(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzéi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: A23K 1/16 ( ) A23K 1/18 ( ) A61K 36/00 ( ) A61K 31/198 ( ) (87) A nemzetközi közzéi adatok: WO PCT/FR 06/ () Elsõbbségi adatok: FR (72) Feltalálók: MERCIER, Yves, F-600 Clermont Ferrand (FR); GERAERT, Pierre-André, F Rochecorbon (FR) (73) Jogosult: Adisseo Ireland Ltd., Dublin 1 (IE) (74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Biológiailag hozzáférhetõ metionin és legalább egy esszenciális olaj kombinációja HU T2 A leírás terjedelme 12 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgya táplálékkészítmény, amely tenyészállatok táplálékának metioninnal történõ kiegészítésére szolgál. Az állatok bélmikroflóráját különbözõ bonyolult közösségek alkotják, idetartoznak a baktériumok, az élesztõk és a gombák. Ennek a mikroflórának nagy hatása van az állatok egészségére és a táplálékuk hatékonyságára. Általában két típusú baktériumot találunk itt meg: ezek egyrészt a patogén baktériumok (például Salmonella, Campylobacter jejuni vagy Clostridium perfringens) és másrészt az olyan baktériumok, amelyeket nem tekintünk patogénnek (ilyenek a Lactobacillus vagy a Propionibacterium). Ezeknek a baktériumoknak az összhatása a tenyészállatok képességeire negatív. Az állattenyésztéssel foglalkozó társadalmak régóta keresik az olyan lehetõségeket, amelyekkel a bél baktériumflórája orientálható, azért, hogy az állatok képességeit javítsák. Így például az US 6,322,825 számú dokumentumban esszenciális olajok alkalmazását ismertetik gyógyszerkészítmények elõállításánál az olyan készítmények helyettesítésére, amelyek például kortizon-szulfonamidokat vagy antibiotikumokat tartalmaznak. Az US 4,166,867 számú dokumentumban lovak számára ismertetnek táplálék elõállítást, amirõl azt írják, hogy illatosabb, mégpedig bevonószerként citrom esszenciális olaj alkalmazásának köszönhetõen. Itt az olaj a végtermék kevesebb mint 0,01 tömeg%¹át teszi ki. A WO 03/ számú szabadalmi bejelentésben táplálékkiegészítõt ismertetnek, amely kérõdzõ állatok táplálékkészítményeiben alkalmazható, és amely tartalmaz legalább egy esszenciális olajat és legalább egy szaponint, amely táplálékkiegészítõ a bendõben hat azáltal, hogy optimális koncentrációban tartja fenn a bendõfehérjéket. Általánosan elterjedt az állatok táplálékát növekedési faktor antibiotikumokkal kiegészíteni, ez lehetõvé teszi az emésztõcsatorna teljes baktériumterhelésének a csökkentését, és a növekedési vagy termelési hatékonyság javítását. Azonban az antibiotikumok növekedési faktorként történõ alkalmazása Európában január 1¹je óta tilos. Érezhetõ tehát az igény helyettesítõ termékek iránt. A találmány egyik célja olyan készítmény kidolgozása, amely tenyészállatok táplálására szolgál, és a tenyészállatok bélflórájára baktericidhatást fejt ki. A találmány további célja tenyészállatok táplálására szolgáló olyan készítmény kidolgozása, amely jótékonyan hat az állatok teljesítményére. A találmány további célja olyan táplálékkészítmény kidolgozása, amely nem tartalmaz antibiotikumokat, ugyanakkor rendelkezik azokkal a jótékony hatásokkal, amelyeket az antibiotikumok gyakorolnak általában az állatok növekedésére. A találmány további célja olyan táplálékkészítmény kidolgozása, amely a tenyészállatok bélflórájára hat. A találmány tárgya tehát biológiailag hozzáférhetõ metionint tartalmazó szinergetikus táplálékkészítmény, amely tenyészállatok táplálására szolgál, és amely tartalmaz: a) egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet és b) legalább 5% legalább egy esszenciális olajat. Azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti készítmény, amely ezt a két komponenst tartalmazza, szinergetikus baktericid hatást fejt ki a bélflóra aktivitására. Ugyanis a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és az esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke kölcsönösen erõsítik egymás hatását. A szakirodalomból nem ismert olyan dokumentum, amely egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és legalább egy esszenciális olaj szinergetikus baktericid hatását ismertetné. Biológiailag hozzáférhetõ metionin ¹on olyan vegyületet értünk, amely képes a