Sejtadhéziós molekulák (CD44v3, VAP-1) előfordulása humán daganatszövetben T- és endothelsejteken. PhD értekezés tézisei. Dr. Forster Horváth Csaba

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Méret: px
Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Sejtadhéziós molekulák (CD44v3, VAP-1) előfordulása humán daganatszövetben T- és endothelsejteken. PhD értekezés tézisei. Dr. Forster Horváth Csaba"

Átírás

1 Sejtadhéziós molekulák (CD44v3, VAP-1) előfordulása humán daganatszövetben T- és endothelsejteken PhD értekezés tézisei Dr. Forster Horváth Csaba Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Országos Onkológiai Intézet 2005 Témavezető: Prof. Dr. Tímár József Szigorlati bizottság: Prof Sréter Lídia orvostudományok doktora, Dr. Orosz Zsolt PhD, Dr. Polgár Csaba PhD Országos Onkológiai Intézet Bíráló bizopttság: Prof Sréter Lídia orvostudományok doktora, Dr. Darvas Zsuzsanna PhD, Dr. Orosz Zsolt PhD Patológiai Tudományok Doktori Iskola, Onkológia Program Vezető: Prof. Dr. Kopper László Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest, 2005

2 1. Bevezetés A daganatkutatással egyidős törekvés a metasztázisképzés gátlására irányuló stratégiák kialakítása. Intenzív kutatás irányul a folyamatban szerepet játszó molekulák, gének feltérképezésére. A CD44 molekula az első olyan gén, melyet egyértelműen a tumorok szóródási képességéért tettek felelőssé. Patkány nem metasztatizáló pancreaskarcinóma sejtjeit CD44v6 exont tartalmazó génnel transzfektálták, mely a tumort metasztatikus fenotípussal ruházta fel.(1) További kutatások eredményeként derült fény a molekula limfocita aktivációban betöltött szerepére (2, 3, 4), T-sejt-endothel kapcsolódás limfocita homing során (5), valamint haematopoezisben betöltött szerepére. Alapvetően adhéziós molekulának tekintették, mely a hialuronsav fő receptora (6,7), továbbá sejtek homo-, ill. heterotipikus adhézióját, sejt-extracelluláris mátrix kölcsönhatást (8,9,10), migrációt mediál. Ezen kívül szignáltranszdukciós kapacitással is rendelkezik, mint az T-sejt aktiváció vizsgálata során kiderült.(2) Érdeklődésünk azért fordult a v3-as exont hordozó izoforma felé, mert az heparán szulfát kötőhellyel rendelkezik. A heparán szulfát proteoglikánokról (HSPG) kiderült, hogy képesek heparinkötő növekedési faktorok és citokinek, mint a bfgf, HB-EGF, MIP-1β HGF/SF és IL-1,-2, -6 (11) megkötésére, így nagy koncentrációban történő bemutatására (138, 139, 140). Ezen kívül bontóenzimektől védhetik meg azokat, meghosszabbítva aktivitásukat. (143, 144). Ezen tényezőknek a közeli sejtekre nézve különböző funkcionális következményei lehetnek. (14,15,16) Malignus tumorok prognosztikai elemzése kapcsán derült fény a CD44 molekula korábbi feltételezésekkel szemben igen változó biológiai viselkedésére. A szolid tumorok terápiájának egyik igéretes módozata a tumorágy ereinek elzárása, és/vagy az érújraképződés (neoangiogenesis) gátlása. Ehhez a tumorágyban szelektíven expresszálódó endotheliális antigénekre van szükség. Korábbi adatok alapján valószínüsíthető volt, hogy a daganatos erek megváltozott adhéziós molekulamintázattal rendelkeznek, így felmerült hogy mind a sejt- (VAP1) mind a matrix adhéziós molekulákban (pl. CD44) eltérések lehetnek A CD44 molekula szerkezete A CD44 molekulacsalád tagjai molekulasúly tekintetében 85 és 250 kd között helyezkednek el. E nagyfokú diverzitás részben a) az alternatív splicing-nak, b) 1

3 másrészt a O- és N-glikozilációnak, c) harmadrészt a poszttranszlációs modifikáció útján a protein törzshöz kötődő glükózaminoglikánoknak (glikanáció) köszönhető. Ad a) A molekula szerkezete nagyfokú variabilitást mutat, a gént 20 exon alkotja; 12 alternatív splicing révén variálható, de ebből 2 az intracelluláris domain régiójában helyezkedik el (18-19). A nagyfokú heterogenitást a membránproximális extracelluláris domain 9 (v2-v10) exonjának kombinációi eredményezik.(9) Potenciálisan a molekula közel 1000 variációja jöhetne így létre, a valóságban is megvalósuló kombinációk számát 50 körülire becsülik. A molekula így alapvetően egy standard és egy variábilis szakaszra osztható. Amennyiben a molekula nem tartalmaz variábilis exonokat, úgy CD44s vagy CD44H jelöléssel illetik. A variábilis exonokat hordozó struktúrák az exonok számától függően jelöltetnek: CD44 v3,8-10, CD44v3-10, CD44 v6-10. A molekula exontérképét látjuk az alábbi ábrán: Ad b) A glikozilációnak két formája létezik: O-típusú, mely szerin és treonin aminosavakon, valamint az N-típusú, mely aszparaginon valósul meg. Neuraminidáz és O-glikozidáz emésztéssel a CD44s molekulasúlya 16 kd-nal, míg a variánsoké kd-nal csökkent. Ez azt mutatja, hogy a variábilis exonokat tartalmazó molekulák (variánsok) jóval több O-glikánt hordoznak. A leghosszabb variáns teljes hosszán 9 potenciális O- glikozilációs hely található. 2

4 N-glikoziláció szempontjából - fentivel szemben - nincs különbség a CD44s és a variábilis exonokat tartalmazó molekulák között. A standard szakaszon 7, a variábilis régióban 2 további lehetséges módosítási hely (v5-ös és v10-es) lelhető fel (10). Ad c) A CD44 molekulán 7 potenciális glikanációs hely található, melyek öt exonban helyezkednek el. Ezek a standard régió variábilis szakasszal szomszédos membrán felőli részén (E5-ös exon), valamint a v3-as, a v10-es és ismét a standard régióban az E15-ös és E16-os exonon helyezkednek el. A glikanáció jól definiált, meghatározott aminosav sorrenddel bíró akceptor szakaszokon történik. Kísérletek tanúsága szerint fentiek közül csupán a standard régió E5-ös, és a v3 variábilis exon módosul poszttranszlációs modifikáció útján. (17) Kondroitinszulfát SG (szerin-glicin), heparánszulfát SGSG szekvenciák szerin oldalláncaihoz (R3C-OH) kapcsolódik. Utóbbi csak a v3-as exonban fordul elő. A glükózaminoglikán kötés szempontjából döntő fontosságú az SG/SGSG szekvenciát (downstream) követő 8 aminosav is. Amennyiben ezeket a két akceptorhely között kicserélték, úgy a HS-kötő képesség is megváltozott és a standard régió E5-ös exonja is alkalmassá vált heparánszulfát kovalens kötésére, a v3-as viszont csak CS-tal módosult. (10, 18) A variánsok közül azért foglalkoztunk CD44v3-mal, mivel ez az egyetlen, mely HS-proteoglikán oldalláncai révén képes heparinkötő citokinek, növekedési faktorok, interleukinok megkötésére és így feltételezéseink szerint az adott sejt funkciójának alapvető befolyásolására. CD44s posttranszlációs modifikációjának lehetőségei 3

5 A 3-as variábilis régió (v3) beépülése heparánszulfát-oldallánc (HS) kötődésének lehetőségét alakítja ki a molekulán ez a molekularész teszi lehetővé a heparinkötő növekedési faktorok (pl. FGF, HGF, HBEGF) kötődését. 1.2 A CD44 funkciója CD44 limfociták felszínén A nyugvó IgD+ B-sejtek CD44 pozitívak, azonban a tonsillák germinális centrumaiban az aktivált fenotípussal bíró IgD- és CD20+ sejtek negatívak. (58) Mások szerint a B- sejtek aktivációja a CD44 v6/v7, v8-10 és a v10 exonokat tartalmazó variánsok kifejeződését indukálja (59, 60). Nyugvó T-sejtek nem expresszálják a CD44 molekula variánsait, csupán standard formáját, míg aktiváció hatására ezek megjelennek felszínükön. A CD44 molekula a T-limfociták és endothel sejtek HA-mediált adhéziójában betöltött szerepe miatt bír immunológiai jelentőséggel. Éppen az antigén iránt elkötelezett T-sejtek nyirokcsomókba, mukóza asszociált nyirokszövetbe (MALT) való bejutásában (homing) van döntő szerepe. A CD44 molekula nagy affinitással kötődik a nyirokszövetek magas endothellel bíró venuláinak (HEV) luminális felszínén található hialuronsav molekulákhoz. (5, 61, 62) Több kutatócsoport is kimutatta, hogy a sejtek legpotensebb hialuronsav receptora a CD44. (63, 64) Az is bebizonyosodott, hogy a CD44 molekulán különböző kötőhelyek felelősek a HEV adhézióért, illetve a hialuronsav kötéséért. (65) A Hermes-3-nak keresztelt anti-cd44 antitest a HEV adhézióért felelős epitopot, míg a Hermes-1 az N- 4

