 M EDTA (ph 7,4), 1 M Tris (ph 7,0), 1 M β-merkaptoetanol, 1% brómfenol-kék, 0,1 M DTT B). Magi fehérjék preparálása A PBS-mix eltávolítása után kapott üledékhez 500 µl puffer A-t adtunk és óvatosan felszuszpendáltuk, majd 15 percig jégen állni hagytuk. A kis ionerőn a sejtek megduzzadtak, a redukáló közeg, valamint a proteáz és foszfatáz inhibitorok a fehérjéket védik a lebomlástól. Ezt követően 5 µl 10 % Nonidet P-40 oldatot adtunk a mintákhoz, és erőteljesen rázattuk 10 másodpercig jégen, majd 4 o C-on, 800 g-n 5 percig centrifugáltuk. Így zömében intakt sejtmagokat kaptunk az üledékben. A csapadékot mennyiségétől függően µl puffer C-ben vettük fel, majd 4 o C-on 15 percig rázattuk, hogy a magas ionerősség hatására a DNS-re kötött fehérjék az oldatba kerüljenek g-n 4 o C-on 10 perc centrifugálás után a felülúszót -80 o C-on tároltuk. 19

20 A puffer A összetétele: 10 mm HEPES (ph 7,9), 10 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 1 mm DTT, 0,5 mm PMSF, 10 µg/ml aprotinin, 10µg/ml leupeptin, 10 µg/ml antipain, 1 mm Na3VO 4. A puffer C összetétele: 20 mm HEPES (ph 7,9), 0,4 M NaCl, 1mM EDTA (ph 0,8), 1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 10µg/ml aprotinin, 10µg/ml leupeptin, 10µg/ml antipain, 1 mm Na 3 VO 4 és 10% glicerin. A fehérje mennyiségét minden esetben módosított Lowry módszerrel határoztuk meg. Western-blot analízis: Mintánként 50 µg fehérjét SDS-PAGE módszerrel választottunk szét, majd PVDF membránra vittük át Mini-Protean II készülék (Bio-Rad) segítségével. A következő ellenanyagokat használtuk az immunfestéshez: (i) elsődleges ellenanyagként, anti- (Egr- 1), anti-(c-fos), anti-(erk1), anti-(erk2), anti-(bcl-xl), anti-(bax) nyúl poliklonális IgG és anti-(foszfo-erk), anti-(foszfo-elk-1), anti-(bcl-2) egér monoklonális IgG (Santa Cruz Biotechnology). (ii) illetve nyúl IgG HRP konjugált és egér IgG HRP konjugált (Jackson) másodlagos ellenanyagként. A fehérjekomplexeket az Amersham által kifejlesztett ECL (enhanced chemi-luminescence) kittel tettük láthatóvá. A membránokat először a monoklonális ellenanyagokkal festettük, majd az eredmények jobb összehasonlíthatósága érdekében minden membránt immunfestettünk egy másik ellenanyaggal is, amelynek mennyisége a kezelések idejétől és módjától független. A mi rendszerünkben erre alkalmas volt az ERK 1/2 fehérjék ellen termeltetett poliklonális ellenanyag. A fehérje felvitel kisebb egyenetlenségeit az ERK1/2 festés alapján korrigáltuk. A Western blottok félkvantitatív értékeléséhez a RTG-filmeket Hewlett Packard 5100C scanner segítségével digitalizáltuk, és Bioscan v1.0 software felhasználásával értékeltük. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA): Ezzel az eljárással transzkripciós faktorok specifikus, ismert szekvenciájú DNS darabokhoz való kötődését vizsgáltuk. A kétszálú (ds) DNS oligonukleotidokat T4 kináz segítségével 5 végen 32 P-ral jelöltük. Az AP-1, STAT-5, Egr-1, NF-κB, NF-AT és c-myb konszenzus oligonukleotidokat a Santa Cruz gyártotta. Ezután a 5-5 μg magi fehérje frakcióhoz adtuk a megfelelő, izotóppal jelölt oligonukleotidokat. A komplex kialakulása után a mintákat 4%-os, nem denaturáló gélen elektroforetizáltuk, így szétválasztva a kis molekulatömegű szabad DNS-szakaszokat a (lassabban vándorló) 20

21 fehérjéhez kötött DNS-től [140]. A kötődés specifikusságát nagy mennyiségű hideg specifikus illetve nem specifikus oligonukleotid hozzáadásával ellenőriztük. A fehérje DNS oligonukleotid komplexek detektálását autoradiográfiásan végeztük. Így meghatározható a különböző mintákban a DNS transzkripciós faktor komplex mennyisége. Kaszpáz-3 aktivitás mérése: Petricsészénként 3x10 6 hormon-megvonással szinkronizált sejtet kezelük különböző anyagokkal. Az ábrákon feltüntetett időpontokban a sejteket centrifugáltuk, majd a fagyasztás-olvasztásos módszerrel lizáltuk a következő összetételű oldatban: 20 mm HEPES-NaOH (ph 7,4), 50 mm NaCl, 3 mm MgCl 2, 10 mm β-merkapto-etanol, 0.4 % Nonidet P-40, 2 mm PMSF, 100 μm Na 3 V0 4, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin és 10 μg/ml antipain. Az így kapott minták fehérje tartalmát Bradford (Sigma) reagenssel határoztuk meg. Mintánként 50 μg fehérjét használtunk a kaszpáz-3 aktivitás mérésére. A minták végtérfogatát 100 μl-re állítottuk be egy 10 mm HEPES-KOH (ph 7,5), 10 % szukróz, 1 mm DTT, 0,025 % CHAPS tartalmú oldattal, amely 50 μm Ac-DEVD-AMC (acetil-asp-glu-val-asp-7-amido 4-metilkumarin) szubsztrátot is tartalmazott. Az AMC felszabadulást fluorimetriásan (360 nm gerjesztő és 460 nm emissziós hullámhosszon) mértük az idő függvényében [141]. A felszabaduló AMC koncentrációját fluoreszcencia intenzitásból számítottuk kalibrációs görbe segítségével. A minták kaszpáz-3 aktivitását a GM-CSF megvonással szinkronizált sejtek aktivitásához viszonyítottuk (3,3 ± 0,5 μm ACM három független kísérletből számolva). DNS létra kimutatása: Az ábrán feltüntetett kezelések után 5 x 10 6 sejtből a teljes celluláris DNS-t a proteináz K-fenol:kloroform:izoamilalkoholos módszerrel nyertük ki [142], majd 1,8%-os etidium-bromid tartalmú agaróz gélen megfuttattuk és lefényképeztük. Northern blot analízis: Sejtek teljes RNS-frakcióját a sav guanidinium-izotiocianát fenol-kloroformos módszerrel izoláltuk [143]. 30 µg RNS glioxilálással denaturáltunk, elektroforézissel méret szerint szétválasztottuk 1%-os agaróz gélen, majd 24 órán keresztül blotoltuk kapilláris technikával Biodine A membránra 20-szoros töménységű SSC oldatban. Az RNS rögzítése után (80 C-on 1 órán át) a filtereket 3-4 órán keresztül előhibridizáltuk, 21