tenyészállatok napi metioninszükségletét kiegészíteni. A metionint különbözõ formákban adagolhatjuk a tenyészállatoknak. A találmány szerint a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület izolált állapotban található. Elõször is ez lehet maga a metionin, így az L¹metionin vagy a D,L-metionin. Ez lehet továbbá egy metioninszármazék. Metioninszármazék ¹on például a metionin sóit, amidjait, alkil- és alkohol-észtereit, ketonszármazékait és hidroxianalógjait, valamint ezek származékait értjük. Ez lehet például a 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav (ezt az alábbiakban HMTBA-nak vagy metionin hidroxianalógnak nevezzük), amelyrõl ismert, hogy az állatok táplálására alkalmas metioninanalóg. Ennek az az elõnye, hogy folyékony formájú, ami megkönnyíti a táplálékgyártó cégek által történõ alkalmazását. A származék lehet továbbá a metionin hidroxianalógjának az izopropil-észtere, vagy a metionin terc-butil-észtere. A találmány szerinti táplálékkészítmény tartalmazhat több biológiailag hozzáférhetõ metioninforrást is, például tartalmazhatja a metionin és hidroxianalógjának a keverékét. A metioninforrás biológiai hozzáférhetõségét úgy határozzuk meg, hogy megállapítjuk a hatóanyag koncentrációját a vérben, az állat fejadagjában bevitt hatóanyag-mennyiséghez viszonyítva. Ez a meghatározás figyelembe veszi a felszívódási arányt a bélbõl a tápcsatornában történõ tartózkodás során, a felvett táplálékból a többgyomrú állatok különbözõ gyomraiba történõ áthaladást és a hatóanyagnak a szervezet által történõ átalakítási arányát (ez van például a metionin hidroxianalógja esetében). Esszenciális olaj ¹on egy a növényekbõl kapott folyadékot értünk (virágok, rügyek, magok, levelek, gallyak, füvek, kérgek, fa, gyümölcsök és gyökerek). Az esszenciális olajat elõállíthatjuk például sajtolással, fermentálással, enfleurage -zsal (nem illó oldószerrel végzett kivonás) vagy extrakcióval. Az esszenciális olajokat néha éterolajoknak vagy illóolajoknak is nevezik, a terpének (nemaromás szénhidrátok) és oxigéntartalmú vegyületek (alkoholok, aldehidek, ketonok) jelenléte miatt, amelyek aromások. Az esszenciális olaj 2

3 lehet nyers, penténmentesített, finomított vagy összetett. Az esszenciális olaj a találmány szerint lehet esszenciális olajok keveréke is. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az esszenciális olajok több mint 5%, legalább egy következõk közül választott vegyületbõl állnak: linalil-acetát, kumin-alkohol, fahéjaldehid, borneol, kadinén, kámfén, kámfor, karvakrol, karvon, cineol, citrál, citrolellál, citronellol, kumén, dipentén, esztragol, eugenol, gerániol, limonén (D vagy L), linalol (D vagy L), mentol, metilkavikol, parakumén, fellandrén, pinén (alfa vagy béta), metil-szalicilát, terpinén (alfa és béta), terpineol (alfa és béta), tujon, timol, bornil-acetát, geranil-acetát, eugenil-acetát, kumin-aldehid, allicin, anetol, perillaldehid és szabinén. Az esszenciális olajok elõnyösen több mint 10% legalább egy említett vegyületbõl állnak. Az esszenciális olajokat elõnyösen az alábbi növények héjából hidegsajtolással vagy különbözõ részeibõl desztillációval vonják ki: fokhagyma, áfonya, aloé, kapor, zöld ánizs, teafa, bazsalikom, bergamott, rózsafa, nyírfa, boróka, sárgarépa, kurkuma, cajuput, kámfor, fahéj, réti kömény, zeller, tölgyfa, citrom, citronella, koriander, kömény, tárkony, gömb formájú eukaliptusz, édeskömény, boróka, bourbon muskátli, gyömbér, ginseng, szegfûszeg, izsóp, nemes babérlevél, valódi levendula, széles levelû levendula, fenyérfû, limett, mandarin, majoranna, borsmenta, szerecsendió, mirrha, mirtusz, niaouli, hagyma, olibánum, narancs, oregano, palmarosa, grapefuit, papaya, paprika, pacsuli, petrezselyem, erõspaprika, tengerparti fenyõ, erdei fenyõ, alma, torma, rozmaring, szantál, borsfû, sassafras, zsálya, vad kakukkfû, terpentin, vöröskakukkfû, illatos verbéna, vetiver, ilang-ilang. Állat ¹on különösen a tenyészállatokat értjük, különösen a legeltetett állatokat (így a hús, tej, sajt és bõr miatt tenyésztett szarvasmarhát; a hús, gyapjú és sajt miatt tenyésztett juhot) a kecskét, a sertést, a nyulat, a szárnyasokat (csirke, tyúk, pulyka, kacsa, liba és egyebek), a víziállatokat (például halak, rákok, kagylók és osztriga), a szabadidõs tevékenységre való és társállatokat (ló, kutya, macska). A szarvasmarhafélék a párosujjú patás kérõdzõk egyik alcsaládja, ezek többgyomrú kérõdzõ emlõsök, amelyek több fontos tenyészállatfajtát foglalnak magukban (tejelõ fajták, húsfajták és vegyes fajták). A találmány szerinti készítmény por alakú vagy folyékony formájú. A biológiailag hozzáférhetõ metionin por vagy szemcse formájú. Ez többek között azt jelenti, hogy ezt a port az esszenciális olajjal hígítjuk a találmány szerinti készítmény elõállítása céljából. Amint már említettük, a metionin lehet hidroxianalógja formájában is, tehát folyékony formában. Ebben az esetben a két folyadékot homogénen elkeverjük, mielõtt az állatoknak adagoljuk, vagy az állatok fejadagjához hozzákeverjük. Elõnyösen az a) vegyületet a következõk közül választjuk: maga a metionin (L¹metionin vagy D,L-metionin), vagy annak valamely só, amid, alkil-észter vagy alkoholos észter típusú származéka, ketonszármazék, hidroxianalóg vagy az említettek származéka A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint az a) vegyület az (I) általános képlettel jellemezhetõ: ahol R jelentése hidrogénatom vagy izopropilcsoport és R jelentése OH vagy NH2 csoport. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti táplálékkészítmény, amely az állatok bélflórájára szinergetikus baktericid hatású, tartalmaz: a) 5 95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, b) 5 95 tömeg% legalább egy esszenciális olajat, és c) adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. Ezen megvalósítási mód szerint a táplálékkészítmény tartalmazhat legalább egy egyéb vegyületet, például egy emulgeálószert vagy zselatint. Ezen megvalósítási mód szerint egy nyitott készítményrõl van szó. Elõnyösen a készítmény tartalmaz tömeg%- ban egy biológiailag hozzáférhetõ metionint, tömeg%-ban legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. Egy találmány szerinti másik megvalósítási módban a készítmény tartalmaz tömeg%-ban egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, tömeg%-ban legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. Egy további találmány szerinti megvalósítási módban a készítmény tartalmaz tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, tömeg% legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. A találmány egyik eltérõ megvalósítási módja szerint a táplálékkészítmény, amely az állatok bélflórájára szinergetikus baktericid hatású, az alábbiakból áll: a) 5 95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és b) 5 95 tömeg% legalább egy esszenciális olaj. Ezen megvalósítási mód szerint a táplálékkészítmény csak ezt a két vegyületet tartalmazza, és nem tartalmaz semmi mást. Ilyenkor tehát egy zárt készítményrõl van szó. Elõnyösen a találmány szerinti táplálékkészítmény tömeg%-ban egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületbõl és tömeg%-ban legalább egy esszenciális olajból áll. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a készítmény tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületbõl és tömeg% legalább egy esszenciális olajból áll. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítmény tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, tömeg% legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet tartalmaz. 3

4 A találmány egyik megvalósítási módja szerint a biológiailag hozzáférhetõ metionin [vagyis az a) vegyület] a készítményben nagyobb mint tömeg%, elõnyösen nagyobb mint 80 tömeg% arányban van jelen. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az esszenciális olaj [vagyis a b) vegyület] a készítményben kisebb mint 40 tömeg%, elõnyösen kisebb mint 20 tömeg% arányban van jelen, különösen elõnyösen kisebb mint 10 tömeg%-ban. Ugyanakkor a találmány egyik megvalósítási módja szerint a b) vegyület a készítményben nagyobb mint 5 tömeg%, elõnyösen nagyobb vagy egyenlõ 8 tömeg% arányban van jelen. A találmány további tárgya táplálékadalék, amely tartalmazza a találmány szerinti készítményt. Táplálékadalék ¹on egy aktív vegyületet vagy aktív vegyületek keverékét értjük, amelyek a táplálékkészítményben vannak általában kisebb mint 2 tömeg%, például kisebb mint 1 tömeg% mennyiségben a táplálékra vonatkoztatva. A találmány további tárgya így napi tápanyagadag típusú állati táplálék, amely tartalmazza a fent definiált tápanyagkészítményt vagy a fent definiált táplálékadalékot. A találmány tárgya végül a fent meghatározott készítmény alkalmazása táplálékkiegészítõ elõállítására. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az ilyen alkalmazás lehetõvé teheti az endogén flóra aktivitásának csökkentését tenyészállatoknál vagy tenyészállatok bélflórájában a patogén mikroorganizmusok káros hatásának csökkentését. A találmány egyik megvalósítási módja szerint egy ilyen alkalmazás lehetõvé teheti még a tenyészállatok képességeinek, például a növekedés, az életképesség, homogenitás és a tenyésztés hatékonysága javítását. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a készítmény javítja a teljesítõképességet oly módon, hogy csökkenti a tenyészállatok bélflórájának aktivitását Tehát a találmány szerint a találmány szerinti készítményt alkalmazzuk tenyészállatoknak táplálékadalék elõállítására az állatok teljesítményének javítása céljából azáltal, hogy csökkentjük az állatok bélflórájának aktivitását. Az alábbi példák és ábrák lehetõvé teszik a találmány bizonyos jellemzõinek és elõnyeinek jobb megértését. Az alábbi példák célja, hogy a kísérlet különbözõ elemei hatására összehasonlítsuk a húscsirkék csípõbelében a flóra által termelt gázt. A gáztermelés a csirke csípõbél flórája baktériumos aktivitásának indirekt jelzõje. 1. példa Állatok és mintavétel 50 húscsirkét nevelünk búzaalapú étrenden. Ezeket a csirkéket azonos étrenden tartjuk. A csirkéket a 35. napon leöljük, majd kivesszük csípõbelük tartalmát anaerob körülmények között. Ezt a tartalmat flakonokba helyezzük, amelyeket 18 C¹on tárolunk. In vitro tesztek Az I. táblázatban ismertetett kísérleti leírás szerint mérjük az idõ függvényében termelt gáz térfogatát. 48 flakont töltünk meg egymás után az alábbiakkal: kezelés (a negatív összehasonlító mintánál semmi, a HMTBA, a HE vagy a kísérleti ), 90 ml pufferoldat, amely búzakeményítõt tartalmaz (ez tápközeg a baktériumok számára); ennek a pufferoldatnak az a szerepe, hogy állandó értéken tartsa a ph¹t és eltüntesse az oxigént, 10 ml inokulum, amely negyedrészben a csípõbél tartalmából és háromnegyed részben steril fiziológiás oldatból áll, amelyet a megtöltés elõtt leszûrünk és homogenizálunk. A vizsgált dózisokat úgy számítjuk, hogy azok reprezentatívak legyenek azon termék koncentrációkra, amelyeket az állatok gyomor-bél tartalmában találnánk. I. táblázat Negatív összehasonlító HMTBA HE 1 1. kísérleti HE 2 2. kísérleti HE 3 3. kísérleti HE 4 4. kísérleti HE 5 5. kísérleti Tétel 0 HMTBA HE 1 HMTBA +HE 1 Ismétlések száma HE 2 HMTBA +HE 2 HE 3 HMTBA +HE 3 HE 4 HMTBA +HE 4 HE 5 HMTBA +HE mg Bevitt HMTBAdózis tömeg% ,5 0 71, ,5 Bevitt mg HE¹dózis tömeg% , , ,5 Inokulum (ml) Pufferoldat (ml) HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke; HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában. 4

5 Az I. táblázatban ismertetett kísérleti leírásból kapjuk az idõ függvényében felvett gáztérfogatgörbéket, amelyek nagyobbrészt szigmoid alakúak. Ezeket a görbéket az alábbi minta szerint modelleztük: Y=A/[1+(C/t)^B] ahol Y=a képzõdött gáz térfogata, t=az idõ, A, B és C=a modell paraméterei. Ezekbõl az egyenletekbõl analizáljuk a modellezett végsõ térfogatot (Vf) (Vf=A), valamint azt az idõt, amely alatt a gáztermelés aránya maximális, ezt Trm-nek nevezzük (ezt az idõt használjuk a latenciaidõ indirekt méréseként, amelyet ebben a kísérletben nem tudunk meghatározni). Elvégzünk egy varianciaanalízist (ANOVA) a kapott adatokkal, a ek hatásának megállapítása céljából. Ha a kezelés hatásvalószínûsége szignifikáns, vagyis ha p<0,05, az átlagokat összehasonlítjuk a PLSD-teszttel (Fisher-féle), ami lehetõvé teszi a különbözõ kezelések átlagától való eltérések meghatározását. Az eredmények az alábbi II. táblázatban láthatók. A II. táblázatban a paraméterértékek szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbnél, amikor a kezelések nem rendelkeznek közös betûvel. Elõször megfigyeljük, hogy valamennyi vizsgált készítmény szignifikánsan eltérõ eredményt ad az