6 terminális hialuronsav kötő régiót ismeri fel. (66) Korábbi megfigyelések szerint nyugvó sejtek, mint thymocyták és csontvelői sejtek jóval csekélyebb mértékben kötődnek HEV-hez, mint a perifériás vér és nyirokszövetek érett, keringő limfocitái. (67) Később, a CD44 molekula azonosítása után fény derült arra, hogy a molekula éretlen, CD4 és CD8+ T-sejteken sejteken alig, éretteken azonban jelentős mértékben expresszálódik. Thymocyták érése során a CD3 expresszió fokozódásával párhuzamosan emelkedik a CD44 szintje, a homing- és adhéziós receptorok koordinált megjelenésének jeleként. Így a perifériára kijutott T-sejtek mindegyike CD44 pozitív. Ezt támasztják alá az IL-2-vel kezelt T-sejt klónok és vonalak esetében megfigyeltek. (68, 69) Nemcsak in vitro, hanem in vivo kísérletek is megerősítik a felfedezést: intraperitoneálisan adott IL-15 előzőleg szuperantigénnel aktivált mezenteriális nyirokcsomó limfociták intraperitoneális akkumulációját eredményezte, melyet a limfociták anti-cd44 mab kezelése megakadályozott, az IL-15 az endotheliális HA prezentációt fokozta. (70) Hialuronsav adhézió Perifériás vérből izolált, nyugvó T-sejtek és klónok nem kötődnek hialuronsavval bevont tenyésztő edényekhez/lemezekhez. Anti-CD3/TCR stimulust követően a sejtek képessé válnak erre, ez a sejtek anti-cd44 antitesttel (J-173) történő kezelésével meggátolható. Más anti-cd44 antitest (F ) a HA kötést 10-szeresére fokozta. A jelenség valószínű magyarázata, hogy a CD44 molekula keresztkötés hatására konformáció változáson megy keresztül, melynek során kötőhelyek kerülnek exponált helyzetbe.(3) Korábbi irodalmi adatok szerint a CD44 HA-kötő képessége független a variáns exonoktól (71, 72). Nem világos azonban, hogyan szabályozódik térben és időben a T- sejtek endotheliális adhéziója, mivel a CD44s T-limfocitákon konstitutívan expresszálódik. Jackson és munkatársai szerint (7) CD44 variáns exonokat hordozó génnel (CD44v3,8-10, v8-10, v3-10, v6-10, v7-10) transzfektált Namalwa sejtek hialuronsav adhéziója 50%-a volt a CD44s molekulákénak. Ennek hátterében a hialuronsavkötő régió variáns exonok okozta konformációváltozását, sztérikus akadályozását valószínűsítik. 5

7 A fenti állításnak ellentmond az a megfigyelés, miszerint CD44 variánsai közül a v6 és v9 exonokat hordozó variáns átmenetileg expresszálódik T-limfocitákon azok aktivációjakor, mely a hialuronsav adhézióval azonos kinetikát mutat. Bármelyikük antitesttel történő gátlása esetén jelentősen csökken a sejtek előzőleg F anti- CD44 antitesttel maximalizált hialuronsav-adhéziója, közel olyan mértékben, mint a hialuronsavkötő régiót blokkoló J-173 antitest esetében. A fenti antitestek ugyanakkor nem blokkolják a molekula N-terminális doménjét, mely a hialuronsav kötéséért felelős. (56) Az említett ellentmondás feloldása jelen irodalmi adatok alapján nem lehetséges. Valószínű, hogy a sejt HA adhéziója nem egyszerűen a variánsok beépülésétől, hanem a sejt típusától is jelentősenfügg. A HA-kötő N-terminális doménben 5 darab N- glikozilációs hely található, melyek sztérikusan befolyásolhatják a HA-kötést. CD44 szerepe T-sejtek szignál transzdukciójában T-sejtek proliferációja, aktivációja kiváltható, ha a T-sejtekkel kokultúrában tartott monocitákat kezeljük anti-cd44 antitesttel. Az aktiváció mechanizmusa három féle lehet: 1.) az antitest IL-1 felszabadulását váltja ki a monocitákból, 2.) T-sejtek IL-2 szekrécióját augmentálja, 3.) T-sejt-monocita adhéziót erősíti (69). A CD44 tehát nemcsak adhéziós molekula, de képes az extracelluláris térből a sejt számára jelzéseket közvetíteni (3). A CD44 v6 és v9 keresztkötésének hatására intracellulárisan Ca 2+ szabadul fel, és a sejtek anti-cd3 indukálta proliferációja fokozódik. Hialuronsav CD44-hez kötődése során mind az afferens, mind az efferens lépések a CD44 közvetítésével zajlanak. A szignált a klasszikus HA-kötő régió mellett a v6, v9 közvetíti a sejt számára, míg az effektor maga CD44 molekula N-terminális doménje. Ennek során a CD44 intracelluláris doménje a citoszkeleton ankirinjéhez kapcsolódik és GTP-áz aktivitással bír. GTP kötése fokozza CD44 és ankirin interakcióját és az inracelluláris Ca 2+ szintjét növeli, mely Calmodulinon keresztül miozin könnyűlánc kinázt aktivál aktomiozin interacióhoz vezetve és a mikrofilamentumok kontrakcióját okozva. Ennek eredményeként változik a CD44 felszíni elrendeződése, így nő a sejtek hiauronsav adhéziója (4). 6

8 Ilyen módon a CD44 különböző formái között a szerzők hierarchiát tételeznek fel: a maximális erősségű adhézó létrejöttéhez a variánsok T-sejt aktivációjakor bekövetkező expressziója szükséges, mely beindítja a fenti folyamatot. (56) Egyes anti-cd44 antitestek a hialuronsavhoz hasonlóan fokozzák CD4+ T-sejtek effektor funkcióit. J-173 önállóan, anti-cd3/cd2 nélkül is képes az említett hatások kiváltására. A proliferáció IL-2 függő, mivel az anti-il-2-vel vagy Cyclosporin A-val gátolható volt. A citolítikus válasz mértéke hasonlónak bizonyult, mint OKT3 (anti- CD3) jelenlétében. A kiváltott effektor funkciókat gátolni lehetett tirozin kináz inhibitorral (genistein), a résztvevő szignáltranszdukciós molekulák súlyukat tekintve megegyeztek az anti-cd3 által kiváltott reakcióban közreműködő fehérjékével (2). CD44 nemcsak serkentő, de gátló funkciót is közvetíthet a sejt számára: felnőtt patkány limfocitái csak a standard variánst hordozzák. Allogén sejtekkel történő aktiváció hatására a legintenzívebben a 3-5. napon variánsok is megjelennek a nagyméretű, blasztos sejtek felszínén. A nyirokcsomóból izolált aktivált limfociták CD44 v6-ot expresszálnak. A variánsokat felismerő anti-cd44 antitesttel mind a B- sejt válasz, mind a T-sejtek proliferációja és a citotoxikus aktivitás is gátolható volt. Transzendotheliális migráció után a T-sejtek az antigénprezentáló sejtekhez migrálnak, eközben a CS tartalmú CD44s már az ECM fibronektin molekuláinak C-terminális heparinkötő doménjéhez kötődve segíti a migrációt. (73) Amennyiben a hialuronsavat CD3/TCR stimulussal együtt alkalmazzák, a kontrollhoz képest megnő az intracelluláris Ca 2+ szintje és fokozza a T-sejt effektor funkcióit: a proliferációt, a T-helper klónok IL- 2 termelését és egy citolítikus hatású, tripszinhez hasonló észteráz (granzyme) szekrécióját. Vagyis egy univerzális extracelluláris mátrix alkotó szintén aktiválni képes T-sejteket CD44 molekulán keresztül (3). Extravazáció közben és azt követően a sejtek tehát az extracelluláris mátrix fehérjéivel kerülnek kapcsolatba, melynek szintén aktiváló hatása lehet rájuk elősegítve migrációjukat és effektor funkcióikat. (74, 75) Mindezekből látható, hogy a T-limfociták felszínén lévő CD44 nem csupán intercelluláris illetve ECM-adhézióban, hanem a sejtunkciók aktivációjában/gátlásában is jelentős szerepet játszik. Ezen kívül CD44 intracelluláris doménje révén p56 lck protein tirozin kinázt aktivál, mely a ZAP-70 protein tirozin kinázt tirozinon foszforilálja, így az képessé válik effektor protein tirozin kinázok és/vagy adapter fehérjék megkötésére. Ilyen a LAT kda foszfoprotein adapter molekula, mely a 7