22 majd 20 órán keresztül hibridizáltuk [α-32p] dctp-jelölt DNS próbákkal standard 50% formamid-tartalmú oldatban szobahőmérsékleten. A következő hibridizációs próbákat használtuk: humán β-aktin cdns; 1,2 kb. nagyságú PstI, v-fos; 1,0 kb nagyságú PstI- Pvu fragmens és az egr-1 próba PCR termék [140]. A filtereket végül 0,2 x SSC-ben mostuk 1% SDS mellett 30 percen keresztül, 55 C-on, majd autoradiográfiásan értékeltük. In Vitro Protein Kinase vizsgálat A sejteket kezelés után jéghideg PBS-ben mostuk, majd 10 percig lizáltuk jégen a következő pufferben: 50 mm Tris/HCl (ph 7,5), 100 nm NaCl, 50 mm NaF, 5 mm EDTA, 40 mm β-glicerofoszfát, 1 mm Na 3 VO 4, 1% (v/v) Triton X-100, 10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml antipain, 5 mm benzamidin és 1 mm PMSF [144]. A felülúszót Protein A-Agarose-on 4 C-on 30 percig előtisztítottuk, majd immunprecipitáltuk 5 μg/ml poliklonális ellenanyaggal (anti Raf-1, anti-p38k vagy anti-jnk1 és JNK2), 4 C-on, 1 órán át. Az így kialakított immunkomplexeket Protein A-Agarose-hoz kötöttük (4 C, további 2 óra). A gyöngyöket kétszer mostuk hidegen a fent említett lízis pufferben, majd kétszer a kináz pufferben, amely nem tartalmazott ATP-t [145]. Végül a gyöngyöket 30 C-on tartottuk 30 percig, 20 μl kináz pufferben, amely tartalmazta a kinázoknak megfelelő szubsztrátokat (2 μg MEK-1 fúziós fehérje a Raf-1 illetve 1 μg ATF-2 fúziós fehérje (Santa Cruz) a p38k és a JNK esetén) 20 μm ATP-t és 0,5 μci (γ- 32 P) ATP-t. A reakciót 10 μl Laemmli puffer adásával állítottuk le, majd a mintákat 5 percig forraltuk. A mintákat 10 % (w/v) SDS-polyacrilamid gélen választottuk el. A foszforilált szubsztrátokat autoradiografiásan mutattuk ki a szárított gelek vagy PVDF membránra történt blottolás segítségével. Az utóbbi esetben a PVDF membránokat az immunprecipicitációhoz használt ellenanyaggal visszafestettük ellenőrzésképpen. 4. EREDMÉNYEK Az ERK1/2 MAPK szerepe a növekedésben és túlélésben A [Ca 2+ ] i emelkedése és ennek hatása TF-1 sejtekben A TF-1 sejteket 16 órán át GM-CSF mentes médiumban tartottuk (kiindulási időpont), hogy a növekedési jelek lecsengjenek, majd különböző [Ca 2+ ] i -emelő szerekkel kezeltük 22

23 (1. táblázat), illetve a kezeletlen sejteket is vizsgáltunk kontrollként. A sejtek hemoglobin szintje sem a kezeletlen (kontroll), sem a [Ca 2+ ] i -emelő szerekkel kezelt sejtekben nem változott a kiindulási időpontban mért értékekhez képest. Ezenkívül sem granulocita sem monocita irányú differenciációt nem figyeltünk meg. Amint azt már korábban is megfigyeltük, a kontroll sejtekben a hormon-megvonás hatására lassú apoptózis következik be [146]. Ugyanakkor a [Ca 2+ ] i -emelő szerek különböző hatással voltak a sejtek osztódására és túlélésére. 1. táblázat. A különböző [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatására létrejövő [Ca 2+ ] i emelkedés és biológiai hatások vázlatos összefoglalása. [Ca 2+ ] i nm nm ~1000 nm >1000 nm emelkedés [Ca 2+ ] i -emelő szer 5-50 nm ionomycin 5 nm A nm ionomycin 7,5 μm CPA 50 nm TG 100 nm A23187 biológiai hatás sejthalál hormon-független túlélés 1 μm ionomycin >2 μm ionomycin >1 μm A23187 hormon-független sejthalál osztódás és túlélés TF-1 sejteket GM-CSF megvonást követően a táblázatban feltüntetett szerekkel kezeltük. Ezután mértük a [Ca 2+ ] i függő fluoreszcenciát fél perccel a kezelések után (lásd Módszerekben). A táblázatban a [Ca 2+ ] i változására jellemző tartományt tüntettük fel. A tripánkék kizárásos módszerrel mért sejtszám változások alapján jellemeztük a biológiai hatásokat (a sejthalál esetén 24, a túlélés és osztódás esetén 72 óráig követve a változásokat). A kontroll sejtekhez képest a [Ca 2+ ] i enyhe emelkedése ( nm) nem gyorsította jelentős mértékben a sejtek pusztulását, ellenben a magas [Ca 2+ ] i (>1000 nm) a sejtek gyors pusztulását eredményezte. Hormon-független túlélést többféle [Ca 2+ ] i -emelő szerrel tudtunk elérni, míg osztódást csak az 1 μm ionomycinnel való kezelés eredményezett. Eredményeink azt mutatták, hogy a biológiai hatások és a [Ca 2+ ] i emelkedés nagysága között összefüggés van. Mivel a [Ca 2+ ] i emelkedés hatására bekövetkező a hormon-független túlélést és osztódást nagyon érdekes jelenségnek tartottuk, kiválasztottunk két kezelést (7,5 μm CPA és 1μM ionomycin) hogy ezeket részletesen tanulmányozzuk. A sejtosztódás és túlélés vizsgálatához GM-CSF hormont 23

24 használtunk pozitív kontrollként. Az itt következő eredményeket a ban megjelent cikkünkben közöltük (Apati, A et al. J Biol Chem, (11): p ) A [Ca 2+ ] i emelkedés és a GM-CSF hatására bekövetkező sejtszám változások A TF-1 sejteket 16 órán keresztül GM-CSF-mentes médiumban tartottuk, ezután a következő anyagokkal kezeltük: GM-CSF (2,5 ng/ml), ionomycin (1μM) és CPA (7,5μM). Tripánkék kizárásos módszerrel 72 órán át követtük a kontroll (kezeletlen) és a kezelt sejtek sejtszám változásait (7. A ábra). Ez időtartam alatt a kontroll sejtek száma jelentősen csökkent (a kiindulási érték 26%-ára), míg a GM-CSF visszaadása a sejtszám jelentős mértékű növekedését eredményezte. Az ionomycin a GM-CSF-hez hasonlóan megnövelte a sejtszámot, bár kisebb mértékben, mint a növekedési hormon. CPA hatására a sejtszám nem változott jelentős mértékben, a kiindulási értékhez képest. Az élő sejtek arányát vizsgálva (7. B ábra) azt tapasztaltuk, hogy míg a kontroll sejtek folyamatosan pusztultak, addig a GM-CSF, az ionomycin és a CPA kezelt sejtek életképessége, a vizsgált időtartamban, nem változott. Az élő sejtek arányát más módszerekkel is megvizsgáltuk (MTT és propidium-jodid segítségével) és azok a 7. ábra A sejtszám (A) és az életképesség (B) változása a GM-CSF, CPA és ionomycin kezelt illetve a kontroll sejtekben. A TF-1 sejteket 16 óra GM-CSF megvonás után (kiindulási időpont) a következő anyagokkal kezeltük: 7.5 μm CPA, 1 μm ionomycin, 2.5 ng/ml GM-CSF. A sejtszám változásokat Tripán-kék kizárás alapján számoltuk, a feltüntetett időpontokban. A sejtszám növekedést a kiindulási sejtszámra (100%) vonatkoztattuk. Az életképesség az élő/ összes sejt arányát tükrözi százalékban kifejezve. Az adatokat legalább 6 független kísérlet alapján számoltuk (átlag±szórás). 24