összehasonlító mintától mindkét kritériumban, vagyis a Vf¹ és a Trm-értékben. A készítmények tehát csökkentik a csípõbélflóra aktivitását. A cél a Trm-érték maximalizálása. Valamennyi kísérleti tehát hatékony. Kimutatjuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület, jelen esetben a HMTBA és az esszenciális olaj között a baktériumaktivitásra. Tulajdonképpen a negatív összehasonlító minta Trm-értéke 10,8 óra. A HMTBA-kezelés azonos Trmértéket eredményez, amibõl kiderül, hogy a HMTBA nincs, vagy csak kis hatással van a baktériumaktivitás beindítására, amikor egyedül alkalmazzuk. A HE1-gyel végzett kezeléssel 13,5 óra Trm-értéket kapunk. A HE1-nek tehát van hatása a baktériumaktivitásra. Az 1¹es számú keverékkel viszont 19,3 óra Trm-értéket kapunk. Az 1¹es számú keveréknek tehát olyan hatása van a baktériumaktivitásra, ami nagyobb mint a HE1 és a HMTBA külön-külön gyakorolt hatásának az összege. Az 1¹es számú keverék, továbbá a 2 5¹ös számú keverék, amivel ugyanilyen típusú eredményt kapunk, tehát szinergetikus hatást gyakorol a Trm-mel mért baktériumaktivitásra. A Vf mérése a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf¹érték minimalizálása. A leghatékonyabbnak tekintett elemek azok, amelyek minimalizálják a végsõ térfogatot, és ugyanakkor maximalizálják a Trm-értéket. Ezek a 3¹as és az 5¹ös számú keverék. II. táblázat Negatív összehasonlító HMTBA HE 1 1. kísérleti HE 2 2. kísérleti HE 3 3. kísérleti HE 4 4. kísérleti HE 5 5. kísérleti Vf (ml) átlag tipikus eltérés a a b bc ef f c ef d de d f Trm (óra) átlag 10,8 10,8 13,5 19,3 28,6 46,3 21,5 39,1 28,9 35,8,8 37,2 tipikus 0,2 0,2 0,1 1,8 1,2 3,1 4,6 3,4 0,4 1,3 1,9 3,1 eltérés különbség különbség a a b c d f c e d e d e Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben), Trm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maximális (óra), n számú kísérleti elem=he n+hmtba. 2. példa Az 1. példa kísérleti körülményeit és paramétereit ismételjük a 2. példában az alábbi III. táblázat szerint. 5

6 III. táblázat HMTBA HE 1 1. kísérleti elem HE 2 2. kísérleti elem Elem 0 HMTBA HE 1 HMTBA+HE 1 HE 2 HMTBA+HE 2 Ismétlések száma Bevitt mg HMTBA dózis tömeg% ,7 0 84,7 Bevitt HE mg dózis tömeg% , ,3 Inokulum (ml-ben) Pufferoldat (ml-ben) HE1: vörös kakukkfû, HE2: teafa, HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában. Az eredményeket a IV. táblázatban adjuk meg. IV. táblázat Negatív összehasonlító HMTBA HE 1 1. kísérleti elem HE 2 2. kísérleti elem Vf (ml) átlag 542,0 296,2 226,7 203,1 319,6 361,1 tipikus eltérés 43,9 28,6 15,5 15,6 10,8 41,3 különbség a b b b b e Trm (óra) átlag 15,3 20,3 27,7 33,1 20,2 24,8 tipikus eltérés 1,0 0,7 1,1 0,8 0,8 0,8 különbség a b c d b e Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben), Trm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maxiális (óra), n számú kísérleti elem=he n+hmtba. Ami a Trm¹et illeti, amelynek maximálisnak kell lenni, valamennyi vizsgált kezelés (HMTBA, HE és a kísérleti elemek) hatékonyak. Ismét kimutatjuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület, ami a HMTBA és az esszenciális olaj között a baktériumaktivitásra. A negatív összehasonlító példánál kapott Trm-érték 15,3 óra. A HMTBA kezeléssel 20,3 óra Trm-értéket kapunk. Tehát a HMTBA hatást fejt ki a baktériumaktivitásra, amikor egyedül alkalmazzuk. A HE1-gyel végzett kezeléssel a Trm-érték 27,7 óra, tehát a HE1-nek van hatása a baktériumaktivitásra. Az 1¹es számú keverékkel (vagy 1¹es számú kísérleti elemmel) 33,1 óra Trm¹et kapunk. Tehát az 1¹es számú keveréknek olyan hatása van a baktériumaktivitásra, amely nagyobb, mint a HE1 és a HMTBA különkülön kifejtett hatásának az összege. Tehát az 1¹es számú keverék, valamint a 2¹es számú keverék, amellyel hasonló típusú eredményeket kapunk, szinergetikus hatást mutat A Vf mérése a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf minimalizálása. A leghatékonyabbnak tekintett elemek azok, amelyekkel minimális a végsõ térfogat, és ugyanakkor maximális a Trm. Ez tehát az 1¹es számú keverék. Megjegyzés: A jelen bejelentés különbözõ példáiban a Vf¹ és Trm-értékek közötti különbség abból adódhat, hogy eltérõ emésztett tartalmat vizsgálunk, különbözõ állatcsoportokból. Annak ellenére, hogy a tenyésztés, a táplálék és a mintavétel körülményei azonosak, a tenyészállat emésztõrendszerében található baktériumpopulációk sohasem teljesen azonosak. A példák függvényében megfigyelt értékek közötti eltérések a különbözõ mintavételekben jelen lévõ baktériumflóra típusai közötti eltéréseknek köszönhetõk. 3. példa Az 1. példa kísérleti körülményeit és paramétereit alkalmaztuk a 3. példában, amint az az alábbi V. táblázatból látható. 6

