Növényi biotechnológia és géntechnológia Dudits, Dénes Heszky, László

Átírás

1 Növényi biotechnológia és géntechnológia Dudits, Dénes Heszky, László

2 Növényi biotechnológia és géntechnológia írta Dudits, Dénes és Heszky, László Publication date 2014 Szerzői jog 2014 Agroinform Kiadó Szerzői jog 2014 Educatio

3 Tartalom Előszó a harmadik, átdolgozott, bővített kiadáshoz... viii Köszönetnyilvánítás... x 1. I. Bevezetés A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjai (Heszky L.) Fogalma Tárgya Célja és gazdasági jelentősége Módszereinek csoportosítása A szövettenyésztés alapjainak megteremtése ( ) A tenyésztett sejtek totipotenciájának bizonyítása és a szomatikus sejtgenetika kialakulása ( ) A növényi géntechnológia kialakulása és felhasználása (1980-tól) Hazai története A növényi biotechnológia pionírjai ( ) A növényi sejtgenetika és szövettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) A növényi géntechnológiai kutatások kezdete és az első eredmények Növény-sejt-növény rendszer in vitro (Heszky L. és Dudits D.) Dedifferenciálódás és redifferenciálódás Az in vitro morfogenezis alternatív útjai Növények felnevelése tenyésztett sejtekből Organogenezis A járulékos szervek differenciálódása A virág morfogenezise in vitro Gumóindukció in vitro Szomatikus embriógenezis Az in vitro szerv- és embriódifferenciálódás molekuláris háttere A növényregenerálás eredményei II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Az ivaros szaporodás biotechnológiája (Heszky L.) Embriókultúra Az embriógenezis jellegzetességei in vivo Története Módszere Az embriókultúrák csoportosítása és felhasználása A proembrió kultúrák céljai, módszerei és eredményei A fejlett-embrió tenyészetek céljai, módszerei és eredményei Felhasználási területei: A csíranyugalom megszüntetése és a generációváltás gyorsítása Portoktenyésztés (in vitro androgenezis) A mikrogametogenezis jellegzetességei in vivo Története Pollenembriógenezis indukcója A pollenhaploidok ontogenezise Androgenetikus poliploidia Módszere In vitro androgenezis In vitro ginogenezis In vitro parthenogenezis Távoli keresztezés Genetikai és nemesítési jelentőség Generatív szervtenyészetek Virágtenyésztés Ováriumtenyésztés Ovulumtenyésztés Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben iii

4 Növényi biotechnológia és géntechnológia Generatív szövettenyészetek Endospermium-tenyésztés Nucellusztenyésztés Generatív sejttenyészetek Izolált mikrospóra tenyésztés Ivarsejtek izolálása és in vitro fúziója Az apomixis biotechnológiája Típusai Biológiája Biotechnológiai lehetőségei Az ivartalan szaporodás biotechnológiája (Heszky L.) Az in vitro mikroszaporítás alapjai Története A zárvatermők apikális merisztémájának anatómiája Merisztématenyésztés Rejuvenilizáció A mikroszaporítás módszerei Hajtástenyésztés Járulékos hajtástenyésztés Járulékos szervtenyészetek Kórokozó-mentesítés Hőkezelés Hidegkezelés Merisztématenyésztés Kemoterápia Kombinált kezelés Az in vitro mikroszaporítás technológiája Az üzemi mikroszaporítás gazdasági jelentősége A steril mikroszaporítás előnyei A steril mikroszaporítás hátrányai Üzemi mikroszaporítás a világon és hazánkban A mikroszaporítás a XXI. században Rita tenyésztési rendszer Vitron 501 mikroszaporító robot Fotoautotróf mikroszaporítás Mikroszaporítás bioreaktorban A mesterséges mag Érett szomatikus embriók előállítása A mesterséges mag előállítása, típusai A mesterséges mag csírázása Gazdasági jelentősége In vitro génbank Az in vitro tárolás feltételei Az in vitro tárolás technikái Gyakorlati alkalmazás Kriobank (krioprezerváció) Fagyásvédő előkezelések Fagyasztás, tárolás, olvasztás Az in vitro génbankok nemzetközi hálózata III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A genetikai variabilitás növelése (Dudits D. és Heszky L.) Szomaklonális variabilitás Biológiai alapja és története Genetikai variabilitás a növényben in vivo A szövettenyészetek in vitro variabilitásának okai A szomaklonális variabilitás módszere Fajhibrid szomaklónok Gyakorlati jelentőség és alkalmazás Mutánsok izolálása sejt- és szövettenyészetekben Az in vitro mutánsizolálás metodikai alapjai iv

5 Növényi biotechnológia és géntechnológia Aminosav analógokkal szembeni rezisztencia Kondicionális letális mutánsok: auxotrófok Herbicidrezisztencia Szelekció betegségekkel és stresszhatásokkal szembeni rezisztenciára Szomatikus hibridizáció protoplasztfúzióval Az ivaros keresztezés lehetőségei és korlátai Protoplasztokból felnevelt növények A protoplasztok egybeolvadása mesterséges sejthibridek A szomatikus fajhibridek főbb sajátosságai Extrakromoszómális tulajdonságok átvitele cibridek A paraszexuális távoli hibridizáció lehetőségei Izolált sejtmagok és metafázis kromoszómák mint a génátvitel eszközei Transzgénikus növények létrehozása DNS-transzformációval A növényi genom mérete és a sejtmagi DNS szerveződése Genomikus növényi géntárak Fág vektorokba történő klónozás Nagyméretű genomikus DNS-szakaszok izolálása és klónozása YAC és BAC génbankok Komplementer DNS-molekulák szintézise és klónozása A transzkripciós mintázat összehasonlításával történő génizolálás további módszerei Növényi genomprogramok: DNS-szekvenciától a funkcióig A növényi gének molekuláris szerkezete és aktivitásának szabályozása Egy növényi gén főbb szerkezeti elemei A génaktivitás promoterműködés mérésének módszerei A folyamatos génkifejeződést biztosító konstitutív promoterek Hormonok által szabályozott illetve szövet-, és szervspecifikus génműködés molekuláris háttere Környezeti faktorok által irányított promoterek Vegyszeres kezeléssel aktiválható promoterek Génkifejeződést befolyásoló tényezők a transzgénikus növényekben Agrobacteriumplazmidok mint természetes génátviteli rendszerek A tumorképződés molekuláris háttere Agrobacterium-fertőzés során A Ti-plazmidokra épülő vektormolekulák főbb elemei Kétplazmidos, ún. bináris vektorok A transzformáció lépései Közvetlen DNS-bevitel Plazmidmolekulák bejuttatása protoplasztokba A DNS keresztüljuttatása a növényi sejtfalon: génpuska IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Genetikailag módosított (GM) növények (Heszky L.) A GM növény Molekuláris növénynemesítés A molekuláris és a hagyományos nemesítés kapcsolata A növényi géntechnológia és a globalizáció A fontosabb géntechnológiai stratégiák Biotikus stressz-rezisztens transzgénikus növények (Dudits D. és Heszky L.) Vírus eredetű molekulák a virális patogénekkel szembeni rezisztencia kialakításában A köpenyfehérje gén kifejeztetésével kialakított rezisztencia Módosított mozgási fehérjékre épített ellenállóság A replikázgén kifejeztetése Nukleinsav-molekulák által közvetített rezisztencia Vírusrezisztencia és transzkripció utáni génelhallgattatás Bakteriális fertőzéssel szemben rezisztens transzgénikus növények Antibakteriális fehérjék túltermeltetése a transzformáns növényekben A patogenitási és virulencia faktorok gátlása A növények természetes védekezési mechanizmusait serkentő géntechnológiák v