25 mérések is hasonló eredményt mutattak. A sejtszám változások a sejtciklus követésével más megközelítésből vizsgálhatók. A kezeléseket követő sejtciklus változásokat propidium-jodidos festéssel vizsgáltuk áramlási citométer segítségével. A GM-CSF, ionomycin, illetve CPA kezelést követően 3 óránként mintát vettünk és mértük a minták DNS tartalmát. Az 8. ábrán a sejtek megoszlását ábrázoltuk a G0/G1, az S és a G2/M fázisok között. A 16 órás GM-CSF megvonás a sejtek szinkronizálódásához vezetett, a sejtek több mint fele (54,4±2,9%) a G0/G1 fázisban maradt. Eredményeink azt mutatták, hogy mind a GM-CSF, mind az ionomycin kezelés hatására a sejtek bejutottak az S fázisba (8. A/B ábra), bár ez a folyamat az ionomycin esetében lassabb volt. A CPA kezelést követően a sejtciklus megakadt, a sejtek megoszlása a ciklus fázisai között nem változott (8. C ábra). 8. ábra A sejtciklus változása a GM-CSF (A) a CPA (B) és az ionomycin (C) kezelést követően. 16 óra hormon-megvonás után kezeltük a sejteket a fent megadott szerekkel, majd 3 óránként mintát vettünk és 70% etanollal fixáltuk a sejteket. A propidium-jodidos festés után (lásd Módszerek) után flowcitometriás elemzést végeztünk, a kapott adatokat ModFit programmal értékeltük. Az ábrán három független kísérletből a legjellemzőbbet ábrázoltuk. 25

26 Minthogy a nem ingerelhető sejtek rendszerint nehezen tűrik a [Ca 2+ ] i nagymértékű emelkedését [88], az apoptózis jeleit vizsgáltuk a kezeléseket követően. 9. ábra Akaszpáz-3 enzimaktivitásának időfüggése (A), a PARP hasítási termék (B) és a DNS létra (C) vizsgálata GM-CSF, CPA és az ionomycin kezelést követően illetve a kontroll sejtekben. A szinkronizált sejteket az ábrán feltüntetett módon kezeltük, majd a jelölt időpontokban feltártuk. A kaszpáz-3 enzim aktivitását fluorimetriás módszerrel határoztuk meg (részletes leírását lásd Módszerek fejezetben). Az ábrán három független kísérlet eredményét mutatjuk be, az értékeket a szinkronizált sejtekben mért értékre vonatkoztattuk(a). A PARP hasítási termék vizsgálata Western-blot segítségével. A mintákat az ábrán feltüntetett időpontokban vettük, és a Módszerekben leírtak alapján dolgoztuk fel (B). 5x10 6 sejtet kezeltünk a megadott anyagokkal. A kezelés után különböző időpontokban kinyertük a DNS-t a mintákból. A mintákat etidium-bromidot tartalmazó agaróz gélen futattuk, majd az eredményt lefényképeztük (C). A kontroll sejtekben a folyamatos hormon-megvonás hatására az apoptózis legfontosabb végrehajtó proteáz, a kaszpáz-3 enzim aktivitása lassan emelkedett (9. A ábra). 24 órán belül a PARP apoptotikus hasítási termékét is ki lehetett mutatni (9. B ábra). A kaszpáz-3 enzim aktiválódása a DNS feldarabolódásához vezet, amit a DNS létra megjelenése alapján lehet követni. Ennek megfelelően a DNS létra is kimutatható volt a kontroll sejtekben (9. C ábra). A CPA, az ionomycin és a GM-CSF kezelést 26

27 követően a kaszpáz-3 aktivitás 6 órán belül lecsökkent (az utóbbi két esetben a tenyésztett sejtekre jellemző értékig 41,5±3,65%), azonfelül sem a PARP hasítási termék, sem a DNS létra nem volt kimutatható még 48 órával a kezelést követően sem. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy mind a GM-CSF visszaadása, mind a CPA illetve ionomycin kezelés visszaszorítja a hormon-megvonással előidézhető apoptotikus folyamatokat. Ezen túl az ionomycin a GM-CSF-hez hasonlóan a sejtek osztódását is eredményezi A [Ca 2+ ] i emelkedés jellemzése Az ionomycin és a CPA hatására bekövetkező hormon-független túléléshez vezető folyamatok részletesebb vizsgálata érdekében fura-2 fluoreszcens festék segítségével követtük a sejtben a [Ca 2+ ] i változását. A kezelést követő 2 órán belül sem a kontroll, sem a GM-CSF kezelt sejtekben nem változott a [Ca 2+ ] i. A CPA mérsékelt [Ca 2+ ] i emelkedést okozott (legmagasabb érték: 228,2±40,6 nm), az ionomycin viszont jóval magasabb értékre emelte a [Ca 2+ ] i -t ( 1397,5±160,2 nm). A Ca 2+ -jel mindkét esetben átmenetinek bizonyult, 1 órán belül megközelítette a kiindulási értéket (2. táblázat). 2. táblázat. A [Ca 2+ ] i mérése Fura-2AM segítségével. idő Kontroll GM-CSF CPA Ionomycin [Ca 2+ ] i (nm) [Ca 2+ ] i (nm) [Ca 2+ ] i (nm) [Ca 2+ ] i (nm) 0,5 perc 93,1±30,4 94,9±19,5 228,2±40,6 1398± perc 97,8±25,1 98,8±26,1 142,3±29,2 570± perc 92,1±33,3 89,2±24,4 122,2±39,9 153,4±36,3 120 perc 94,4±27,2 94,7±23,2 99,4±28,8 146,4±40,5 TF-1 sejteket szinkronizáltuk GM-CSF megvonással, majd kezeltük a következő anyagokkal: 7,5 µm CPA, 1 µm ionomycin, 2,5 ng/ml GM-CSF. Ezután mértük a [Ca 2+ ] i függő fluoreszcenciát megadott idővel a kezelések után (lásd Módszerekben). Az adatokat legalább három független kísérlet eredményeiből számoltuk (átlag±szórás(sd)). A külső Ca 2+ EGTA-val történő megkötésével vizsgálható a [Ca 2+ ] i -emelő szerek hatása a sejt belső Ca 2+ raktáraira. Amennyiben a külső Ca 2+ szintet visszaállítjuk a raktár ürülését követő kapacitatív Ca 2+ beáramlás is vizsgálható. Amint az a 10. ábrán látható 27