7 V. táblázat HMTBA HE 1 1. kísérleti elem Elem 0 HMTBA HE 1 HMTBA+HE 1 Ismétlések száma Bevitt HMTBA-dózis mg mg tömeg% ,7 Bevitt HE¹dózis mg tömeg% ,3 Inokulum (ml-ben) Pufferoldat (ml-ben) HE1: fahéj, HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában. Az eredményeket az alábbi VI. táblázatban adjuk meg. VI. táblázat HMTBA HE 1 1. kísérleti elem Vf (ml) átlag 632,7 334,3 218,3 20,0 tipikus eltérés különbség a b c e Trm (óra) átlag 14,1 28,1 53,5 >72 tipikus eltérés 0,1 2,2 10,9 nd különbség a b c d Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben), Trm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maxiális (óra), n számú kísérleti elem=he n+hmtba, nd: nem határoztuk meg. Valamennyi vizsgált készítménynél szignifikánsan eltérõ eredményeket kapunk, mint az összehasonlító vizsgálatban mindkét kritérium, vagyis a Vf és a Trm szempontjából. A készítmények tehát csökkentik a csípõbélflóra aktivitását. Ami a Trm¹et illeti, amelynek maximálisnak kell lenni, valamennyi vizsgált kezelés (HMTBA, HE és a kísérleti elem) hatékony. Ismét kimutattuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metionin, itt a HMTBA, és az esszenciális olaj, itt a fahéj esszenciális olaj között a baktériumaktivitásra. A negatív összehasonlító Trm-értéke 14,1 óra. A HMTBA kezeléssel 28,1 óra Trm¹et kapunk. A HMTBA-nak tehát hatása van a baktériumaktivitásra, amikor önmagában alkalmazzuk. A HE1 kezeléssel 53,5 óra Trm-értéket kapunk. A HE1 tehát hatást gyakorol a baktériumaktivitásra. Az 1¹es számú keverék (vagy 1¹es számú kísérleti elem) nagyobb mint 72 óra Trm-értéket eredményez. Tehát gyakorlatilag teljesen baktericid hatása van, ami megakadályozza az emésztõrendszer tartalmából származó baktériumok által termelt gázfejlõdést. A HMTBA és a fahéj esszenciális olaj kombinációja tehát nagyon erõs hatást fejt ki a baktériumaktivitásra, az a hatás nagyobb, mint a fahéj esszenciális olaj és a HMTBA külön-külön kifejtett hatásának az összege. Az 1¹es számú keverék tehát erõs szinergetikus hatást mutat. Lásd a 6. ábrát. A Vf mérése a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf minimalizálása. A leghatékonyabb elemeknek azokat tekintjük, amelyek minimalizálják a végsõ térfogatot, és ugyanakkor maximalizálják a Trm-értéket. Az 1¹es számú keverék megfelel ezeknek a jellemzõknek, tehát különösen hatékonynak tekinthetõ. 4. példa Az 1. példa kísérleti körülményeit és paramétereit alkalmaztuk a 4. példában is, amint azt a VII. táblázatban bemutatjuk. 7

8 VII. táblázat HMTBA MHE 1. kísérleti elem Elem 0 HMTBA MHE2 HMTBA + MHE2 Ismétlések száma Bevitt HMTBA-dózis mg tömeg% ,7 Bevitt HE¹dózis mg tömeg% ,3 Inokulum (ml-ben) Pufferoldat (ml-ben) MHE: 3/4 rész teafa, 1/4 rész fahéj esszenciális olaj, HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában. Az eredményeket a VIII. táblázatban adjuk meg. VIII. táblázat HMTBA MHE1 1. kísérleti elem Vf (ml) átlag tipikus eltérés különbség a b b d Tm (óra) átlag 11,1 15,4 19,0 25,3 tipikus eltérés 1,4 1,7 2,7 2,6 különbség a b d e Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben) Tm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maxiális (óra). Ismét kimutatjuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és az esszenciális olaj keverék között a baktérium aktivitására. A negatív összehasonlító minta Trm-értéke 11,1 óra. Ami a kísérleti elemet illeti, ami 84,7% HMTBA-ból és 15,3% keverékbõl áll, amely 3/4 részben teafa esszenciális olaj és 1/4 részben fahéj esszenciális olaj keveréke: a HMTBA kezelés 15,4 óra Trm-értéket eredményez. Tehát a HMTBA-nak hatása van a baktériumaktivitásra, amikor önmagában alkalmazzuk (különbség van a negatív összehasonlító mintához képest), a különbség értéke: 4,3 óra. az MHE kezeléssel 