Minta-előkészítési tanulmány PAH vegyületek csecsemőtápszerből történő meghatározására

Átírás

1 Minta-előkészítési tanulmány PAH vegyületek csecsemőtápszerből történő meghatározására Szakdolgozat Kémia Alapszak NAGY DÁVID Témavezetők: Dr. Eke Zsuzsanna Nyiri Zoltán Analitikai Kémiai Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest Természettudományi Kar Kémiai Intézet A védés helye: Analitikai Kémiai Tanszék 2015

2 Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Eke Zsuzsannának, amiért hasznos tanácsaival, javaslataival és útmutatásával hozzájárult szakdolgozatom megírásához. Köszönettel tartozom Nyiri Zoltán PhD hallgatónak, aki nélkül a szakdolgozat nem valósult volna meg. Továbbá köszönet illeti az Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratóriumot, amiért lehetővé tették számomra a szakdolgozat elkészítését. Köszönettel tartozom a családomnak a támogatásért. 1

3 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás... 1 Rövidítésjegyzék Bevezetés Irodalmi áttekintés A csecsemőtápszerek jellemzése A csecsemőtápszerek gyártása Policiklusos aromás szénhidrogének általános jellemzése Fizikai-kémiai tulajdonságok A policiklusos aromás szénhidrogének keletkezése, előfordulása Expozíció Metabolizmus, toxicitás Szabályozás A PAH-ok meghatározási lehetőségei Kromatográfiás módszerek Folyadékkromatográfia Gázkromatográfia Minta-előkészítési módszerek Szilárd fázisú extrakció Molekuláris lenyomatú polimer szilárd fázisú extrakció Szilárd fázisú mikroextrakció Gélpermeációs kromatográfia Szilárd fázisú mátrix diszperzió Túlnyomásos folyadékextrakció Donor akceptor komplex kromatográfiás tisztítás Egyéb módszerek Az irodalomból levonható következtetések Célkitűzés Kísérleti rész Felhasznált vegyszerek Alkalmazott készülékek, eszközök Kromatográfiás körülmények Minta-előkészítés Potenciálisan zavaró komponensek azonosítása

4 4.4.2 Minta-előkészítés kidolgozása Extrakciós hatékonyság vizsgálata Kidolgozott minta-előkészítési módszer Kalibráció A kidolgozott módszer jellemzése Visszanyerés vizsgálata Torzítatlanság Eredményekből levonható következtetések Szakdolgozat összefoglaló Summary Irodalomjegyzék

5 Rövidítésjegyzék Ace acenaftén Acy acenaftilén Anth antracén BaA benzo[a]antracén BaP benzo[a]pirén BbF benzo[b]fluorantén BghiP benzo[g,h,i]perilén BkF benzo[k]fluorantén Chr krizén DahA dibenzo[a,h]antracén EtOH etanol FLD fluoreszcens detektor Flt fluorantén Flu fluorén GC gázkromatográfia HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia IcdP indeno[1,2,3-cd]pirén LOD kimutatási határ LOQ meghatározási határ LVI nagy térfogatú injektálás MS tömegspektrometria MeOH metanol Nap naftalin SPE szilárd fázisú extrakció SPME szilárd fázisú mikroextrakció PAH policiklusos aromás szénhidrogének Phe fenantrén Pyr pirén SCAN a tömegspektrométer pásztázó üzemmódja SIM a tömegspektrométer szelektív ionkövetési üzemmódja 4

6 1. Bevezetés Az újszülöttek számára a legjobb táplálék az anyatej. Az Egészségügyi Világszervezet (World Health Organization, WHO) az anyatejet javasolja, mint kizárólagos táplálékforrást 6 hónapos korig. Így érhető el az újszülöttek egészséges fejlődése, növekedése. A gyermekek anyatejjel történő táplálása kiegészítő élelmiszerek használata mellett 2 éves korukig ajánlott. Azonban nem minden édesanya képes megfelelő minőségű és mennyiségű anyatejjel ellátni újszülöttjét, ezért az anyatejet helyettesítő termékekre van szükség. Így nyernek létjogosultságot az anyatejpótló csecsemő tápszerek. A csecsemőtápszerrel szembeni legfőbb elvárás, hogy az anyatej kémiai összetételét minél inkább megközelítse. A kiindulási alapanyag általában tehéntej, azonban lényeges eltérések mutatkoznak az anyatej összetételéhez viszonyítva [1]. Csecsemőkorban a szervezet rendkívül érzékeny a táplálék összetételére. Az élet ezen korai szakaszában különösen fontos jó minőségű, toxikus vegyületektől mentes élelmiszert biztosítani számukra, az egészséges fejlődés érdekében. A policiklusos aromás szénhidrogének (Policyclic Aromatic Hydrocarbons, PAH vegyületek) karcinogén, mutagén vegyületek. Többek között előfordulhatnak élelmiszerekben, csecsemőtápszerben való jelenlétük komoly egészségügyi kockázatot jelenthet az újszülöttekre. Az eddigiek során főként növényi eredetű olajokban, illetve hőkezeléssel, füstöléssel járó élelmiszeripari folyamatoknak kitett élelmiszerekben vizsgálták a PAH vegyületek mennyiségét. Csecsemőtápszerekben mindeddig kevés alkalommal vizsgálták a PAH-ok előfordulását, annak ellenére, hogy élelmiszer-biztonsági szempontból fontos felmérni a kockázatot a csecsemőtápszereket illetően is. Az Európai Bizottság 835/2011 rendelete szabályozza a PAH vegyületek mennyiségét csecsemőtápszerekben, összesítve benzo[a]pirénből, benzo[b]fluoranténből, krizénből, benz[a]antracénból maximálisan 1 µg/kg mennyiséget tartalmazhatnak [2]. 5

7 2. Irodalmi áttekintés 2.1 A csecsemőtápszerek jellemzése A legtöbb csecsemőtápszer tehéntej alapú. A tehéntej két-háromszor több fehérjét tartalmaz, mint az anyatej, melyek aminosav-összetétele is eltérő. Az anyatej több ciszteint tartalmaz, míg fenil-alaninból, triptofánból, tirozinból kevesebbet. Fontos különbség a fehérjék típusainak aránya: az anyatejben található fehérjék 60%-a tejsavó-fehérje, míg a tehéntejben ez az arány 20%. A lipidek is fontos összetevői a csecsemőtápszereknek. Az esszenciális zsírsavak (linoleinsav, a-linoleinsav) mellett az idegrendszer és a retina fejlődéséhez elengedhetetlen, többszörösen telítetlen arachidonsavat és dokozahexaénsavat is tartalmazniuk kell. Ezek a tehéntejben kis mennyiségben fordulnak csak elő, ezért a csecsemőtápszerek gyártása során a hozzáadásuk igen fontos [3,4]. Szénhidrátok szempontjából a tehéntej kevesebb laktózt tartalmaz, és csak nyomnyi mennyiségben találhatók benne oligoszacharidok, így ezekben a komponensekben is dúsítani kell a csecsemőtápszert. Az anyatej a K, és D vitamin kivételével minden zsíroldható és vízoldható vitamint tartalmaz. A tehéntejhez képest több A, E, C vitamin, nikotinsav, inozitol található meg benne. A nyomelemek mennyisége is eltér. Ezért az eltérő összetételből adódóan pótolni kell a tehéntej-alapú csecsemőtápszerben a hiányzó vitaminokat (A, E, C, D, K vitamin, stb.) illetve nyomelemeket (Ca, Zn, Fe, Cu, Mn, I, Se). Szabad nukleotidok is találhatók az anyatejben, de nincs elérhető dózis-hatás összefüggés a csecsemőtápszerhez hozzáadott nukleotidok és a csecsemő fejlődése között [5]. Az anyatej emellett számos egyéb biológiailag aktív vegyületet is tartalmaz, például növekedési faktorokat, citokineket, immunválaszt elősegítő vegyületeket. Immunoglobulin A is megtalálható az anyatejben, azonban ezen antitestek hozzáadása a csecsemőtápszerhez nem megvalósítható, jelenlétük egyéb komponensekkel helyettesíthető a csecsemőtápszerben [6]. A csecsemőknek növekedésük előrehaladtával eltérő összetételű tápszerre van szükségük, korcsoportok szerinti lebontásban: anyatej-pótló tápszer (6 hónapos korig) anyatej-kiegészítő tápszer (6-18 hónapos korig) junior tápszer (1-3 éves korig) 6