28 EGTA mellett az ionomycin és a CPA a sejt belső Ca 2+ raktárainak ürülését okozta. A külső Ca 2+ visszaadását gyors, és a belső raktárakból felszabaduló Ca 2+ -hoz képest nagymértékű beáramlás követett a külső térből (10. ábra). 10. ábra A [Ca 2+ ] i változása CPA (A), illetve ionomycin (B) hatására. 16 órás GM-CSF megvonás után a TF-1 sejteket megtöltöttünk fura-2-am festékkel (lásd Módszerekben), majd 0,5 mm EGTA mellett mértük a [Ca 2+ ] i -függő fluoreszcenciát. A nyíllal jelölt időpontokban CPA-t illetve ionomycint adtunk a sejtekhez, így mérve a belső raktárakból felszabaduló Ca 2+ mennyiségét. Ezt követően Ca 2+ -ot (1 mm CaCl 2 ) adva a rendszerbe a külső térből beáramló Ca 2+ mennyiségét követtük. Az ábra több kísérlet jellegzetes eredményét mutatja. Annak eldöntésére, hogy a belső Ca 2+ raktárak ürülése és a Ca 2+ beáramlása közül melyik és milyen mértékben járul hozzá a hormon-független túléléshez, a következő kísérleteket végeztük: a 16 órás hormon-megvonás után 3 mm EGTA-t adtunk a médiumhoz, majd 5 perc múlva GM-CSF, CPA illetve ionomycin kezelést alkalmaztunk és követtük a sejtszám változását külső Ca 2+ -mentes közegben. 24 órával a kezelést követően összehasonlítottuk az EGTA-val előkezelt és az előkezeletlen mintákat. A kontroll, illetve a GM-CSF, a CPA, és az ionomycin kezelésekhez képest az EGTA-s előkezelés a következő mértékben csökkentette a sejtszámokat: 75,1±2,2%, 43,9±5,2%, 87,2±3,2% és 94,6±2,8%-kal. Az EGTA-s kezelés hosszútávon a belső Ca 2+ raktárak tartós ürüléséhez vezet. Így, amennyiben a túlélést a raktárak ürülése okozza, a kontroll sejtek túlélése megnövekedne. Ehhez képest a sejtszám mind a kontroll, mind a GM-CSF-fel kezelt sejtek esetében csökkent az EGTA-val történő előkezelés hatására. A Ca 2+ -emelő szerek esetében összetettebb az EGTA hatása: mivel megakadályozza a külső térből történő beáramlást, így a [Ca 2+ ] i jelentős emelkedését és a raktárak 28

29 visszatöltődését, ezen keresztül a belső Ca 2+ raktárak gyors és tartós ürüléséhez vezet. A sejtszámok nagymértékű csökkenése arra utal, hogy a túléléshez az influx szükséges és nem elégséges csupán a belső raktárakból felszabaduló Ca 2+, illetve, hogy minél gyorsabb és teljesebb a belső raktárak ürülése annál gyorsabban pusztulnak a sejtek. Mivel a CPA és az ionomycin mesterséges [Ca 2+ ] i -emelő szerek, megvizsgáltuk, hogy milyen fiziológiás ligandok képesek ilyen nagyságrendű [Ca 2+ ] i emelkedést előidézni. Az általunk vizsgált citokin receptor ligandok a GM-CSF, IL-3, IL-4, eritropoetin és NGF nem befolyásolták a TF-1 sejtekben a [Ca 2+ ] i t. A purinerg receptor ligand ATP (1mM) és a PAR ligandok, a trombin (1U/ml) és a tripszin (250 ng/ml), viszont mérhető [Ca 2+ ] i emelkedést okoztak (11. A-D ábra). Ez a kezdeti [Ca 2+ ] i emelkedés pár percen belül eltűnt az ATP és a trombin esetében, míg a tripszin a CPA-hoz hasonló hosszan fenntartott [Ca 2+ ] i emelkedést eredményezett. 11. ábra A [Ca 2+ ] i változása ATP (A), trombin (B), tripszin (C), illetve CPA (D) hatására. TF-1 sejteket, 16 órás GM-CSF megvonás után, megtöltöttünk fura-2-am festékkel (lásd Módszerekben), majd külső Ca 2+ jelenlétében mértük a [Ca 2+ ] i függő fluoreszcenciát. Ezután a sejteket az ábrán feltüntetett szerekkel kezeltük, a nyíllal jelölt időpontokban. Három független kísérlet jellegzetes eredményét ábrázoltuk. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a CPA és az ionomycin által okozott [Ca 2+ ] i emelkedés: 1, összemérhető a fiziológiás ligandok által előidézhető [Ca 2+ ] i emelkedéssel, 29

30 2, a sejtek által szabályozható, mivel 1 órán belül a kiindulási szintre csökken, 3, a hormon-független túlélés elengedhetetlen feltétele Az apoptózisban szerepet játszó fehérjék vizsgálata A túléléssel kapcsolatos folyamatokat tovább vizsgálva, kíváncsiak voltunk az apoptózissal összefüggő fehérjék, a Bcl-2 fehérje család, mennyiségi változásaira. A hormon-megvonással szinkronizált sejteket GM-CSF-fel, ionomycinnel illetve CPA-val kezeltük, majd különböző időpontokban a teljes sejtlizátumból meghatároztuk a legfontosabb anti-apoptotikus (Bcl-2 és Bcl-xl) és pro-apoptotikus (Bax) fehérjék, mennyiségét Western blot alapján (12. ábra). 12. ábra ABcl-xl(A)ésaBcl-2 (B)antiapoptótikus, illetve a Bax (C) proapoptótikus fehérjék mennyiségének változása GM-CSF, ionomycin illetve CPA hatására a kontroll sejtekhez képest. Szinkronizált TF-1 sejteket kezeltünk a feltüntetett anyagokkal. 8, 24 és 48 órával a kezeléseket követően mintákat vettünk a kezelt illetve kontroll sejtekből. A sejteket feltártuk a szokott módon (lásd Módszerek), majd μg fehérjét szétválasztottunk 12,5%-os SDS poliakrilamid gélen, ezután PVDF membránra vittük át és immunfestettük. A Módszerekben leírt módon digitalizált és számszerűsített feketedés értékből következtettünk a fehérjék mennyiségére. Az így kapott értékeket a kezelés előtti fehérje szintekre normalizáltuk. A fehérje felvitel egyenetlenségeit az anti-erk1/2 ellenanyaggal való festés alapján korrigáltuk. Az ábrázolt adatok három független kísérlet eredményének átlagát és szórását tükrözik. 30