6 Növényi biotechnológia és géntechnológia A reaktív oxigéngyökök képződésének befolyásolása génbeépítéssel Gombarezisztens transzgénikus növények Gombaellenes enzimek Patogenezishez kapcsolt növényi fehérjék és peptidek Aktív oxigénfajták Állati eredetű fehérjék és peptidek Rovarrezisztens transzgénikus növények Mikroorganizmus eredetű gének Növényi eredetű gének Állati eredetű gének Abiotikus stressz-rezisztens transzgénikus növények (Dudits D. és Heszky L.) Herbicidrezisztens transzgénikus növények A géntechnológiával kialakított herbicidrezisztencia jelentősége Géntechnológia stratégiái Glifozát rezisztencia Szulfonilurea rezisztencia Imidazolinon rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Bromoxinil rezisztencia Atrazin rezisztencia Szárazság és ozmotikus stresszrezisztencia a transzformáns növényekben A sejtstruktúra megőrzését szolgáló fehérjék Ozmotikus védelmet biztosító vegyületek (ozmolitok) szintetizáltatása Károsító molekulák hatástalanítását biztosító mechanizmusok A vízhiányt kísérő jelátviteli és génexpressziós szabályozás: az abszcizinsav szerepe Szélsőséges hőmérsékleti viszonyokat tűrő transzgénikus növények A reaktív oxigéngyökök károsító hatását mérséklő anyagcsere-folyamatok Anyagcseréjükben módosított transzgénikus növények A fehérje és aminosav anyagcsere módosítása Az aminosav bioszintézis módosítása Metioninban gazdag fehérjék termeltetése A búzaliszt minőségének javítása A szénhidrát anyagcsere módosítása A keményítő bioszintézise (11/3. ábra) A keményítő mennyiségének módosítása Amilóz és amilopektin arány módosítása Cukortartalom módosítás A zsírsav bioszintézis módosítása A zsírsavak bioszintézise Rövid- és közepes láncú zsírsavak arányának növelése Hosszú láncú zsírsavak arányának növelése Fejlődésben módosított transzgénikus növények (Heszky L. és Dudits D.) Transzgénikus hímsterilitás és hibrid előállítás Citoplazmás és génikus hímsterilitás Hímsteril transzgénikus növények előállítása A hímsteril transzgénikus növények fenntartása és felszaporítása Fertilis F1 vetőmag előállítás Hímsterilitás kémiai kezeléssel GM növényekben Gyakorlati alkalmazás A növények növekedését, fejlődését és morfológiai felépítését érintő géntechnológiai beavatkozások A terminátor technológia Transzgénikus növények, mint bioreaktorok (Heszky L.) Idegen fehérjék, peptidek génjeinek működtetése GM növényekben Idegen fehérjék termeltetése rekombináns vírusokkal fertőzött növényekben A gazdaságos fehérjetermelés feltételei ,,Ehető vakcinák termeltetése Antitestek termeltetése vi

7 Növényi biotechnológia és géntechnológia Ex situ felhasználás (egészségügy, ipar stb.) In situ felhasználás növényekben (növényvédelem) Heterológ fehérjék és peptidek termeltetése Bioaktív peptidek Emberi fehérjék Ipari enzimek Ciklodextrin termelés Műanyag termelés V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái Transzgénikus fajtákkal és termékekkel kapcsolatos kockázatok A géntechnológia és az evolúció A géntechnológia és a horizontális rekombináció Biológiai (ökológiai) rizikótényezők Transzgén hatások A transzgén termékének (fehérje) hatásai (14/1. ábra) Gazdasági (szociális) hatások (14/2. ábra) A,,lényegi azonosság elve Törvényi szabályozás az USA-ban és az EU-ban Törvényi szabályozás Magyarországon A növényi-biotechnlógia növekvő szerepvállalása a fenntartható fejlődés feltételeinek megteremtésében: hazai lehetőségek és feladatok vii