19,0 óra Trm-értéket kapunk. A HE1-nek tehát hatása van a baktériumaktivitásra (különbség mutatkozik a negatív összehasonlító mintához képest), a különbség értéke: 7,9 óra. a keverék (vagyis a kísérleti elem) 25,3 óra Trmértéket ad. A keveréknek tehát olyan hatása van a baktériumaktivitásra, amely nagyobb mint az MHE2 és a HMTBA hatásának összege külön alkalmazva. Tulajdonképpen a (25,3 11,1) nagyobb, mint (4,3+7,9) A keveréknek tehát szinergetikus hatása van a baktériumaktivitásra. A Vf mértéke a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf minimalizálása. A leghatékonyabb elemeknek azokat tekintjük, amelyek minimalizálják a végsõ térfogatot, és ugyanakkor maximalizálják a Trm-értéket. Ebben a kísérletben alkalmazott keverék megfelel ezeknek a jellemzõknek, tehát különösen hatékonynak tekinthetõ. 5. példa Az 1. példában kimutattuk 5 esszenciális olaj keverék hatékonyságát a búzaalapú táplálékkal táplált állatokból származó csípõbélflóra aktivitásának csökkentésére. Ennek a kísérletnek a célja annak a kimutatása, hogy az említett keverékbõl három ugyancsak csökkenti az olyan csirkék csípõbél flórájának a hatását, amelyeket kukoricaalapú táplálékkal tápláltak. Állatok és mintavétel A körülmények azonosak az 1. példában alkalmazott körülményekkel. 8

9 In vitro teszt A kísérleti sémát az I. táblázatban mutatjuk be a 2¹es, 3¹as, 4¹es és 5¹ös keverékre. Az eredményeket a IX. táblázatban adjuk meg. IX. táblázat HE2+HMTBA HE3+HMTBA HE4+HMTBA HE5+HMTBA Vf (ml) átlag tipikus eltérés 11,8 8,4 1,5 14,4 13,9 különbség a b b b b Tm (óra) átlag 17,1,1 22,1 28,0,3 tipikus eltérés 0,68 1,86 1,18 0,63 2,20 különbség a d b c d HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke. A táblázatban a paraméter értékek szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbnél, amikor a kezelésekben nincsen közös betû. A 4 vizsgált keverék szignifikánsan csökkenti a Vf¹értéket és szignifikánsan növeli a Trm-értéket az összehasonlító mintához viszonyítva. Következésképpen ezek a termékek hatékonyan csökkentik a kukoricaalapú táplálékkal táplált csirkék csípõbélflórájának az aktivitását mind rövid idõ alatt, mind hosszú idõ alatt, ugyanúgy, ahogy a búzaalapú táplálékkal táplált csirkék flórája esetében (az 1. példában). Ezek a keveréket tehát hatékonyak mindkét alkalmazott tápláléktípussal. 6. példa Az 1. és 5. példában kimutattuk több esszenciális olaj keverék hatékonyságát a húscsirkékbõl származó csípõbélflóra aktivitására Ennek a vizsgálatnak a célja, hogy megismerjük ezen keverékek hatékonyságát sertés vakbélflóráján. Állatok Sertéseket nevelünk a 100. napig, majd anaerob körülmények között kivesszük a vakbelük tartalmát. In vitro tesztek A kísérleti vázlatot az I. táblázatban ábrázoltuk a 2¹es, 3¹as és 4¹es számú keveréknél. Az eredményeket a X. táblázatban mutatjuk be. Ebben a táblázatban a paraméterek értékei szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbön, amikor a kezelésekben nincsen közös betû. X. táblázat HE2+HMTBA HE3+HMTBA HE4+HMTBA Vf (ml) átlag tipikus eltérés 48,0 2,5 27,4 17,4 különbség ab d c b Trm (óra) átlag 21,1 23,9 25,8 25,2 tipikus eltérés 0,36 1,25 2,04 1, különbség a bc c c HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke. Valamennyi vizsgált keverék csökkenti a Vf¹értéket, szignifikánsan a 2. és 3., átlagosan a 4. keverékre, és szignifikánsan növelik a Trm-értéket az összehasonlító mintához viszonyítva. A keverékek tehát hatékonyan csökkentik sertések vakbélflórájának aktivitását mind rövid távon, mind hosszú távon. 55 Tehát 3 keverék mûködik mind a csirke, mind a sertés flóráján. 7. példa Ennek a vizsgálatnak a célja összehasonlítani legalább egy esszenciális olaj és a HMTBA hatékonysá- 9