8 A tehéntej alapú csecsemőtápszerek nem minden esetben alkalmazhatóak, különös tekintettel a laktóz-intoleranciában és kazein-allergiában szenvedőkre [7]. A speciális egészségügyi igényeknek megfelelően különböző típusú tápszerek érhetők el: hipoallergén, részlegesen hidrolizált fehérjetartalommal szója alapú, szójafehérjék alkalmazása kazein helyett elemi formula, aminosavak alkalmazása fehérjék helyett 2.2 A csecsemőtápszerek gyártása A csecsemőtápszer az egyik legszigorúbban szabályozott kereskedelmi forgalomban lévő élelmiszer. Az Amerikai Gyógyszer- és Élelmiszerellenőrző Hatóság (FDA, Food and Drug Administration) szabályozása kiterjed a tápanyag összetételre, minőség-irányítási műveletekre, termékmegjelölésre [8]. A csecsemőtápszerek kétfajta kiszerelésben, por és folyékony (etetésre kész) formában kaphatók. A csecsemőtápszerek alapanyaga általában pasztörizált tej koncentrátum vagy teljes, illetve fölözött tejpor. Két gyártási technológia használatos a csecsemőtápszerek előállítására, a száraz keverési és a nedves keverési eljárás. A száraz keverési eljárásnál az összetevőket por formában keverik össze. Az eljárás olcsó, hőkezelés nélkül azonban fennáll a veszélye a mikrobiológiai szennyeződésnek, illetve nem megfelelő keverés esetén a porkeverék inhomogén lesz [9,10]. A gyártási séma nedves keverési eljárásnál 3 fő lépésből áll: a keverék előkészítése, evaporáció, szárítás [10]. Ezen lépések célja a hidrofil és lipofil nyersanyagok stabil emulzióvá történő homogenizálása, illetve a mikroorganizmusok inaktiválása hőkezeléssel. Az előkészítés során a homogén víz-olaj emulzió eléréséhez a vízoldható tej komponenseket, növényi olajokat, lipideket, és a fölözött tejport rekombinálják. Olaj-emulgeátor mixet adagolnak az elegyhez C hőmérsékleten, majd magas nyomáson homogenizálják és lehűtik. A magas nyomáson történő homogenizáció elősegíti a lipid összetevők elegyedését a protein komponensekkel, illetve a tej előzetes hőkezelése is hozzájárul a mikrobiológiai, fizikai, kémiai minőség magasabb szintű kontrollálásához. Ezt egy végső hőkezelés követi a patogén mikroorganizmusok eltávolítása érdekében, majd bepárlással koncentrálják az oldott anyagokat az emulzióban. A gyártás utolsó lépése a porlasztva szárítás forró levegővel, végül a csecsemőtápszer csomagolásra kerül. 7

9 2.3 Policiklusos aromás szénhidrogének általános jellemzése Fizikai-kémiai tulajdonságok A policiklusos aromás szénhidrogének legalább kettő összekapcsolódó aromás gyűrűt tartalmazó, polikondenzált vegyületek. Funkciós csoportot, heteroatomot nem tartalmaznak. Több mint száz vegyület sorolható közéjük. Alapvetően inert vegyületek, stabilitásuknak köszönhetően igen széleskörű az előfordulásuk a környezetben. Apoláris vegyületek, vízoldhatóságuk rendkívül alacsony, viszont apoláris közegben jól oldódnak, növényi-állati zsírszövetekben akkumulálódhatnak. Könnyen adszorbeálnak szerves anyagokhoz. A PAH vegyületek illékonysága nagymértékben függ a vegyületben lévő gyűrűk számától. Míg a 2-3 darab gyűrűt tartalmazó vegyületek gázfázisban vannak szobahőmérsékleten, a legalább 5 darab gyűrűt tartalmazó vegyületek a PM 2.5 frakciójú aeroszolokban hajlamosak feldúsulni, melyek aztán kiülepedhetnek [11,12] A policiklusos aromás szénhidrogének keletkezése, előfordulása A policiklusos aromás szénhidrogének általában nem önmagukban, hanem a vegyületek keverékeként fordulnak elő. Keletkezésük szerves anyagok tökéletlen, oxigénhiányos égési folyamatainak következménye. Származhatnak antropogén vagy természetes forrásból is. Természetes forrásaik a vulkáni tevékenység, az erdőtüzek, a hidrotermális folyamatok, és az olajszivárgás [13]. Azonban fő forrásuk az emberi tevékenység. Elégtelen működésű gépjármű katalizátorok, égési folyamatot alkalmazó gyárak, a fa konzerválásához használt kátrány, a gumi égése, az olajszennyezés mind hozzájárul a PAH-ok kibocsájtásához [13]. A PAH vegyületek prekurzora számos szénhidrogén lehet. Azonban az alapvetően gyűrűket tartalmazó vegyületek, mint például a koleszterin jelenléte, erős korrelációt mutatnak a PAH-ok keletkezésével. A keletkezés az alábbi mechanizmus szerint történik: a szerves vegyületek krakkolódása során kisebb fragmensek, főként gyökök keletkeznek [13]. A piroszintézis során ezek a gyökök rekombinálódnak, PAH-okat hozva létre. Ennek a folyamatnak az optimális hőmérséklete C, azonban geológiai időskálán már C-n is keletkeznek alkilezett PAH-ok [14]. A PAH vegyületek előfordulása a környezetben igen széleskörű, a légkörben gáz és kondenzált fázisban aeroszolként, a talaj felsőbb rétegeiben, illetve talajvizekben is megtalálhatók. 8

10 2.3.3 Expozíció A PAH-ok bekerülése a szervezetbe három fő útvonalon történhet: belégzés, bőr kontaktus, illetve élelmiszerek elfogyasztásával. A PAH vegyületek fő expozíciós forrása az élelmiszerek. Élelmiszerekbe több úton kerülhetnek PAH vegyületek. A zöldségek, gyümölcsök viaszos felületére történő adszorpcióval, illetve a talajból, talajvízből történő felvétel során; állati eredetű élelmiszerekbe bioakkumulációval; magas hőmérsékletű élelmiszerfeldolgozási folyamat eredményeképp, mint sütés, grillezés, füstölés, közvetlen érintkezés égéstermékekkel; illetve nem élelmiszer-minőségű ásványi olajok felhasználásával [15] Metabolizmus, toxicitás A PAH-ok a szervezetbe bekerülve képesek áthatolni a lipoprotein membránokon, nyálkahártyán, így könnyen eljuthatnak a belső szervekig is [16]. A PAH vegyületek toxicitása növekedhet a szervezet metabolizmusának hatására. A metabolizmus során a szervezetbe került vegyületek szerkezete megváltozik, poláris csoportok addícionálódnak rájuk. Mindez abból a célból történik, hogy a szervezet inaktiválja az idegen vegyületet, vagy vízoldható formában kiüríthető legyen a szervezetből. Bizonyos esetekben azonban ez a reakcióképesség növekedéséhez vezethet. A PAH vegyületek és főként vicinális diol epoxid metabolitjaik genotoxikus hatásúak, adduktokat képeznek DNS makromolekulákkal [17]. Továbbá mutagén és rákkeltő hatású vegyületek [18]. Egyéb biológiai hatásokkal is rendelkeznek: immunoszupresszánsok, aktiválhatják az aril-hidrokarbon receptort, amivel felborítják a sejtek homeosztázisát. Átjuthatnak a placentán, ezért teratogén hatással is rendelkeznek [19]. A szervezet kitettségének megállapítása általában 1-hidroxipirén vizeletből való kimutatásával történik [20] Szabályozás Az Európai Unión belül szabályozás van érvényben a PAH vegyületek maximális mennyiségére csecsemőtápszerben: az Európai Bizottság 835/2011 rendelete alapján maximum 1 µg/kg mennyiséget tartalmazhatnak összesítve benzo[a]pirénből, benzo[b]fluoranténből, krizénből, benzo[a]antracénból ezek a készítmények [2]. A korábbi 9