8 Előszó a harmadik, átdolgozott, bővített kiadáshoz,,és megáldá Isten őket és mondá nékik Isten: Szaporodjatok és sokasodjatok és töltsétek be a földet és hajtsátok birodalmatok alá; és uralkodjatok a tenger halain, az ég madarain és a földön csúszó-mászó mindenféle állatokon. És mondá Isten: Imé, néktek adok minden maghozó füvet az egész föld színén és minden fát, amelyen maghozó gyümölcs van; az legyen néktek eledelül. Mózes első könyve , 29. (Károli Gáspár fordításában) A növénytermesztés, kertészet és erdészet állítja elő az emberiség számára a nap sugárzó energiájának megkötésével a primer szervesanyagokat, az alapvető élelmiszereket és az állati takarmányokat, emellett az ipari termelés számára sokféle alapanyagot, valamint energiát is szolgáltat. A világ népessége rohamosan nő, ennek következtében drámaian csökken annak a területnek a nagysága, melyen egy ember szükségleteit meg kell termelni. Az egy főre jutó termőterület a világon 1950-ben 0,51 ha volt és ez 2025-re 0,17 ha-ra fog csökkenni. Az alap- és alkalmazott növénytudományok feladata, hogy eredményei olyan mértékű fejlődést váltsanak ki a termelésben, ami lehetővé teszi a szükségletek 0,17 ha-on való kielégítését. E probléma végleges megoldása a klasszikus növénytudományoktól önmagukban nem várható, azokkal a növények genetikai termőképessége már nem fokozható olyan mértékben, amennyire szükség lenne. Erre csak a molekuláris biológia, biotechnológia és géntechnológia legújabb eredményeit és módszereit felhasználó és azokat továbbfejlesztő alkalmazott növénytudományok beleértve a növénynemesítést is lesznek képesek. Az 1980-as évektől, a molekuláris biológia rendkívül gyors térhódításával az alap- és alkalmazott növénytudományok módszertani megközelítéseiben forradalmi változás következett be. A molekuláris módszerek alkalmazása amellett, hogy racionális megközelítéseket tesz lehetővé a kutatásban, várhatóan meg fogja változtatni az emberiség szemléletét a mezőgazdasági termeléssel kapcsolatban is. A molekuláris megközelítésben a növénytermesztés végül is nem több, mint néhány tucat növényfaj életfolyamatainak hasznosítása a társadalom számára. Napjaink növénytermesztését, kertészeti és erdészeti termelését felfoghatjuk úgy is, hogy nem búzát, kukoricát, zöldséget, gyümölcsöt, fát stb., hanem cukrot, fehérjét, olajat, cellulózt, alkaloidokat stb. termelünk. A vegyi üzemek, melyek ezeket az anyagokat előállítják, a növények, pontosabban a növényi sejtek. A termelőfolyamat pedig a növények anyagcseréje. A modern mezőgazdaság és az azt szolgáló tudományok az elmúlt évszázadok során igyekeztek a maximumot kihozni azokból a biológiai rendszerekből (szántóföldi, kertészeti, erdészeti fajok), melyeket a természet felkínált. A XX. században a növénynemesítés eredményeinek alkalmazása biztosította azt a fejlődést, mely képes volt élelmiszerrel ellátni a Föld gyorsan növekvő (1999. október 12-én elérte a 6 milliárd főt) lakosságát. Nem tették meg azonban azt a kicsi, de mégis óriási lépést, mely a növények képességeinek, tulajdonságainak viii

9 Előszó a harmadik, átdolgozott, bővített kiadáshoz mesterséges megváltoztatását tette volna lehetővé. Az évszázad végétől viszont a tudományos lehetőség már adott. A molekuláris megközelítésre alapuló tudományok lehetővé teszik, hogy az élő szervezetek jelen esetben a növények működését (életét) vezérlő genetikai programot mi emberek változtassuk meg, az emberiség (a gazdaság) igényeinek megfelelően. Ez az új biotechnológia és géntechnológia lényege, lehetősége és stratégiája. A növényi biotechnológia és géntechnológia a növénynemesítés lehetőségeinek kiszélesítésével járul hozzá a fenntartható fejlődés megvalósításához, különös tekintettel ix

10 Köszönetnyilvánítás A könyv szerzőinek külön örömére szolgál, hogy a bemutatott példák nagy számban hazai kutatások eredményeire épülnek. Ezért külön köszönetet mondanak a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjában (Szeged) és a Gödöllői Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszékén (Gödöllő), valamint a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban (Gödöllő), a Gabonatermesztési Kutató Khtben (Szeged) és a Mezőgazdasági Kutatóintézetben (Martonvásár) dolgozó kollégáknak, hogy a tudományos eredményeiket bemutató ábrákat rendelkezésünkre bocsátották. Külön köszönet és elismerés illeti Keczánné Czakó Zsuzsannát (MTA SZBK) a kézirat elkészítésében nyújtott alkotó közreműködéséért. Köszönet illeti Kiss Józsefet, Zámbó Lászlónét, Pongrácz Sándornét, Bakos Györgynét, Tóth Péternét, Bellusné Daniek Ágnest (SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöllő) és a tanszék doktoranduszai közül Veres Anikót, Debreczeni Dianát és Galli Zsoltot a kézirat összeállításában, valamint az ábrák elkészítésében nyújtott áldozatkész segítségükért. A szerzők köszönetet mondanak továbbá Barnabás Beátának az MTA doktorának és Balázs Ervinnek az MTA lev. tagjának, szakmai lektoroknak, a kézirattal kapcsolatos megjegyzéseikért és értékes szakmai tanácsaikért, valamint Sági Ferencnek, a biológiai tudomány kandidátusának javító észrevételeiért. E könyv megjelenését támogatták: Aventis Crop Science, Magyarország, Monsanto x

11 1. fejezet - I. Bevezetés A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjai (Heszky L.) Fogalma A növényi biotechnológia és különösen a növényi géntechnológia nemzetközileg is új fogalomnak tekinthető, melyet sokféleképpen értelmeznek, ezért pontos és egyértelmű definíciója rendkívül fontos. A klasszikus biotechnológia vagy biológiai technológia olyan gyártási eljárást jelent, melyben valamilyen élő szervezet vagy annak alkotórészei (pl. enzimek) végzik a termék előállítását. E megfogalmazásból azonnal kitűnik, hogy ezt műszaki aspektusból értékelték, tehát olyan ipari gyártási eljárásokat neveztek biotechnológiának, melyben bizonyos lépéseket mikroorganizmusok vagy enzimek végeznek. Mivel ezek az iparágak (gyógyszeripar, élelmiszeripar stb.), illetve a takarmánytartósítás viszonylag régen kialakultak, a biotechnológia fogalmát kizárólagosan e területeken használták a 70-es évek végéig. Ezek a zömében mikrobiális fermentációra, erjesztésre stb. alapozott technológiák nem lebecsülve gazdasági jelentőségüket a hagyományos vagy klasszikus biotechnológiának tekintendők. Az új és hagyományos biotechnológia között a határvonalat a genetikai módosítás jelenti. Az új biotechnológiai eljárásokban tehát az ember által bizonyos célból megváltoztatott, genetikailag módosított élő szervezetek vesznek részt. Ezek az élő szervezetek pedig már a mikroorganizmusokon kívül lehetnek növényi vagy állati sejtek, sőt növények, vagy állatok is. Az új biotechnológiai technikák gyors elterjedése a kutatásban és egyre növekvő gazdasági jelentősége szükségessé tette a 80-as évek elején a biotechnológia fogalmának módosítását. Az újra csak műszaki szempontból megfogalmazott nemzetközi nómenklatúra szerint az új biotechnológia: a biokémia, a mikrobiológia és a műszaki tudományok olyan integrált alkalmazása, amelynek célja a mikroorganizmusok, tenyésztett növényi, állati sejtek vagy azok valamely részének technológiai felhasználása. E megfogalmazás ugyan jelentett valamilyen előrelépést, azonban bonyolult, hiányos és nehezen értelmezhető a mezőgazdaság oldaláról. A növényi biotechnológia: a növények, növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását és az így kialakított új képességeik technológiai felhasználását jelenti. A növényi biotechnológia tehát az új biotechnológiák közé tartozik és két fő lépésből áll. Az elsőben új tulajdonságokkal rendelkező egyedeket (sejt vagy növény) állítunk elő, melyeket a második lépésben a gyakorlatban használunk fel. A gyakorlat a növényi biotechnológia esetében a növénynemesítést, a növényvédelmet és a szaporítóanyag-előállítást, illetve a növénytermesztési technológiákat jelenti. A növényi biotechnológia végeredményben nem tekinthető önálló diszciplínának, hanem különböző tudományok, tudományterületek eredményeit szintetizáló, módszereit gyakorlati cél érdekében komplexen felhasználó, új tudományos és gazdaságfejlesztési irányzatnak. A fogalomban jelzett két lépés összhangban van magának a biotechnológiának, mint szónak az összetéte-lével is. A növényi biotechnológia fogalmának első lépésében jelzett genetikai módosítás jelenti tulajdonképpen a bio oldalt. Azokat a kísérletes biológiai diszciplínákat, amelyek elméleti eredményeinek és módszereinek alkalmazásával új értékek hozhatók létre. Ezek három csoportba sorolhatók: a szaporodás biotechnológiája, szomatikus sejtgenetika és géntechnológia. A szaporodás (reprodukció) biotechnológiája: a növények ivaros (szexuális) és ivartalan (aszexuális) szaporodásának módosítását jelenti a növényi sejtek, szövetek, vagy szervek in vitro tenyészeteiben. A szomatikus sejtgenetika a növényi sejtek genetikai programjának megváltoztatását jelenti, közvetve sejtszintű manipulációval, sejt- és protoplaszttenyészetekben. A géntechnológia a növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását jelenti, molekuláris genetikai módszerekkel. 1

12 I. Bevezetés A géntechnológia tehát része a növénybiotechnológiának. Tudományos és gazdasági jelentősége azonban felülmúlja a másik két megközelítést. A hazai és nemzetközi törvényi szabályozásnak megfelelően csak a géntechnológiával megváltoztatott sejtek és növények tekintendők genetikailag módosítottnak, azaz GM-nek. A GM növények (géntechnológiával módosított növények, transzgénikus növények, transzformáns növények stb.) tehát azok, melyek sejtmagjába (genomjába), a géntechnológia molekuláris módszereivel idegen gént (transzgén) juttatnak be és az integrálódik, működik és öröklődik. A transzgénikus növények, illetve fajták (GM fajták) tehát abban különböznek a hagyományostól, hogy a növény minden sejtje sejtmagjában általában egy vagy több transzgént és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott fehérjéket tartalmaz. A fentiek alapján egyértelmű a különbség a növényi biotechnológia és a hagyományos biotechnológia között, valamint az újabb biológiai eljárások (pl. biotermesztés, biokert, biohumusz stb.), illetve a bioaktív anyagokat (serkentők és gátlók) felhasználó technoló-giák között. Erre a megkülönböztetésre rendkívül nagy szükség van, mert a növényi biotechnológia végül is nem a már ismert és más fogalmakkal bevezetett eljárások átkeresztelése, hanem minőségileg újat, új piacot és értéket teremtő molekuláris és sejtgenetikai, valamint sejtés szövettenyésztési eljárások, illetve azok eredményeit felhasználó technológiák összessége. E könyv következő fejezeteiben a sejt- és szövettenyésztés, valamint a sejt- és molekuláris genetikai módszereket, azok fejlesztési lehetőségeit, eredményeit és gazdasági jelentőségét ismertetjük, három fő egységben (szaporodás biotechnológiája, szomatikus sejtgenetika és géntechnológia), utalva a technológiai vonatkozásra ott, ahol ez már napjainkban is lehetséges Tárgya A növénybiotechnológiának biológiai oldalról két meghatározó eleme van: az első a genetikai módosítás, a második a növényi sejt. Ebből logikusan következik, hogy a növényi biotechnológia tárgya nem lehet más, mint a növények örökítő anyaga (DNS), illetve az azt hordozó legkisebb totipotens élő egysége, a növényi sejt. A növényi biotechnológia központjában tehát a sejt (ivarsejt, szomatikus sejt) áll, függetlenül attól, hogy a genetikai manipulációt molekuláris, sejt- vagy egyedszintű megközelítéssel végezzük. Ennek oka, hogy a sejt a növénynek az a legkisebb része, amelynek teljes genetikai információkészlete van, tehát totipotens. Másképpen fogalmazva nem ismerünk olyan, a sejtnél kisebb egységet, amelyből intakt növényt lehetne regenerálni. Ebből az következik, hogy molekuláris megközelítés (géntechnológia) esetén is sejtszintű molekuláris transzformációra van szükség ahhoz, hogy a transzgén integrációját az in vitro rekombinációt követően genetikailag módosított növényt kaphassunk. Ebből logikusan következik, hogy a GM sejtből regenerált GM növény minden sejtje tartalmazni fogja a transzgént. 2

13 I. Bevezetés 1/1. ábra: A növényi sejt (A) és az abból izolált protoplaszt (B) sematikus ábrázolása, különös tekintettel az örökítő vagy genetikaianyag lokalizációjára Biotechnológiai szempontból a növényi sejt (1/1. ábra) néhány specialitással rendelkezik. Először is a szilárd, általában másodlagosan vastagodott sejtfala tűnik szembe, amely az állati sejttel szemben nehezíti idegen információt hordozó molekulák, sejtorganellumok bejuttatását. Enzimkezeléssel eltávolítva a sejtfalat, sejtfal nélküli növényi sejteket, úgynevezett protoplasztokat kapunk (1/1. ábra), melyek ideális objektumai a genetikai beavatkozásnak. A DNS legnagyobb része (90 99%) a kettős hártyával, membránnal határolt sejtmagbantalálható. A DNS szerkezete lineáris és az eukariótákra jellemző szerveződést mutat. Hosszúsága néhány centimétertől néhány méterig terjed. A genom mérete megközelítőleg 1 x 10 8 és 10 x bázispár között változik, ami 0, pg értéknek felel meg. A kultúrnövények genomjának mérete elérheti, sőt jelentősen meghaladhatja az emberi genomét (3 x 10 9 ). Ennek oka részben a poliploidia, részben az ismétlődő (repetitív) szekvenciák nagy aránya (25 95%). A genomiális DNS kromoszómákba csomagolva található a sejtmagban, melyek száma általában 2n = között van (1/2. ábra). 3