10 gát akkor, amikor a vegyületeket külön-külön alkalmazzuk, üvegekben (a két termék kis mennyiségben található 100 ml oldatban; tehát kicsi az érintkezés közvetlenül a molekulák között), vagy úgy alkalmazzuk, hogy elõzetesen az oldathoz történõ hozzáadásuk elõtt összekeverjük ezeket. Állatok Ehhez a vizsgálathoz 35 napos, búzaalapú táplálékkal táplált csirkékbõl származó csípõbélflórát alkalmazunk In vitro tesztek Ebben a vizsgálatban az 1. példában vizsgált egyik keveréket vizsgáljuk. A kísérleti adatokat az I. táblázatban adjuk meg a 2¹es számú keverékre. Az eredményeket a XI. táblázatban adjuk meg. A táblázatban a paraméter értékek szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbtõl, amikor a kezelésekben nincsen közös betû. XI. táblázat HE 2+HMTBA keverés után HE 2+HMTBA külön alkalmazva Vf (ml) átlag tipikus eltérés 20,4 23,3 24,4 különbség a c b Tm (h) átlag 14,8 31,3 19,4 tipikus eltérés 0,45 3,31 0,66 különbség a c a HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke. A HE2+HMTBA hatása lényegesen nagyobb, amikor a két vegyületet az üvegbe történõ adagolás elõtt keverjük össze: az elõzetes érintkezés különösen nagymértékben javítja a vegyületek flórára gyakorolt hatását. Felezhetjük tehát, hogy a vegyületek között fizikokémiai kölcsönhatások vannak, ezek a kölcsönhatások módosítják a hatékonyságukat. Ez igazolja, hogy egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és legalább egy esszenciális olaj keverékének szinergetikus hatása van példa Állatok Ebben a vizsgálatban 35 napos, búzaalapú táplálékkal táplált csirkékbõl származó csípõbélflórát vizsgálunk. In vitro tesztek A kísérlet vázlatát a XII. táblázatban adjuk meg. XII. táblázat HMTBA MHE Kísérleti elem Elem 0 HMTBA HE HMTBA+HE Ismétlések száma Bevitt HMTBA-dózis mg tömeg% ,7 Bevitt HE¹dózis mg tömeg% ,3 Inokulum (ml-ben) Pufferoldat (ml-ben) HE: oreganoolaj. Az eredményeket a XIII. táblázatban adjuk meg. A táblázatban a paraméterértékek szignifikánsan különbözõek az 5%¹os küszöbnél, amikor a kezelések nem tartalmaznak közös betût. 10

11 XIII. táblázat HMTBA HE HE+HMTBA Vf (ml) átlag tipikus eltérés 45,1 17,7 127,6 1,9 különbség a a a a Tm (h) átlag 16,0 16,2 18,3 20,3 tipikus eltérés 1,67 0,71 0,99 0,67 különbség a a a a Amikor önmagában alkalmazzuk, a HMTBA-nak nincs szignifikáns hatása a fermentációra, ugyanúgy, hogy az 1. példában volt megfigyelhetõ. Az oreganoolaj a Trm-értéket átlagosan 2,3 órával növeli meg a negatív összehasonlító mintához képest (szignifikáns hatás). Az oreganoolaj és a HMTBA keveréke a Trm-értéket 4,3 órával növeli meg a negatív összehasonlító mintához viszonyítva. A keverék hatása szinergetikus a baktériumflóra aktivitására. Az olaj és a HMTBA tehát szinergiában hatnak a flóra aktivitásának rövid távú csökkentésére Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az a) vegyületet a következõk közül választjuk: maga a metionin (L¹metionin vagy D,L-metionin), vagy annak valamely só, amid, alkil-észter vagy alkoholos észter típusú származéka, ketonszármazék, hidroxianalóg vagy az említettek származéka. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az a) vegyület az (I) általános képlettel jellemezhetõ: SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Tenyészállatok táplálására szolgáló biológiailag hozzáférhetõ metionint tartalmazó szinergetikus készítmény, amely tartalmaz: a) egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet és b) legalább 5 tömeg% legalább egy esszenciális olajat. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely a következõket tartalmazza: a) 5 95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, b) 5 95 tömeg% legalább egy esszenciális olajat és c) adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely az alábbiakból áll: a) 5 95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és b) 5 95 tömeg% legalább egy esszenciális olaj ahol R jelentése hidrogénatom vagy izopropilcsoport és R jelentése OH vagy NH2 csoport. 6. Az 1 5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása állat táplálására szolgáló táplálék elõállítására. 7. Az 1 5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása táplálékadalék elõállítására. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás táplálékadalék elõállítására tenyészállatoknál az endogén flóra aktivitásának csökkentésére. 9. A 7. igénypont szerinti alkalmazás táplálékadalék elõállítására tenyészállatok teljesítményei, így növekedés, életképesség, homogenitás, tenyésztés hatékonysága javítására. 10. A 7. igénypont szerinti alkalmazás gyógyszeroldat elõállítására tenyészállatok bélflórájának patogén mikroorganizmusai káros hatásai leküzdésére. 11

12 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest