(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: G01N 33/94 (06.01) G01N 33/66 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/GB 04/ (30) Elsõbbségi adatok: GB (72) Feltaláló: RICHARDSON, Peter, Hadstock, Cambridge CB1 6PF (GB) (73) Jogosult: Cambridge Biotechnology Ltd., Cambridge CB2 1XJ (GB) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Terápiás vegyületek azonosítása (7) Kivonat A találmány tárgyát potenciális terápiás ágensek azonosítása képezi. A találmány tárgya közelebbrõl eljárás potenciális terápiás ágensek azonosítására, amely szerint meghatározzák egy tesztvegyület affinitását egy adenozinreceptorral szemben magasabb ph¹n, ami legalább ph=7,4, és alacsonyabb ph¹n is, ami, és 7,2 közötti, vagy,0 és 7,0 közötti érték, és a vegyületet potenciális terápiás ágensként azonosítják, ha affinitása az alacsonyabb ph¹n legalább ¹szer nagyobb, mint a magasabb ph¹n. HU T2 A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 8 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgyát potenciális terápiás ágensek azonosítása képezi. Normál emlõsszervezet szöveteiben az extracelluláris ph szigorúan szabályozott 7,3 és 7,4 értékek között. Néhány szövetben alacsonyabb ph¹értékeket tapasztaltak, különösen a gyomor belsejében (2 és 3 közötti ph), és néhány epitélium felszínén [például a tüdõ felszínének ph¹ja körülbelül 6,8 (Jayaraman, S. és munkatársai, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, C04 11 (01)]. Patológiás szövetekben, például gyulladás, ischaemia és más típusú károsodás alatt a ph¹értéke lecsökken. Például artritiszes ízületben a ph¹érték tipikusan akár 1 egység csökkenése is tapasztalható [Andersson, S. E. és munkatársai, J. Rheumatol. 26, (1999)]. A közelmúltban kimutatták, hogy oszteoartritiszes ízületekben a porcnál alacsony, akár,0 ph¹értéket is tapasztaltak [Konttinnen, Y. T. és munkatársai, Arth. Rheum. 46, (02)]. Túlzott neuronális aktivitás szintén eredményezheti az extracelluláris ph csökkenését. Például epilepsziás elektromos kisülések és a gerincvelõ túlstimulálása az extracelluláris ph változásával társul [Chesler, M., Prog. Neurobiol. 34, 401/427 (1990)]. Ehhez hasonlóan, az extracelluláris ph csökkenését figyelték meg szilárd tumorokban, ahol megfigyeltek akár, ph¹értéket, valószínûleg a gyenge perfúzió és a glikolitikus metabolizmus túlsúlya következtében [Thistlethwaite, A. J. és munkatársai, Radiation Oncology Biol. Phys. 11, (198)]. Ischaemiában a vérellátás hiánya eredményezi a ph leesését [Immke, D. C. és McCleskey, E. W., Nature Neurosci. 4, (01)], és azt követõen gyulladásos sejtek aktiválódását. A fentebb említett valamennyi betegségben és állapotban a közös faktor az, hogy az érintett szövetek energiaigénye meghaladja az ellátottság mértékét. Ez anaerob metabolizmusban tejsav és piroszõlõsav termelõdését eredményezi. A ph¹változásokhoz vezetõ másik faktor a szekréciós vakuólumok kiürülése (például idegvégzõdésekben vagy gyulladásos sejtekben) az extracelluláris térbe, ugyanis a vakuólumokban a közeg ph¹ja alacsonyan van tartva. A ph csökkenése segíthet megvédeni a szövetet. Például a központi idegrendszerben lévõ NMDA-receptor, amely jelentõs szerepet játszik ischaemiás károsodásban, ph=6,8 értéken gátolva van. A másik közös faktor a fentebb leírt betegségben az adenozin. Az adenozin általánosan elõforduló, lokális hormon/neurotranszmitter, amely négy ismert receptoron hat, az adenozin A1¹, A2A¹, A2B- és A3¹receptorokon. Az adenozin általában kiegyensúlyozza az energiaellátást és az energiaigényt szövetekben. Például a szívben felszabaduló adenozin lelassítja a szívmûködést A1¹receptor által mediált hatással a csomókban és a szívpitvarban [Beardinelli, L. és Isenberg, G., Am. J. Physiol. 224, H734.H737], miközben egyidejûleg kitágítja a szívkoszorúeret az energiaellátás (azaz glükóz¹, zsír- és oxigénellátás) fokozása céljából [Knabb és munkatársai, Circ. Res. 3, (1983)]. Ehhez hasonlóan, gyulladás alatt az adenozin a gyulladást okozó aktivitás inhibitoraként szolgál, míg fokozott idegrendszeri aktivitás körülményei között (például epilepsziában) az adenozin gátolja az idegi kisüléseket [Klitgaard és munkatársai, Eur. J. Pharmacol. 242, (1993)]. Ez a rendszer, vagy változatai jelen vannak minden szövetben. Így tehát olyan körülmények között, amelyben a ph¹értéke leesik, az adenozin lokálisan kiegyensúlyozza az energiaellátást és energiaigényt, így helyreállítja a normál szöveti funkciót és ph¹t. Az adenozint önmagában szupraventrikuláris tachycardia diagnosztizálására és kezelésére lehet alkalmazni. Az adenozin-a1-receptor-agonistákról ismeretes, hogy hatásos analgetikumként képesek hatni [Sawynok, Eur. J. Pharmacol. 347, 1 11 (1998)]. Az adenozin-a2a-receptor-agonistákról ismeretes, hogy gyulladásgátló ágensként képesek hatni (lásd például az,877,180 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását és a WO 99/34804 számú nemzetközi közzétételi iratot). Kísérleti állatokban az A2A-receptoragonistákról kimutatták, hogy hatékonyan alkalmazhatók nagyon sokféle állapotban, például szepszisben, artritiszben és ischaemiás-reperfúziós károsodásban, amelyet vese¹, szívkoszorúér- vagy agyi artéria elzáródása eredményez. Ilyen körülmények között a közös faktor a gyulladásos válasz mértékének csökkenése az említett receptor gátlóhatása következtében, amely megtalálható a legtöbb, ha nem az összes gyulladásos sejten. Az adenozinreceptorok általános (mindenféle szövetben elõforduló) eloszlása azt jelenti, hogy adenozinreceptor-agonisták beadása káros mellékhatásokat okoz. Ez általában eleve kizárja adenozinalapú terápiák kifejlesztését. Szelektív A1¹receptor-agonisták bradycardiát okoznak. Az elsõ szelektív A2A-receptoragonistával 2¹[4¹(2¹karboxi-etil)-fenil-etil-amino]- -Netil-karboxamido-adenozinnal vagy CGS21680¹al 2.Afázisú klinikai vizsgálatokat végeznek potenciálisan magas vérnyomás elleni szerként alkalmazva. Azonban beadása jelentõs vérnyomásesést okoz és megnõ a szív kimenõ teljesítménye. Az FR számú szabadalmi iratban leírtak szerint adenozinszármazékok (ideértve olyan 2¹alkoxiadenozin-származékokat, amelyek kis, kettõnél nem kevesebb szénatomszámú alkilcsoportot tartalmaznak) alacsony vérnyomást elõidézõ (hipotenzív) és szívkoszorúeret tágító aktivitással rendelkeznek. Bartlett és munkatársai [J. Med. Chem. 24, (1981)] leírták 1¹metil-izoguanozin analógjainak elemzését. Ilyen analógok közé tartozik 2¹metoxiadenozin (spongosin-ként is ismeretes). Ezt és más vegyületeket teszteltek vázizomlazító, hipotermikus, kardiovaszkuláris és gyulladásgátló hatásaikra rágcsálókban, orális beadást követõen. 2¹metoxi-adenozin patkányokban carrageenannal indukált gyulladást 2%-ban gátolt, mg/kg po. beadva. Azonban az átlagos vérnyomásban (41%) és a pulzusban (2%) is megfigyeltek csökkenést, ha ezt a vegyületet ebben a dózisban beadták. 2

3 Kirk és Richardson [British Journal of Pharmacology 114, (199)] leírták [3H]-CGS21680 kötõhelyek jellemzését patkánystriatumban és ¹cortexben. A WO96/38728 számú nemzetközi közzétételi iratban egy eljárást közölnek A2a-receptor kötési aktivitásának mérésére farmakológiai jelentõségû vegyületekkel szemben ( 3 H)-SCH8261 jelû tritiált ligandum alkalmazásával. Jiang és munkatársai [J. Med. Chem. 40, (1997)] leírták helyspecifikus mutagenezis alkalmazását humán A2A jelû adenozinreceptortranszmembrán helikális doménjében, a ligandumkötés szerkezet-aktivitás összefüggésének vizsgálatára. Ribeiro és munkatársai [Progress in Neurobiology 68, (03)] összefoglaló leírást közöltek adenozinreceptorokról az idegrendszerben, és megjegyzik, hogy az adenozinreceptor-agonistákkal asszociált, perifériás mellékhatások korlátozzák terápiás szerként történõ alkalmazhatóságukat. Tehát van igény olyan adenozinreceptor-agonisták elõállítására, amelyeket minimális mellékhatásokkal lehet beadni. Askalan és Richardson [J. Neurochem. 63, (1994)] leírták hisztidincsoportok szerepét az adenonzin-a2a-receptor ligandum kötõhelyekben. Különösen a ligandumok kötésének ph¹függését vizsgálták. Az affinitás két négyszeres növekedését figyelték meg néhány ligandumra, ha a környezet ph¹ját 7,0- rõl levitték,¹re. Azonban adenozin-a2a-receptorok hatását nem vizsgálták. Hiley és munkatársai [British Journal of Pharmacology 116, (199)] a ph hatásait vizsgálták adenozinra adott válaszban, patkányból izolált, perfúziónak alávetett, mesenteria superior artériaágyban. Az átáramoltatott folyadék ph¹jának csökkentése 6,8¹ra ¹szeresére növelte az adenozinra adott dilatációs válaszokat. Meglepõ módon azt találtuk, hogy fiziológiás tartományban, viszonylag alacsony ph¹értékeknél néhány vegyület lényegesen magasabb (körülbelül 0-szor magasabb) affinitással és/vagy hatékonysággal rendelkezik adenozinreceptorokkal szemben, mint magasabb ph¹értékeken. Feltételezhetõen ez amiatt van, mert a receptorok konformációja megváltozik a ph¹változásra adott válaszként. Felismertük, hogy adenozinreceptorok ph¹érzékenységét ki lehet használni olyan más adenozinreceptor-ligandumok azonosítására, amelyek csak alacsony ph¹körülmények között mutatnak magas receptoraffinitást és/vagy hatékonyságot. Ilyen adenozinreceptor-ligandumok hatásaival azután célba lehet venni alacsony ph¹jú régiókat, például patológiás szöveteket anélkül, hogy ez az ismert adenozinreceptor-ligandumok beadásával járó, súlyos mellékhatásokat okozna. A találmány tárgyát képezi eljárás potenciális terápiás ágens azonosítására, amelyben meghatározzuk egy tesztvegyület affinitását és/vagy hatékonyságát egy adenozinreceptorral szemben magasabb ph¹n, ami legalább ph 7,4, és alacsonyabb ph¹n is, ami , és 7,2 közötti, vagy,0 és 7,0 közötti érték, és a vegyületet az említett ágensként azonosítjuk, ha affinitása és/vagy hatékonysága alacsonyabb ph¹n nagyobb, mint magasabb ph¹n. A különbség a potenciális terápiás ágens adenozinreceptorral szemben mutatott affinitása és/vagy hatékonysága között alacsonyabb ph¹n és magasabb ph¹n elõnyösen a lehetõ legnagyobb. Abban az esetben, ha nagy a különbség affinitásban és/vagy hatékonyságban, várható, hogy az ágenst olyan dózisban lehet beadni, amelynél kifejti kedvezõ terápiás hatásait, és elkerülhetõ vagy minimalizálható bármilyen mellékhatás, ami az ágens magasabb dózisaival társul. Az affinitás és/vagy hatékonyság alacsonyabb ph¹n elõnyösen minimum ¹szer nagyobb, elõnyösebben minimum 0- szor nagyobb, a legelõnyösebben minimum 00-szer nagyobb, mint az affinitás és/vagy hatékonyság magasabb ph¹n. Alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással és/vagy hatékonysággal rendelkezõ agonistákat alkalmazni lehet terápiában, például fájdalom, különösen neuropátiás vagy krónikus gyulladásos fájdalom és artritisz prevenciójára, kezelésére vagy csillapítására. Ilyen agonisták szelektivitása azt jelenti, hogy célba lehet venni patológiás szöveteket, például artritiszes ízületeket, ezáltal lehetõvé válik a technika állása szerint jelenleg alkalmazott dózisoknál kisebb dózisok beadása, és a mellékhatások minimalizálása. A találmány szerinti eljárásokat olyan ligandumok azonosítására lehet alkalmazni, amelyek csak adenozin-a2a-receptorhoz kötõdnek nagy affinitással alacsony ph¹n, amely esetben a receptorról feltételezhetõ, hogy eltérõ konformációt vesz fel, mint amit ph=7,4 értéken. Mivel ezek a ligandumok csak alacsony ph¹n hatásos agonisták, a szervezetnek csak abban a részében mûködnek, ahol a ph lecsökkent, a leginkább figyelemre méltó módon, artritiszes ízületi tokban és hasonló gyulladásos helyeken. A találmány szerinti eljárásokat olyan ligandumok azonosítására lehet alkalmazni, amelyek csak adenozin-a1-receptorhoz kötõdnek nagy affinitással alacsony ph¹n. Ilyen ligandumok várhatóan alkalmasak túlzott mértékû szövetaktivitás, például idegi aktivitás csökkentésére, és várhatóan csökken a mellékhatások mértéke, ismert adenozin-a1-receptor-agonistákhoz képest. Ismert agonisták mellékhatásai lehetnek bradycardia és arteritisz. A találmány szerinti eljárásokat olyan ligandumok azonosítására lehet alkalmazni, amelyek csak adenozin-a3-receptorhoz kötõdnek nagy affinitással alacsony ph¹n. Ilyen ligandumok várhatóan alkalmasak gyulladásos rendellenességek kezelésére. A leírásban közölt információkra alapozva, szakember képes azonosítani alkalmas hatóanyagokat speciális beteg állapotok kezelésére. Ezek az ágensek szelektíven lennének hatásosak patológiás szövetben, így csökkentik a receptorokkal társult mellékhatások valószínûségét és súlyosságát. Izolált szövetben és sejtpreparátumokban a ph¹érzékenységet pontosan meg lehet mérni. Ezért azok a 3

4 vegyületek, amelyekrõl bebizonyosodott, hogy megfelelnek az adott követelményeknek patológiás állatmodellekben (például gyulladásos fájdalom esetén), jelölt -ként jöhetnek szóba ezt követõ gyógyszerfejlesztéshez. A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületekrõl várható, hogy különbözõ állapotok terápiájában, beleértve profilaxisában lehet ezeket alkalmazni. Ezek olyan betegségek vagy állapotok lehetnek, amelyekben a betegség vagy állapot prevencióját, kezelését vagy enyhítését adenozinreceptorok aktiválása közvetíti. Ilyen betegségek vagy állapotok például olyanok, amelyekben a helyi szöveti energiaigény meghaladja ellátottság mértékét, például gyulladás, ischaemiás-reperfúziós károsodás, túlzott neuronális aktivitás (például epilepsziában, vagy krónikus fájdalom vagy hiperalgézia, azaz fokozott fájdalomérzékenység, beleértve gyulladásos és neuropátiás fájdalom), szepszis, szeptikus sokk, neurodegeneráció (például Alzheimer-kórban), és más állapotok, amelyekben az energiaigény meghaladja az ellátottság mértékét, például izomkimerültség vagy sportgörcs. A találmány szerinti eljárások alkalmazásával azonosított vegyületek hatékonyak lehetnek fájdalom prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére, különösen az alábbi fájdalomtípusok esetén: bélfájdalom, hasnyálmirigy-fájdalom, medence/gáti fájdalom, hátfájdalom, derékfájdalom, mellfájdalom, szívfájdalom, medencefájdalom/pid, ízületi fájdalom (például amely íngyulladással, nyálkatömlõ-gyulladással, akut artritisszel társul), nyakfájdalom, szülési fájdalom (vajúdás vagy császármetszés), rákos fájdalom, HIV-eredetû fájdalom, eltávolított végtagban érezni vélt fájdalom (fantomfájdalom), mûtét utáni fájdalom, krónikus neuropátiás fájdalom, gerincmûtét utáni fájdalom ( failed back surgery syndrome ), fizikai trauma utáni fájdalom (ideértve lõtt seb által, közlekedési baleset által okozott vagy égés okozta fájdalom), hegszövet fájdalma, akut herpesz Zoster-fájdalma, akut hasnyálmirigy-gyulladásban átfúródás fájdalma (rák), herpesz utáni neuralgia, trigeminális neuralgia. A találmány szerinti eljárások alkalmazásával azonosított vegyületek hatékonyak lehetnek neuropátiás vagy más fájdalom prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére, amit az alábbiak okoznak vagy ezekkel társult: diabetikus neuropátia, polineuropátia, fibromyalgia, myofascialis (izompólya) fájdalom szindrómája, oszteoartritisz, reumatoid arthritis, ülõidegzsába vagy lumbáris radiculopátia (ideggyökér-bántalom), spinalis (gerinc) stenosis, halántékcsonti-állkapocsi ízületi rendellenesség, vesekólika, menstruációs zavar/endometriózis. A találmány szerinti eljárások alkalmazásával azonosított vegyületek hatékonyak lehetnek gyulladásos vagy más fájdalom prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére, amit az alábbiak okoznak vagy ezekkel társult: artritiszes állapotok, például oszteoartritisz, reumatoid arthritis, reumatoid spondylitis (csigolyagyulladás), köszvényes artritisz, vagy asztma, krónikus obstruktív tüdõbetegség, fibrózis, sclerosis multiplex, szepszis, szeptikus sokk, endotoxikus sokk, gram-negatív sokk, toxikus sokk, vérzéses sokk, felnõttkori respirációs distressz szindróma, agyi malária, szervtranszplantáció kilökõdése, rákot, HIV¹et kísérõ fájdalom, krónikus tüdõgyulladás betegség, szilikózis, tüdõ sarcosis, csontreszorpciós betegség, reperfúziós károsodás, graft-versus-host kilökõdés, sclerosis multiplex, myastenia gravis, allograft kilökõdések, fertõzés következtében kialakult láz és myalgia (izomfájdalom), AIDS¹el összefüggõ komplex (ARC), hegdaganat (keloid) képzõdése, hegszövet képzõdése, Crohn-féle betegség, fekélyes vastagbélgyulladás és pyresis, irritábilis bél szindróma, oszteoporózis, agyi malária, bakteriális meningitisz, vagy amfotericin-b-kezelés, interleukin 2-kezelés, OKT3-kezelés vagy GM¹CSF-kezelés káros mellékhatásai. A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületek különösen hatékonyak lehetnek bizonyos típusú gyulladások prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére, például artritisz (különösen az ízületi tok artritisze), asztma, pszoriázis (pikkelysömör) és bélgyulladás esetén. A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületek különösen hatékonyak lehetnek reumatoid arthritis, irritábilis bél szindróma vagy oszteoartritisz prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére. Egy vegyület használhatóságát radioaktív ligandumot alkalmazó vizsgálati eljárással lehet meghatározni, a lentebb leírtak szerint. Az affinitás növekedését a nagy affinitású kötõhelyre (azaz az agonista kötõhelyre) lehet mérni, míg az agonista hatékonyságát különbözõ ph¹értékeken úgy lehet meghatározni, hogy mérjük a kis és a nagy affinitású állapotok affinitásának különbségét. Ezt GTP és stabil analógjainak alkalmazásával lehet elvégezni, amely átalakítja a nagy affinitású receptor kötõhelyet kis affinitású hellyé, tehát úgy mûködik, mintha agonisták aktiválnák a receptort. Nem hatékony ligandumok (azaz antagonisták) nem különböztetik meg ezeket az eltérõ affinitási állapotokat. Ezzel alternatív módon, eltérõ ph¹értékeken különbözõ affinitásokkal és/vagy hatékonysággal rendelkezõ agonistákat funkcionális vizsgálati eljárásokban lehet azonosítani, azaz egy második hírvivõ (messenger) termelõdésének vagy fogyásának mérésével (például campfelhalmozódás, inozitol-foszfát-átvitel ( turnover ), kalcium-jelátvitel, kinázaktiválás stb. stimulálásával vagy gátlásával). Egy tesztvegyület adenozinreceptorral szembeni affinitását az alábbiak közül bármelyik eljárás alkalmazásával meg lehet határozni: i) jelölt tesztvegyület (beleértve radioaktívan jelölt tesztvegyület) kötése több koncentrációban szövetekben, szövetmetszetekben, intakt sejtekben, feltárt sejtekben vagy sejtbõl származó membránokban jelen lévõ adenozinreceptorokhoz; ii) az adenozinreceptorokon lévõ, jelölt tesztvegyület kicserélõdése jelöletlen tesztvegyülettel való inkubálással, ilyen receptorokat hordozó szövetek, szövetmetszetek, intakt sejtek, feltárt sejtek vagy sejtbõl származó membránok alkalmazásával. A jelölt vegyület le- 4