14 I. Bevezetés 1/2. ábra: A növények minden sejtje a sejtmagban tartalmazza a teljes genomot, melynek hosszúsága fajonként jelentős eltérést mutat A gének száma ezerre tehető. A növényi genom analízisét az ún. Genom Projektek végzik. Céljuk a genomokban lévő genetikai információ megfejtése. Az információt a DNS 4 építőelemének, a nukleotidoknak (A,T,G,C) sorrendje határozza meg. Az első lépésben a DNS szekvenálás során a különböző kultúrfajok genomiális DNS-ének nukleotid sorrendjét határozzák meg. Ez időigényes feladat, hiszen a kukorica genomja 3,9 milliárd (3,9 x 10 9 ), a búzáé 17 milliárd (1,7 x ) nukleotidból áll. A második lépésben kell majd a gének helyét meghatározni (térképezni) a láncban (funkcionális genomanalízis). Ami a szekvenálást illeti, a növények közül az Arabidopsis genomja, mely a legkisebb (1 x 10 8 bp) áll a legközelebb a befejezéshez, de előrehaladottnak tekinthető a kukorica és a rizs (1 x 10 9 bp) genomanalízise is. A genetikai anyag 1 10%-a található a sejtorganellumokban, tehát a plasztiszokban (átlag db/ sejt) és a mitokondriumokban (átlag db/ sejt). Az organellum DNS prokarióta típusú és több, átlagosan másolata található egy organellumban. Ennek következtében az organellum genom kópiáinak száma egy sejtben meghaladhatja az ezret, tehát az organellum DNS-nek,,populációi találhatók egy-egy növényi sejtben (1/1. táblázat). 4

15 I. Bevezetés A kloroplasztisz genom egy kópiájának átlagos mérete a kultúrnövények esetében kb, amelyen gén található. A mitokondrium genom egy példányának mérete átlagosan kb. A kódolt fehérjék száma kevesebb vagy hasonló a kloroplasztiszéhoz. Végeredményben a növény tulajdonságai részben a sejtmagban, részben az egyes organellumokban lévő DNSben kódoltak. Az utóbbiak az extrakromoszomális tulajdonságok hordozói, amelyek ún. anyai öröklésmenetet mutatnak. A géntechnológiai módosításra tehát három egymástól elkülönült helyen, a sejtmag- (genom) DNS-ben, a plasztisz-dns-ben, illetve a mitokondrium-dns-ben kerülhet sor. A növényi biotechnológia sikerének és alkalmazhatóságának másik elemét az a követelmény jelenti, hogy a genetikai módosítást követően a transzformált, fúzionált, szelektált stb. sejtekből növényeket lehessen felnevelni. Ennek lehetőségét a növényi sejt- és szövettenyésztésnek az utóbbi évtizedekben elért eredményei teremtették meg. A növényi sejt totipotenciája in vitro realizálásának lehetősége viszont szemléletmódosítást igényel (1/3. ábra). 5

16 I. Bevezetés 1/3. ábra: A növényi biotechnológiaés a sejt-növény rendszer két alaptechnikája, a kallusztenyésztés (A és B) és a sejttenyésztés (C és D) A: kallusz szövet, mely differenciálatlan parenchima sejtekből áll; B: dohány növényregenerálás organogenezissel; C: sejtszuszpenzió, mely sejtaggregátumokból áll; D: sárgarépa növényregenerálás szomatikus embriógenezissel (Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növén nemesítés Tanszék, Gödöllő) A növénybiotechnológiában a sejt egyenlőnek tekinthető a növénnyel. Gyakorlatilag ez azt jelenti, hogy a növénybiotechnológus, amikor sejtekkel dolgozik, tulajdonképpen növénnyel dolgozik. A biotechnológia szempontjából a sejt azért tekinthető egyenlőnek a növénnyel, mert genetikai anyaga minden olyan információt tartalmaz, amely az intakt növényre jellemző, és a sejtekből in vitro növények regenerálhatók. A sejtszintű rendszer tehát elvben bármikor növényszintre hozható (1/4. ábra). 6

17 I. Bevezetés 1/4. ábra: Biotechnológiai eredetű fajta előállításának sémája. A genetikai módosítás a kiválasztott növények in vitrotenyészeteiben történik. Ezt követően a kultúrákból (sejt, protoplaszt) növényeket kell regenerálni, majd szántóföldi kísérletekkel kell igazolni a genetikai módosítás növényszintű manifesztációját és stabil öröklődését. Ezt követően a genetikailag manipulált növények a klasszikus nemesítés, fajtaminősítés rendszereken keresztül válhatnak minősített fajtává, ami a növénytermesztési alkalmazás feltétele Célja és gazdasági jelentősége A növényi biotechnológia különböző tudományok eredményeit szintetizáló, azok módszereit piaci célok érdekében komplexen felhasználó, új tudományos és gazdaságfejlesztési irányzatként jellemezhető. Ebből a megközelítésből kiindulva a növényi biotechnológia célja nem lehet más, mint a növények genetikai információjának módosításával új, gazdaságilag értékes fajták, hibridek előállítása, valamint új növénytermesztési technikák, szabadalmak és technológiák kifejlesztése (1/5. ábra). 7

18 I. Bevezetés 1/5. ábra: A géntechnológiai megközelítés lényege, hogy a gének megfelelő módosításával lehetővé teszi a kapcsolt fehérjék megváltoztatását úgy, hogy azokkal a kívánt fenotípus elérhető legyen Gazdasági jelentősége miatt külön kell említenünk a géntechnológiát és az abban rejlő tudományos és gazdasági lehetőségeket. Elöljáróban piaci szempontból néhány alapvető kérdést kell tisztáznunk. A Földön élő valamennyi szervezet, így a növények összes tulajdonsága is, az örökítő anyagban, a DNS-ben (30 50 ezer génben) van kódolva (lásd előző pontban). A gén fogalmát a géntechnológia szempontjából úgy definiálhatjuk, hogy a DNS azon szakasza, mely egy vagy több fehérje kódját és annak megnyilvánulásához szükséges regulációs szekvenciákat tartalmazza. Végeredményben a gén egy olyan programcsomagot jelent, mely a tárolt információ szempontjából szerkezeti és működési egységet alkot. A növényi géntechnológia során tulajdonképpen ilyen programcsomagokat viszünk át a donor fajból a recipiens növénybe. A transzgénikus növények tehát azok, melyek sejtmagjába (genomjába) géntechnológiával idegen gént (transzgén) juttatunk be és az integrálódik, működik és öröklődik. A Földön az élet információja minden élőben többé-kevésbé azonos rendszer szerint van kódolva. Ezért a transzgén származhat vírusból, baktériumból, gombából, rovarból, állatból, sőt emberből is. Bárhonnan származik a gén, alapvető feltétel az, hogy azt a növényben működő szabályozó szekvenciákkal kell ellátnunk. A GM növényfajta genetikailag tehát abban különbözik a hagyományos fajtától, hogy genomjában egy vagy több géntechnológiával kialakított idegen gént és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott egy vagy több új fehérjét tartalmaz. Ennek következtében a GM fajta néhány tulajdonságban eltér a hagyományos fajtáktól. Ezeknek a tulajdonságoknak azonban komoly termesztéstechnológiai, kereskedelmi és ipari értékük lehet. 8