11 szabályozás csak a benzo[a]pirénre terjedt ki, maximális mennyisége 1 µg/kg csecsemőtápszerben [21]. Az Amerikai Környezetvédelmi Hivatal (United States Environmental Protection Agency, US EPA) által kiemelt PAH vegyületek listáján is szerepelnek az Európai Unió által csecsemőtápszerben szabályozott PAH-ok, az alábbi táblázaton látható a teljes lista (1. Táblázat). 1. Táblázat EPA által szabályozott PAH vegyületek listája Név Rövidítés Moláris tömeg /g mol -1 Határérték csecsemőtápszerben CAS-szám Szerkezeti képlet naftalin Nap acenaftilén Acy acenaftén Ace fluorén Flu fenantrén Phe antracén Anth fluorantén Flt pirén Pyr benzo[a]antracén BaA 228 krizén Ch 228 benzo[b]fluorantén BbF μg/kg (összesítve BaP,BaA,Ch,BbF) 1 μg/kg (összesítve BaP,BaA,Ch,BbF) 1 μg/kg (összesítve BaP,BaA,Ch,BbF) benzo[k]fluorantén BkF benzo[a]pirén BaP μg/kg (összesítve BaP,BaA,Ch,BbF) indeno[1,2,3-cd]pirén IP benzo[g,h,i]perilén BghiP dibenzo[a,h]antracén DBahA

12 2.4 A PAH-ok meghatározási lehetőségei Az élelmiszerek összetett mátrixok, nyomnyi mennyiségben jelenlévő komponensek kimutatása belőlük nehéz feladat, ezért a vizsgálandó komponens elválasztása szükséges a mintaalkotóktól. A PAH-ok lipofil vegyületek, olajos mintából a lipid alkotókkal együtt extrahálhatók, melyeket a későbbiek során el kell választani tisztítási lépésekben a PAH vegyületektől. Számos megközelítés született az évek során a minta-előkészítési lépésekre. Az analitikai meghatározás folyadékkromatográfiával (Liquid Chromatography, LC) és gázkromatográfiával (Gas Chromatography, GC), illetve ezek tömegspektrometriával (Mass Spectrometry, MS) kapcsolt technikáival (LC-MS, GC-MS) kivitelezhető. A GC-s vagy LC-s módszerek esetén eltérő mintaelőkészítési lépésekre lehet szükség. A PAH vegyületek élelmiszermintákból történő meghatározásáról jó összefoglalást nyújtanak Purcaro és Plaza- Bolanos cikkei [22,23] Kromatográfiás módszerek Folyadékkromatográfia A folyadékkromatográfia gyakran alkalmazott módszer PAH vegyületek meghatározására élelmiszermintákban. Hivatalos szervezetek, mint a Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (International Organisation for Standardization, ISO), és az Amerikai Környezetvédelmi Hivatal is LC-s módszereket ajánlanak PAH vegyületek meghatározására étkezési olajokból és zsiradékokból [24,25,26,27]. Ezen források főként az US EPA által megjelölt, kiemelt kockázattal bíró PAH-okra vonatkoznak (a későbbiekben EPA PAH-ok), míg az Európai Unió ettől néhány vegyületben eltérő listát tett közzé a fontosnak tekintett PAH vegyületekről (a későbbiekben EU PAH-ok) [28]. Az LC elterjedtebb PAH-ok élelmiszerekből történő meghatározására, mert néhány vegyületpár esetén, például Ch és BaA, jobb felbontóképességgel rendelkezik, mint a GC [27]. Általában C18 fázisú oszlopot használnak az elválasztásra, acetonitril-víz vagy metanol-víz gradiens elúció mellett. Az EU PAH-ok esetében többlépcsős gradiens elúció szükséges, mert néhány csúcs szétválasztása igen nehézkes a vegyületek konstitúciós izomériája miatt. Ilyen például a dibenzo[a,h]pirén és a dibenzo[g,h,i]pirén, vagy az indeno[1,2,3-cd]pirén és a benzo[g,h,i]perilén [29,30]. 11

13 Megfelelő érzékenységgel rendelkező spektrofluorimetriás detektorok (Fluorimetric Detector, FLD) alkalmasak a legtöbb PAH vegyület detektálására (kivételek: Acy, Flu, Ace, Nap, ciklopenta[c,d]pirén, alkilezett PAH-ok [31]), mert azok aromás jellegük miatt könnyen gerjeszthetők. UV detektorok is alkalmasak PAH-ok detektálására, azonban alacsony szelektivitásuk miatt használatuk mellőzött. Manapság már egyre elterjedtebb a tömegspektrométer is, melyet főként atmoszférikus fotoionizációval (Atmospheric Pressure Photoionisation, APPI), esetleg atmoszférikus kémiai ionizációval (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) alkalmazzák policiklusos aromás szénhidrogénekre [32] Gázkromatográfia A gázkromatográfia szintén alkalmas PAH-ok meghatározására. Némelyik PAH vegyület rosszul detektálható LC-FLD módszerrel, nem mutat fluoreszcenciát, így szükségszerű a gázkromatográfiához illetve GC-MS-hez folyamodni. A PAH-ok élelmiszerekből és olajokból történő meghatározására gyakrabban alkalmazott HPLC-FLD módszerrel szemben a GC-MS-el alacsonyabb kimutatási határ és jobb szelektivitás érhető el. A PAH-ok hőstabil vegyületek, nem bomlanak el a GC mérés hőmérsékletén. A tömegspektrométer könnyen kapcsolható GC-hez, tandembe is kapcsolható, jó a szelektivitása és érzékenysége. Leggyakrabban elektronütközéses ionizációt (Electron Impact, EI) alkalmaznak ionforrásként, amelynek használata kemény ionizációnak minősül. PAH vegyületekre alkalmazva jobb ionizációs hatásfok érhető el GC-MS-sel, mint az APCI-t vagy APPI-t alkalmazó HPLC-MS-sel. A kimutatási határ általában pg-os nagyságrendbe esik PAH vegyületekre. A mennyiségi meghatározás deuterált PAH belső standarddal történik legtöbb esetben. Az US EPA szerint PAH-ok mérésére a GC nem elég megbízható, némelyik PAH vegyületpárok csúcsa nem válik el a mérés során, mint például a BbF, BkF, vagy a DbahA és IP [27]. Ezen csúcspárok elválasztása nagyban függ az állófázis minőségétől, a megfelelő oszlop kiválasztása fontos feladat, a témáról számos tanulmány született [33,34]. GC-s analízisnél nagyon fontos a megfelelő injektálási mód kiválasztása, a minta komponenseinek eltérő forráspontjára illetve illékonyságára is tekintettel kell lenni. Általában splitless, illetve ezen belül nagy térfogatú (Large Volume Injection, LVI), programozott hőmérsékletű elpárologtatásos (Programmed Temperature Vaporization, PTV) injektálást használnak [35]. Nagy térfogatú injektálás során jellemzően mikroliter térfogat kerül 12