5 het a tesztvegyület, vagy a receptorra szelektív ligandum. Nyilvánvaló, hogy egy agonista hatékonyságát az fejezi ki, hogy milyen mértékben képes aktiválni receptorát. Nagy hatékonyságú agonisták maximális receptorválaszt idéznek elõ, és részleges agonisták kisebb mértékû választ idéznek elõ. A tesztvegyület hatásának hatékonyságát az adenozinreceptoron az alábbi módszerek bármelyikével meg lehet határozni: i) meghatározzuk az adenozinreceptor hatásának mértékét jeltovábbító molekulák, például camp, IP3 és szabad kalcium felhalmozódásának vagy fogyásának mérésével szövetekben, szövetmetszetekben, intakt sejtekben vagy részlegesen feltárt sejtekben; ii) biológiai membránokat alkalmazunk adenozinreceptor aktiválásának meghatározására egy tesztvegyületre adott válaszban, G¹protein-aktiválódás mérésével (például radioaktívan jelölt guanin nukleotidok alkalmazásával), vagy enzimaktivitás (például adenililcikláz, foszfodiészteráz, foszfolipáz vagy protein-kináz) mérésével, vagy adenozinreceptor által aktivált ioncsatornákban az ionáramlás mérésével (például kalciumvagy kálium-csatornák); iii) adenozinreceptor hatását protein-kináz aktivitásának mérésével határozzuk meg szövetekben, szövetmetszetekben, intakt sejtekben, részlegesen feltárt sejtekben vagy sejtbõl származó membránokban; iv) adenozinreceptor hatását foszfolipáz-aktivitás (például foszfolipáz¹c, foszfolipáz¹a2, foszfolipáz¹a2, foszfolipáz¹d) mérésével határozzuk meg szövetekben, szövetmetszetekben, intakt sejtekben, részlegesen feltárt sejtekben vagy sejtbõl származó membránokban; v) adenozinreceptor hatását fehérjefoszforiláció és defoszforiláció mérésével határozzuk meg szövetekben, szövetmetszetekben, intakt sejtekben, részlegesen feltárt sejtekben vagy sejtbõl származó membránokban. Egy vegyület aktivitásának szintje (azaz belsõ, intrinszik hatékonysága) változhat a kívánt hatástól függõen. Például kis hatékonyságú agonisták alkalmasak lehetnek a receptor-deszenzibilizálás valószínûségének csökkentésére, vagy extra dimenziót hozhatnak létre a megcélzásban, azaz olyan szövetekben, ahol nagy mennyiségû a receptortartalék. Az aktivitás elõnyösen legalább 0%¹a annak, elõnyösebben legalább akkora, mint amit bármilyen hatóanyagra lentebb leírtak. A különbség elõnyösen fiziológiás ph (7,4) és ph=, vagy magasabb, például 6,2 (extrém ischaemiás szövetre), 6,, 7,0 (tipikus érték krónikus gyulladásos területen), vagy 7,2 ph¹érték között látszik. Ezzel alternatív módon, kis hatékonyságú, részleges agonistákat funkcionális antagonistaként lehet alkalmazni, amelyek a receptorhoz kötõdnek és meggátolják az endogén transzmitter/hormon (például adenozin) kötõdését. Ha egy potenciális terápiás ágenst azonosítunk, ezt követõen meghatározhatjuk, hogy az ágens rendelkezik¹e terápiás hatással, például fájdalom vagy gyulladás ellen (különösen a fentebb felsorolt bármelyik betegség vagy állapot ellen). Elõnyösen nem humán állatmodellt alkalmazunk annak meghatározása céljából, hogy az azonosított ágens rendelkezik¹e terápiás hatással. Bármilyen alkalmas állatmodellt alkalmazhatunk. Ilyen például kollagén-ii-injekcióval indukált artritisz, vagy olyan neuropátiás fájdalom, amit sztreptozotocinnal indukált diabétesz indukált. Az azonosított ágens terápiás hatását elõnyösen az ágens EC0-értéke alatti koncentrációban határozzuk meg az adenozinreceptornál, ph=7,4¹en. A terápiás hatást elõnyösebben olyan koncentrációban határozzuk meg, amely az EC0-érték egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van. Annak igazolása céljából, hogy az azonosított ágenst be lehet¹e adni minimálisra csökkentett mellékhatásokkal, meghatározhatjuk az azonosított ágens által okozott mellékhatásokat (például bradycardia, alacsony vérnyomás vagy tachycardia). Ezeket az ágens EC0-értéke alatti koncentrációban határozzuk meg az adenozinreceptornál, ph=7,4¹en. A mellékhatásokat elõnyösebben olyan koncentrációban határozzuk meg, amely az EC0-érték egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van. Számos vegyületet azonosítottak, amelyek adenozin-a1- vagy ¹A2-receptorra agonisták. Ezek a vegyületek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitást mutatnak adenozin-a1- vagy ¹A2-receptorral szemben. Feltételezhetõ, hogy a receptorok konformációja megváltozik a ph¹változásra adott válaszként. A változás pontos mechanizmus ismeretlen, de feltételezik, hogy az agonistában jelen lévõ hisztidinek szerepet játszanak benne ezekhez a receptorokhoz kötõdve, és amelyek pk¹értéke a fiziológiás tartományban van. Az 1. ábrán szemléltetjük az affinitás növekedését, amelyet 2¹metoxi-adenozinnal figyeltünk meg, ahogyan a ph¹t ligandumkötési kísérletben ph=7,4-rõl csökkentettük ph=,¹re. A 2. ábrán bemutatjuk, hogy megfigyelhetõ volt az affinitás ugyanilyen növekedése ph=7,0 és ph=6,8 értéken, de az archetipikus CGS21680 jelû A2A-receptor-agonista nem mutatott ilyen hatást. Az affinitás változásának másik meglepõ következménye, hogy 2¹metoxi-adenozin hatékonysága adenozin-a2a-receptoron körülbelül 0-szorosára növekedett (3. ábra). Ezzel ellentétben 3 ¹dezoxi-2-metoxi-adenozin affinitása csökkent az A1¹receptoron, ha a ph¹értéke 7,4-rõl lecsökkent 6,2¹re. A nagy affinitású állapotokra meghatározott Ki¹értékek [3H]-DPCPX kicserélõdésében humán A1¹receptorról 8±8 nm ph=7,4¹en, és 40±114 nm ph=6,2¹n. Tehát úgy tûnik, hogy adenozinreceptor-agonisták és részleges agonisták a szöveti ph lokális változásaival behatóan befolyásolhatók, és ez meglepõ módon az ilyen ligandumok hatékonyságát növelheti vagy csökkentheti. Az olyan vegyületek, amelyek hatékonysága csökkentést mutat,