19 I. Bevezetés Végül is a géntechnológia molekuláris eszköztára az emberiség kezébe adta azt a lehetőséget, hogy a növényfajokat olyan új tulajdonságokkal, képességekkel ruházza fel, melyek az adott fajban az evolúció során nem, vagy nem az ember által kívánt mennyiségben és minőségben alakulhattak ki. Ennek a lehetőségnek a kihasználására a világon az elmúlt évtizedben géntechnológiai verseny alakult ki a transzgénikus növényfajták XXI. században várható piacainak megszerzéséért. E verseny a globalizáció jegyében zajlik, mely során vegyipari konszernek fúzionálnak vagy vásárolnak fel biotechnológiai, illetve vetőmag vállalatokat. Ennek következtében eddig nem ismert méretű tőkekoncentráció jött, és jön létre a vetőmagiparban, mely évente dollármilliárdokat képes befektetni a gazdaságilag jelentős transzgénikus növények előállításába, a gének, eljárások, fajták, termékek, szabadalmi védelmébe és bevezetésébe az egész világon Módszereinek csoportosítása A növényi biotechnológia mint diszciplína, tárgyának (növényi sejt) és céljának (genetikai módosítás) megfelelően három nagy egységre osztható. A csoportosítás alapelve az, hogy az örökítő anyagban közvetlenül vagy közvetve hozunk-e létre információváltozást. Ennek megfelelően a molekuláris szintű megközelítést a géntechnológia, a sejtszintű technikákat a szomatikus sejtgenetika, továbbá a szövet- és szervszintű módszereket a szaporodás biotechnológiája jelentik. Géntechnológia A géntechnológia az örökítő anyag közvetlen molekuláris módosítását teszi lehetővé. A molekuláris biológia, sejtgenetika és szövettenyésztés különböző módszereit alkalmazza, melyek lehetővé teszik: a/ az egyes tulajdonságokért felelős gének izolálását, jellemzését és felszaporítását (klónozását); aa/ a gazdaságilag jelentős gén olyan vektorba építését, mellyel lehetővé válhat a gén átvitele a recipiens sejtbe, biztosítja továbbá a genomba való integrációját és működését; aaa/ a genetikailag módosított sejtekből a kifejlett szervezet (transzgénikus növény) előállítását (regenerációját). Szomatikus sejtgenetika A géntechnológiával szemben ezeknek a technikáknak a tárgya nem közvetlenül az örökítő anyag, a DNS, hanem a sejt vagy a sejtorganellum. Ennek ellenére alkalmazásuk közvetve molekuláris szintű változásokat okoz a genomban, illetve a plazmonban. A sejtgenetika a protoplasztfúzióra alapozott szomatikus hibridizáció, cibridizáció, sejtszintű mutánsizolálás, szomaklonális variabilitás stb. különböző sejtszintű és sejttenyésztési módszereit alkalmazza. A szaporodás biotechnikája A genetikai módosítás az ivaros és ivartalan szaporodás laboratóriumi manipulációjával történik általában sejt-, szövet- és szervtenyészetekben. Módszerei a haploidia, az embriókultúra, az in vitro termékenyítés, a ginogenezis, a merisztémakultúra, a vegetatív mikroszaporítás, a szomatikus embriógenezis stb. E csoportba tartoznak azok a módszerek is, amelyek felhasználásakor a genetikai módosítással nem a megváltozást, hanem ellenkezőleg, a genetikai stabilitást, a homozigóta állapotot, a genetikai homogenitást kívánjuk elérni és azt változatlan formában fenntartani, valamint megőrizni, illetve felszaporítani. 9

20 I. Bevezetés 1/6. ábra: A növényi biotechnológia és géntechnológia fontosabb területei, valamint módszerei Az 1/6. és 1/7. ábrán az izolátum jellege szerinti, az irodalomban leggyakrabban használt csoportosítást mutatjuk be. Újabban a gyakorlati alkalmazás egyre jobban elkülönülő területei is bizonyos csoportosítást jelentenek (pl. növénynemesítési biotechnológia, növényvédelmi biotechnológia, vegetatív mikroszaporítás stb.). Sőt napjainkban növénycsoportok, illetve növényfajok szerinti elkülönülés is tapasztalható (gabonafélék biotechnológiája, burgonya biotechnológiája, erdészeti fajok biotechnológiája stb.). Végeredményben a növényi biotechnológia egyre bővülő ismeretei, széleskörű gyakorlati elterjedése egyre specializáltabb csoportosítást eredményez, de a genetikai módosítás szintje alapján történő hármas tagolódás minden esetben érvényesül. 10

21 I. Bevezetés 1/7. ábra: A sejt- és szövettenyésztés fontosabb technikái. 1. In vitro ginogenezis: ovárium, ovulum izolálás táptalajra és növényregenerálás haploid sejtből. 2. In vitro termékenyítés: ovárium izolálás táptalajra, megtermékenyítés kémcsőben tömlőt hajtó pollennel, magfejlődés és csírázás. 3. Embriótenyésztés: proembriók fejlődésének fenntartása kémcsőben és növényregenerálás. 4. Vegetatív szaporítás: járulékos embriógenezis indukcióval. 5. Vegetatív szaporítás merisztématenyésztéssel: izolált merisztémacsúcsból járulékos merisztémák nevelése, feldarabolás növényregeneráció. 6. Kalluszkultúra: a növény osztódó kambiális szöveteiből kalluszindukció, majd növényregenerálás. 7. Protoplaszt tenyésztés: protoplasztok izolálása levél mezofillum sejtekből, növényregenerálás. 8. Szomatikus hibridek: izolált protoplasztok fúziója, növényregenerálás. 9. Portok, mikrospórakultúra: portokokban táptalajon a pollenből haploid növényregenerálás androgenezissel Felhasznált és ajánlott irodalom Altman, A. et al. eds. (1999): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht Boston London. Altman, A. ed. (1998): Agricultural Biotechnology. Marcel Dekker, Inc. New York Basel Hong-Kong. Dudits D., Dohy J. szerk. (1998): Biotechnológia, lépéstartás Európával. MTA, Budapest. Dudits D., Heszky L. (1990): Növényi biotechnológia. Mg. Kiadó, Budapest. Heszky L. (1995): Növényi biotechnológia. Az Agrárgazdaság jövőképe. Agro 21. Füzetek 5, Maróti M. (1976): A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest. Skjervold, H. (1989): Biotechnológia. Mg. Kiadó, Budapest. A növényi biotechnológia története tulajdonképpen a növények sejt- és szövettenyésztésével kezdődik. Ismertetésekor csak a fejlődés fő vonulatát követjük nyomon, utalva a legfontosabb személyekre, eredményekre, megvilágítva néhány összefüggést. E fejezetben nem kívánunk az egyes technikák történetével és különböző 11

22 I. Bevezetés fajokon való felhasználásával foglalkozni. Ezeket a könyv későbbi fejezeteiben az adott technika bemutatásakor részletezzük. A növényi sejtek és szövetek tenyésztésének történetét talán nem túlzás, de 1838-ban kell indítanunk, amikor is két német kutató, a botanikus SCHLEIDEN és a biológus SCHWANN nyilvánosságra hozta sejtelméletét. A mi szempontunkból nem azon a megállapításukon van a hangsúly, hogy minden szervezetet sejtek, szövetek és szervek építenek fel, hanem azon, hogy a soksejtű szervezetek minden egyes differenciálódott sejtje valószínűleg megtartja mindazon,,információt, amely a kiinduló egyetlen sejtben, a megtermékenyített petesejtben jelen van. Néhány évtizeddel később, a múlt század hetvenes éveiben WÖCHTING a keltike (Corydalis solida) gumójának vágásfelületén megfigyelt organizációval (levél- és gyökérfejlődés) in vitro kísérletesen bizonyította ezt a hipotézist. Tulajdonképpen már csak egy lépésnek tűnt a növényi szomatikus sejtek totipotenciájának in vitro bizonyítása. Ennek gondolatát elsőként az 1854-ben, a Mosonmagyaróváron született német HABERLANDT vetette fel 1902-ben. Végeredményben tehát a századfordulón kezdődött a mai értelemben vett növényi sejt- és szövettenyésztés története (2/1. táblázat). Az elmúlt évszázad növényi biotechnológiával kapcsolatos eredményeit 3 fő szakaszra osztva mutatjuk be. Az első, amely az 1940-es évek végéig tartott, a steril technika és a legalapvetőbb módszerek kidolgozásának időszaka volt. A másodikban, között a különböző szervek, merisztémák, haploid és szomatikus sejtek, valamint protoplasztok totipotenciáját sikerült bizonyítani, mely utóbbi eredményekre alapozva, indult a növényi szomatikus sejtgenetika kialakulása. Ezt a harmadik szakasz követte 1980-tól, mely napjainkban is tart 12

23 I. Bevezetés és a növényi géntechnológia forradalmi és látványos előretörését, sőt a GM növények köztermesztésbe kerülését eredményezte, a 90-es évek közepén A szövettenyésztés alapjainak megteremtése ( ) HABERLANDT 1902-ben közölt munkájában elsőként próbálkozott a növények vegetatív sejtjeinek tenyésztésével egyszerű táptalajon. Abból indult ki, hogy ha tényleg létezik a totipotencia, akkor megfelelő feltételek között olyan fejlődés tartható fenn, ami intakt növény kialakulásához vezet. Természetesen ennek bizonyítása az akkori tenyésztési feltételek, táptalajok és a konkrét izolátum (epidermisz-, sztóma-, és szőrsejtek) miatt neki még nem sikerülhetett. Ez azonban nem keserítette el és bízott abban, hogy egyszer valakinek sikerülni fog embriókat felnevelni a növények vegetatív sejtjeiből. HABERLANDT-tal egyidőben, 1904-ben sikeres kísérleteket végzett HANNIG, retekembriókkal. A kipreparált embriók ásványi sókat és szacharózt tartalmazó tápközegben tovább folytatták fejlődésüket, s belőlük növényeket kapott. Nyilvánvalóvá vált, hogy a további kutatásokat nem a sejt-, hanem az egyedfejlődés előrehaladottabb szervezettségi szintjén kell folytatni, amelyet az embrió, illetve gyökér- és hajtásmerisztéma jelentett. A HANNIG eredményes munkáját követő három évtized a növényi szövettenyésztés módszereinek megalapozó évtizedei voltak. LAIBACH 1925-ben képes volt táptalajon hibrid embriókat is életben tartani és belőlük hibrid növényeket felnevelni. A fejlődés fő vonalát azonban nem az embriók mesterséges felnevelése (embriótenyésztés vagy embriókultúra), hanem a szervkultúrák jelentették. Az 1920-as évek elején Amerikában ROBBINS, Európában egy HABERLANDT-tanítvány, KOTTE sikerrel oldotta meg a gyökérmerisztémák növekedéséhez szükséges mesterséges feltételek kialakítását. A szervetlen sókat és glükózt tartalmazó tápoldatban az izolált borsó- és kukorica-gyökércsúcsok intenzíven növekedtek és elágazó gyökérré fejlődtek. Folyamatos tenyésztésüket azonban a tenyészetek algás, bakteriális és gombás fertőződései megakadályozták. Ezek a tapasztalatok vezettek el a mai értelemben vett steril szövettenyésztési módszerek kidolgozásához. Nyilvánvalóvá vált ugyanis, hogy a növényi szövetek, szervek mesterséges tenyésztése más táptalajokat és más feltételeket kíván, mint az akkoriban példának tartott állati szövettenyésztés. Teljesen steril (csíramentes) feltételek nélkül az izolált növényi részek tartós tenyésztése megoldhatatlan. Az új módszerek kidolgozását végül is siker koronázta és ezzel elérkeztünk az 1930-as évek végéhez. A harmincas években két szövettenyésztési iskola hívta fel magára a figyelmet, az egyik White körül az USAban, a másik Gautheret körül Franciaországban. Talán nem tévedünk, ha a mai értelemben vett szövettenyésztés kezdetét e két csoport munkásságától számítjuk. White 1932-ben már sikerrel tenyésztett ovulumokat. A fejlődés szempontjából azonban sokkal fontosabb volt 1934-es vizsgálata, amikor paradicsom- (Lycopersicon esculentum) gyökércsúcsból indított gyökértenyészetben szervetlen sókat, szacharózt és élesztőkivonatot tartalmazó mely utóbbit később B-vitaminokkal helyettesített folyékony táptalajban teremtette meg a folyamatos tenyésztés feltételeit. E munka lett a későbbi szervtenyészetek (levél, hajtás, virág) kiindulópontja is. A sikeres paradicsom gyökértenyészet amelyet 7 naponta kellett az oldalgyökerekről átoltani, és amely White 1968-ban bekövetkező halálakor már 1726 passzálást ért meg tekinthető a korlátlan idejű növényi szövettenyészetek első állomásának. Közben Gautheret elsőként indukált kalluszt in vitro és a szintén francia Nobécourt-ral együtt 1939-ben kidolgozott egy hathetente folyamatosan átoltható, jól osztódó sárgarépa kalluszkultúrát. A módszer kidolgozásakor a kor legújabb kutatási eredményeit használta, a táptalajt agarral szilárdította és White-féle vitaminokkal (tiamin, piridoxin, niacin) egészítette ki, továbbá felhasználta az 1937-ben Went és THIMANN által felfedezett auxint, az indolecetsavat (IES) is. White szintén 1939-ben számolt be a Nicotiana glauca és N. langsdorffii keresztezéséből származó hibridből indított, folyamatosan növekvő kalluszról. A kallusz az in vitro tenyésztett differenciálatlan, folyamatosan osztódó növényi sejtek tömege. E két növény, a dohány és a sárgarépa, valamint in vitro tenyészeteik azóta a növényi sejt- és szövettenyésztési alapkutatások gyakran használt tesztobjektumaivá váltak. Most egy pillanatra térjünk vissza Haberlandt posztulátumára. A kutatóknak tehát 1939-ben sikerült, ha nem is izolált egyes sejteket, de sejtek tömegét mesterséges feltételek között életben tartani, növekedésük és osztódásuk 13