14 injektálásra, melyből az oldószer nagy része lefúvatásra kerül, így nem terheli az oszlopot. Emiatt nő az érzékenység, de jelentős forráspontkülönbség szükséges az oldószer és a legalacsonyabb forráspontú célkomponens között a veszteség elkerülése céljából Minta-előkészítési módszerek A PAH-ok élelmiszerekből történő vizsgálata esetén fontos megkülönböztetni zsírokban gazdag, illetve zsírt nem tartalmazó mintatípust. Nem zsíros minták, például italok, víz esetén általában az extrakció és tisztítás egy lépésben kivitelezhető. Zsírt tartalmazó minták esetén, melyek lehetnek szilárdak (sajt, hús, élelmiszerporok, csecsemőtápszer) és folyékonyak (olajok, tej, fogyasztásra kész tápszer), a kulcsfontosságú lépés a mono-, di-, és trigliceridek elkülönítése a PAH vegyületektől. Ezen vegyületek ugyanis lerakódhatnak az injektor betétben, a GC oszlopon, ezáltal rontják az elválasztás hatékonyságát és az oszlop élettartamát. Ebben az esetben az extrakciós és a tisztítási lépés elkülönítve vagy egyszerre is megvalósítható. Mivel a csecsemőtápszerek triglicerideket tartalmaznak, így az apoláris mátrixú mintákra alkalmazott minta-előkészítést fogom részletesen tárgyalni, és kitérek a tej, illetve tej alapú minták, csecsemőtápszer vizsgálatára is Szilárd fázisú extrakció A legáltalánosabban alkalmazott minta-előkészítési módszer lipidek eltávolítására a PAH vegyületek mellől, illetve a mátrix elkülönítésére a szilárd fázisú extrakció (Solid Phase Extraction, SPE). Ez a módszer elősegíti a pontosabb detektálhatóságot, és sok esetben egy lépésben kivitelezhető a tisztítás és az extrakció. Veyrand és munkatársai [36] kísérletük során polisztirol-divinilbenzol kopolimer töltetet alkalmaztak, a PAH vegyületek a szorbensen maradtak, míg a triglicerideket ciklohexán-etanol 70:30 eleggyel lemosták az oszlopról, majd a PAH-okat etil-acetát-ciklohexán 60:40 eleggyel eluálták. Moret és munkatársai [37] úgy tapasztalták, hogy szilika oszlopot alkalmazva, olaj minta esetén, a trigliceridek kötődnek az oszlopon, míg a PAH vegyületek hexán-diklórmetán elegyével eluálhatók. Salguiero és munkatársai [38] PAH és hidroxi-pah vegyületeket vizsgáltak csecsemőtápszerekben, LC-FLD-vel és LC-MS/MS-sel. A PAH-ok esetén 3x10 ml hexánnal 13

15 extraháltak 1 g mintát, majd az egyesített extraktumot szilika SPE-vel tisztították. Az eluátumot N 2 atmoszférában szárazra párolták, majd 0,5 ml acetonitrilben oldották fel a HPLC-FLD analízishez. Moreda és munkatársai [39] különböző fajta olíva és egyéb növényi olajokban határozták meg a PAH vegyületek mennyiségét, melyhez első lépésben szilika, majd tisztításként aminopropil fázisú SPE oszlopot is alkalmaztak. Céljuk a szkvalénből és szteroidalkoholokból származó vegyületek eltávolítása volt a mintából. Az olívaolaj feldolgozása során izomerizációval és részleges bomlással keletkeznek ezek a PAH-okhoz hasonló polaritású vegyületek. Módszerükkel 80% fölötti visszanyerést és 0,1-0,2 µg kg -1 kimutatási határt értek el Molekuláris lenyomatú polimer szilárd fázisú extrakció Az SPE technikák fejlődésének legújabb vívmányai a molekuláris lenyomatú polimerek (Molecularly Imprinted Polymer, MIP). A polimerizáció templát molekulák jelenlétében történik, melyek később eltávolíthatóak. A polimer mátrixban a templát molekulával komplementer üregek keletkeznek, melyek nagy affinitással, reverzibilisen kötik meg azt a későbbiekben, szelektív extrakciót eredményezve. A módszer előnye, hogy használata gyors, egyszerű, kevés az oldószerigénye. PAH-okra is elérhetőek MIP SPE oszlopok. Drabova és munkatársai [40] SupelMIP SPE-PAH oszlopot használva növényi olajat vizsgáltak, az elúció etil-acetáttal történt. A komponensek elválasztása GCxGC-vel, detektálása repülési idő analizátoros tömegspektrométerrel történt. A módszer visszanyerése EU PAH-okra vonatkozóan 70-97% között adódott Szilárd fázisú mikroextrakció A szilárd fázisú mikroextrakció (Solid Phase Microextraction, SPME) az SPE egyik változatának tekinthető, igen hasonló működési elvvel, azonban eltérő szorpciós felülettel. A módszerhez használt eszköz egy kvarc szál, melyre kémiai kötéssel polimer folyadékfilm van rögzítve. A bevonat kémiai minőségétől függően képes abszorbeálni a mintában jelenlévő 14

16 szerves mikroszennyezőket. Két megközelítésben használható, direkt bemerítéses (Direct Immersion, DI) és gőztérbe helyezéses (Headspace, HS) formában. Vichi és munkatársai [41] divinilbenzol/karboxén/polidimetilsziloxán SPME szálat használtak szűz olívaolajból történő gőztér SPME meghatározására, mely nagy affinitással rendelkezik a 202 g mol -1 -nál kisebb molekulatömegű PAH-okra. Jó visszanyerést tapasztaltak még naftalinra is, ami illékonysága folytán bepárlást is tartalmazó módszerek során sokszor elveszik. Aguinaga és munkatársai [42,43] elsők között alkalmaztak SPME-t tej és csecsemőtápszer PAH-tartalmának vizsgálatára. Az SPME mindkét alkalmazási lehetőségét (DI, HS) megvizsgálták. A kísérletük során PDMS, PDMS/DVB, PA fázisú SPME szálakat hasonlítottak össze a visszanyerés, extrakciós hatékonyság szempontjából. Ezek közül a PDMS/DVB bevonatú szál bizonyult a legjobbnak a PAH-ok és a DVB között fellépő π-π kölcsönhatásnak köszönhetően. Azt tapasztalták, hogy az extrakció paramétereitől, mint idő, hőmérséklet, kevertetés, nagyban függ a hatékonysága. Gőztéranalízist alkalmazva az alacsony moláris tömegű PAH-ok jobban extrahálhatók, de a négy gyűrűnél többel rendelkezőek nem vizsgálhatóak. A DI-SPME alkalmas az EPA PAH-ok vizsgálatára, de a mátrix komplexitása miatt a mennyiségi meghatározáshoz standard addícióra van szükség. Ezen kísérleti tapasztalatokat felhasználva a szerző egy későbbi cikkében optimalizálta a statikus HS-SPME módszert, könnyű PAH-ok kimutatására ugyanilyen típusú mintákból. Mindkét kísérlet során GC-MS-t alkalmaztak Gélpermeációs kromatográfia Gélpermeációs kromatográfiára (Gel Permeation Chromatography, GPC) is van példa az irodalomban. Ez a méretkizárásos kromatográfia egy fajtája, mely a vegyületek eltérő méretét használja ki oly módon, hogy a kisebb részecskék képesek bediffundálni a gél pórusaiba, míg a nagyobb hidrodinamikai sugárral rendelkező részecskék továbbhaladnak. Így a kisebb részecskék több időt töltenek az oszlopon, ezáltal megvalósul az elválás a nagyobb molekuláktól. Ballesteros és munkatársai [44] sztirol-divinilbenzol kopolimer töltetes GPC-t használtak diklórmetán mozgófázissal, PAH-ok és peszticidek olajból történő meghatározására, 0,3-200 µg kg -1 kimutatási határt értek el az előbbiekre. Ciecierska és munkatársa [45] Lengyelországban kereskedelmi forgalomban lévő csecsemőtápszerekben vizsgáltak PAH vegyületeket, GPC előkészítési módszert alkalmazva. 15

17 A homogenizált, Na 2 SO 4 -tal szárított mintát hexán-aceton elegyével extrahálták, majd szárazra párlás után újra feloldották ciklohexán-etil-acetát elegyben, végül ugyanezt használva mozgófázisként TSK Gel G1000HXL GPC oszlopon vezették át, a célkomponensek elválasztása és detektálása HPLC-FLD-vel történt Szilárd fázisú mátrix diszperzió Szilárd fázisú mátrix diszperziót (Matrix Solid Phase Dispersion, MSPD) is alkalmaztak már PAH-ok vizsgálatára olajokban és magas zsírtartalmú szilárd mintákban. Ez a módszer hasonló a szilárd fázisú extrakcióhoz. Az adszorbenst mozsárban összeőrlik a mintával, majd egy oszlopba töltve tömörítik, és az anyagi minőségüktől függően eluálják a szennyezőket vagy a mérni kívánt vegyületeket. Bogusz és munkatársai [46] olaj mintát C18 fázisú adszorbenssel kevertek össze, majd Florisil (aktivált Mg 2+ szilikát) SPE oszlopra töltötték rá. Habár az MSPD jól használható szilárd minták esetén, kutatásukból azt a következtetést vonták le, hogy az SPE használata egyszerűbb, pontosabb, jobb a visszanyerése; SPE-re 80%, míg MSPD-re 50-60%-os visszanyerést tapasztaltak benzo[a]pirénre vonatkoztatva Túlnyomásos folyadékextrakció A túlnyomásos folyadékextrakciót PAH vegyületekre első alkalommal Wang és munkatársai [47] alkalmazták hal és sertéshús vizsgálatára. A Dionex ASE 200 készüléken 1500 psi (kb. 100 bar) nyomást alkalmaztak, további tisztítási lépésként a koextrahálódott lipideket tömény kénsavval kezelték, végül Florisil töltetű SPE oszloppal távolították el a zavaró komponenseket Donor akceptor komplex kromatográfiás tisztítás Donor akceptor komplex kromatográfiás (Donor-acceptor Complex Chromatography, DACC) tisztításra is találunk példát az irodalomban. A DACC alapja π-π kölcsönhatás az adszorbens és a PAH vegyületek között, π-elektronokat nem tartalmazó mozgó fázis használata mellett. Barranco és társai [48] donor akceptor komplex kromatográfiás oszlopot 16

18 hasonlítottak össze Al 2 O 3 töltetes oszloppal. Kísérletük rámutatott arra, hogy a módszer nem alkalmas könnyű PAH-ok (Nap, Ace, Acy, Flu) vizsgálatára, némely PAH-okra azonban (BaA, Ch, BghiP, IP) szelektívebb, mint az alumina oszlop Egyéb módszerek Klasszikus minta-előkészítési módszer a minta zsírtartalmának elszappanosítása, melyet folyadék-folyadék extrakció követ, végül a tisztítási lépésként SPE-t alkalmazhatnak. Kishikawa és munkatársai [49] tej, és tejalapú mintákat vizsgáltak, köztük csecsemőtápszert is, az etanolos közegű átészterezés után hexánnal extraháltak. Az átészterezés idejét, az oldat összetételét optimalizálták a legjobb visszanyerés érdekében, így arra jutottak, hogy az ideális hőmérséklet 60 C, az elegy optimális összetétele: EtOH-H 2 O 90:10, a NaOH koncentrációja 0,4 M. A hexános extraktumot szárazra párolták, a bepárlási maradékot acetonitrilben oldották fel újra, a mérés HPLC-FLD-vel történt. A szappanosítást tejalapú minták esetén SPE-vel is lehet kombinálni, mint tették azt Naccari és munkatársai [50]. Kísérletük során etanolos KOH oldattal végezték az átészteresítést, majd ciklohexánnal extraháltak. Az extraktumot bepárolták, acetonitrilben oldották fel, és acetonitrillel kondícionált diatómaföld alapú (Extrelut NT3) SPE oszlopra vitték fel. A mérést szintén HPLC-FLD-vel hajtották végre. Egy másik lehetőség, hogy a folyadék-folyadék extrakció előtt koffeines komplexképzést alkalmaznak. A PAH vegyületek képesek komplexet képezni koffeinnel hangyasavas közegben, mely vizes NaCl-oldatos extrakcióval megbontható [51] Az irodalomból levonható következtetések Viszonylag kicsi az aránya a szakirodalmon belül a PAH vegyületek tej, illetve tej alapú minták vizsgálatáról elérhető cikkeknek. A kutatók figyelme eddig főként különböző forrásból származó étkezési célú olajokra és sütéssel, füstöléssel járó élelmiszeripari folyamatok hatásának élelmiszerekkel kapcsolatos vizsgálatára irányult. Az általam fellelt tejjel, tejtermékekkel és csecsemőtápszerekkel foglalkozó források főbb körülményeit és a kimutatási határokat (Limit Of Detection, LOD) táblázatban foglaltam össze (2. Táblázat). Alapvetően elmondható, hogy a HPLC-t sokkal többször alkalmaztak az eddigiekben tej alapú minták esetén, a fluoreszcenciás detektor olcsó, elterjedt, és PAH-okra általánosságban jól 17

19 használható. Azonban az EPA PAH listán szereplő vegyületek közül némelyik nem detektálható ily módon. A folyadékkromatográfia kevésbé érzékeny a minta tisztaságára, míg GC-MS-nél szükséges a minták lipidmentesítésére törekedni az oszlop, az injektor, és a tömegspektrométer kímélése szempontjából. 2. Táblázat Tejre és csecsemőtápszerre alkalmazott módszerek összehasonlítása Mintaelőkészítés Krom. Módszer Visszanyerés /% LOD Forrás extrakció hexánnal, majd szilika SPE HPLC-FLD ,01-0,7 µg/kg [38] DI SPME GC-MS 87, ng/dm 3 [42] HS SPME (könnyű PAH-ok) GC-MS 89,2-112,7 0,2-5 ng/dm 3 [43] extrakció hexán/acetonnal, majd GPC HPLC-FLD 66, ,05-0,47 µg/kg [45] etanolos szappanosítás, extrakció hexánnal HPLC-FLD ,0013-0,076 µg/kg [49] etanolos szappanosítás, extrakció ciklohexánnal, szilika SPE HPLC-FLD/MS ,0120-0,201 µg/kg [50] 18