6 valószínûleg kis hatékonyságú részleges agonistaként mûködnek. Felismertük, hogy potenciális terápiás ágenseket úgy is lehet azonosítani, hogy tesztvegyületet beadunk in vivo vagy in vitro annál alacsonyabb dózisban, mint ami várhatóan szignifikáns mértékben aktiválna adenozinreceptorokat (azaz elegendõ adenozinreceptort kedvezõ terápiás hatás elõidézéséhez), és azután meghatározzuk azt a dóziskülönbséget, ami szükséges a patológiás szövetben lévõ receptor aktiválásához normál szövethez viszonyítva. A találmány tárgyát képezi egy további vonatkozásában eljárás potenciális terápiás ágens azonosítására, amelyben egy tesztvegyület érintkeztetünk egy patológiás szövetben, sejtben vagy membránban lévõ, és egy megfelelõ normál szövetben, sejtben vagy membránban lévõ adenozinreceptorral (A1¹, A2A¹, A2B- vagy A3¹adenozin-receptorral) a tesztvegyület EC0-értéke alatti koncentrációjában az adenozinreceptornál ph=7,4-értéken, és meghatározzuk, vajon van¹e bármilyen különbség az adenozinreceptor hatásában a tesztvegyülettel való érintkeztetésre adott válaszban a normál szövet és a patológiás szövet között. A tesztvegyületet elõnyösen olyan koncentrációban érintkeztetjük az adenozinreceptorral, amely az EC0- érték egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van. A tesztvegyületet abban az esetben azonosítjuk potenciális terápiás ágensként, ha a tesztvegyület az adenozinreceptor agonistája, és az adenozinreceptor hatása, ami a tesztvegyületre adott válaszként jön létre, nagyobb mértékû patológiás szövetben, mint normál szövetben. Ha a patológiás szövet epitél szövetet tartalmaz, epitél betegség (például pszoriázis, asztma, COPD) kezelésére szolgáló terápiás vegyületeket lehet azonosítani. Adenozinreceptor-agonisták, amelyek különbözõ receptoraffinitással és/vagy hatékonysággal rendelkeznek eltérõ ph¹n, vagy amelyek különbözõ hatást fejtenek ki patológiás szövetben normál szövethez viszonyítva, lehetnek például adenozinszármazékok. Tehát azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárást szkrínelési eljárásként lehet alkalmazni, különösen adenozinszármazékok szkrínelésére. Olyan származékok lehetnek elõnyösek, amelyek kis affinitással és/vagy hatékonysággal rendelkeznek ph=7,4¹en. A származékok szelektivitása különbözõ adenozinreceptorokkal szemben megváltozhat a ph csökkenésével, ennek megfelelõen egy adott vegyület szelektivitását meg kell határozni normál és csökkentett ph¹n egyaránt. Az alábbi általános képlet szerinti, a találmány tárgyát nem képezõ vegyületeket találtuk, amelyek közül többrõl feltételezzük, hogy nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokra és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon alacsonyabb ph¹n: (I) ahol R jelentése 1 4 szénatomos (C 1 4 ) alkoxicsoport és X jelentése OH; (II) ahol R jelentése 1 4 szénatomos (C 1 4 )-alkoxi-csoport és X jelentése H. Azt találtuk, hogy a. példában szemléltetésképpen bemutatott vegyületek affinitása nagyobb volt adenozin-a2a-receptorokkal szemben alacsonyabb ph¹n. Az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületeket, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, különbözõ betegségek vagy állapotok prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére szolgáló gyógyszerként lehet alkalmazni. Ilyenek lehetnek olyan betegségek vagy állapotok, amelyekben a prevenciót, kezelést vagy enyhítést adenozinreceptorok aktiválódása közvetíti. Ilyen betegségek vagy állapotok például olyanok, amelyekben a lokális energiaigény meghaladja az ellátottság mértékét és/vagy a ph leesik. Az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületeket, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, különösen rák, gyulladás, ischae- 6

7 miás-reperfúziós károsodás, fájdalom, fokozott neuronális aktivitás (például epilepsziában, vagy krónikus fájdalomban vagy hiperalgéziában, beleértve gyulladásos és neuropátiás fájdalmat), szepszis, szeptikus sokk, neurodegeneráció (például Alzheimer-kór), izomkimerültség vagy izomgörcs (különösen sportgörcs) prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére szolgáló gyógyszer elõállítására lehet alkalmazni. Az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületek, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, az alábbi típusú fájdalmak prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére lehetnek hatékonyak: bélfájdalom, hasnyálmirigy-fájdalom, medence/gáti fájdalom, hátfájdalom, derékfájdalom, mellfájdalom, szívfájdalom, medencefájdalom/pid, ízületi fájdalom (például amely íngyulladással, nyálkatömlõgyulladással, akut artritisszel társul), nyakfájdalom, szülési fájdalom (vajúdás vagy császármetszés), rákos fájdalom, HIV-eredetû fájdalom, eltávolított végtagban érezni vélt fájdalom (fantomfájdalom), mûtét utáni fájdalom, krónikus neuropátiás fájdalom, gerincmûtét utáni fájdalom ( failed back surgery syndrome ), fizikai trauma utáni fájdalom (ideértve lõtt seb által, közlekedési baleset által okozott vagy égés okozta fájdalom), hegszövet fájdalma, akut herpesz Zoster-fájdalma, akut hasnyálmirigy-gyulladásban átfúródás fájdalma (rák), herpesz utáni neuralgia, trigeminális neuralgia; neuropátiás vagy más fájdalom, amit az alábbiak okoznak vagy ezekkel társult: diabetikus neuropátia, polineuropátia, fibromyalgia, myofascialis (izompólya) fájdalom szindrómája, oszteoartritisz, reumatoid arthritis, ülõidegzsába vagy lumbáris radiculopátia (ideggyökérbántalom), spinalis (gerinc) stenosis, halántékcsontiállkapocsi ízületi rendellenesség, vesekólika, menstruációs zavar/endometriózis; vagy amit az alábbi gyulladásos vagy más fájdalom okoz vagy ezekkel társult: artritiszes állapotok, például oszteoartritisz, reumatoid arthritis, reumatoid spondylitis (csigolyagyulladás), köszvényes artritisz, vagy asztma, krónikus obstruktív tüdõbetegség, fibrózis, sclerosis multiplex, szepszis, szeptikus sokk, endotoxikus sokk, gram-negatív sokk, toxikus sokk, vérzéses sokk, felnõttkori respirációs distressz szindróma, agyi malária, szervtranszplantáció kilökõdése, rákot, HIV¹et kísérõ fájdalom, krónikus tüdõgyulladás betegség, szilikózis, tüdõ sarcosis, csontreszorpciós betegség, reperfúziós károsodás, graftversus-host kilökõdés, sclerosis multiplex, myastenia gravis, allograft kilökõdések, fertõzés következtében kialakult láz és myalgia (izomfájdalom), AIDS¹el összefüggõ komplex (ARC), hegdaganat (keloid) képzõdése, hegszövet képzõdése, Crohn-féle betegség, fekélyes vastagbélgyulladás és pyresis, irritábilis bél szindróma, oszteoporózis, agyi malária, bakteriális meningitisz, vagy amfotericin-b-kezelés, interleukin 2-kezelés, OKT3-kezelés vagy GM¹CSF-kezelés káros mellékhatásai. Az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületek, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, különösen hatékonyak sajátos gyulladástípusok, például artritisz (különösen artritiszes ízületi tokban) asztma, pszoriázis és bélgyulladás prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére. Az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületek, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, különösen hatékonyak reumatoid artritisz, irritábilis bél szindróma vagy oszteoartritisz prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére. Az (I) általános képletû vegyületek lehetnek: 2¹metoxi-adenozin, 2¹etoxi-adenozin, 2¹propoxi-adenozin, 2¹izopropoxi-adenozin és 2¹butoxi-adenozin. Az (I) általános képletû vegyületek elõnyösen 2¹metoxi-adenozin, 2¹etoxi-adenozin és 2¹butil-oxi-adenozin. A (II) általános képletû vegyületek lehetnek: 3 ¹dezoxi-2-metoxi-adenozin, 3 ¹dezoxi-2-etoxi-adenozin, 3 ¹dezoxi-2-propoxi-adenozin, 3 ¹dezoxi-2-izopropoxiadenozin és 3 ¹dezoxi-2-butoxi-adenozin. A (II) általános képletû vegyületek elõnyösen 3 ¹dezoxi-2-propoxiadenozin, 3 ¹dezoxi-2-izopropoxi-adenozin és 3 ¹dezoxi-2-butoxi-adenozin. 2-metoxi-adenozinról leírták, hogy EC0-értéke adenozin-a2a-receptornál 3 M [Daly, J. W. és munkatársai, Pharmacol. 46, 91 0 (1993)]. Azonban meglepõ módon ez a vegyület jelentõs antihiperalgéziás és gyulladásgátló aktivitással rendelkezik 0,2 M vagy kisebb plazmakoncentrációknál. Ezekben az alacsony dózisokban 2¹metoxi-adenozin mellékhatásainak kisebb a valószínûsége és súlyossága. A PCT/GB03/0379 számú nemzetközi közzétételi iratban leírják 2¹metoxi-adenozin aktivitását analgetikumként (nem közölték bejelentésünk benyújtásáig). Az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt más vegyületekrõl, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon (és a találmány szerinti eljárásokkal azonosított vegyületekrõl), azt is feltételezzük, hogy sokkal hatékonyabbak alacsony dózisokban, mint más adenozinreceptor-agonisták. Tehát várható, hogy ilyen vegyületeket hatékonyan lehet beadni olyan dózisokban, amelyeknél mellékhatások fellépésének valószínûsége és súlyossága csökkent mértékû. Az ilyen vegyületek által elõidézett mellékhatások valószínûsége és súlyossága alternatív módon és kiegészítésképpen kisebb mértékû lehet, mint más adenozinreceptor-agonistáké. A fájdalomnak két komponense van, mindkettõ szenzoros neuronok aktiválásában játszik szerepet. Az elsõ komponens a korai vagy azonnali fázis, ha egy szenzoros neuron stimulálódik, például a bõrön hõ vagy nyomás eredményeként. A második komponens olyan szenzoros mechanizmusok fokozott érzékenységének a következménye, amelyek beidegzik azt a szövetet, ami korábban károsodott. Ezt a második komponenst hívják hiperalgéziának, és szerepet játszik szö- 7