31 24 órával a GM-CSF kezelés után azt tapasztaltuk, hogy a Bcl-xl szintje megduplázódott, majd a következő 24 órában tovább emelkedett (2,5-szeresére). Ezzel ellentétben az ionomycin csak nagyon enyhén növelte (1,5-szeres), a CPA pedig nem változtatta a Bcl-xl mennyiségét a vizsgált időtartamban. A Bcl-2 mennyisége mindhárom kezelést követően kétszeresére emelkedett, bár a CPA esetében ez is lassabban zajlott, 24 órás késést figyeltünk meg a GM-CSF-hez képest. A Bax fehérje mennyiségében egyik kezelés sem okozott jelentős változást. A fehérje mennyiségek változásait összevetve elmondhatjuk, hogy összhangban a túlélési adatokkal, az antiapoptotikus fehérjék aránya emelkedett meg. A lassan pusztuló kontroll sejtekben, az antiapoptotikus fehérjék (Bcl-2, Bcl-xl) mennyisége enyhén csökkent, míg a Bax mennyisége kicsit emelkedett (12. B ábra). Ez utóbbi esetben az apoptotikus fehérje aránya növekedett meg. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a [Ca 2+ ] i emelkedés hatására a Bcl-2 fehérje mennyisége növekedett, a többi vizsgált Bcl-2 családba tartozó fehérje mennyisége pedig nem mutatott jelentős változást. Ez arra utal, hogy a Bcl-2 fontos tényező a TF-1 sejtek apoptózis elleni védelmében Az ERK1/2 aktivációjának jellemzése Minthogy a túléléshez és osztódáshoz vezető jelpályák közül a MAPK útvonal az egyik legfontosabb, az aktivált p-erk1/2-re specifikus ellenanyag segítségével vizsgáltuk az ERK1/2 foszforilációjának nagyságát és időfüggését. A 16 órán keresztül GM-CSFmentes médiumban tartott TF-1 sejtek ERK1/2 alapaktivitása lecsökkent. Ezután különböző koncentrációjú ionomycinnel valamint CPA-val kezelve a sejteket (13. A ábra) az ERK1/2 gyors, 5 percen belül bekövetkező, eltérő erősségű foszforilációja volt megfigyelhető. Az ERK1/2 aktivációja függött a [Ca 2+ ] i emelkedés mértékétől. A CPA esetében csak igen gyenge, 500 nm ionomycin koncentráció alatt pedig nem is mutatható ki az ERK1/2 aktiválódása. Ezekben a kísérletben követtük az Elk-1 transzkripciós faktor foszforilációval történő aktiválódását is (13. A ábra). Az Elk-1 foszforiláció együtt zajlott az ERK1/2 aktiválódásával és csak akkor következett be, ha az ERK1/2 foszforiláció meghaladott egy küszöbértéket (lásd 13. A ábra CPA illetve 500 nm alatti ionomycin kezeléseket). 31

32 13. A ábra Az ERK1/2 és Elk-1 fehérjék foszforilációjának koncentráció-függése (A) GM-CSF megvonás után 16 órával kezeltük a sejteket, a kezeléstől számítottuk az időpontokat. A p-erk1/2 és p-elk-1 szintek alakulása 5 perccel a CPA illetve különböző mennyiségű ionomycin kezelést követően. Jellegzetes immunfestési kép, aktivált p-erk és p-elk-1 illetve ERK1/2 elleni ellenanyaggal festve. Tekintettel arra, hogy a fiziológiás válasz kialakulásában mind az aktiválódás mértékének, mind az időbeni lefutásának fontos szerep jut, az 13. B és C ábrákon egy olyan kísérletsorozat eredményeit ábrázoltuk, amely az ERK1/2 és Elk-1 foszforilációjának időfüggését mutatja GM-CSF (2,5 ng/ml), ionomycin (1μM) és CPA (7,5μM) kezelést követően. 13. B és C ábra Az ERK1/2 és Elk-1 fehérjék foszforilációjának időfüggése (B, C) Az ERK1/2 (B) és Elk-1 (C) foszforilációjának időbeli változása. A feketedés értékeket a kiindulási foszforilált fehérje szintekre normalizáltuk. A fehérje felvitel egyenetlenségeit az anti-erk1/2 ellenanyaggal való festés alapján korrigáltuk. Három független kísérlet adatainak átlaga és szórása alapján készült grafikonok. 32

33 Az ERK1/2 aktiváció vizsgálatakor mind a GM-CSF, mind a [Ca 2+ ] i -emelő szerek esetében kétfázisú görbét kaptunk (13. B ábra). Az első csúcsot 5 percnél, míg a másodikat 2 és 3 óra között mértük. Az Elk-1 foszforilációja időben együtt futott az ERK1/2 aktiválódással, ahol ez utóbbi elérte a kritikus szintet (13. C ábra). Így a CPA-s kezelés csak 3 óránál eredményezett Elk-1 foszforilációt. A kontroll sejtekben sem ERK1/2 sem Elk-1 foszforiláció nem volt megfigyelhető a vizsgált időtartamban. A foszforilálatlan ERK1/2 fehérje mennyisége kezeléstől függetlenül változatlan volt, ezért később is ezt használtuk belső kontrollként. A továbbiakban megvizsgáltuk, hogy a külső Ca 2+ szint hogyan befolyásolja az ERK1/2 és az Elk-1 aktiválódását. A GM-CSF, ionomycin és CPA adása előtt a sejteket 3 mm EGTA-val 5 percig előkezeltük. A mintákat abban az időpontban vettük, amikor az ERK1/2 illetve az Elk-1 aktiváció a legmagasabb volt. A 13. D ábrán látható, hogy az EGTA előkezelés a [Ca 2+ ] i -emelő szerek esetén teljesen meggátolta, míg a GM-CSF esetén nem befolyásolta az ERK1/2 és az Elk-1 aktiválódását. 13. D ábra Az EGTA hatása az ERK1/2 és Elk-1 fehérjék foszforilációjára (D) A p-erk1/2 és p-elk-1 fehérjék Western-blot vizsgálata 3 mm EGTA jelenlétében és EGTA nélkül, GM-CSF, ionomycin és CPA kezelést követően illetve kontroll sejtekben (D). Összegezve eredményeinket megállapítottuk, hogy a GM-CSF kezelés hatására az ERK1/2 és az Elk-1 kezdetben nagymértékű aktivációja következik be, amelyet lecsengése után egy kisebb mértékű követ. Mivel a GM-CSF nem okozott mérhető Ca 2+ jelet és az EGTA-s előkezelés sem befolyásolta hatását, nagyon valószínű, hogy az ERK1/2 aktivációjához vezető jelpálya nem ugyanaz, mint a [Ca 2+ ] i -emelő szerek esetében. Az ionomycin és a CPA is két lépcsőben aktiválta az ERK1/2-t, de míg az 33

34 ionomycin esetében az Elk-1 foszforiláció két lépcsős volt, addig a CPA első ERK1/2 aktivációja nem volt elég erős az Elk-1 aktiválódásához. Az aktivációs lépések mindkét szer esetében függtek a külső Ca 2+ szintjétől, azaz Ca 2+ beáramlás nélkül nem játszódnak le. Az, hogy az ionomycin a GM-CSF-hez hasonlóan két fázisban aktiválta az ERK1/2-Elk-1 utat és a sejtek túlélésén kívül az osztódásukat is elősegítette arra utal, hogy az ERK1/2-Elk-1 út első, gyors - vagy még inkább a kétfázisú - aktiválódása fontos kulcslépése lehet a sejtek osztódásának Az [Ca 2+ ] i emelkedés hatása a c-fos, Egr-1 és AP-1 transzkripciós faktorokra Az Elk-1 transzkripciós faktor szabályozza a c-fos és az Egr-1, a hemopoetikus sejtek túlélésében és szaporodásában szerepet játszó transzkripciós faktorok, mennyiségét. Ezért megvizsgáltuk, hogy milyen változások következnek be a c-fos és Egr-1 transzkripciós faktorok mennyiségében [Ca 2+ ] i emelkedés hatására. Kísérleteink azt mutatták, hogy a fehérje szintek megemelkedtek 1 órával az ionomycin illetve GM-CSF kezelést követően (14. A ábra). A [Ca 2+ ] i emelkedés hatását a c-fos és egr-1 gének átírására az emelkedett mrns szintek igazolták (30 percnél). Mivel a CPA kezdetben csak igen gyengén aktiválta az ERK1/2-t, ami az Elk-1 foszforilációjához nem volt elegendő, érthető, hogy ezekben a korai időpontokban (30-60 perc) sem az mrns, sem a fehérje szintek nem változtak CPA kezelést követően. A CPA okozta második aktivációs hullám azonban már elegendőnek bizonyult, hogy mindkét transzkripciós faktor szintjét megemelje 3 órával a kezelés után (14. B ábra). Amint az várható volt, a kontroll sejtekben sem a c-fos, sem az Egr-1 szintje nem változott. A c-fos fehérje egy Jun családba tartozó fehérjével dimerizálódva alakítja ki az AP-1 transzkripciós faktort, amely különböző késői gének átírását szabályozza. DNS kötődési vizsgálattal megállapítottuk, hogy a megemelkedett c-fos mennyiség megnövelte az AP-1 DNS kötődését, ami arra utal, hogy a keletkezett c-fos fehérje funkcionálisan aktív volt (14.C ábra) A MEK gátlásának hatása az ERK1/2 és Elk-1 foszforilációjára és a c-fos és Egr-1 fehérjék mennyiségére A MEK-1 specifikus gátlószere a PD98059 teljes mértékben gátolta a GM-CSF, ionomycin illetve CPA kezelés hatására létrejövő ERK1/2 és Elk-1 aktivációt, továbbá az azt követő c-fos és Egr-1 expressziót is (14. A/B ábra). A CPA esetében ez 3 óránál 34

35 volt észlelhető, hiszen a jelek itt voltak a legerősebbek. Az AP-1 transzkripciós faktor kötődése is teljesen eltűnt a gátlószer hatására a [Ca 2+ ] i -emelő szerrel kezelt sejtek esetében (14. C ábra). 14. ábra A PD98059, MEK-1 gátlószer hatása az ERK1/2 és Elk-1 fehérjék foszforilációjára, a c-fos és Egr-1 fehérjék mennyiségére GM- CSF és ionomycin (A) illetve CPA (B) kezelést követően. Az AP-1 DNSkötődésének vizsgálata MEK-1 gátlószer hatására ionomycin és CPA kezelést követően (C). 30 perc PD gátlószerrel való előkezelést követően a sejteket az ábrán feltüntetett szerekkel a megadott ideig kezeltük. A minták egy részéből fehérjét preparáltunk majd Westernblot módszerrel vizsgáltuk a p-erk1/2 és p-elk-1 fehérjék illetve a c-fos és Egr-1 transzkripciós faktorok mennyiségét, a megfelelő ellenanyagok segítségével. A fehérje felvitelt anti-erk1/2 ellenanyaggal való festés alapján ellenőriztük (A, B). A [Ca 2+ ] i -emelő szerekkel kezelt minták másik feléből kivontuk a magi fehérjéket és EMSA módszerrel vizsgáltuk az AP-1 transzkripciós faktor DNS-kötődését. A DNS-kötődés specifikusságát a legerősebb jel jelöletlen, AP-1 specifikus oligonukleotiddal való leszorítása alapján ellenőriztük (C). Hasonló gátlást figyeltünk meg egy másik MEK1/2 inhibitor, az UO126 esetében is. Gátlószerrel végzett kísérleteink azt mutatták, hogy a c-fos és Egr-1 mennyiségének növelése a MEK-ERK1/2-Elk-1 útvonal aktiválásán keresztül valósult meg. 35

36 A MEK gátlásának hatása a hormon-független túlélésre A MEK-ERK1/2-Elk-1 útvonal szerepét a TF-1 sejtek túlélésében és osztódásában a MEK gátlószer hosszú távú hatásának vizsgálatával jellemeztük. A 3. táblázatban látható, hogy a PD98059 minden esetben csökkentette a Bcl-2 mennyiségét, jelezve, hogy a Bcl-2 szabályozása az ERK1/2 aktiválódásán keresztül zajlik. A MEK-1 gátlása a sejtszám és az élő sejtek arányának jelentős csökkenéséhez vezetett 48 órával az ionomycin illetve CPA kezelést követően (3.táblázat). 3. táblázat. A MEK-1 gátlószer, PD98059 hatása a sejt Bcl-2 szintjére, osztódására, és életképességére. Bcl-2 mennyiség Sejtszám növekedés (%) Életképesség (%) (rel. egység) Kontroll 0,91±0,12 44,8±16,1 61,6±7,4 PD ,75±0,12 7,1±3,1 8,3±2,8 GM-CSF 1,47±0,19 322±79,3 95,5±3,9 GM-CSF+PD 0,85±0,13 182,6±16,2 92,0±4,1 CPA 1,28±0,16 153±32,1 90,0±3,2 CPA+PD ,80±0,13 32,2±10,8 53,0±5,2 Ionomycin 1,39±0,20 271,0±55,4 95,0±3,4 Ionomycin+PD ,78±0,15 15,2±5,5 14,0±4,8 A Bcl-2 mennyiségét Western-blot alapján határoztuk meg 12 órával a megadott kezeléseket követően. Az eredményeket a kiindulási Bcl-2 mennyiségéhez (1,00) viszonyítottuk. A fehérjefelvitelt az ERK1/2 szintekre standardizáltuk. A sejtek osztódását és életképességét tripánkék kizárásos módszerrel mértük, 48 órával a megadott kezeléseket követően. Az eredményeket a kiindulási sejtszámhoz (100%) viszonyítottuk. Az adatokat legalább három független kísérlet eredményeiből számoltuk (átlag±szórás(sd)). A MEK-1 gátlás az ionomycin esetében nagyobb mértékű sejtpusztuláshoz vezetett, mint a CPA-s kezelést követően. Ez arra utal, hogy az ERK1/2 aktiválódása nélkül a 36

37 sejtek rosszabbul tűrik az ionomycin okozta magas [Ca 2+ ] i t. A GM-CSF-fel kezelt sejtekben a MEK-1 gátlása nem okozott számottevő csökkenést az élő sejtek arányában, csupán a sejtszám növekedése lassult le. Eredményeink azt mutatják, hogy a GM-CSF kezelést követő ERK1/2 aktiváció a sejtosztódásban játszik szerepet, a sejtek túlélését a GM-CSF receptorról induló más jelpályák is képesek biztosítani. Ezzel szemben a [Ca 2+ ] i -emelő szerekkel előidézhető hormon-független túléléshez, illetve osztódáshoz az ERK1/2 MAPK út aktiválódása nélkülözhetetlen Az ERK1/2 MAPK szerepe az eritroid differenciációban Ez az alfejezet a ben megjelent eredményeinken alapul (Kolonics, A., et al., Cell Signal, (10): p ), az utolsó részben közölt adatok kivételével, mivel ezeket a kísérleteket a két cikk eredményeit összevetve terveztük Az Epo hatására bekövetkező sejtszám változások GM-CSF megvonással szinkronizált TF-1 sejteket kezeltünk 5 U/ml hrepo vagy 2,5 ng/ml GM-CSF hormonnal, és követtük a sejtszám, illetve az élő sejtek arányának változását tripánkék kizárásos módszerrel (15. ábra). 15. ábra A sejtszám (A) és az életképesség (B) változása a GM-CSF és az Epo hormonnal kezelt, illetve a kontroll sejtekben. 16 óra GM-CSF megvonás után (kiindulási időpont) a TF-1 sejteket a következő anyagokkal kezeltük: 2,5 ng/ml GM-CSF és 5 U/ml Epo. A sejtszám változásokat tripán-kék kizárásos módszerrel határoztuk meg. A sejtszám növekedést a kiindulási sejtszámra (100%) vonatkoztattuk. Az életképesség az élő/ összes sejt arányát tükrözi százalékban kifejezve. Az adatok 3 független kísérlet eredményét tükrözik. 37

38 A növekedési hormon visszaadása a sejtek túléléséhez és folyamatos osztódásához vezetett. Az Epo kezelés nem védte meg a sejteket a pusztulástól. 72 órával az Epo kezelést követően mind a sejtszám (57,8±17,8%-ra), mind az életképesség (69,1±7,8%- ra) jelentősen csökkent a kiindulási értékhez (100%) képest, habár kisebb mértékben, mint a kezeletlen (kontroll) sejtek esetében. Hasonló eredményre vezetett, ha az élő sejtek arányát MTT teszttel, illetve propidium-jodidos festéssel határoztuk meg. Amint az a 16. A ábrán megfigyelhető, a kezeléseket megelőző hormonmegvonás kétszeresére növelte a kaszpáz-3 aktivitását a normál tenyészetben mérhető értékhez képest. 16. ábra Akaszpáz-3 enzimaktivitásának időfüggése (A) és a DNS létra (B) vizsgálata GM- CSF és Epo kezelést követően, illetve a kontroll sejtekben. A 2,5 ng/ml GM-CSF mellett tartott (tenyészet) vagy a 16 óra GM-CSF megvonás után kezelt, illetve kezeletlen (kontroll) sejtekben mértük a kaszpáz-3 enzim aktivitását fluorimetriás módszerrel (részletes leírását lásd Módszerek fejezetben). Az ábrán három független kísérlet eredményét mutatjuk be, az értékeket 16 óra GM-CSF megvonás utáni sejtekben mért értékre vonatkoztattuk (A). 16 óra GM-CSF megvonás után a sejteket kezeltük a megadott anyagokkal, illetve kezeletlenül (kontroll) hagytuk. 72 óra után kinyertük a DNS-t a mintákból (B). A mintákat etidium-bromidot tartalmazó agaróz gélen futattuk, majd az eredményt lefényképeztük A GM-CSF visszaadása 2-3 órán belül a tenyészetben mérhető szintre csökkentette az enzim aktivitását, amely a vizsgált időtartamban már nem is változott. Ezzel szemben mind a kontroll, mind pedig az Epo-val kezelt sejtekben folyamatosan emelkedett az enzim aktivitása. Ezt követően 48 órával a kezelések után az Epoval kezelt, illetve a kontroll sejtekben az apoptózisra jellemző DNS létrát is megfigyeltünk, míg a GM-CSF kezelést követően a DNS feldarabolódása nem volt kimutatható (16. B ábra). A GM- CSF kezelés hatására megemelkedik mind a Bcl-2, mind a Bcl-xl mennyisége (12. 38

39 ábra). Az Epo hatására az a Bax és a Bcl-xl mennyisége nem változott, a Bcl-2 szintje pedig felére csökkent már 24 órával az Epo kezelést követően. Kísérleteink azt mutatták, hogy az Epo nem képes sem a sejtek növekedését, sem túlélésüket biztosítani, jelenlétében a sejtek apoptotizálnak Az Epo hatása az eritroid differenciációra Hormon-megvonással szinkronizált sejteket 5 U/ml Epo hormonnal kezeltünk, és benzidines festéssel követtük a hemoglobin-termelést. A TF-1 sejtek hemoglobin szintje folyamatosan nőtt; már 24 óránál mérhetően megemelkedett a kontroll sejtekhez képest, a legmagasabb értéket 48 és 72 óra között érte el. 72 órával az Epo kezelés után a hemoglobin mennyisége akár a kiindulási szint ötszörösét is elérte (17. A ábra). Amint várható volt a GM-CSF (2,5-25 ng/ml között) nem emelte a hemoglobin szintjét 72 óra alatt. Sőt 2,5 ng/ml GM-CSF jelenlétében az Epo-val előidézhető hemoglobin-termelés sem indult be. Azonkívül a GM-CSF akkor is visszaszorította a hemoglobin képződését, ha az Epo után 24 órával adtuk a GM-CSF hormont (17. A ábra). Ez azt jelenti, hogy a GM-CSF gátolja az Epo-val előidézhető hemoglobin-termelést, továbbá, hogy a hemoglobin termelő sejtek osztódását sem segíti elő ábra A hemoglobin szint (A) és a c-myb DNS-kötődésének (B) változása kontroll, GM-CSF, illetve Epo kezelést követően ng/ml GM-CSF mellett tartott (*), illetve 16 óra GM-CSF megvonással szinkronizált sejteket kezeltünk Epo hormonnal. A sejtek hemoglobin tartalmát 72 óra múlva benzidines festéssel határoztuk meg, legalább három független kísérletben (A). A GM-CSF illetve Epo hormonnal kezelt mintákból magi fehérje frakciót készítettünk, és EMSA módszerrel vizsgáltuk c- Myb transzkripciós faktor DNSkötődését. A DNS-kötődés specifikusságát a legerősebb jel c- Myb specifikus, de jelöletlen oligonukleotiddal való leszorítása alapján ellenőriztük (B). A félkvantitatív analízis alapján 6 órával a kezelések után a GM-CSF illetve Epo kezelt sejtekben a c-myb DNS-kötődésének aránya: 3,5±0,4 (n=3), (p<0,02).

40 A c-myb transzkripciós faktor eritroid differenciációban betöltött negatív szerepéről több cikk is megjelent [138, ]). Ezért megvizsgáltuk az Epo és a GM-CSF hatását a c-myb transzkripciós faktor DNS-kötődésére EMSA módszerrel. 16 órán keresztül megvontuk a TF-1 sejtektől a GM-CSF-et, majd Epo illetve GMCSF hormonnal kezeltük őket. Különböző idő elteltével elválasztottuk a magi fehérjéket és vizsgáltuk a minták DNS-hez való kötődését. Amint az a 17. B ábrán látható, az Epo folyamatosan csökkentette, míg a GM-CSF növelte a c-myb DNS-kötését. Méréseink azt mutatták, hogy 6 órával a kezelések után, a GM-CSF több mint háromszorosára növelte c-myb-dns komplex mennyiségét az Epo hatásához képest. A c-myb fehérje mennyisége is hasonlóan változott Western-blot alapján. Az Epo tehát elősegítette a hemoglobin képződést, és csökkentette a c-myb mennyiségét, illetve DNS-hez való kötődését. A GM-CSF nem okozott eritroid differenciációt, sőt még az Epo által előidézhető érést is megakadályozta Az Epo és a GM-CSF hatása a MAPK-ok aktivációjára Mivel jól ismert, hogy a MAPK-ok részt vesznek az érési folyamatok szabályozásában, megvizsgáltuk az Epo (5 U/ml), illetve a GM-CSF (25 ng/ml) hatását a Raf-1, a JNK és a p38 aktiválódására. Az in vitro kináz assay-ben az immunprecipitált kinázok aktivitását vizsgáljuk hozzáadott szubsztrátok segítségével. A Raf-1 esetében MEK-1, míg a JNK és a p38 esetében ATF-2 fehérjét használtunk szubsztrátként. A 18. ábra A részének tanusága szerint a GM-CSF megvonással szinkronizált sejtekben (kontroll) nagyon alacsony volt a Raf-1 aktivitás, ami a GM-CSF visszaadását követően megemelkedett. Az Epo azonban nem aktiválta a Raf-1 kinázt. A JNK és a p38 esetében a szinkronizált sejtekben is mérhető aktivitást tapasztaltunk, amit azonban sem a GM- CSF, sem az Epo nem tudott tovább fokozni (18. B/C ábra). A kontrollként használt anizomicin hasonló körülmények között jelentős mértékben emelte a p38 aktivitását (18. C ábra). Akkor sem tapasztaltunk aktiválódást, amikor aktivált p-jnk illetve p-p38 elleni ellenanyagokkal vizsgáltuk a GM-CSF, illetve az Epo kezelés hatását. Egyedül a Raf-1/MEK-1 út aktiválódását figyeltük meg GM-CSF kezelés hatására. Mivel ez az út az ERK1/2 aktiválódásához vezet, a következőkben az ERK1/2 MAPK aktiválódását vizsgáltuk meg részletesebben. 40

41 18. ábra A Raf-1 (A), a JNK (B) és a p38 (C) kinázok aktivitásának változása GM-CSF, és Epo hormonnal kezelt, illetve a kontroll sejtekben. A TF-1 sejteket 16 óra GM-CSF megvonás után kezeltük 25 ng/ml GM- CSF és 5 U/ml Epo hormonnal, illetve kezeletlenül hagytuk. 15 perc elteltével a sejteket feldolgoztuk (lásd Módszerek), majd az így kapott mintákban mértük a kinázok aktivitását in vitro kinase assay módszerrel. A kinázok hatására a megfelelő szubsztrátjaik radioaktív foszforral jelölődtek, amit autoradiográfiásan láthatóvá tettünk. A JNK illetve p38 esetében a membránt immunfestettük JNK-1, illetve p38 elleni ellenanyaggal,hogy a fehérjefelvitel egyenletességét ellenőrizzük (A és B). A Raf-1 kináz esetében a kísérlet ismétlése hasonló eredményt mutatott Az Epo és a GM-CSF hatása az ERK1/2 aktivációjára Az aktivált ERK1/2 ellen termeltetett foszfospecifikus ellenanyag segítségével, Western-blot módszerrel vizsgáltuk az ERK aktiválódását a különböző kezelések hatására. Bár leírták az ERK1/2 aktiválódását Raf-1 független úton is Swiss 3T3 sejtekben [150, 151], a TF-1 sejtekben a Raf-1 és az ERK 1/2 aktiválódás hasonló lefutású. A kontroll sejtek igen alacsony Raf-1 és ERK1/2 aktivitást mutattak. Ezeket a kiindulási aktivitásokat csak a GM-CSF tudta fokozni, az Epo még sokkal magasabb koncentrációkban (50 U/ml és 100 U/ml) sem (19. A ábra). Ezen az ábrán mutatjuk be azt is, hogy párhuzamosan az ERK1/2 aktivációjával, foszforilálódik az Elk-1 transzkripciós faktor is. A GM-CSF hatására bekövetkező ERK1/2 és Elk-1 foszforiláció teljesen gátolható MEK gátlószerek 30 μm PD98059 (19. A ábra), illetve 10 μm UO126 - segítségével. Mivel a GM-CSF aktiválja a PKC Ca 2+ -független, de DAG-függő izoformáját [152] és a PKC aktiválódása az ERK1/2 aktiválódásához vezethet [153], megvizsgáltuk a PKC szerepét az ERK1/2 aktiválódásában. Ha GM- CSF kezelés előtt PKC gátlószert (BIM, 5 μm) adtunk a sejtekhez, ez csak kis mértékben csökkentette az ERK1/2 és az Elk-1 foszforilációt. Ugyanennyi BIM viszont 41

42 teljesen meggátolta a PMA hatására létrejövő eredetileg magasabb szintű foszforilációt is (19. A ábra). Ez azt jelenti, hogy a GM-CSF a PKC aktiválástól nagyrészt függetlenül, MEK függően aktiválja az ERK 1/2 és az Elk-1 fehérjéket a TF-1 sejtben. 19. ábra Az ERK1/2 és Elk-1 (A), illetve a CREB aktiválódásának (B) vizsgálata. TF-1 sejteket 16 óra GM-CSF megvonás után kezeltük az ábrán feltüntetett szerekkel. (A BIM és a PD98059 gátlószerekkel 30 percig tartott az előkezelés.) 15 perc elteltével a sejteket feldolgoztuk (lásd Módszerek), majd az így kapott fehérjemintákat Western-blot módszerrel elemeztük. A PVDF membránokat ERK1/2 (A), illetve CREB (B) ellenanyaggal is immunfestettük, hogy a fehérjefelvitel egyenletességét ellenőrizzük. A másik transzkripciós faktor, amely receptor közvetített úton, ERK1/2 függően is aktiválódhat, a CREB. Ezért vizsgáltuk a CREB fehérje foszforilációját GM-CSF, illetve Epo kezelést követően (19. B ábra). A PMA a PKC aktiválásán keresztül szintén aktiválhatja a CREB fehérjét, így a PMA-t használtuk pozitív kontrollként. 15 perccel a kezelések után azt tapasztaltuk, hogy a GM-CSF és a PMA hatására az aktivált p-creb mennyisége megnövekedett, míg az Epo, még magasabb koncentrációban sem okoz változást a p-creb szintjében. Tovább vizsgálva a folyamatot, PKC illetve MEK gátlószerrel előkezeltük a sejteket. A GM-CSF kezelés esetén a MEK gátlása teljesen, míg a PKC gátlása csak részben gátolta a CREB foszforilációját. A PMA esetében 42