20 3. Célkitűzés A szakirodalomban fellelhető PAH vegyületek tejből és tejalapú élelmiszerekből köztük csecsemőtápszerekből történő meghatározását vizsgáló publikációk jelentős része fluoreszcens detektorral kapcsolt folyadékkromatográfiás módszereket ismertet. Emellett a gázkromatográfiás-tömegspektrometriás technikák háttérbe szorulnak számos előnyük ellenére is. Az elterjedt fluoreszcenciás módszerekkel szemben a tömegspektrométer nagyobb fokú szelektivitással rendelkezik, aminek köszönhetően javíthatók a célkomponensek kimutatási határai. A gázkromatográfia előnye pedig a kolonna nagyobb felbontóképessége, ami által lehetővé válik a folyadékkromatográfiás oszlopokon nehezen szeparálódó szerkezeti izomerek elválasztása is. Szakdolgozatom célja egy olyan minta-előkészítési módszer kidolgozása volt, mely lehetővé teszi a PAH vegyületek csecsemőtápszerből történő meghatározását tömegspektrométerrel kapcsolt gázkromatográfiás módszerrel. Az EPA által kiemelt 16 PAH vegyületet vizsgáltam, mert tartalmaz HPLC-FLD-vel rosszul detektálható PAH-okat, illetve tartalmazza a csecsemőtápszerben szabályozott PAH vegyületeket is. A csecsemőtápszer magas lipid-tartalommal rendelkezik, mely koelúciós okok miatt zavarja a PAH vegyületek meghatározhatóságát, illetve mennyiségüknél fogva túlterhelik a gázkromatográfiás kolonnát, ezzel csökkentve annak élettartamát. Ennek megfelelően e zavaró komponensek eltávolítását kellett megvalósítanom. A szakirodalom feldolgozása során számos szilárd fázisú extrakción alapuló minta-előkészítési módszert találtam, ezért én is ennek használata mellett döntöttem. Célom volt az SPE alkalmazhatóságának vizsgálata különböző körülmények között (mozgófázis összetétele, SPE oszlop minősége), illetve a módszer optimálása. 19

21 4. Kísérleti rész 4.1 Felhasznált vegyszerek A módszerfejlesztéshez használt analitikai tisztaságú PAH standardok a Chem Service (West Chester, Egyesült Államok) és a Sigma-Aldrich (St. Louis, Egyesült Államok) vállalatoktól származtak. A belső standardként használt deuterált PAH vegyületek (acenafténd10, fenantrén-d10, krizén-d12, perilén-d12) a Supelcotól (Pennsylvania, Egyesült Államok) kerültek beszerzésre. A szilárd PAH standardokból µg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítettem acetonban, melyet 10 µg/ml koncentrációra higítottam hexánnal. A minta-előkészítéshez használt vegyszerek: diklórmetán, metanol, nátrium-klorid a Merck Kft.-től (Budapest, Magyarország), 96%-os etil-alkohol a Thomasker Finomvegyszer Kft.-től (Budapest, Magyarország); hexán és nátrium-szulfát a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, Egyesült Államok) származnak. A gázkromatográfiás méréshez használt vivőgáz 5.0 tisztaságú hélium volt, a bepárláshoz 4.5 tisztaságú nitrogén állt rendelkezésemre (Messer Hungarogáz Kft., Budapest). 4.2 Alkalmazott készülékek, eszközök A méréseket egy Agilent 6890N típusú gázkromatográffal és a hozzá kapcsolt Agilent 5973 inert tömegspektrométerrel végeztem (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). A készülék fel volt szerelve egy CTC Combi Pal automata mintaadagolóval (CTC Analytics AG, Zwingen, Svájc), és egy Gerstel CIS4 PTV injektorral (Gerstel GmbH, Mülheim an der Ruhr, Németország). A gázkromatográfon MSD ChemStation E szoftver és NIST spektrumkönyvtár üzemelt. A mérések kivitelezésére használt gázkromatográfiás oszlop Restek Rxi-5ms (15 m 0,25 mm 0,25 µm) volt. (Restek Co., Bellefonte, Egyesült Államok). A minta-előkészítéshez Biotage Isolute Si, Isolute C18 oszlopokat (Biotage, Uppsala, Svédország), Hermle Z230A típusú centrifugát használtam (Maschinenfabrik Berthold Hermle AG, Gosheim, Németország). 20

22 4.3 Kromatográfiás körülmények Hőmérsékleti program Kezdeti hőmérséklet: 40 C Kezdeti hőmérséklet ideje: 7 perc Végső hőmérséklet: 330 C Végső hőmérséklet ideje: 10 perc Felfűtési sebesség: 15 C/min Injektor Injektor hőmérséklet: 330 C Injektált térfogat: 1µl Injektálás módja: splitless Kapilláris oszlop: Restek Rxi-5ms Hosszúság: 15 m Átmérő: 0,25 mm Rétegvastagság: 0,25 µm Vivőgáz: Hélium 5.0 tisztaságú Áramlási sebesség: 1,1 ml/min Transferline hőmérséklet: 330 C 21

23 4.4 Minta-előkészítés Potenciálisan zavaró komponensek azonosítása A minta-előkészítés megtervezéséhez első lépésként szükséges volt felmérni, melyek a nagy mennyiségben jelen levő zavaró komponensek a csecsemőtápszer mintában. Ezért a mintát hexános extrakciónak vetettem alá, melyre azért esett a választásom, mert a PAH vegyületek is jól oldódnak benne. A csecsemőtápszer mintából 2 grammot kétszer 2 ml hexánnal extraháltam. Az extraktum 1 μl-jét split injektálási technikát alkalmazva 10:1-es split arány mellett GC-MS mérésnek vetettem alá SCAN üzemmódban. A pásztázott tömegtartomány Da volt. A hexános extrakció főként triglicerideket nyert ki a mintából, a kromatogram és a kromatogramon található legintenzívebb csúcs tömegspektruma az alábbi ábrákon láthatók (1. Ábra, 2. Ábra) Ábra Csecsemőtápszer hexános extrakciójának SCAN kromatogramja 10:1-es split injektálást alkalmazva 2. Ábra A 26,7 perc retenciós idejű csúcsból származó tömegspektrum 22

24 A vegyületeket NIST spektrumkönyvtár segítségével azonosítottam. A tömegspektrométerrel az Da tartományban csak az 550 Da-nál kisebb molekulatömegű triglicerideket tudtam beazonosítani. Ezen érték fölött már sok esetben azonos triglicerid fragmenseket detektáltam, melyekről nem lehet pontosan kijelenteni, hogy melyik trigliceridhez tartoznak. A trigliceridek pontos összetétele nem állapítható meg, azonban ez nem is volt a mérés célja. A csúcsok közel azonos retenciós idő különbségei arra engednek következtetni, hogy az 550 Da-t meghaladó fragmensek is trigliceridekből származóak, és a zsírsavészterek szénatom-számának növekedésével arányosan nőtt a retenciós idő. Egy egymáshoz közeli retencióval rendelkező csúcsot is láthatunk a kromatogramon 28,6 perc retenciós időnél, melyek valószínűleg az azonos szénatomszámú oldalláncból álló trigliceridek telített és telítetlen láncainak különbségéből fakadóak, de ezt a mérésünk alapján nem jelenthetjük ki teljes bizonyossággal Minta-előkészítés kidolgozása A minta-előkészítés kidolgozásához szilárd fázisú extrakciós módszerekből indultam ki, melyekre számos példa található [38,50]. A szakirodalom alapján a trigliceridek eltávolítására szilika fázisú SPE alkalmas [37]. Azonban kutatócsoportunk tapasztalata szerint szilika fázisú SPE-vel nem érhető el kellő mértékű visszatartás trigliceridekre, ezért érdekesnek találtam a trigliceridek átészteresítését alkalmazni a szilika fázisú SPE-t megelőzően, Kishikawa [49] módszere alapján. A csecsemőtápszert etanol-víz közegben emelt hőmérsékleten NaOH-al átészteresítették, majd hexánnal extrahálták. Azonban a zsírsav-etilészterek is zavaró mennyiségben lennének jelen a mérés során, ezért szükséges eltávolítani őket. Azt feltételeztem, hogy a zsírsav-észterek a PAH vegyületektől eltérő erősséggel kötődnek a szilika fázisú SPE oszlophoz, így elválasztásuk esetleg megvalósítható. A csecsemőtápszer mintából 2 grammot 4 ml etanol-víz 90:10 térfogat arányú elegyével 0,4 M NaOH koncentráció mellett ultrahangos fürdőben egy órán keresztül 60 C hőmérsékleten átészteresítettem. Ezt követően kétszer 2 ml hexánnal extraháltam a mintát. Az extraktumot nátrium-szulfáttal szárítottam, majd 2 ml-re pároltam be nitrogén atmoszférában, ezután szilárd fázisú extrakciónak vetettem alá egy 500 mg szilika töltettel rendelkező oszlopon, 15 ml hexán eluálószerrel. A szilika SPE oszlopot előzőleg 4 ml hexánnal 23