8 vetkárosodásból eredõ krónikus fájdalom valamennyi formájában, de a fájdalomérzékelés korai vagy azonnali fázisában nem. Tehát a hiperalgézia növekedett mértékû fájdalomérzés állapota, melyet szövetkárosodás okoz. Ez az állapot az idegrendszer természetes válasza, ami látszólag arra szolgál, hogy segítse a sérült egyedet a károsodott szövet védelmében, idõt adva arra, hogy megtörténjen a szövet-helyreállítás. Ennek az állapotnak két ismert oka képezi az alapját, szenzoros neuronaktivitás fokozódása, és nociceptív (fájdalomérzõ) információk neuronális feldolgozásának megváltozása, ami a gerincvelõben történik. A hiperalgézia legyengíthet krónikus gyulladásos állapotokban (például reumatoid arthritiszben), és ha szenzoros idegkárosodás történt (azaz neuropátiás fájdalomban). A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületekrõl, (I) vagy (II) általános képletû vegyületekrõl, vagy a. példában leírt vegyületekrõl, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, feltételezzük, hogy hatékonyan gátolnak fájdalomérzetet neuropátiás és gyulladásos fájdalomtól szenvedõ emlõsszervezetekben, még akkor is, ha beadásuk olyan dózisokban történik, amelyek várhatóan jóval alacsonyabb koncentrációkat idéznek elõ, mint amelyek ismereteink szerint adenozinreceptorokat aktiválni képesek. Feltételezzük, hogy ezekben a dózisokban az ilyen vegyületek úgy képesek neuropátiás és gyulladásos fájdalmat kezelni, hogy nem okoznak olyan jelentõs mellékhatásokat, amelyek más adenozinreceptor-agonisták beadásával társulnak, és anélkül, hogy csökkentenék a normál szenzoros érzékelést. A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületeket, (I) vagy (II) általános képletû vegyületeket, vagy a. példában leírt vegyületeket, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, antihiperalgéziás szerként lehet alkalmazni olyan fájdalom (különösen hiperalgézia) prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére, amely neuropátia, például bélfájdalom, hátfájdalom, rákos fájdalom, HIV-eredetû fájdalom, eltávolított végtagban érezni vélt fájdalom (fantomfájdalom), mûtét utáni fájdalom, diabetikus neuropátia, polineuropátia, herpesz utáni neuralgia és trigeminális neuralgia eredménye. A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületek, (I) vagy (II) általános képletû vegyületek, vagy a. példában leírt vegyületek, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, antihiperalgéziás szerként lehet alkalmazni olyan fájdalom (különösen hiperalgézia) prevenciójára, kezelésére vagy enyhítésére, amely gyulladásos betegség, beleértve bélfájdalom, hátfájdalom, rákos fájdalom, fibromialgia, mûtét utáni fájdalom, oszteoartritisz és reumatoid arthritis eredménye A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületek, (I) vagy (II) általános képletû vegyületek, vagy a. példában leírt vegyületek, amelyek alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitással rendelkeznek adenozinreceptorokkal szemben és/vagy hatásuk hatékonysága nagyobb adenozinreceptorokon, ha fájdalom (különösen hiperalgézia) kezelésére alkalmazzuk azokat, várhatóan elõnyökkel (például fokozott hatékonyság és/vagy csökkent mértékû mellékhatások) rendelkeznek a két fõbb, ismert analgetikum-osztályhoz tartozó vegyületekhez képest. Ezek: (i) nemszteroid gyulladásgátló gyógyszerek (NSAID¹ek) és rokon COX 2-inhibitorok; és (ii) morfinra alapuló ópiátok. Mindkét említett osztályhoz tartozó analgetikumok hatékonyak normál fájdalomérzés kezelésére. Azonban kevésbé hatékonyak néhány hiperalgéziás fájdalomtípus ellen, például neuropátiás fájdalom ellen. Sok orvos vonakodik felírni ópiátokat olyan nagy dózisokban, ami szükséges neuropátiás fájdalom kezelésére az ilyen vegyületek beadása által okozott mellékhatások miatt, és annak valószínûsége miatt, hogy a páciensek függõvé válhatnak. NSAID-gyógyszerek kevésbé hatékonyak, mint az ó- piátok, így még nagyobb dózisok szükségesek ezekbõl a vegyületekbõl. Azonban ez nem kívánat, mert ezek a vegyületek a gyomor bél traktus irritációját okozhatják. A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületet, (I) vagy (II) általános képletû vegyületet, vagy a. példában leírt vegyületet egy alanynak olyan mennyiségben kell beadni, ami a plazmában olyan koncentrációcsúcsot idéz elõ, ami kisebb, mint a vegyület EC0- értéke adenozinreceptoroknál ph=7,4¹en. Nyilvánvaló, hogy a vegyület EC0-értéke valószínûleg eltérõ különbözõ adenozinreceptorokra (azaz az A1, A2A, A2B, A3 jelû adenozinreceptorokra). A vegyület beadott mennyiségét a vegyület legalacsonyabb és a legmagasabb EC0-értékéhez viszonyítva kell kiszámítani a különbözõ receptorokra. A plazmában a koncentrációcsúcsa az EC0-érték egy ezredétõl egy ötödéig, vagy egy ötvenedétõl egy harmadáig (elõnyösebben egy ezredétõl egy huszadáig, egy századától vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig, egy ötvenedétõl egy tizedéig, vagy egy tizedétõl egy ötödéig) terjedõ tartományban van. A plazmában a koncentráció csúcsa elõnyösen az EC0-érték egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van. A beadott mennyiség elõnyösen olyan koncentrációt idéz elõ a plazmában, ami több, mint egy óráig fennmarad a vegyület EC0-értékének egy ezredétõl egy ötödéig, elõnyösebben egy ezredétõl egy huszadáig, vagy egy századától egy ötödéig, vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig terjedõ tartományban adenozinreceptoroknál, ph=7,4¹en. A beadott mennyiség elõnyösebben olyan koncentrációt idéz elõ a plazmában, ami több, mint egy óráig fennmarad egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban. 8

9 Félreértések elkerülése céljából, a leírásban a vegyület EC0-értékét úgy definiáljuk, mint a vegyületnek az a koncentrációja, amely olyan receptorválaszt idéz elõ, amelynek mértéke a receptorválasz alapértéke és a maximális receptorválasz között középen van (például dózis-válasz görbe alapján meghatározva). Az EC0-értéket standard körülmények között kell meghatározni (fiziológiás nátrium-klorid-oldat, ph=7,4¹re pufferolva). EC0 meghatározásaihoz izolált membránokat, sejteket és szöveteket alkalmazunk, amelyek pufferolt nátrium-klorid-oldatban vannak ph=7,4¹en (például sejttenyésztõ tápközegben), például Daly és munkatársai által leírtak szerint [Pharmacol. 46, 91 0 (1993)], vagy elõnyösen Tilburg és munkatársai által leírtak szerint [J. Med. Chem. 4, 91 0 (02)]. Az EC0¹et in vivo is meg lehet határozni adenozinreceptorok által közvetített válasz mérésével normál egészséges állatban, sõt, normál körülmények között, perfúziónak alávetett szövetben (azaz oxigénnel ellátott vérben, vagy oxigénnel ellátott izotóniás közegekben, amelyek szintén ph=7,4¹re vannak pufferolva) normál egészséges állatban. Ezzel alternatív módon, a találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyület beadott mennyisége olyan mennyiség lehet, amely a plazmában olyan koncentrációcsúcsot eredményez, amely a Kd¹érték egy ezredétõl egy huszadáig, egy ezredétõl egy harmadáig, elõnyösebben egy századától egy ötödéig, vagy egy ötvenedétõl egy tizedéig terjedõ tartományban van adenozinreceptoroknál. Elõnyösebben a mennyiség olyan, amely a plazmában olyan koncentrációcsúcsot eredményez, amely a Kd¹érték egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van adenozinreceptoroknál. Nyilvánvaló, hogy a vegyület Kd¹értéke valószínûleg eltérõ különbözõ adenozinreceptorokra (azaz az A1, A2A, A2B, A3 jelû adenozinreceptorokra). A vegyület beadott mennyiségét a vegyület legalacsonyabb és a legmagasabb Kd¹értékéhez viszonyítva lehet kiszámítani a különbözõ receptorokra. A vegyület beadott mennyisége elõnyösen olyan mennyiség, amely a plazmában olyan koncentrációt eredményez, ami legalább egy óráig fennmarad a vegyület Kd¹értékének egy ezredétõl egy ötödéig, elõnyösebben egy ezredétõl egy huszadáig, vagy egy századától egy ötödéig, vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig terjedõ tartományban adenozinreceptoroknál. A mennyiség elõnyösebben olyan koncentrációt idéz elõ a plazmában, ami legalább egy óráig fennmarad a vegyület Kd¹értékének egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban adenozinreceptoroknál. A vegyület Kd¹értékét az egyes receptoroknál standard körülmények között kell meghatározni, ahol adenozinreceptorok forrásaként ilyen receptorokat endogén expresszáló szövetekbõl vagy sejtekbõl származó, vagy az adenozinreceptor-géneket tartalmazó DNSvektorokkal transzfektált sejtekbõl származó plazmamembránokat alkalmazunk. Ezzel alternatív módon, teljes sejtpreparátumokat lehet alkalmazni, adenozinreceptorokat expresszáló sejtek felhasználásával. A különbözõ receptorokra szelektív, jelölt (például radioaktívan jelölt) ligandumokat kell alkalmazni pufferolt (ph=7,4) nátrium-klorid-oldatban [lásd például Tilburg és munkatársai, J. Med. Chem. 4, (02)] a kötési affinitás, és így a vegyület Kd¹értékének meghatározása céljából az egyes receptorokon. Ezzel alternatív módon, a találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyület beadott mennyisége az mennyiség lehet, amely a vegyület olyan minimális dózisának egy ezredétõl egy ötödéig, vagy egy ötvenedétõl egy harmadáig (elõnyösebben egy ezredétõl gey huszadáig, vagy egy századától vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig) terjedõ tartományban van, amely mellékhatásként bradycardiát, alacsony vérnyomást vagy tachycardiát idéz elõ ugyanahhoz a fajhoz tartozó állatokban, mint amelynek a vegyületet beadjuk. Elõnyösebben a mennyiség olyan, ami a mellékhatásokat elõidézõ, minimális dózis egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van. A vegyület beadott mennyisége elõnyösen olyan mennyiség, amely a plazmában olyan koncentrációt eredményez, ami legalább egy óráig fennmarad a mellékhatásokat elõidézõ, minimális plazmakoncentráció egy ezredétõl egy huszadáig, vagy egy századától vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig terjedõ tartományban. A beadott mennyiség elõnyösebben olyan koncentrációt idéz elõ a plazmában, ami legalább egy óráig fennmarad a mellékhatásokat elõidézõ, minimális plazmakoncentráció egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban. Ezzel alternatív módon, a találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyület beadott mennyisége az mennyiség lehet, amely a plazmában olyan koncentrációkat idéz elõ, ami a vegyület olyan minimális plazmakoncentrációjának egy ezredétõl egy ötödéig, vagy egy ötvenedétõl egy harmadáig (elõnyösebben egy ezredétõl egy huszadáig, vagy egy századától vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig) terjedõ tartományban van, amely mellékhatásként bradycardiát, alacsony vérnyomást vagy tachycardiát idéz elõ ugyanahhoz a fajhoz tartozó állatokban, mint amelynek a vegyületet beadjuk. A beadott mennyiség elõnyösen akkora, amely a plazmában olyan koncentrációkat idéz elõ, ami a mellékhatásokat okozó minimális plazmakoncentráció egy tizedétõl egy ötödéig terjedõ tartományban van. Elõnyösebben a mennyiség olyan, ami a mellékhatásokat elõidézõ minimális plazmakoncentráció egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a 9

