Áttekintés 5/11/2015 MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK 1 FÉNYMIKROSZKÓPIA FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA. Mikroszkópia, fénymikroszkópia

Átírás

1 forrás: ldutolsó dia PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK 1 FÉNYMIKROSZKÓPIA FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA humán tüdőszövet (hisztológia) sejtmozgás (fázis kontraszt mikroszkópia) mikrosebészet egyedi molekulák formin, aktin (TIRFM) mitózis, tengericsillag petesejt aktin, mikrotubulus, kromoszómák (3D konfokális mikroszkópia) BIOFIZIKA március 18. Dr. Bugyi Beáta Biofizikai Intézet mitózis aktin, mikrotubulus (konfokálismikroszkópia) véráram élő egér májában dextran, hepatociták (intravitálismikroszkópia) Áttekintés KÉPALKOTÓ MÓDSZEREK MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK FÉNYMIKROSZKÓPIA» a fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei fény-anyag kölcsönhatása: REFRAKCIÓ, DIFFRAKCIÓ NAGYÍTÁS, FELBONTÁS, KONTRASZT FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA» speciális komponensek a fluoreszcencia mikroszkópban Mikroszkópia, fénymikroszkópia MIKROSZKÓPIA = MIKROS (kicsi) + SZKOPEIN (nézni) - az emberi szem számára láthatatlan objektumok láthatóvá tétele - különbözõ mérettartományba esõ biológiai objektumok megfigyelése: szervektõl (cm 10-2 m) egyedi molekulákig (nm 10-9 m). PÁSZTÁZÓ PRÓBA MIKROSZKÓPIA ELEKTRON MIKROSZKÓPIA FÉNYMIKROSZKÓPIA A képalkotáshoz látható fényt ( nm) és üvegbõl készült lencséket alkalmaz. a kis objektumoknak elég nagynak kell lenniük, hogy az emberi szem számára láthatóvá váljanak 1

2 Az egyszerû fénymikroszkóp képalkotása 1x nagyító Az összetett fénymikroszkóp képalkotása 2x nagyító GYŰJTŐLENCSE T K1 megfigyelő olvasókő (~ B.C. Abbas Ibn Firnas) OBJEKTÍV gyűjtőlencse közelebb a tárgyhoz K2 T OKULÁR gyűjtőlencse közelebb a megfigyelőhöz K1 megfigyelő NAGYÍTOTT valós fordított állású von Leeuwenhoek ( holland zoológus, mikrobiológus) NAGYÍTOTT látszólagos fordított állású NAGYÍTOTT valódi fordított állású Hans & Zacharias Jansen (~1590 holland üvegműves, optikus) Lencserendszerek a modern fénymikroszkópban A fénymikroszkóp nagyítása é é í á á é OKULÁR KONDENZOR egyenletes megvilágítás Köhler ó í á OBJEKTÍVlencse: í ~ OKULÁRlencse: á ~10 25 ó ~ OBJEKTÍV Lencsék, lencserendszerek numerikus apertúra NUMERIKUS APERTÚRA(NA) egy optikai lencse(rendszer) fénygyűjtő képessége NA több fényt gyűjt össze NA n sinα n: a lencse és a tárgy közötti közeg törésmutatója α: apertúra szög, a lencse által összegyűjtött fénykúp félnyílásszöge Ha korlátlan nagyítású lencserendszert használnánk, akkor korlátlanul kis dolgokat is láthatóvá tudnánk tenni? NEM A fény hullámtermészetét is figyelembe kell vennünk! DIFFRAKCIÓ, INTERFERENCIA (korábban: EM hullámok, RTG-diffrakció elõadás) 2

3 a tárgy minél apróbb részletei is elkülöníthetõk legyenek egymástól A fénymikroszkóp felbontóképessége FELBONTÁSI HATÁR az a legkisebb távolság, amelyre eső két különálló tárgypont két különálló pontként jelenik meg a képen(d) Diffrakció a fénymikroszkópban KÉP észlelhető fényhatás/diffrakciós kép elhajlási rendek: 0, 1, 2 SZÉTSZÓRT A TÉRBEN A kép, mint diffrakciós mintázat John Herschel ( , angol csillagász), George Biddell Airy( , angol csillagász) AIRY MINTÁZAT: egyetlen pontszerű tárgy diffrakció limitált képe 3D-ban: PSF (POINT SPREAD FUNCTION) objektív hátsó fókuszsíkja DESTRUKTÍV minimum - sötét KONSTRUKTÍV maximum - világos INTERFERENCIA fényforrás DIFFRAKCIÓ TÁRGY optikai rács rácsállandó: d periodikus optikai sajátságok INFORMÁCIÓ XY irány laterális Z irány axiális Richard W Coleet al Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality controlnature Protocols (2011) A felbontás Abbe-féle határa Ernst Abbe( ) A fénymikroszkóp felbontóképessége diffrakciós limit Képformálás: A 0. rendű maximum mellett legalább az 1. rendű maximum is részt vesz a képalkotásban. 1 objektív 0 1 A maximumok elhajlási irányaira ( ): 0, 1, 2 Részt vesz a képalkotásban: 1esetre: Össze kell gyűjteni: 2 2 Rayleigh-feltétel: Az egyik pont képének főmaximuma a másik pont képének első mellékmaximumára essen. XY irány laterális, 0.61 ~200 Z irány axiális 2 ~800 λ: a megvilágító fény hullámhossza NA: a lencserendszer numerikus apertúrája 3

4 Klasszikus felbontás növelési lehetõségek λ: a megvilágító fény hullámhosszának csökkentése hullámhossz (nm) NA= 0.8 d x,y (nm) NA: a lencserendszer numerikus apertúrájának növelése IMMERZIÓS KÖZEG 1877 diffrakciós határ Ernst Abbe, Carl Zeiss 2014 Nobel díj Stefan Hell, Eric Betzig és William Moerner "for the development of super-resolved fluorescence microscopy" immerziós közeg törésmutató levegő víz glicerin olaj Ernst Abbe emlékmű, Jena 014/ a tárgy minden érdekes része elkülönüljön a környezetétõl Kontraszt Probléma: a legtöbb élő minta (szövet/sejt ) vékony és optikailag transzparens, így nehéz láthatóvá tenni átesőfénymikroszkópiával. A vizsgált objektumoptikai INHOMOGENITÁSA (azon sajátsága, ami megkülönbözteti a környezetétől) fényelnyelés törésmutató alak szín a mintán áthaladó FÉNY SAJÁTSÁGAINAK MEGVÁLTOZÁSÁT eredményezi irány sebesség fázis polaritás hullámhossz Kontrasztnövelőtechnikák: fázis-kontraszt-, differenciális interferencia kontraszt (DIC), Hoffman-modulációs kontraszt-, sötétlátóterű-, polarizációs-, fluoreszcencia mikroszkópia Fluoreszcencia mikroszkópia FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA fénymikroszkópia + fluoreszcencia A képalkotáshoz látható fényt ( nm) és üvegbõl készült lencséket alkalmaz. A vizsgált mintát a fluoreszcencia emissziója révén képezi le. Elõnyei: fluoreszcencia biztosította spektrális flexibilitás kontraszt kevéssé invazív speciális alkalmazások (FRAP, FRET, FLIM) speciális technikák révén a felbontóképesség javítható Hogyan tehetjük fluoreszcenssé a vizsgált mintát? standard fluorofórok BELSŐ(INTRINSIC) FLUOROFÓRÓK: autofluoreszcencia, limitált KÜLSŐ(EXTRINSIC) FLUOROFÓRÓK: spektrális flexibilitás szintetikusfesték kvantum gyöngy fluoreszcens fehérje GFP: zöld fluoreszcens fehérjeés változatai 2008 Kémiai Nobel díj: Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP". antitest, immunofluoreszcencia 4

5 Hogyan tehetjük fluoreszcenssé a vizsgált mintát? szabályozható (fotokonvertálható) fluorofórok Hogyan képezhetjük le a minta fluoreszcenciáját? STANDARD trans FÉNYFORRÁS ívlámpa lézer FOTOAKTIVÁLHATÓ DETEKTOR szem minta FOTOKAPCSOLHATÓ SZŐRİK TÜKRÖK epi DETEKTOR CCD kamera PMT Hogyan képezhetjük le a minta fluoreszcenciáját? optikai szûrõk, dikroikus tükrök (ld. Áramlási citometria) OPTIKAI SZŐRİK hullámhosszfüggı transzmissziós/abszorpciós sajátságok aluláteresztı felüláteresztı sáv DIKROIKUS TÜKRÖK hullámhosszfüggı reflexiós és transzmissziós/abszorpciós sajátságok Hogyan képezhetjük le a minta fluoreszcenciáját? optikai szûrõk, dikroikus tükrök dikroikus tükör emissziós szőrı gerjesztési szőrı DIKROIKUS TÜKÖR DETEKTOR OKULÁR OBJEKTÍV EMISSZIÓS SZŐRİ FÉNYFORRÁS GERJESZTÉSI SZŐRİ MINTA VASP-GFP aktin-rfp VASP-GFP aktin-rfp VASP-GFP aktin-rfp Shows again the localization of VASPat protruding lamellipodia and filopodia tips in a fish fibroblast expressing VASP-GFPand Actin-RFP. forrás: Shows again the localization of VASPat protruding lamellipodia and filopodia tips in a fish fibroblast expressing VASP-GFPand Actin-RFP. forrás: 5

6 Fény-, fluoreszcencia mikroszkópia kulcsfogalmak : nagyítás, felbontás, kontraszt Lencsék, lencserendszerek képalkotása Numerikus apertúra Airy mintázat, diffrakciós határ Speciális elemek a fluoreszcencia mikroszkópban: fluorofórok, fényforrások, detektorok, optikai szûrõk, tükrök Javasolt internetes anyagok /