25 kondicionáltam. Az oszlopra az extraktum teljes mennyiségét (2 ml) felvittem, arra voltam kíváncsi, hogy hexán eluens mellett van-e az oszlopnak visszatartása. Az eluátumot milliliterenként 10 frakcióba gyűjtöttem, majd split injektálási módot alkalmazva 10:1-es split arány mellett GC-MS mérésnek vetettem alá SCAN üzemmódban. Azonban a szilárd fázisú extrakció nem távolította el, illetve nem tartotta vissza a zsírsavetilésztereket, az első frakcióban megjelentek, a kromatogram az alábbi ábrán látható (3. Ábra). A szilika fázisú SPE-t 500 ng/ml koncentrációjú PAH standard oldattal azonos körülmények között megismételve, a PAH vegyületek is megjelentek az első frakcióban. A hexánnál lényegesen gyengébb eluens nincsen, ezért szilika oszlopon nem érhető el visszatartás zsírsav-etilészterekre, és PAH vegyületekre sem, ezért az átészterezést és a szilika fázisú SPE alkalmazását elvetettem. 3. Ábra Az átészterezett és SPE-zett minta SCAN kromatogramja 10:1-es split injektálás esetén 1. Frakció Ezt követően a fordított fázisú SPE alkalmazási lehetőségeit vizsgáltam. A triglicerid és PAH komponensek partíciós koefficiense között nagyságrendbeli különbségek vannak, melyet az alábbi táblázat szemléltet (3. Táblázat). A logp értékek becsléséhez MarvinSketch programot használtam. 24

26 3. Táblázat Néhány választott triglicerid és PAH vegyület logp értékeinek összehasonlítása Vegyületcsalád Trigliceridek PAH vegyületek Vegyület neve Moláris tömeg /g mol -1 logp Trikaprin 554,8 10,92 Tripalmitin 807,32 18,92 Trisztearin 891,5 21,59 Triolein 885,4 20,51 Naftalin 128,2 2,96 Pirén 202,3 4,28 Dibenzo[a,h]antracén 278,3 5,93 A két vegyületcsalád polaritása közötti szignifikáns eltérés miatt azt feltételeztem, hogy a fordított fázisú SPE a megfelelő eluens megválasztása mellett képes visszatartani a triglicerideket az oszlopon, míg az azoknál kisebb méretű PAH vegyületek kisebb retenciót mutatnak a fordított fázison, esetleg áthaladnak az oszlopon, így a zsíroktól elválaszthatók. Egy 500 mg-os C18-as SPE oszlopot 4 ml hexánnal kondicionáltam. A mintát az előzőekhez hasonló módszerrel készítettem elő, 4 ml EtOH-H 2 O 90:10 térfogatarányú elegy hozzáadásával, majd kétszer 2 ml hexános extrakcióval. Azonban átészteresítést nem alkalmaztam, ezért nem volt szükség NaOH hozzáadására és melegítésre. A 2 g mintához arányaiban kevésnek bizonyult 4 ml extraháló folyadék, ezért az EtOH-H 2 O elegy térfogatát 8 ml-re változtattam. Az SPE oszlopra 200 µl-t vittem fel a mintából, illetve az összehasonlítás érdekében egy másik oszlopra 10 µg/ml koncentrációjú PAH-mix standard oldatból. A frakciókat GC-MS-sel mértem, a csecsemőtápszer mintát SCAN üzemmódban 10-es split arányú injektálással, míg a PAH-okat SIM üzemmódban (Single Ion Monitoring, szelektív ion-követés) splitless injektálás mellett. Eluensként acetont alkalmaztam, és 10 db 1 ml-es frakciót gyűjtöttem be. Aceton eluensnél a csúcsterületek alapján a PAH-ok már az első frakcióban több mint 70%-ban lejöttek, azonban a trigliceridek körülbelül 50%-a is itt eluálódott, az alábbi táblázat szerint (4. táblázat). A PAH-ok esetén az első 4 frakció után már csak nyomokban, az összes csúcsterület 1%-ánál kisebb mennyiségben tartalmazott PAH-okat a többi frakció, míg a csecsemőtápszer minta esetében az első 6 frakció tartalmazta a trigliceridek 99%-át. Ebből az 25

27 következett, hogy az acetonnál polárosabb eluensre van szükség. Ezért az acetont metanol mozgófázisra cseréltem, és azonos körülmények között megismételtem a kísérletet, azonban így sem sikerült elérni a trigliceridek visszatartását az oszlopon. 4. Táblázat A PAH-ok és a trigliceridek megoszlása az eluált SPE frakciók között acetonnal eluálva Vegyület 1. frakció 2. frakció 3. frakció 4. frakció 5. frakció 6. frakció Naftalin 72,02% 13,67% 8,83% 4,48% < 1,00% < 1,00% Acenaftilén 74,29% 12,73% 8,01% 3,98% < 1,00% < 1,00% Acenaftén 72,39% 13,78% 8,59% 4,24% < 1,00% < 1,00% Fluorén 73,11% 13,41% 8,28% 4,21% < 1,00% < 1,00% Fenantrén 71,15% 14,40% 8,89% 4,56% < 1,00% < 1,00% Antracén 73,92% 13,12% 8,00% 3,95% < 1,00% < 1,00% Fluorantén 71,48% 14,58% 8,63% 4,32% < 1,00% < 1,00% Pirén 71,12% 14,85% 8,70% 4,33% < 1,00% < 1,00% Benzo[a]antracén 77,01% 14,96% 4,99% 2,04% < 1,00% < 1,00% Krizén 73,82% 14,35% 7,56% 3,27% < 1,00% < 1,00% Benzo[b]fluorantén 82,62% 10,34% 4,49% 1,56% < 1,00% < 1,00% Benzo[k]fluorantén 84,09% 9,87% 3,74% 1,29% < 1,00% < 1,00% Benzo[a]pirén 88,23% 7,19% 2,69% 0,88% < 1,00% < 1,00% Indeno[1,2,3-cd]pirén 92,36% 4,83% 1,37% 0,44% < 1,00% < 1,00% Dibenzo[a,h]antracén 94,75% 3,80% 1,07% 0,38% < 1,00% < 1,00% Benzo[g,h,i]perilén 91,51% 6,16% 1,82% 0,51% < 1,00% < 1,00% Trigliceridek 48,43% 3,88% 21,73% 15,95% 9,58% 0,44% Ezért növelni kellett a szilárd fázisú extrakcióhoz használt mozgófázis polaritását; víz hozzáadásával változtattam az eluens erősséget. A C18 SPE oszlopot a hexánnal történő kondicionálás után az éles polaritás-váltás elkerülése érdekében 4 ml acetonnal, végül 4 ml eluálószerrel mostam. Az eluátumot NaCl hozzáadása után 1 ml hexánnal extraháltam, melyből a későbbiek során injektáltam. MeOH-H 2 O 50:50 arányú elegyét vizsgáltam először, 6 ml eluens alkalmazásával, de a PAH vegyületek és a trigliceridek is az oszlopon maradtak. Ezért a MeOH-H 2 O arányát 90:10-re változtattam, és megismételtem a kísérletet. A PAH-ok több mint a fele az első frakcióban jött le, míg a trigliceridek a 2. frakcióban jelentek csak meg, így részelegesen sikerült elválasztani őket egymástól, mely az alábbi ábrán látható (4. Ábra). 26

28 4. Ábra Frakciók összehasonlítása MeOH-H 2 O 90:10 arányú mozgófázis esetén, összes csúcsterület alapján Ezután a MeOH-H 2 O arányának kisebb módosítása következett a PAH-ok a trigliceridektől való teljes elválasztásához. A MeOH-H 2 O arányt 80:20, majd 85:15 arányra változtattam, egyik esetben sem jelentek meg trigliceridek első 6 frakcióban, míg a PAH vegyületek eluálódtak. Végül a MeOH-H 2 O 85:15 arányú keverék alkalmazására esett a választásom, mert a PAH-ok koncentráltabban jelentek meg az első három frakcióban, míg a MeOH-H 2 O 80:20 arányú mozgófázis esetén nem volt ennyire szűk az eloszlásuk, melyet az alábbi ábra szemléltet (5. Ábra). 5. Ábra Frakciók összehasonlítása MeOH-H 2 O 80:20 és 85:15 arányú mozgófázis esetén, összes csúcsterület alapján 27

29 4.4.3 Extrakciós hatékonyság vizsgálata Szükségét láttam ellenőrizni az individuális lépések extrakciós hatékonyságát. A minta-előkészítés minden eddigi lépését csecsemőtápszer minta nélkül megismételtem, PAH standard hozzáadásával, melyből annyit adtam hozzá, hogy a végtérfogat 0,5 µg/ml koncentrációt tartalmazzon, 100% extrakciós hatékonyságot feltételezve. Összehasonlításként szintén 0,5 µg/ml koncentrációjú standard PAH oldatot alkalmaztam. A méréseket GC-MS-el, SIM módban hajtottam végre. Az extrakciós hatékonyság kiszámításához elosztottam a mért minta PAH komponenseire kapott összes csúcsterületét a standard oldatra kapott csúcsterülettel, majd megszoroztam 100-zal. Először a minta-előkészítés első lépésében használt 90:10 arányú etanol-víz elegyének kétszer 4 ml hexánnal történő extrakciós hatékonyságát vizsgáltam. A mérésből kiderült, hogy ebben a lépésben az extrakciós hatékonyság igen alacsony, ezért szükséges megváltoztatni az etanol-víz arányát. Az etanol-víz arányát 10:90-re, illetve 50:50-re változtattam, és megismételtem a kísérletet, melyekből a visszanyerés közel 100%-os volt mindkettőre, így a későbbiekben ezekkel az arányokkal dolgoztam. Az SPE után kapott metanol-víz eluátum hexánnal történő extrakciója is alacsony visszanyerést produkált, így módosítottam az extrakciót kétszer 1 ml hexánra, illetve 0,5 g NaCl-t, és 1 ml desztillált vizet is adtam az elegyhez, mely 99%-os visszanyerést eredményezett. A szilárd fázisú extrakció visszanyerése önmagában nem mérhető, hiszen a 85:15 arányú metanol-víz eluens nem mérhető GC-MS-el az általam alkalmazott mérési körülmények között, szükséges extrahálni hexánnal. A két lépés különbségéből állapítható meg az SPE utáni visszanyerés. Az eredményeket táblázatban foglaltam össze (5. Táblázat). 5. Táblázat Minta-előkészítési lépések extrakciós hatékonyságának vizsgálata Extrakció Minta-előkészítési lépés Visszanyerés EtOH-H 2 O 90:10-al 15,9% EtOH-H 2 O 50:50-al 94,6% EtOH-H 2 O 10:90-al 105,4% 1 ml hexánnal 21,2% SPE utáni extrakció 2x1 ml hexánnal,+ 1 ml vízzel 99,5% Szilárd fázisú extrakció 82,4% 28

30 Habár az EtOH-H 2 O 10:90 arányú elegye magas visszanyerést produkált PAH vegyületekre, azonban a csecsemőtápszer mintára alkalmazva nem bizonyult praktikusnak. A tápszer bizonyos alkotói kisebb sűrűséggel rendelkeznek az alkalmazott elegynél, ezért flotáció következik be, mint az alábbi fényképen is megfigyelhető (6. Ábra). A folyadékfázis felszínére felúszott részecskék 5500 ford./perc fordulatszámú centrifugálás hatására sem ülepedtek le, így a PAH vegyületekre szintén magas visszanyeréssel rendelkező EtOH-H 2 O 50:50 arányú elegyére esett a választás. Az elegy térfogatát is megváltoztattam 8 ml-ről 12 ml-re, mert a tápszer minta nedvesedése 1,5 ml-rel csökkenti a hexános extrakcióra továbbvihető folyadék térfogatát. 6. Ábra Csecsemőtápszer extrakciója EtOH-H 2 O 50:50 elegyével, majd hexánnal 29

31 4.5 Kidolgozott minta-előkészítési módszer Az eddig elért eredmények figyelembevételével alakult ki a minta-előkészítési módszer a csecsemőtápszer mintára. A csecsemőtápszerből 2,00 g-ot mértem be egy 15 ml-es centrifuga csőbe, a későbbiek során ennél a fázisnál adalékoltam a mintát. A mintához 12 ml 50:50 térfogatarányú EtOH-H 2 O elegyet adtam hozzá, majd 10 percig ultrahangos kádban szonikáltattam. Ezt követően centrifugálásnak vetettem alá a mintát, 5500 ford./perc fordulatszámon. A folyadékfázist óvatosan, a leülepített csecsemőtászer szemcsék felkeverése nélkül egy 40 ml-es vial-ba pipettáztam. Az EtOH-H 2 O elegyet kétszer 4 ml hexánnal extraháltam, az extraktumot 0,1 g Na 2 SO 4 -el szárítottam, majd nitrogén atmoszférában 0,5 ml-re pároltam be. A következő lépés a szilárd fázisú extrakció volt, a C18 töltetű 500 mg-s SPE oszlopot használtam. Az oszlopot 4 ml hexán, 4 ml aceton, majd 4 ml 85:15 arányú MeOH-H 2 O eleggyel kondicionáltam. A kondicionálás után 200 µl-t vittem fel az extraktumból. Eluálószerként 85:15 térfogatarányú MeOH-H 2 O-t használtam. Az első 6 ml eluátumot gyűjtöttem be, majd hozzáadtam kb. 0,5 g NaCl-t és 1 ml desztillált vizet. Kétszer 1 ml hexánnal extraháltam, majd a hexános frakciókat egyesítettem és 0,05 g Na 2 SO 4 -tal szárítottam, majd egy GC-s fiolába zártam. 4.6 Kalibráció A minták mennyiségi elemzése során belső standard módszert használtam. A kalibráció a célkomponenseket ismert koncentrációban tartalmazó standard oldatsorozat mérésével történt, mindegyik mintához belső standardot (deuterált PAH-ok: acenaftén-d10, fenantrén-d10, krizén-d12, perilén-d12) adtam azonos mennyiségben. A kiértékelés során az egyes komponensek csúcsterületeinek a belső standard csúcsterületeire vonatkoztatott arányával számoltam. A csúcsterületeket a moláris tömegben hozzá közel álló belső standard csúcsterületére vonatkoztattam. A kalibrációt az alábbi koncentrációkban végeztem: 250 ng/ml, 500 ng/ml, 750 ng/ml. Az analitikai mérőgörbe paramétereit táblázatban foglaltam össze (6. Táblázat). 30