10 legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban van. A vegyület beadott mennyisége elõnyösen olyan mennyiség, amely a plazmában olyan koncentrációt idéz elõ, ami több, mint 1 óráig fennmarad a mellékhatásokat okozó, minimális plazmakoncentráció egy ezredétõl egy huszadáig, vagy egy századától vagy egy ötvenedétõl egy ötödéig terjedõ tartományban. Elõnyösebben a mennyiség olyan koncentrációt idéz elõ a plazmában, ami több, mint egy óráig fennmarad a mellékhatásokat okozó, minimális plazmakoncentráció egy tízezredétõl egy ötödéig, vagy egy tízezredétõl egy huszadáig, vagy egy tízezredétõl egy századáig, a legelõnyösebben egy tízezredétõl egy ezredéig terjedõ tartományban. A találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyület megfelelõ dózisa változhat a páciens kora, neme, tömege és állapota, a vegyület hatékonysága és a beadás módja stb. szerint. A megfelelõ dózist szakember könnyen képes meghatározni. Várható, hogy a találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyület beadott mennyiségének 0,001 és mg/kg között, vagy 0,01 és mg/kg között, például 0,01 és vagy mg/kg között, vagy 0,001 és 0,01 mg/kg között kell lennie. A mennyiség lehet kevesebb mint 6 mg/kg, elõnyösen legalább 0,001, vagy 0,01 vagy 0,0 mg/kg, például 0,01 és 2 mg/kg közötti. A mennyiség lehet legalább 0,1 mg/kg, például 0,1 és 1 vagy 2 mg/kg közötti, vagy 0,1 és 1 mg/kg közötti. Egy tipikus mennyiség 0,2 vagy 0,6 és 1,2 mg/kg közötti. A találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyület dózisegysége tipikusan maximum 00 mg (például 1 és 00 mg közötti, elõnyösen és 00 mg közötti) hatóanyagot tartalmaz. A hatóanyag elõnyösen gyógyászati készítmény formájában van, amely a hatóanyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót, segédanyagot vagy hígítószert tartalmaz. A dózis elõnyösen 0,1 és 2 közötti, például 0, és 1 közötti, tipikusan körülbelül 0,6 mg hatóanyagot tartalmaz az alany (ember) 1 testtömeg-kg-jára vonatkoztatva. Ilyen mennyiségben hatásos kezelés érhetõ el anélkül, hogy a vérnyomás egyidejûleg lényegi módon (például nem több, mint %) leessen. A dózis egy 70 kg¹os embernek elõnyösen kevesebb mint 4 mg, elõnyösen legalább 0,7 mg, elõnyösebben legalább 3, mg, a legelõnyösebben legalább 7 mg. Elõnyösebben 7 és 70 mg, vagy 14 és 70 mg közötti. A fentebb meghatározott dózismennyiség jelentõsen kisebb (akár körülbelül 00-szer alacsonyabb), mint ami várható (spongosin EC0-értéke alapján adenozin-a2a-receptoroknál) vagy követelmény olyan vegyületektõl, amelyek bármilyen kedvezõ terápiás hatással rendelkeznek. A találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületeket beadhatjuk más terápiás ágenssel, például gyulladásgátló szerekkel (szteroidok, NSAID¹k, metotrexát), analgetikumokkal (például ópiátok, NSAID¹k, kannabinoidok, tachykininmodulátorok vagy bradykininmodulátorok) vagy antihiperalgéziás szerekkel (például gabapentin, pregablin, kannabinoidok, nátrium- vagy kalciumcsatorna-modulátorok, antiepileptikumok vagy antidepresszánsok) együtt vagy nélkül. A találmány szerinti eljárással azonosított, vagy az (I) vagy (II) általános képletû, vagy a. példában leírt vegyületet általában bármilyen alkalmas eszközzel, bármilyen alkalmas kiszerelésben, bármilyen alkalmas módon be lehet adni. A vegyületet elõnyösen orálisan, parenterálisan, nyelv alá, transzdermálisan, intratekálisan vagy transzmukozálisan be lehet adni. Más alkalmas mód lehet intravénás, intramuszkuláris, szubkután, inhalálás vagy helyileg történõ beadás. A gyógyszer beadott mennyisége tipikusan magasabb, ha orálisan adjuk be, mint ha például intravénásan. Orális beadásra alkalmas készítmények lehet szilárd dózisegységformák, és olyanok, amelyek folyadékot tartalmaznak, például injekciók, továbbá lehetnek például tabletták, kapszulák, fiolák és ampullák, amelyekben a hatóanyag ismert módon van kiszerelve fiziológiailag elfogadható segédanyaggal, hígítószerrel vagy hordozóval. Alkalmas hígítószerek és hordozók ismeretesek, például laktóz és talkum, alkalmas kötõágensekkel együtt stb. A vegyületek beadási gyakorisága elõnyösen várhatóan naponta két három alkalom. A vegyületek alapként szolgálhatnak hatékonyabb gyógyszer, vagy gyógyszerek azonosításához, amelyek mellékhatásai tovább vannak csökkentve. A találmány alábbiakban leírt elõnyös megvalósítási módjai csak szemléltetés célját szolgálják, a csatolt ábrákkal együtt, amelyekben: Az 1. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozin affinitásának növekedését adenozin- A2A-receptorral szemben ph=, értéken, ph=7,4-hez képest. A 2. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozin affinitása (nem CGS21680 affinitása) patkányból származó adenozin-a2areceptorral szemben növekszik, ahogyan a ph csökken (7,4-rõl 7,0¹re, 6,8¹ra). Az 3. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozin hatékonyságának növekedését adenozin-a2a-receptorral szemben ph=7,0 értéken, ph=7,4-hez képest, de CGS21680 hatékonysága nem növekszik. A 4. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozin gátolja carrageenannal indukált gyulladás hiperalgéziás hatását. Az. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozinnak (0,624 mg/kg po.) nincs szignifikáns hatása a vérnyomásra és a pulzusra.

11 A 6. ábrán bemutatjuk 2¹metoxi-adenozin antihiperalgéziás hatását neuropátiás fájdalom krónikus konstrikciós modelljében. A 7. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozin (62,4 és 624 mg/kg ip.) carrageenannal (CGN) indukált gyulladást gátol indometacinnal (3 mg/kg, po) összehasonlítható hatékonysággal, olyan koncentrációkban, amely nem befolyásolta a vérnyomást; és a 8. ábrán bemutatjuk 2¹metoxi-adenozin (0,6 mg/kg) koncentrációjának idõbeli változását a plazmában, patkánynak történõ beadás után. 1. példa 2-Metoxi-adenozin affinitása adenozin-a2areceptorral szemben növekszik, ha a ph csökken Patkányból származó striatális membránokat inkubáltunk 90 percig, 22 C¹on, 2 nm [3H]-CGS21680, 1 egység/ml adenozin-deamináz és növekvõ koncentrációjú 2¹metoxi-adenozin jelenlétében, majd szûrtük és folyadékszcintillációs számlálóban mértük. Az adatokat egy és két kötõhelyet figyelembe vevõ görbére illesztettük (lásd az 1. ábrát). a) Megfelel a százalékosan kifejezett, specifikus kötõdés teljes mennyiségének; b) megfelel a nagy affinitású állapotban lévõ helyek arányának; c) megfelel a nagy affinitású állapot Ki¹értékének [nem kötõdött ph=7,4¹en, a Hill-féle ábrázolással nyert egyenes meredeksége (nh) közel volt az egységhez, és a görbe illesztési algoritmusa két kötõhelyet figyelembe véve nem volt képes valós jellemzõket meghatározni nagy affinitású állapothoz]; d) megfelel a kis affinitású állapot Ki¹értékének. 2. példa 2-Metoxi-adenozin és CGS21680 affinitásának összehasonlítása adenozin-a2a-receptorral szemben, különbözõ ph¹n Kötõdött [3H]-CGS21680 kicserélését az 1. példában leírtak szerint végeztük. Az eredmények azt mutatják, amelyeket a 2. ábrán bemutatunk, hogy 2¹metoxiadenozin affinitása adenozin-a2a-receptorral szemben növekszik (viszont CGS21680 affinitása nem), ahogyan a ph csökken (7,4-rõl 7,0¹re, 6,8¹ra). 3. példa 2-Metoxi-adenozin hatékonysága adenozin-a2areceptorral szemben növekszik, viszont CGS21680¹é nem növekszik ph=7,0¹en, ph=7,4- hez viszonyítva Humán A2A-receptort expresszáltunk HEK293-sejtekben, és meghatároztuk, hogy agonisták milyen mértékben képesek camp-felhalmozódást stimulálni rolipram jelenlétében, foszfodiészteráz enzimek gátlásához. Az eredményeket bemutatjuk a 3. ábrán példa 2-Metoxi-adenozin gátolja carrageenannal indukált gyulladás hiperalgéziás hatását A 4. ábrán bemutatjuk, hogy 2¹metoxi-adenozin gátolja carrageenannal indukált gyulladás hiperalgéziás hatását: A. 2¹metoxi-adenozin (0,6 mg/kg) carrageenannal (CGN) indukált termális hiperalgéziát (CITH) gátol indometacinnal (3 mg/kg, po) összehasonlítható hatékonysággal. B. A válasz koncentrációfüggése 2¹metoxi-adenozin esetén, a dózis beadása után 3 órával. Carrageenant (2%, mikroliter) beadtunk a jobb hátsó mancsba, Egy hõforrást helyeztünk el közel a kezelt és kezeletlen hátsó mancsokhoz, és kimutattuk a különbséget a láb visszahúzásának lappangási idejében. Beadtunk 2¹metoxi-adenozint a carrageenannal egyidejûleg. 2¹Metoxi-adenozin ugyanolyan hatékony volt, mint az indometacin (Indo, 3 mg/kg po.).. példa 2-Metoxi-adenozin (0,6 mg/kg po.) nincs szignifikáns hatással a vérnyomásra és a pulzusra Beültethetõ radiotelemetriás berendezést helyeztünk el csoportonként 6 patkány hasüregébe. Az eszköz nyomás-katéterét az abdominális aortába illesztettük és két elektródát helyeztünk el a bõr alatt lead II helyzetben (a bal ág hasüreg/jobb váll). A patkányokat külön-külön tettük egy radioreceptorra (DSI) adatgyûjtés céljából saját ketrecükben. Azután meghatároztuk 0,6 mg/kg 2¹metoxi-adenozin vagy hordozó hatását (po.) a vérnyomásra. Az eredményeket bemutatjuk az. ábrán: A: vérnyomás; B: pulzus. 6. példa 2-Metoxi-adenozin antihiperalgéziás hatása neuropátiás fájdalom krónikus konstrikciós modelljében 2-Metoxi-adenozin (0,624 mg/kg po.) gátolja patkányban az ülõideg krónikus konstrikciós károsodás által okozott termális hiperalgéziát. Anesztézia alatt az ülõideget feltártuk a jobb lábban, és lazán négy fonalat kötöttünk az idegköteg köré. Körülbelül két hét múlva a patkányokban termális hiperalgézia fejlõdött ki az operált lábban, amit 2¹metoxi-adenozin legalább, vagy nagyobb mértékben hatékony volt, mint karbamazepin (CBZ, 0 mg/kg sc.). Az eredményeket bemutatjuk a 6. ábrán. 7. példa 2-Metoxi-adenozin (62,4 és 624 g/kg ip.) gátolja carrageenan (CGN) által indukált gyulladást, az indometacinnal (3 mg/kg, po.) összehasonlítható hatékonysággal olyan koncentrációban, amely nincs hatással a vérnyomásra Carrageenant (2%, mikroliter) beadtunk a jobb hátsó mancsba, és a mancs térfogatát plethysomometriával határoztuk meg. Beadtunk 2¹metoxi-adenozint a carrageenannal egyidejûleg. Az eredményeket bemu- 11

12 tatjuk a 7. ábrán. 2¹Metoxi-adenozin ugyanolyan hatékony volt, mint az indometacin (Indo, 3 mg/kg po.). 8. példa A plazmában mért koncentráció idõbeli változása 2¹metoxi-adenozin patkánynak történõ beadása (0,6 mg/kg) után 2-Metoxi-adenozin EC0-értéke adenozinreceptorokon (ph=7,4¹en mérve) 900 ng/ml (3 M). A 8. ábrán látható, hogy a plazmában mért koncentráció az EC0- érték 2%¹a fölött marad több, mint 3 órán át. Megfigyeltünk gyulladásgátló és antihiperalgéziás hatásokat (a vérnyomás változása nélkül), amikor a plazmában a koncentráció-csúcs az EC0-érték 1%¹a és 30%¹a között van, in vitro meghatározva. Ha a plazmában a koncentrációcsúcs eléri az EC0-értéket, a vérnyomásban lényegi csökkenés következik be, ami órákig tart. 9. példa Adenozinreceptor-agonisták fokozott affinitása alacsony ph¹n a GTP-eltolódásban megfelelõ növekedéssel társul, ami alapján feltételezzük, hogy ezek az agonisták szintén hatékonyabbak alacsonyabb ph¹n. Ezeket az eredményeket lentebb összefoglaljuk táblázat 3H CGS21680 kicserélõdése patkány striatalis A2Areceptorából (az értékek Ki¹értékek nm¹ban) ph=7,4 ph=, CGS21680,±2,1 2,8±1,0 NECA 3,±0,9 1,1±0,2 CV ± 3±9 R-PIA 172±21 21±1,4 S-PIA 1712± ±4,9 NECA: ¹N-etil-karboxamido-adenozin; CV1808: 2¹fenil-amino-adenozin; PIA: fenil-izopropil-adenozin A fentebbi értékek minden esetben csak egy affinitású állapotot mutatnak az agonistákra, ami alapján feltételezzük, hogy a magas és az alacsony affinitású állapotok hasonló affinitásúak. Azonban 2¹metoxi-adenozin és 2¹etoxi-adenozin két látszólagos affinitású állapotot mutat alacsonyabb ph¹n (2. táblázat). A nagy affinitású állapotok megfeleltek az összes kötõhely körülbelül 2%-ának, és GTP jelenlétével megszûntek, ami alapján feltételezzük, hogy ezek a nagy affinitású agonista kötõhelynek felelnek meg. 2. táblázat 3H CGS21680 kicserélõdése patkány striatalis A2A-receptorából (az értékek Ki¹értékek nm¹ban) 2¹metoxi-adenozin ph=7,4: nagy affinitás nem detektálható kis affinitás 200±0 ph=,: nagy affinitás 12,1±2,7 kis affinitás ±0 2-etoxi-adenozin ph=7,4: nagy affinitás 24±76 kis affinitás 6600±20 ph=,: nagy affinitás 2,8±1,2 kis affinitás ±1 Továbbá olyan vegyületeket is találtunk, amelyek nagyobb affinitást mutattak patkányból származó A1¹receptorra alacsonyabb ph¹n (3. táblázat) táblázat 3H¹DPCPX kicserélõdése patkány agykérgébõl származó A1¹receptorból (Ki nm) 2-klór-adenozin ph=7,4: nagy affinitás 4,4±1,8 kis affinitás 1670±40 ph=6,2: nagy affinitás 3,7±0, kis affinitás 1660±40 3 -dezoxi-2-klór-adenozin ph=7,4: nagy affinitás 227±74 kis affinitás 11,00±80 ph=6,2: nagy affinitás 17±46 kis affinitás 13,400±2400 Mindkét ph¹értéken GTP stabil analógja (GppNHp) megszüntette a 3 ¹dezoxi-2-klór-adenozin által felismert, nagy affinitású állapotot. 60. példa Adenozin-A2A-receptorokra alacsonyabb ph¹n nagyobb affinitású vegyületek A lentebb felsorolt vegyületekrõl azt találtuk, hogy nagyobb affinitással rendelkeztek adenozin-a2a-receptorokkal szemben ph,¹n, mint ph=7,4¹en. A2Areceptorkötési vizsgálati eljárást végeztünk [3H]- CGS21680 alkalmazásával, és analizáltuk az 1. példában leírtak szerint. Bemutatjuk a ph=,¹n detektált nagy és a kis affinitása kötõhelyek Ki¹értékeit, és a ph=7,4¹en detektált hely Ki¹értékét. 12

13 HU T2 Ha X=OH Szerkezet R 1 ph=, (Ki 1) nm ph=, (Ki 2) nm ph=7,4 (Ki 2) nm OCH 3 1, OCH 2 CH 2 CH 2 CH OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH OPh O-(4¹ciano)-Ph O-(3¹Ph)-Ph 0, indanil-oxi O-[3¹CH(CH 3 ) 2 ]-Ph NH(CH 3 ) NHCH 2 CH N(CH 3 ) NHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 0,7 290 NHPh NH-(4¹MeO)-Ph NH-(4¹F)-Ph 0 0 NH-ciklopentil NH-ciklohexil 0, N CH 3, N CH 2 CH 2 CH(CH 3 ) OCH 2 -ciklopentil 0,2 4 0 SO 2 CH 2 CH OCH 2 CH 2 OH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH X=H Szerkezet R 1 ph=, (Ki 1) nm ph=, (Ki 2) nm ph=7,4 (Ki 2) nm OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH

14 HU T2 Szerkezet R 2 ph=, (Ki 1) nm ph=, (Ki 2) nm ph=7,4 (Ki 2) nm N(CH 3 ) NHCH 2 CHC(CH 3 ) 2 1, N CH 3, N CH 2 Ph Piperazil N Me, N (CH 2 CH 2 OCH 3 ) R 1 R 2 R 3 ph=, (Ki 1) nm ph=, (Ki 2) nm ph=7,4 (Ki 2) nm H NH 2 CH(CH 3 ) H NH 2 H H NHCH 3 CH(CH 3 ) OCH 3 NH 2 Ph Szerkezet R 4 ph=, (Ki 1) nm ph=, (Ki 2) nm ph=7,4 (Ki 2) nm CH 2 CH 2 CH NHCH 2 CH

15 SZABADALMI IGÉNYPONTOK Eljárás potenciális terápiás ágensek azonosítására, amely szerint meghatározzuk egy tesztvegyület affinitását egy adenozinreceptorral szemben egy magasabb ph¹n, ami legalább ph=7,4, és egy alacsonyabb ph¹n is, ami, és 7,2 közötti, vagy,0 és 7,0 közötti érték, és a vegyületet potenciális terápiás ágensként azonosítjuk, ha affinitása az alacsonyabb ph¹n több, mint ¹szer nagyobb, mint a magasabb ph¹n. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület affinitásának meghatározásakor jelölt tesztvegyület receptorhoz való kötõdését mérjük különbözõ koncentrációkban. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület affinitásának meghatározásakor az adenozinreceptoron kötõdött, jelölt tesztvegyület kicserélõdését mérjük jelöletlen tesztvegyületre. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az adenozinreceptor szövetben, szövetmetszetben, intakt sejtben, feltárt sejtben vagy sejtbõl származó membránban található.. Eljárás potenciális terápiás ágens azonosítására, amely szerint meghatározzuk egy tesztvegyület hatásának hatékonyságát egy adenozinreceptoron magasabb ph¹n, ami legalább ph=7,4, és alacsonyabb ph¹n is, ami, és 7,2 közötti, vagy,0 és 7,0 közötti érték, és a vegyületet potenciális terápiás ágensként azonosítjuk, ha a hatékonyság alacsonyabb ph¹n több, mint ¹szer nagyobb, mint a magasabb ph¹n. 6. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület hatékonyságát úgy határozzuk meg, hogy a tesztvegyületet érintkeztetjük az adenozinreceptort tartalmazó szövettel, szövetmetszettel, intakt sejttel vagy részlegesen feltárt sejttel, és meghatározzuk az adenozinreceptor hatását egy jelátvivõ molekula felhalmozódásának vagy fogyásának mérésével a szövetben, szövetmetszetben, intakt sejtben vagy részlegesen feltárt sejtben. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a jelátvivõ molekula camp, IP3 vagy szabad kalcium. 8. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület hatékonyságát úgy határozzuk meg, hogy a tesztvegyületet érintkeztetjük az adenozinreceptort tartalmazó biológiai membránnal, és meghatározzuk az adenozinreceptor hatását: G¹protein-aktiválódás; enzimaktivitás; vagy a biológiai membránnal asszociált ioncsatornán keresztülfolyó ionáramlás mérésével. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a G¹proteinaktiválódást radioaktívan jelölt guanin-nukleotidok alkalmazásával mérjük, vagy ahol a mért enzimaktivitás adenilil-cikláz¹, foszfodiészteráz¹, foszfolipáz- vagy protein-kináz-aktivitás, vagy ahol az ioncsatorna, amelyen a keresztülfolyó ionáramlást mérjük, kalcium- vagy káliumcsatorna.. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület hatékonyságát úgy határozzuk meg, hogy a tesztvegyületet érintkeztetjük az adenozinreceptort tartalmazó szövettel, szövet-metszettel, intakt sejttel, feltárt sejttel vagy sejtbõl származó membránnal, és meghatározzuk az adenozinreceptor hatását protein-kinázaktivitás mérésével a szövetben, szövetmetszetben, intakt sejtben, feltárt sejtben vagy sejtbõl származó membránban. 11. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület hatékonyságát úgy határozzuk meg, hogy a tesztvegyületet érintkeztetjük az adenozinreceptort tartalmazó szövettel, szövetmetszettel, intakt sejttel, feltárt sejttel vagy sejtbõl származó membránnal, és meghatározzuk az adenozinreceptor hatását foszfolipázaktivitás (például foszfolipáz¹c, foszfolipáz¹a2, foszfolipáz¹d) mérésével a szövetben, szövetmetszetben, intakt sejtben, feltárt sejtben vagy sejtbõl származó membránban. 12. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyület hatékonyságát úgy határozzuk meg, hogy a tesztvegyületet érintkeztetjük az adenozinreceptort tartalmazó szövettel, szövetmetszettel, intakt sejttel, feltárt sejttel vagy sejtbõl származó membránnal, és meghatározzuk az adenozinreceptor hatását fehérjefoszforiláció és/vagy defoszforiláció mérésével a szövetben, szövetmetszetben, intakt sejtben, feltárt sejtben vagy sejtbõl származó membránban. 13. Az igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az alacsonyabb ph=értéke, és 6, közötti. 14. Az igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az alacsonyabb ph=értéke, és 6,2 közötti.. Az igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az adenozinreceptor adenozin-a2a-receptor, adenozin-a1-receptor vagy adenozin-a3-receptor. 16. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol azt is meghatározzuk, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol nemhumán állatmodellt alkalmazunk annak meghatározására, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása. 18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti eljárás, ahol meghatározzuk, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása fájdalom vagy gyulladás ellen. 19. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol meghatározzuk, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása rák, ischaemiás-reperfúziós károsodás, fokozott neuronális aktivitás (például epilepsziában, vagy krónikus fájdalomban vagy hiperalgéziában, beleértve gyulladásos és neuropátiás fájdalmat), szepszis, szeptikus sokk, neurodegeneráció (például Alzheimer-kór), izomkimerültség vagy izomgörcs ellen.. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol meghatározzuk, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása artritisz, asztma, pszoriázis, bélgyulladás, reumatoid arthritis, irritábilis bél szindróma vagy oszteoartritisz ellen. 21. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol meghatározzuk, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása neuropátia, például bélfájdalom, hátfájdalom, rákos fájdalom, HIV-eredetû fájdalom, eltávolított végtagban érezni vélt fájdalom (végtagi fantomfájdalom), mûtét utáni fájdalom, diabetikus neu-

16 ropátia, polineuropátia, herpesz utáni neuralgia vagy trigeminális neuralgia eredményeként kialakult hiperalgézia ellen. 22. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol meghatározzuk, hogy az azonosított ágensnek van¹e terápiás hatása gyulladásos betegség, például bélfájdalom, hátfájdalom, rákos fájdalom, fibromialgia, mûtét utáni fájdalom, oszteoartritisz vagy reumatoid arthritis eredményeként kialakult hiperalgézia ellen. 23. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az azonosított ágens terápiás hatását az ágens EC0-értéke alatti koncentrációjánál határozzuk meg, elõnyösen az ágens EC0-értékének egy tízezredétõl egy ötödéig terjedõ koncentrációjában, az adenozinreceptornál, ph=7,4¹en. 24. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol meghatározzuk az azonosított ágens által okozott mellékhatásokat. 2. A 24. igénypont szerinti eljárás, ahol a mellékhatásokat az ágens EC0-értéke alatti koncentrációjánál határozzuk meg, elõnyösen az ágens EC0-értékének egy tízezredétõl egy ötödéig terjedõ koncentrációjában, az adenozinreceptoron, ph=7,4¹en. 26. A 24. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a mellékhatás bradycardia, alacsony vérnyomás vagy tachycardia mellékhatás. 27. Eljárás potenciális terápiás ágens azonosítására, amely szerint egy tesztvegyület érintkeztetünk egy patológiás szövetben, sejtben vagy membránban lévõ, és egy megfelelõ normál szövetben, sejtben vagy membránban lévõ adenozinreceptorral a tesztvegyület EC0-értéke alatti koncentrációban, az adenozinreceptoron, ph=7,4-értéken, és meghatározzuk, hogy van¹e bármilyen különbség az adenozinreceptor hatásában a tesztvegyülettel való érintkeztetésre adott válaszban a normál szövet és a patológiás szövet között. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, ahol a tesztvegyületet abban az esetben azonosítjuk potenciális terápiás ágensként, ha a tesztvegyület az adenozinreceptor agonistája, és az adenozinreceptor hatása, ami a tesztvegyületre adott válaszként jön létre, nagyobb mértékû patológiás szövetben, mint normál szövetben. 29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, ahol a patológiás szövet epitél szövetet is magában foglal. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás pszoriázis, asztma vagy COPD kezelésére szolgáló potenciális terápiás ágens azonosítására. 16

17 HU T2 Int. Cl.: G01N 33/94 17

18 HU T2 Int. Cl.: G01N 33/94 18

19 HU T2 Int. Cl.: G01N 33/94 19

20 HU T2 Int. Cl.: G01N 33/94