24 I. Bevezetés feltételeit biztosítani. A következő lépéshez, a totipotencia in vitro bizonyításához azonban még további felfedezésekre volt szükség és csak 20 évvel később sikerült A tenyésztett sejtek totipotenciájának bizonyítása és a szomatikus sejtgenetika kialakulása ( ) Van Overbeek, Conklin és Steward az embriókultúrákban tesztelt kókuszdiótejjel és az időközben szintetikusan előállított auxinnal a 2,4-D-vel (2,4-diklórfenoxi-ecetsav) képesek voltak kalluszt indukálni a már differenciálódott sejtekből is. Ezek a kísérletek új növényi növekedési hormoncsoport, a citokininek felfedezésén keresztül a totipotencia in vitro bizonyításához vezettek. Elérkeztünk egy újabb jelentős név, Skoog (USA) munkásságához. Skoog megállapította, hogy a dohánykallusz in vitro fejlődését a heringspermából kivont friss DNS nem befolyásolja, viszont bizonyos idő után ( régi minta ) serkenti. A friss DNS aktiválható volt autoklávozással, enyhén savas közegben. Egy évvel később sikerült izolálni az osztódás serkentéséért felelős vegyületet, amelyet Skoog 6-furfurilamino-purinként határozott meg és kinetinnek nevezett el. A kés bbi kutatások igazolták, hogy a citokininek a növények természetes növekedésszabályzó anyagai, és a zeatin volt az első citokinin, amit növényből sikerült izolálni. Az auxinok és a citokininek használata a táptalajban már bizonyos organizációt eredményezett a kalluszban. Elsőként White és Nobécourt figyelt meg véletlenszerű gyökér- és hajtásdifferenciálódást a tenyésztett kalluszban. Skoog egyik munkatársával, Miller-rel 1957-ben számolt be a ma már klasszikussá vált kísérletéről, a dohánykallusz hajtás- és gyökérregenerációjának hormonális szabályzásáról. Ennek lényege, hogy a kallusztenyésztéshez szükséges optimális auxin-kinetin arány csökkentésével hajtásfejlődés, növelésével pedig gyökérfejlődés indukálható. E munka alapján napjainkig számos más faj esetében is sikerült a növényregeneráció tenyésztett sejtekből, bár bebizonyosodott, hogy a fajok többségénél a morfogenezis indukciója sokkal bonyolultabb, mint az első látásra Skoog kísérletéből következett. Skoog professzornál és iskolájánál maradva feltétlenül említést kell tennünk az indiai származású Murashige kollégájával dohánykalluszon 1962-ben kidolgozott de azóta szinte minden növényfajnál széles körben használt táptalajáról, az MS-táptalajról. Az MS alaptáptalajon és módosított változatain érték el a kutatók azokat az eredményeket, amelyek a növényi szövettenyésztés utolsó, csaknem három évtizedét fémjelzik. Visszatérve azonban Haberlandt gondolatához, tehát az ötvenes évek második felére sikerült a kalluszsejtek totipotenciáját in vitro bizonyítani. A kutatók azonban nem rendelkeztek olyan módszerekkel, amelyek izolált egyedi (single) sejtek tenyésztését tették volna lehetővé. Az első lépéseket ebbe az irányba Hildebrandt munkatársai tették ben sikerült kalluszból folyékony táptalajban olyan sejtszuszpenziót létrehozniuk, amely különálló sejtekből és néhány sejtes aggregátumokból állt. Az első folyamatosan fenntartható sejtszuszpenzióról NICKELL 1956-ban számolt be, objektuma a bab (Phaseolus vulgaris) volt. A szuszpenziós kultúrák módszertanát Melchers és Bergmann 1959-ben tökéletesítette. Ez azóta sem sokat változott. A szuszpenziós kultúrák tehát részben már egyedi sejtek tenyészetét jelentették. Az ötvenes évek végén és a hatvanas évek elején ezek totipotenciáját is sikerült bizonyítani. A növényregeneráció azonban a dohányon megfigyelt szervdifferenciálódás helyett egy új ontogenetikai utat követett, az embriógenezist. A berlini Reinert és a New York-i Steward munkássága nyomán (1958) vált ismertté a szomatikus embriógenezis, amely a sárgarépa sejtszuszpenzió egyedi sejtjeiből indult. Steward a Cornell Egyetemen az 1960-as évek közepén csaknem százezer embriót kapott egy lombikban, miután enzimes kezeléssel egy fejlődő sárgarépa embriót sejtjeire bontott, majd a különálló sejtekben indukálta az embriógenezist. E munka már ténylegesen megfelelt Haberlandt posztulátumának és a zigótához hasonló embriógenezissel bizonyította a tenyésztett egyedi sejtek totipotenciáját. Ez a sejtszintű klónozás alapja, amelyet Taylor a világszerte ismertté vált,,biológiai pokolgép c. könyve kiinduló gondolataként használt 1968-ban. Ezek az eredmények azonban a szomatikus vagy testi (diploid 2n) sejtek totipotenciáját bizonyították. A haploid (n) ivarsejtek kipreparálása és tenyésztése az állatoktól eltérően a növényeknél rutinszerűen még nem volt megoldott. Ezért a tenyésztést magával az ivarszervvel együtt végezték. 14