9 Grb-2 adapterrel és PLCγ-1-gyel alkot komplexet. Utóbbi a plazmamembránhoz transzlokálódik, így TCR asszociált protein tirozin kináz által foszforilálódik. Az immár aktív PLCγ-1 foszfatidil inozitolt hasít, DAG és IP 3 keletkezik, és megnő az intracelluláris Ca 2+ szint, mely további szignáltranszdukciós útvonalakat hoz működésbe (199). Saját kísérletsorozatunkban, melyben immoblizált anti-cd3 antitesttel és IL-2-vel előkezelt T-limfocitákat anti-cd44v3 antitesttel stimuláltunk, nem tapasztaltuk a sejtek fokozott izotóp (tríciált timidin) inkorporációját, proliferációját. (Nem publikált adatok.) Miért vizsgáltuk a CD44v3 molekula expresszióját T-sejteken? Fejnyaki tumorok progressziós markereinek kutatása közben immunhisztokémiai preparátumon figyeltük meg, hogy az intra/peritumorális limfoid infiltrátum egyes sejtjei a tumorsejtek mellett szintén expresszálják a CD44v3 antigént. Így merült fel a kérdés, hogy ezen antigén megjelenése jellemezheti-e a tumor és az effektor sejtek kölcsönhatását, vagyis limfociták aktiváltsági állapotát. A molekula korábban leírt egyedi szerkezeti jellemzői, melyek citokinek prezentációja révén feltehetően lehetővé teszik a limfocitaproliferáció és funkció módosítását, valamint az a megfigyelés miszerint az általunk vizsgált fejnyaki tumorok tumor infiltráló (TIL) limfocitáin is jelen van, arra indított minket, hogy tanulmányozzuk viselkedését nyugvó és in vitro aktivált limfocitákon CD44 proteoglikán az endothelen Ellentmondásos adatok láttak napvilágot a CD44 endothel sejteken történő expresszióját illetően. Voltak, akik negálták azt, mások ezzel ellenkező megfigyeléseket tettek (79, 80, 81, 14, 82, 83, 84, 85) és és feltételezték szerepét a migrációban (86, 87). Az is vita tárgyát képezte, hogy csak a standard forma (CD44s), vagy a molekula variánsai (CD44v) is kifejeződnek. Zöller (88), Griffioen (89) és McCarthy (90) munkacsoportjainak kísérletei meggyőzően bizonyítják, hogy a molekula variánsai közül néhány adott körülmények között megjelenik. HUVEC TNF-alfával történő aktivációja nemcsak a CD44 expresszió jelentős emelkedését eredményezte, hanem S 35 izotóp makromolekulákba történő inkorporációja is emelkedett, mely a proteoglikán szintézis fokozódását jelzi (91) Endothel sejtek luminális felszínén gyakran előforduló 8

10 proteoglikán a hialuronsav, melynek horgonyzó fehérjéje a CD44. Humán dermális endothelsejtek TNF-alfával történt stimulációja során a hialuronsav kötődés jelentős emelkedését figyelték meg, melynek magyarázata a CD44 konformációjának változása, míg a CD44 expresszió mértéke nem változott. (92) Nyúl eredetű mikrovaszkuláris endothelsejtek domináns proteoglikánja a chondroitin szulfát, melynek horgonyzó fehérjéje a CD44 standard és v3 exon tartalmú splice variánsa, mely a Ser-Gly-Ser-Gly alternatív akceptor helyet tartalmazza. CSPG-on kívül, mely az extrahált proteoglikán 70-80%-át teszi ki, 20%-ban HSPG-t is kimutattak. A sejtek fibrinogénen történő migrációja és fibrin mátrixba való inváziója döntően a molekula által kötött CS függvénye, mely újabb bizonyíték a CD44 jelentősége mellett. (82) Mások szintén úgy találták, hogy az endothelsejtek főleg CSPG-okat termelnek (93-96) Mások sejttenyészeten vizsgálták CD44v3 előfordulását és HUVEC-en FACS vizsgálattal nem találtak CD44v3-at. (89) Korábbi tanulmányok CD44v3-at endothelen csupán mrns szinten detektálták, a fehérjét pedig csak a bőr késői típusú hiperszenzitivitási reakcióiban, illetve foggyökerek gyulladásos folyamataiban írták le (88, 97). Heparán szulfát proteoglikánoknak alapvető jelentőségük van az angiogenezis folyamatában. Az eddig leírt endothel sejtek által termelt HSPG a glypican, betaglycan, a perlecan, a syndecan és a CD44 család tagja, a CD44v3 molekula. A glypican sejtfelszíni proteoglikán, mely a sejt membránjához glikozilfoszfatidilinozitolon (GPI) keresztül kapcsolódik (98). A családnak hat tagját írták le emberben. Eltérő molekuláris szerkezetükben közös a 14 cystein reziduum és a C-terminálishoz és így a sejtmembránhoz közeli 50 aminosavat tartalmazó HSPG akceptor régió, valamint a C- terminális hidrofób domén, mely a GPI-kötést teszi lehetővé (99-106). Endothel sejteken a glypican a trombin aktivációjában alapvető szerepet tölt be (107), valamint az endostatin alacsony affinitású receptora (108) A extracelluláris mátrix proteoglikánok közül a versican és a perlecan tartozik ide. A versicannak 4 izoformája ismert, ezek közül csak a V3 expresszálódik detektálható szinten endothel sejtekben és ez is csak aktiváció hatására. (109) A perlecan 400 kda molekulasúlyú extracelluláris molekula, az erek bazális membránjának komponense, mely lehetővé teszi endothelsejtek adhézióját azok β1 és αv integrinjein kersztül (110, 111). A transzmembrán proteoglikánok családjából a HSPG-ok közül a syndecanok (112) és a CSPG-ok részéről a CD44 (90, 92, 113) emelendő ki. A syndecan család 9

11 transzmembrán heparán szulfát proteoglikán, melynek négy tagját ismerjük: syndecan-1 (114), syndecan-2 (fibroglycan) (115), syndecan-3 (N-syndecan) (116), syndecan-4 (ryudoglycan) (117). A molekula szerepet játszik intercelluláris és extracelluláris mátrix növekedési faktor kötésben (118, ), adhézióban (122, 123, 124) és hemosztázisban (125). Mind a négy syndecan expresszióját megfigyelték endotheliális sejteken ( ). A molekulák rövid intracelluláris szakasza a citoszkeletonnal áll kapcsolatban és inracelluláris doménje tirozin kinázok által foszforilálható, mely a molekula szignáltranszdukcióban betöltöltött lehetséges szerepére utal. A betaglycan járulékos TGF-ß receptor molekula, melyről kimutatták, hogy az endoglinhez kötődve expresszálódik humán mikroendothel sejtek felszínén (130). Amint azt már említettük, a CD44 molekulacsalád tagjai nagyfokú variabilitást mutatnak, mely részben 12 exon az alternatív splicingjának, másrészt a O- és N- glikozilációnak, harmadrészt poszttranszlációs modifikáció útján a protein törzshöz kötődő glükózaminoglikánoknak (glikanáció) köszönhető. A variánsok közül a CD44v3-ra koncentráltunk, mely heparán szulfát proteoglikán oldallánca révén képes növekedési faktorok megkötésére és így -feltételezéseink szerint- az endothelsejt funkciójának befolyásolására. Az angiogenezis egyik Achilles sarka a növekedési faktorok receptoraikhoz történő kötődése. A legpotensebb endotheliális növekedési faktorok a bázikus FGF (bfgf, ß- FGF), VEGF és a HGF (scatter factor). Mindhárom faktorról kiderült, hogy heparinkötő tulajdonságú és nagy affinitású receptorhoz való kötődése heparán szulfát proteoglikánok (HSPG) asszisztenciája mellett történik (14, 131, 132, 133,134, 135). Ismeretes, hogy tirozin kináz receptorok párokba rendeződve (homodimért alkotva) továbbítják az extracelluláris tér jelzéseit. Az endotheliális növekedési faktorok receptorai kivétel nélkül ebbe a típusba tartoznak. Ezért kiemelkedő jelentőségű megfigyelés, hogy az FGF1 HSPG általi oligomerizációja szükséges az FGFR dimerizációjához és így mitotikus szignál kiváltásához (136). Az utóbbi időkben írták le, hogy heparin hatására FGF2 molekulák biológiailag aktív párokká alakulnak elősegítve a receptor dimerizációját. A heparinnak ebben az interakcióban stabilizáló szerepet is tulajdonítanak (137). A HSPG-ok heparinkötő citokinek biológiai aktivitását a következő módokon befolyásolják: növekedési faktorok oldott, sejtfelszíni vagy extracelluláris matrixhoz kötött HSPG-hez kötődnek, így azok 10

12 befolyásolhatják a receptorok számára rendelkezésre álló faktorok koncentrációját. Ez a helyzet TGF-ß és betaglycan (138, 139) FGF2 és perlecan, valamint syndecan (140) esetében is. FGF2 és VEGF 165 tirozin kináz receptorokhoz való kötődése erősen csökken, ha a sejtfelszíni HSPG mennyiségét heparinázos emésztéssel vagy a szintézis gátlásával redukálják (141, 142) valamint HSPG-hoz történő kötődésük megóvja őket bontóenzimek emésztésétől (143, 144). Ezenkívül szerepet játszhatnak a szignáltranszdukcióban önállóan vagy tirozin kináz receptorokhoz kapcsolódva (145, 146, 147). HSPG befolyásolni tudja növekedési faktorok intracelluláris sorsát is (148). Ugyanaz a növekedési faktor különböző HSPG-okhoz kapcsolódva eltérő hatást válthat ki, amint azt FGF2 és syndecan, betaglycan, valamint perlecan esetetében kimutatták (149, 150). Syndecan gátolja (151), míg a perlecan segíti (152) FGF2 indukálta endothelsejt proliferációt. További bizonyíték HSPG-k angiogén szerepe mellett, hogy tisztított perlecan fokozza a FGF2 által beindított angiogenezist (109), glypican segíti FGF1 és FGF2 FGFR-1-hez történő kötődését (94). Immobilizált syndecan-1 fokozza FGF2 indukálta endothelsejtek osztódását. Figyelemre méltó, hogy amint oldott heparin/hs blokkolja FGF2 FGFR-hez és HSPGhez történő kapcsolódását endothelsejtek felszínén (98), úgy oldott állapotú syndecan, glypican gátolja bfgf FGFR-hez történő kötődését (110) Ezen megfigyelés adott lendületet heparin/hspg származékok fejlesztésének, melynek célja ezek angiogenezis inhibitorként való felhasználása. A növekedési faktor recptorokhoz való kötődésének gátlása szintén hatásos eszköz lehet. Erre szolgál példával munkacsoportunk közleménye, mely szerint a HGF β- láncának két heparinkötő régiójából származó penta- és hexapeptiddel in vivo chorioallantois membránon végzett kísérletben szignifikáns angiogenezisgátlás volt elérhető. A hatás valószínűleg a heparinkötő endotheliális növekedési faktorok receptorhoz való kötődését segítő HSPG kötőhelyeinek kompetitív blokkolása révén jött létre (153). 11

13 Tumorasszociált erek fenotípusa Molekuláris endotheliális targetek azonosítása kiemelkedő fontosságú a tumorterápia szempontjából. A CD44 számos sejttípuson, mint a már említett T-limfocitákon is aktivációs markerként viselkedik. Amennyiben ez tumoros környezetben endothelsejteken is így lenne, úgy egy újabb célantigén lenne a birtokunkban, mellyel tumorok érhálózatát szelektíven támadhatnánk. A kérdés megválaszolására Griffioen és munkatársai vesetumorból és ép veseszövetből izoláltak endothelsejteket (89). Ezek expressziós profilját összehasonlítva azt találták, hogy a tumoros környezetből származó sejtek majdnem 4-szeres intenzitással fejezték ki a CD44 standard formáját, a variánsok közül csak a v5 és a v10 volt detektálható, - ezek is igen változó métékben-, míg egyéb endothelspecifikus antigének (CD34, ICAM-1, ICAM-2, CD31) expressziója csökkent vagy nem változott (230, 231, 232). Splice variánsokat nem detektáltak sem in situ immunhisztokémiai módszerekkel, sem frissen izolált, nyugvó HUVEC sejteken FACSszal. Aktiváció hatására (10 ng/ml bfgf) HUVEC-en jelentősen emelkedett a CD44s szintje és a variánsok közül a v5, v6, v7 és a v10 jelentek meg. RNS szinten a CD44s nyugvó sejteken is jelen volt, de a splice variánsok csak bfgf kezelés hatására íródtak át. Ilyenek a v5- v10 és a v3-as vagy a v4-es exont tartalmazó termékek voltak. Griffioen munkacsoportja tehát - Bennetthez hasonlóan - humán endothelen protein szinten nem talált alternatív akceptor hellyel bíró CD44 variánst, mely HS oldallánc megkötésére alkalmas lenne ( 89). Onkológiai kutatásaink során, prognosztikai faktorok azonosítása alkalmával felfigyeltünk arra, hogy mind a bőr, mind pedig a szem uveális melanómáiban a peritumorális és intratumorális erek nagy számban expresszálták a CD44v3-antigén. Lévén, hogy a melanoma malignum tumorsejtszigetei a peritumorális érhálóból kapják vérellátásukat (76), valamint a legfőbb endotheliális növekedési faktorok, - VEGF, bfgf és HGF mind képesek HSPG oldalláncán keresztül CD44v3-hoz kötődni (14, 77, 78). Feltételeztük, hogy az erősen angiogén peritumorális érháló kiserei megváltoztathatják fenotípusukat. Fentiek érdeklődésünket a CD44 v3 endotheliális kifejeződésének irányába terelték. 12

14 1.2.3 CD44 daganatokban, mint lehetséges prognosztikai faktor A CD44 a limfocita homingban betötött szerepének felfedezése után akkor élte reneszánszát, amikor kiderült róla, hogy egy bizonyos exonját nem metasztatizáló daganatsejtekbe transzfektálva, azokat áttétképző sejtekké alakítja. Nem metasztatizáló egér pankreászkarcinóma sejteket a CD44v6/v7 exonját tartalmazó génnel transzfektálva az áttétképzővé válik, hasonlóan a fenti exont ab ovo hordozó és metasztatikus fenotípussal rendelkező tumorsejtvonallal. (19, 20). Ezen túlmenően anti- CD44v6 antitesttel a nyirokérinvázió és metasztázis képződés in vivo gátolhatónak bizonyult (21). Azóta számos humán tumoron vizsgálták a CD44 variánsok exresszióját a túléléssel összehasonlítva, újabb prognosztikai fatorok, markerek után kutatva. Daganattípus Antigén Prognosztikai Megjegyzés, irodalom összefüggés kolonkarcinóma CD44v6 nincs összefüggés CD44v3 és heparináz rossz prognózis gyomorkarcinóma CD44v6 rossz prognózis differenciált > diffúz melanoma malignum CD44v3 rossz prognózis szervi áttét, CD44s rossz prognózis emlő karcinóma scd44v6 (szecernált) CD44s metasztázis, TNM rossz prognózis duktális és N pozitív endometrium karcinóma CD44v6 rossz prognózis 44, 45 urotheliális karcinóma CD44v8-10/CD44s rossz prognózis exfoliálódott sejteken 46 non-hodgkin limfóma vulva laphámkarcinóma szemhéj laphámkarcinóma CD44v6 scd44 (szecernált) rossz prognózis rossz prognózis high grade NHL: független faktor, CD44v6 rossz prognózis független faktor, 55 CD44v3 nincs összefüggés CD44v6 rossz prognózis M>0: CD44v6, 56 Míg eddig említett daganattípusokban a CD44 variánsok expressziójának - főleg a v6- nak - fokozódása rossz prognózissal társul, addig ez laphámkarcinómáknál, mint azt vizsgálataink is mutatják, nem egyértelmű. 1.3 A VAP-1 molekula szerkezete A VAP-1 biokémiai értelemben egy kd molekulasúlyú - két 84,6 kd molekulasúlyú, hat potenciális N-glikozilációs helyet tartalmazó alegységből álló - homodimer transzmembrán szialoglikoprotein., mely szemikarbazid szenzitív monoamin-oxidáz aktivitással bíró ektoenzim (155). 13

15 1.4 A VAP-1 biológiai szerepe VAP-1 limfoid-endothel sejt adhézióban, extravazációban betöltött szerepéről Antitumorális immunterápia egyik döntő eleme az effektor sejtek célba jutása. Ennek feltétele az endothel és limfociták közti kapcsolódás (tethering, rolling, adhézió), mely az extravazáció iniciális lépése. Irodalmi adatok szerint TIL-ek erős α4-integrin, LFA-1 és CD44 expressziót mutattak, ezzel szemben L-szelektin alacsony szinten fejeződött ki. A tumorerek az adhéziós molekulamintázat alapján aktiváció jeleit mutatták: emelkedett az ICAM-1, VCAM-1, E-szelektin és a PNAd expressziója. A TIL-ek szignifikánsan jobban kötődtek a tumor endothelhez, összehasonlítva szinovitisz és perifériás nyirokcsomó mintáival vagy mukóza asszociált limfoid szövet ereivel (MALT). Mivel a szinovitisz mintáiban ugyanazok az eddig megismert adhéziós molekulák expresszálódnak, mint a tumor-endothelen, fentiekből a szerzők arra következtettek, hogy a TIL-endothel adhézióban eddig le nem írt mechanizmusok, molekulák vesznek részt a leírtakon kívül. (154). A leírt vizsgálatok 1995-ben készültek. A VAP-1 molekula azóta került felfedezésre ugyanezen munkacsoport által. Kis mértékben különböző molekulasúllyal rendelkező VAP-1 molekulákat elsősorban érfal simaizom sejtjeiben és egyéb simaizmot tartalmazó szövetekben (156), valamint adipocitákon találtak. A molekula sziálsav oldalláncai alapvető fontosságúak a limfocitaadhézió mediációjában (157). Mint azt az adhéziós kísérletekből megtudtuk, az endotheliális felszín adhéziós molekulái közül a VAP-1 jelentős mértékben felelős limfoid sejtek endotheliális adhéziójáért (158). Fiziológiás körülmények között erek luminális felszínén, vagyis funkcionálisan aktív állapotban csak nyirokcsomók, tonsilla és Peyerplakkok HEV-jén, valamint májsinusoidokban expresszálódik. Az adhéziós kísérletek VAP-1-gyel transzfektált sejtvonalon a kapillárisok véráramlását szimuláló körülmények között zajlottak. A sejtekkel benőtt csövekben a fiziológiásnak megfelelő áramlásértéket állítottak elő (0,3-0,7 dyn/cm 2 ). Érdekesség és a megfigyelés élettani hitelessége mellett szól, hogy a limfociták nyíró erő, azaz áramlás hiányában 8-szor gyengébben tapadtak a VAP-1-gyel transzfektált patkány eredetű HEV-vonalhoz. A Ficollal szeparált buffy coat sejtjei közül legerősebben a T-killer sejtek kötődtek, 2,3- szer erősebben a T-helper sejteknél. Granulociták a perifériás vérből izolált limfocitákénál gyengébb kölcsönhatást mutattak. 14

16 A VAP-1-gyel transzfektált endothelsejtek szignifikánsan erősebben kötötték meg a limfocitákat, mint a kontroll (mock, génmentes vektorral végzett transzfekció). A T- killer sejtek adhéziója szignifikáns mértékben csökkenthető volt anti-l-szelektin és anti-cd18a/cd11 antitestekkel. Az interakciót tehát döntően L-szelektinek és αlβ2 integrinek mediálják. Ennek ellenére bizonyított, hogy a VAP-1 ligandja nem az L- szelektin, hiszen a VAP-1 képes L-szelektin negatív sejtek adhézióját, valamint szemben a PNAd-nel mind L-szelektin pozitív és negatív limfociták adhézióját közvetíteni. A VAP-1, az E-szelektin és a PNAd az áramlásnak kitett gyulladásban lévő endothel elsőként expresszálódó adhéziós molekulái (157). A fenti kísérletet anti-cd44 antitesttel is kivitelezték, mely a limfociták endothelhez történő adhézióját kétszeresére növelte. A T-sejtek felszínén lévő CD44 molekulák keresztkötése ezek szerint fokozta a VAP-1 ligandjának affinitását vagy expresszióját. Mint korábban bemutattuk, a limfociták célba jutásában, extravazációjában a folyamat egyes szakaszainak megfelelő ligandok és receptoraik játszanak szerepet. A limfociták L-szelektinje ligandjához - az endotheliális PNAd-hoz - átmenetileg kötődve a gördülő sejtet megállásra késztetik, míg a nyíróerőnek ellenálló, stabil adhézió már az α4 és β2 integrinek (LFA-1, VLA-4) és ligandjaik( VCAM-1 és MAdCAM-1) között jön létre (159, 160). Az intercelluláris transzmigrációban endotheliális ICAM-1,-2, limfocita β2- integrinek és a CD31 homotipikus adhéziójának tulajdonítanak jelentőséget. A VAP-1- nek az adhézió kezdeti fázisában tulajdonítanak szerepet. VAP-1 endotheliális expressziója és szerepe a gyulladásban Előbbi adatokból következik a kérdés: indukálható-e a molekula luminális megjelenése? Sejtkultúrában -, mint köldökzsinórvénából izolált endothelsejteken vagy emberi agyból izolált mikroendothelen (HBE, saját megfigyelés) - a tárgyalt antigén semmilyen gyulladásos mediátorral, citokinnel nem indukálható. Tonsillában a VAP-1 mind intracellulárisan, mind luminálisan expresszálódik. In situ körülmények között, - tonsilla szervkultúrában, egy a sejtkultúránál fiziológiásabbnak tekinthető mikromileuben a VAP-1 expressziója LPS, IL-4 és IFN-γ hatására fokozódik (161). A VAP-1 gyulladásban játszott szerepét, az antigén expresszióját in vivo is vizsgálták. Kísérletesen létrehozott akut dermatitisben szenvedő állatoknak intravénásan anti-vap- 1 antitestet injektáltak, majd a szövettani mintát vettek a dermatitis területéből. Az 15

17 antigén immunhisztokémia detektálása során csak szekunder és tercier antitestet alkalmaztak, így kizárólag az in vivo luminálisan megkötött anti-vap-1 antitestet hívták elő. Jelölés kizárólag a gyulladás területén volt látható, a gyulladásmentes zóna nem jelölődött. Az elemzést részben konfokális mikroszkópiával végezték, mely módszerrel az érfal endothel és simaizom rétege elkülöníthető. Bizonyos metszetekben a VAP-1 a simaizomsejtekre, pericitákra lokalizálódott. Radioaktív jelöléssel ellátott antitestekkel kimutatták, hogy az anti-vap-1 a gyulladás területén 10-szer magasabb koncentrációban kötődött az egészséges régiókhoz képest.(162) Az antitestakkumuláció a gyulladásos stimulus alkalmazását követően 60 perc múlva már detektálható volt, maximumát 8 óra múlva érte el, majd óra múltán csökkenni kezdett. Az antigén expresszió kinetikájából valószínűsíthető, hogy az intracellulárisan raktározódik és stimulus hatására transzlokálódik a sejtmembránba. De novo proteinszintézis ennél hosszabb időt igényelne. Az az időtartam, mely során a molekula sejtfelszínen expresszálódik arra enged következtetni, hogy az mind a polimorfonukleáris gyulladásos sejtek, mind pedig a limfociták célhoz juttatásában és transzmigrációjában szerephez jut. Úgy tűnik az antigén kifejeződése szervspecifikus, mert appendixben nem expresszálódik. Sejtfelszíni expressziójukat követően az endotheliális adhéziós molekulák enzim hatására leválnak és az extracelluláris térbe kerülnek vagy internalizálódnak. Kísérletek tanúsága szerint a VAP-1 esetében döntően ez utóbbi mechanizmus érvényesül, mely a már említett szempontokkal együtt lehetőséget teremtenek hatóanyagok gyulladás területére történő célba juttatására.( 162). VAP-1 tumorok erein Kiemelendő, hogy a VAP-1 molekula élettani körülmények között csak a máj vaszkuláris és szinuszoidális endotheljén jelenik meg luminálisan, ezért izgalmas kérdés, hogy tumorok vérellátását biztosító erek endotheljén hogyan alakul a VAP-1 expressziója. Ezidáig igen kevés publikáció látott napvilágot e témában. Hepatocelluláris karcinómában és kolorektális karcinóma májmetasztázisában, valamint fejnyaktumorokban vizsgálták VAP-1 viselkedését (167, 241). Mind hepatocelluláris karcinóma, mind normál májszövet vaszkuláris és sinusoidális endothelsejtjein a VAP- 1 expressziója szignifikánsan intenzívebb, mint kolorektális karcinóma májmetasztázisaiban, mely utóbbi gyakorlatilag negatív. Az endotheliális ICAM-1 16

18 kifejeződése hasonlóan alakul (241). Az említett elváltozások közül hepatocelluláris karcinómában magas, míg kolorektális karcinóma májmetasztázisaiban alacsony és inkább peritumorális lokalizációjú a limfoid infiltrátum. Kísérletek, melyekben PBL és TIL-ek tumorális endothelhez történő adhézióját vizsgálták, a HCC-ban szenvedő beteg sejtjeinek 3- és 5-szörös mértékű adhézióját igazolták kolorektális karcinóma májmetasztázisában szenvedő beteg sejtjeihez képest. A molekuláris mechanizmus tisztázása során a sejtek kitapadását sikeresen tudták gátolni anti-vap-1 és anti-icam antitestekkel. A fenti kísérletben tehát a limfoid infiltrátum mennyisége szorosan korrelált az endotheliális VAP-1 expresszió mértékével, ok-okozati összefüggést sejtetve. Fejnyaki tumorokban az intratumorális VAP-1 expresszió heterogénnek bizonyult és az immuneffektor sejtek (CD8 pozitív T-limfociták, LAK (limfokin (IL-2) aktivált killer), NK) endotheliális adhéziója nagy mértékben függött az endotheliális VAP-1 expresszió szintjétől (167), ezen kívül a VAP-1 expresszió intenzitása és a pozitív erek sűrűsége nem korrelált a dysplasia fokával(242). A VAP-1 molekula tehát olyan indukálható endotheliális aktivációs marker, mely nyirokcsomókon, mukóza asszociált szöveteken (MALT), gyulladásos folyamatokon kívül tumorokban fejeződik ki, így tumor targeting célpontja lehet, valamint a tumorellenes immunitásban is jelentőséggel bír. Mindezen irodalmi adatok fényében a disszetáció kutatási témáit az alábbiakban jelöltük meg. 1.5 Célkitűzések 1. A klinikai tapasztalat alapján a gége és a garat subrégióinak tumorai között lényeges prognosztikai eltérés mutatkozik. Munkacsoportunk arra a kérdésre próbált választ találni, hogy mi indokolja a hypopharyngeális tumorok lényegesen agresszívebb biológiai viselkedését, a glottikus illetve a szupraglottikus tumorokhoz képest. A kérdés megválaszolásához a tumorok un. metasztázis-asszociált molekuláinak protein szintű expresszióját vizsgáltuk: CD44, Nm23H1 és MMP2. 2. Fejnyaki tumorok progressziós markereinek kutatása közben immunhisztokémiai preparátumon figyeltük meg, hogy az intra/peritumorális 17

19 limfoid infiltrátum egyes sejtjei a tumorsejtek mellett szintén expresszálják a CD44v3 antigént. Így merült fel a kérdés, hogy a CD44v3 splice variáns megjelenése a T sejteken jellemezheti-e a tumor és az effektor sejtek kölcsönhatását, vagyis a limfociták aktiváltsági állapotát. 3. A daganat-indukált angiogenezis kulcskérdése a daganatos erek geno- és fenotípusa. Célul tűztük ki, hogy különböző daganatféleségekben megvizsgáljuk a daganatos erek CD44- és VAP-1 adhéziós molekula expresszióját in vitro és in vivo. 2. Anyag és módszer 2.1. Beteganyag Fej-nyaki daganatos beteganyag 12 laryngealis és hypopharyngealis tumorban szenvedő beteg 15 tumormintáját használtuk fel a metasztázis-asszociált gének vizsgálatára vonatkozó tanulmányunkhoz. Három esetben ismételt biopsziák történtek és mind a 15 tumormintát pathológiai vizsgálatnak vetettük alá. A betegek legfontosabb klinikai adatait beleértve a túlélést táblázatban mutatjuk be (1. táblázat). A G1, G2 és G5 jelű tumorok a laryngealis szabadszélből eredtek, sublaryngealis terjedéssel. A G6, G7 (1. ábra) és G9 jelűek előrehaladott állapotú laryngealis tumorok, melyek supralaryngealis vagy intralaryngealis terjedést mutatnak. A G9 jelű eset lokális inváziója során áttörte a pajzsporcot és a praelaryngealis izmok felé terjedt. A G3, G8 és a G4 tumorok supralaryngealis lokalizációjúak, melyek epilaryngealis felszínből eredtek (2. ábra). Lokális inváziójuk során a prae- epilaryngealis teret érintették és a laryngealis terjedés során a G3, 8-as daganat a hangszalagokat fixálta. A H1, H2, H3, H4, H5 és a H6 (3. ábra) jelű tumorok hypopharyngealisak, melyek a recessus piriformisból származnak. A H2, ill. H3 esetek a recessus piriformis laterális faláról indultak és a hypopharynx irányába terjedtek. A H1, H4, H5 és H6 jelű daganatok a teljes recessus piriformist kitöltötték és a hypopharynx lateralis falának egy részét infiltrálták. A primer tumorok méreteit táblázatban adtuk meg (2. táblázat). Az első mérőszám a legnagyobb vertikális kiterjedést a második a horizontális átmérőt mutatja. A daganatokat elsődlegesen sebészileg kezelték, melyet helyi besugárzás követett. 18

20 1. Táblázat. Fejnyaki laphámrákos betegek adatai. nem lokalizáció szövettan TNM recidíva metasztázis túlélés(hó) 1 G1 n GL SCCC T2N0M0 50-él 2 G2 f GL SCCC T2N0M0 46-él 3 G3,G8 f SGL SCCC T3N2M0 nyirokcsomó 32-él 4 G4 n SGL SCCC T2N0M0 42-él 5 G5 f GL SCCC T2N0M0 22-él 6 G6,G7 f GL SCCC T3N0M0 24-él 7 G9 n GL SCCC T4N0M0 lokális 5-elhunyt 8 H1 f HPH SCCC T3N2M0 nyirokcsomó 30-él 9 H2 f HPH SCCC T4N2M0 lokális 41- elhunyt 10 H3 f HPH SCCC T4N0M0 lokális 9-elhunyt 11 H4,H5 f HPH SCCC T4N0M0 lokális 8-elhunyt 12 H6 f HPH SCCC T4N3M1 tüdő 2-elhunyt 2. Táblázat. A vizsgált fejnyaki tumorok mérete Átmérő (cm) vertikális horizontális 1 G1 2,1 2,8 2 G2 1,7 2,6 3 G3,G8 3,9 3,2 4 G4 2,3 1,8 5 G5 1,8 2,2 6 G6,7 2,7 3,3 7 G9 2,5 4,1 8 H1 0,8 2,1 9 H2 0,6 0,8 10 H3 1 0,8 11 H4,5 1,2 1,8 12 H6 1 1,5 A tumor-infiltráló sejtek és a tumorális erek vizsgálata során további 17 glottikus rákot vizsgáltunk, ebből 9 hypopharyngeális míg 8 laryngealis lokalizációjú volt, így mindösszesen 32 glottikus rákot vontunk be tanulmányainkba. Humán melanomás beteganyag 28 különböző vastagságú malignus melanomában szenvedő beteg paraffinba ágyazott szövettani mintáját, valamint 3 nem tumoros mintát használtunk vizsgálatainkhoz. A SE Etikai bizottságának egyetértésével az 1975-ben kiadott és 1983-ban revideált Helsinki Nyilatkozattal egyetértésben történt. A két nem közel egyenlő szerepelt a vizsgálatban 19

21 (15 nő, 13 férfi), a követési idő minimum 29 hónap volt, maximum 181 hónap (3. táblázat). Fagyasztott szövettani anyag állt rendelkezésünkre 10 melanomás betegtől, és a 3 nem tumoros bőrelváltozásból. 3.táblázat: Melanomás betegek klinikai adatai Sorszám Breslow Túlélés Dg Nem Metasztázis 1 1,1 >181 ssm N NYCS 2 1,3 48E ssm N szervi 3 1,4 10E ssm F szervi 4 1,9 45E ssm N szervi E alm F szervi 6 2,3 31E ssm F szervi 7 2,4 59E ssm F szervi 8 2,6 23E ssm N szervi 9 2,8 8E ssm F szervi 10 2,8 86E alm N >72 ssm F NYCS E ssm N szervi 13 3,1 32E nm F szervi 14 3,4 >81 ssm F ,6 21E nm N szervi 16 3,7 >155 nm N ,8 14E ssm N szervi E ssm F szervi 19 5,2 85E nm N szervi 20 6 >29 nm N E ssm N szervi E ssm F szervi 23 7,5 >61 nm N E nm N szervi E nm F szervi 26 9,9 40E nm N szervi >57 ssm F NYCS E nm F szervi alm= akrolentiginózus melanoma, ssm= superficial spreading melanoma, nm= nodular melanoma, E= exitus, N= nő, F=férfi, NYCS= nyirokcsomó, túlélés hónapokban kifejezve 20

22 2.2. Sejtek, sejtvonalak Emberi T-sejtek és T-sejtvonalak A mononukleáris sejteket egészséges önkéntesek perifériás véréből Ficoll sűrűséggrádiens centrifugálással nyertük. A sejteket PBS-ben mostuk, ezt követően az adherens sejteket 10% FCS tartalmú RPMI 1640-ben 6 lyukú lemezen 37 o C-on 1 órás inkubációval vontuk ki. A T-sejt koncentrációt nylonvatta oszlopok alkalmazásával emeltük. A MOLT-4, CCRF-CEM és a Jurkat T-sejt leukémia vonalakat 10% FCS és gentamicin tartalmú RPMI 1640 médiumban tartottuk. A perifériás vérből izolált T- sejtket 10% FCS tartalmú RPMI 1640 médiumban 10 ng/ml PMA vagy OKT3 hibridoma felülúszóval (anti-cd3 antitestet tartalmaz) előkezelt 24 lyukú plate-en interleukin-2 (DuPont Med. Prod. Wilmington, DE) 100 U/ml koncntrációban történő felhasználásával aktiváltuk 24 illetve 48 órán keresztül. A 24 lyukú plate-et OKT3 hibridoma felülúszó 4%-os hígításával 3 órán keresztül 37 o C-on inkubáltuk, majd a lemezt PBS-sel történő háromszori mosás után használtuk. A CCRF-CEM és a MOLT- 4 sejteket 10 ng/ml koncentrációjú PMA-val 24 órán keresztül stimuláltuk. A cikloheximid protein szintézis inhibitort, illetve az endoplazmás retikulum-golgi transzportot gátló brefeldin A-t (165, 166) (Sigma, St Luois, MO) 10 μg/ml-s koncentrációban alkalmaztuk. Endothel sejtvonalak Az agyi mikrovaszkuláris endothel kultúra (HBE) Nagy Zoltán professzor (OPNI, Bp.) ajándéka. A sejteket D-MEM és HAM F12 médium 1-1 arányú keverékében tenyésztettük (mindkét médium Sigma, St. Luois, MO terméke), melyet 20% FCS-sel, 50 mg/ml streptomycinnel és 50 U/ml penicillinnel egészítettünk ki. A humán köldökvénából izolált endothelsejteket (HUVEC) a korábban már leírt módon izoláltuk és tenyésztettük (12, 92). Az endotélsejteket 20% FCSA, 0,1 mg/ml heparinnal, 10 μ/ml afgf-fel, 10 μ/ml bfgf, 15 μ/ml EGF, 2 mm glutaminnal, ECGS-sel (endotélsejt növekedési adalék), 100 U/ml penicillinnel és 100 μg/ml streptomycinnel kiegészített M199-es médiumban tenyésztettük. Transzformált humán endotheliális sejtvonal gyanánt Kaposi szarkóma immortalizált vonalát (KS Imm) (13, 169), 5% FCS-sel és antibiotikumokkal kiegészített RPMI-1640-ben (Sigma) tenyésztettük. 21

23 2.3.Immunhisztokémia Fejnyaki daganatok (CD44v3, Nm23, MMP2) A sebészi preparátum paraffin blokkjaiból készült metszeteket Superfrost tárgylemezre vettük fel, deparaffináltuk és mikrohullámkezeléssel antigén feltárást végeztünk. Az endogén peroxidáz aktivitást hidrogénperoxid (H 2 O 2 ) preinkubációval gátoltuk, míg a nem specifikus protein kötést 3% BSA/PBS 30 perces inkubációjával blokkoltuk. A CD44v6-ot illetve CD44v3-at monoklonális egér anti-cd44v6 illetve CD44v3 antitestekkel detektáltuk 1:100-as hígításban (R & D, UK). Az NM23H1 fehérjét egér monoklonális anti-nm23 antitest (Novocastra) 1:100-as hígításával detektáltuk. Primer antitestekkel a metszeteket 60 percen keresztül 37 o C inkubáltuk. 3% BSA-s PBS-sel történő mosás után az antitesteket biotin konjugált anti-egér vagy anti-nyúl IgG (DAKO) 1:200-as BSA-PBS hígításával és streptavidin-peroxidázzal (1:100 hígítás, DAKO) hívtuk elő. A peroxidáz enzim aktivitást AEC/H 2 O 2 vel illetve DAB szubsztráttal detektáltuk és ezt követően a metszeteket hemalaunnal vagy metilzölddel festettük. Az immunológiai reakciókat a pozitív tumorsejtek százalékos arányával quantitáltuk. Látóterenként száz tumorsejtet számoltunk és tumoronként három látóteret értékeltünk. A táblázatok legfelső sorában a nem tumoros epithelium pozitív sejtjeinek százalékos arányát viszonyítási alapul tüntettük fel. Melanoma malignum és glottikus daganatszövet (CD44v3) CD44v3 humán szövetekben történő expressziójának vizsgálatára bőr melanomájából, illetve glottikus daganatszövet sebészi beavatkozás során eltávolított mintáinak felhasználásával, a betegek előzetes tájékoztatása és azok beleegyezése után végeztünk vizsgálatokat. 5 μm vastag fagyasztott metszeteken végeztünk kettős jelölést nyúl antihumán α-laminin (1:50, DAKO, Glastrup, Dánia) és monoklonális anti-humán CD44v3 antitest 10μg/ml koncentrációjú hígításával párhuzamosan. A megkötött immunglobulint anti-nyúl TRITC cel (1:50, Jackson Immunoresearch Inc.), illetve biotinilált anti-egér IgG-vel, majd streptavidin-fitc-cel (mindkettő 1:100-ban) 22

24 detektáltuk. Magfestésre TOTO-3-at alkalmaztunk, 1:1000-ben történt hígítással (Molecular Probes, Eugene, OR). Az immunfloureszcenciát konfokális lézer mikroszkóppal vagy Spot Junior digitális kamerával ellátott hagyományos immunfluoreszcens mikroszkóppal elemeztük. Melanoma malignum (VAP-1) Az ereken történő VAP-1 expresszió meghatározására szekvenciális kettős jelölést alkalmaztunk: VAP-1/CD34, VAP-1/simaizom aktin, valamint CD34/ simaizom aktin alkalmazásával. Mikrohullámú antigén feltárás és a nem specifikus proteinkötések 3% BSA tartalmú PBS-sel történő blokkolása után a metszeteket monoklonális anti-humán VAP-1 vagy monoklonális anti-humán simaizom aktin antitesttel (1:100, DAKO) inkubáltuk. A megkötött IgG-t az LSAB2 tormaperoxidáz rendszer és vektor SG szubsztrát (sötétkék, Vector) felhasználásával detektáltuk. 10 perces desztillált vizes mosást követő 10 perces avidin oldattal történő blokkolás után antihumán CD34 monoklonális antitestet használtunk, melyet az LSAB2 alkalikus foszfatáz rendszerrel fukszin szubsztráttal és levamizol blokkolással (75 μg/2ml DAKO) hívtunk elő. Magfestést metilzölddel végeztünk. Mivel az adipociták a két antigén közül kizárólag a VAP-1 antitesttel jelölődnek, ezért ezt belső pozitív kontrollként használva a két rendszer közötti aspecifikus keresztkötéseket ki tudtuk zárni. 5 μm vastag fagyasztott melanoma metszeteken kettős jelölést végeztünk nyúl antihumán α-laminin (1:50, DAKO, Glostrup, Dánia) és monoklonális anti-humán VAP-1 (70 μg/ml, 167) antitestek felhasználásával. A megkötött immunglobulint anti-nyúl TRITC (1:50, Jackson Immunoresearch Inc, West Grave, Pennsylvania, USA) és biotinilált anti-nyúl IgG (1:100, Vector Laboratories Inc, Burlingame, California, USA), valamint streptavidin-fitc (1:100, Vector) alkalmazásával detektáltuk. A magfestést TOTO3 oldatával végeztük (1:1000 Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Az immunfloureszcenciát konfokális lézermikroszkóppal (MRC-1024, BioRad Laboratories GmbH, München, Németország) elemeztük. 23

25 2.4. VAP-1 immunelektronmikroszkópia 30 μm vastag fagyasztott metszeteket fixáltunk 4%-os paraformadlhidben 60 percig, majd PBS-ben mostuk ezeket 20 percen keresztül 3 alkalommal. A nem specifikus protein kötéseket 3% BSA tartalmú PBS-sel blokkoltuk 30 percig. A mintákat antihumán VAP-1 antitesttel inkubáltuk, a kötött IgG biotinilált anti-egér IgG-vel és streptavidin-peroxidázzal (mindkettő 1:100, Vector) hívtuk elő. A jelölt mintákat 1 órán keresztül 2,5%-os glutár-aldehidben fixáltuk. Utófixálást 1%-os OsO 4 oldatban és 0,05% kálium-ferrocianid tartalmú 0,05 mol/l koncentrációjú Na-cacodylát oldattal végeztünk 60 percig. Ezt követően a minta víztelenítése felszálló acetonsorban történt, a beágyazást Spurr-féle keverékkel végeztük VAP-1/CD34 és SMA/CD34 kettős jelölt szövettani preparátumok morfometriája Az intratumorális terület és a tumor-stroma határterület stromális ereit külön számoltuk. Utóbbi esetben azokat az ereket tekintettük stromálisnak, melyek a tumoros góc határán kívül helyezkedtek el és nem érintkeztek tumorsejtekkel. A peritumorális stromából a tumor-stróma határtól számított 200 μm-es sávot vizsgáltuk. 20-as objektívvel metszetenként minimum 4 látóteret elemeztünk, eredményként a VAP-1 illetve a simaizom aktin pozitív erek gyakoriságát adtuk meg, az összes CD34 pozitív ér százalékában A VAP-1 immunhisztokémia statisztikai analízise Egy szempontos variancia analízissel, Mann-Whitney teszttel ill. nagy elemszámú Wilcoxon elemeztük A CD44 expresszió mérése áramlásos citométerrel (FACS) T-sejtek T-sejtek és T-sejtvonalak sejtfelszíni antigén immunfluoreszcens jelölését fixálatlan sejteken 4 o C-on vagy 1%-os pufferolt paraformaldehid oldattal (PFA) történt fixálás 24

26 után végeztük. Intracellularis antigén detektálás előtt a sejteket 15 percig PFA-ban fixáltuk, majd 1%-os saponinnal 30 percen keresztül permeabilizáltuk. A jelölés szobahőmérsékleten zajlott. A nem specifikus antigén kötődést 1% BSA tartalmú PBSsel blokkoltuk. A sejteket 60 percen keresztül 10 mg/ml koncentrációjú primer antitest oldatban inkubáltuk. A monoklonális anti-cd25 antitestet a DAKO-cégtől (Dánia), az anti-cd44s, anti-cd44v3 és anti-cd44v6 antitesteket az R & D Systems-től (Abingdon, GB) vásároltuk. Izotípus kontrollként egér IgG2b, IgG2a és IgG1 antitesteket (Sigma) alkalmaztunk. A sejteket 3-szor mostuk PBS-ben, majd 60 percen keresztül FITC-konjugált kecske anti-egér IgG antitesttel inkubáltuk (1:70, Amersham, Little Chalfont, GB). Ezt követte PBS-sel történő háromszori mosás. A T-sejtek, illetve T-sejt subpopulációk azonosítására a sejteket phycoerithrin-nel (PE) konjugált monoklonális anti-cd3, anti-cd4 (Immunotech, Marseille, Fanciaország) (kontroll: PE-konjugált IgG1, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) vagy anti-cd8 Quantum Red (Sigma) antitestekkel inkubáltuk 30 percen keresztül. A fluoreszcenciát FACStar áramlásos citométerrel mértük (Becton Dickinson). Endothel sejteken A HUVEC-et 24 órán keresztül szérummentes médiumban, teljes médiumban, vagy 25 ng/ml koncentrációjú bfgf (Peprotec Inc., Rocky Hill, NJ) illetve 50 ng/ml koncentrációjú VEGF (Peprotec Inc., Rocky Hill, NJ) tartalmú szérummentes médiummal inkubáltuk. KS Imm sejteket TNFα (10 ng/ml) illetve PMA (10 ng/ml) és 4 % BSA tartalmú szérummentes médiumban inkubáltuk 36 órán át. A sejtfelszíni jelölés alkalmával a HUVEC-sejteket rövid tripszin-edta (Sigma) inkubációval mobilizáltuk, majd paraformadehid 1%-os oldatával 10 percen keresztül fixáltuk. Intracelluláris antigén-detektálás céljából a sejteket fixálásuk után 1%-os szaponin oldattal permeabilizáltuk 30 percen keresztül. A nem specifikus kötéseket 3%-os BSA tartalmú PBS-sel blokkoltuk. Ezt követően a sejteket anti-cd44v3 antitesttel vagy IgG 2 b-vel (izotípus kontroll) inkubáltuk, majd mostuk háromszor PBS-sel, ezt követően alkalmaztunk anti-egér-fitc másodlagos antitestet. A fluoreszcenciát FACStar áramlásos citométerrel mértük (Becton Dickinson). 25

27 2.8. Immuncitokémia (fluoreszcens mikroszkópia, konfokális mikroszkópia) T-sejtek A felszíni és a citoplazmatikus anti-cd44v3-mal jelölt T-sejteket Spot Junior CCD kamerával ellátott NIKON Eclipse-E600 epifluoreszcens mikroszkóppal (Optoteam, Bécs, Ausztria) képelemző szoftver felhasználásával vizsgáltuk (Diagnostic Instruments Inc. Sterling Heights, MI). Ezek jelölése megegyezik a T- sejtek áramlásos citometriai vizsgálatára történt jelöléssel. Egyes mintákat konfokális mikroszkóppal LaserSharp szoftverrel is elemeztük (MRC Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Németország). Ezekben az esetekben az anti-cd44v3 jelölt sejteket biotinilált anti-egér IgG-vel, ezt követően streptavidin- FITC-cel inkubáltuk (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) magfestést propidiumjodiddal (2 μg/ml, 1 perc) végeztünk. Kettős jelölés esetén a mintákat anti-cd3 antitesttel jelöltük, majd inkubáltuk biotinilált anti-egér IgG-vel és streptavidin-texas Red-del (Amersham). Endothel sejtek Az endothel sejteket bevonattal rendelkező fedőlemezekre helyeztük. HBE esetében az adhézióhoz a fedőlemezeket 10%-os patkányfarokból izolált kollagén oldattal vontuk be. A KS Imm esetében 16,5 μg/ml (Sigma) koncentrációjú fibronektint, a HUVEC sejtek adhéziójához 1%-os zselatin oldatot használtunk. A HUVEC-et 24 órán keresztül inkubáltuk szérummentes, vagy komplett médiumban, ill. kezeltük 25 ng/ml bfgf ill. 50 ng/ml VEGF tartalmú szérummentes médiummal (Peprotec Inc., Rocky Hill, NJ). A HBE sejteket háromféle képpen kezeltük: 36 órán át 4% BSA-tartalmú szérummentes médiummal, 48 órán keresztül KS Imm sejtek kondicionált médiumával vagy pedig komplett médiummal. A KS Imm sejteket 36 órán át 4% BSA-tartalmú szérummentes médiummal, vagy pedig teljes médiummal kezeltük. A sejteknek a kitapadáshoz 24 óra állt rendelkezésükre, PBS-sel történő mosás után a sejteket 1%-os paraformaldehid oldattal vagy pedig aceton és metanol 1:1 arányú keverékével fixáltuk 10 percen keresztül, melyet 3% BSA-s és 50%-os kecskeszérumos blokkolás követett 20 percen keresztül, melynek célja az aspecifikus protein kötődés gátlása volt. A sejteket a 26

28 következő antitestekkel inkubáltuk: monoklonális anti CD44v3, anti CD44S (R&D Systems, Abingdon, GB) és nyúl-antihumán MMP-2 antitest (Research Genetics, Huntsville, AL) 60 percen keresztül szobahőmérsékleten 3 % BSA tartalmú PBS 1:100 arányú hígításával. A megkötött IgG-t első lépésben biotinilált ló anti-egér IgG-vel, második lépcsőben pedig streptavidin-fitc, valamint antinyúl-tritc (Jackson Immunoresarch Inc.) 1:50 hígításával detektáltuk. A HUVEC esetében FITC-konjugált anti-egér másodlagos antitestet használtunk. Izotípus kontroll gyanánt egér IgG2 (Sigma) antitestet használtunk. A sejteket minden lépés után 3x mostuk 5 percen keresztül PBS-ben. Vectashield-del történő fedés előtt (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) a fedőlemezeket desztillált vízzel mostuk. A sejteket konfokális lézermikroszkóppal (MRC 1024, BioRad Laboratories GmbH, München, Németország) illetve hagyományos epifluoreszcens mikroszkóppal (Nikon E600, Nikon, Tokyo, Japán) vizsgáltuk. Mindkét mikroszkóp rendelkezett fáziskontraszt üzemmóddal CD44 Western blot A sejteket mintapufferrel oldottuk fel 5x10 6 ml koncentrációban, 5 percig főztük és 2,5x10 5 sejtnek megfelelő adagot vittünk fel 8% SDS-poliakrilamid gélre (Mini- Protean II Cell, Bio-Rad Laboratories). A fehérje blottolásához Mini-Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories) készüléket, PVDF membránt és 130 percen keresztül 200 ma áramerősséget alkalmaztunk. A blottot ezután 7,5 ph értéken 0,2% hidrogén peroxid tatalmú 0,1 M Tris oldat és 20%-os metanol keverékével kezeltük 30 percen keresztül, majd blokkoltuk 2% BSA, 5% sovány tejpor, 0,1% Twin20 és 150 mm NaCl tartalmú 7,9 ph értékű 10 mm Tris pufferrel 1 órán keresztül. A primer antitesteket blokkoló pufferrel 1 mg/ml koncentrációra hígítottuk és 4 o C-on 1 éjszakán keresztül alkalmaztuk. Ezt követően a blottokat biotinilált anti-egér IgG-vel (1:1500, 1 óra), majd streptavidintorma-peroxidáz oldatával (1:3000, 1 óra) (mindkettő Vector Lab.) inkubáltuk. A membránokat 4 alkalommal TBS pufferrel mostuk minden inkubációs lépést követően. Negatív kontrollként Jurkat-sejtek egyenlő mennyiségű lizátumai szolgáltak. 27

29 2.10. Sejtmigráció A migrációs assay-t Boyden-kamrában kiviteleztük, mint ahogy azt korábban mások leírták (13, 169). Zselatin 5 mg/ml koncentrációjú oldatával bevont polivinil-pirrolidonmentes polikarbonát filtert használtunk 12 nm-es pórusmérettel. A HUVEC sejteket anti-cd44v3 vagy IgG2b antitestek 20 μg/ml-es koncentrációjú oldatával 2 órán keresztül szobahőmérsékleten preinkubáltuk. Mosás után az endothelsejteket 0,1%-os BSA tartalmú szérummentes médiumban a felső kompartmentbe helyeztük. Az alsó kompartmentet 10 μg/ml koncentrációjú VEGF-fel kiegészített NIH3T3 sejtek felülúszójával vagy pedig negatív kontroll gyanánt szérummentes médiummal töltöttünk meg. A kamrákat ezután 37 o C-on 5%-os CO 2 -ban 6 órán keresztül inkubáltuk. A kísérlet befejeztével a filter tetején lévő sejteket mechanikusan eltávolítottuk, majd 5-10 random kiválasztott látótér sejtjeit számoltuk össze festés után. A kísérletben 3 párhuzamost alkalmaztunk RT PCR 10 7 transzformált T-sejtből vagy A431, HBE, HUVEC és Kaposi szarkoma sejtvonalak konfluens 25 cm 2 felületű tenyészetéből izoláltunk teljes mrns-t, a gyártó utasításai alapján (TRI REAGENT TM, Sigma). A reverz transzkripcióhoz a teljes mrns-ből 1 μg-ot használtunk, melyet 1 µl 10 mm-os dntp, 1 μl oligo dt és 7 μl nukleázmentes víz keverékéhez adtunk. A keveréket centrifugáltuk és 70 o C-on inkubáltuk 10 percig. A csöveket ezután jégre helyeztük és a következő komponenseket adtuk hozzá: 4 μl 5- szörös standard puffer, 2 μl 0,1 M-os DTT (10 mm végkoncentrációhoz), 1 μl M-MLV reverz transzkriptáz (200 egység/ μl, Sigma), 0,5 μl ribonukleáz inhibitor (40 egység/ μl), 2,5 μl nukleázmentes víz, 20 μl végtérfogatig. A keveréket 37 o C-on inkubáltuk 50 percen keresztül. A procedúrát a reverz transzkriptáz o C közötti hő általi denaturációja követte. A cdns-s termék 2 μl-ét amplifikáltuk, a CD44 standard régió 5 (AGT CAC AGA CCT GCC CAA TGC CTT T) és v3 exon 3 primerét (GGT GTC TGT CTC TTT CAT CTT CAT TTTCTT CAT TT), a v3 exon 5 (GGG AGC CAA ATG AAG AAA ATG AAG ATG AAA G) és standard régió 3 (TTT GCT CCA CCT TCT TGA CTC CCA TG), illetve β-aktin primereit használva. A PCR amplifikációt 25 μl-es reakciótérfogatban kiviteleztük, mely 1,5 mm magnéziumklorid tartalmú 10x-es 28

30 PCR puffer (DyNAzyme TM, Finnzyme) 2,5 μl -ét, 2,5 mm nukleotid/dntp mix (DyNAzyme TM, Finnzyme) 2 μl-ét, minden primer (10 pmol/ μl) 2,5 μl-ét, 13,1 μl vizet és DNS polimeráz (2 U/ μl DyNAzyme TM, Finnzyme) 0,4 μl-ét tartalmazta. A reakciókat Eppendorf Mastercycler gradiensen kiviteleztük. Az amplifikációs folyamatot 12 perces 94 o C-os inkubációval indítottuk, ezt követően 35 cikluson a következő szekvencia ment végbe: 94 o C-on 30 másodperc, 65 o C-on 30 másodperc, először 72 o C-on 120 másodperc. A folyamat végén 10 percen keresztül 72 o C-on inkubáltunk. A negatív kontroll reakciói a fent leírtakkal azonos módon zajlottak, természetesen reverz transzkripció nélkül. A termékek valódiságát szekvencia analízissel igazoltuk. 29

31 3. Eredmények 3.1. A CD44v3, v6, NM23H1 és az MMP2 expressziója fejnyaki daganatokban 15 laryngealis és hypopharyngealis tumoros mintát szerepelt tanulmányunkban (1. táblázat). A szövettani diagnózis minden esetben laphámsejtes karcinóma volt. A lokalizációt tekintve 9 esetben laryngealis és 6 esetben hypopharyngealis tumorról volt szó. A stádium meghatározását a UICC protokoll alapján végeztük. Beteganyagunkban a férfiak voltak túlsúlyban. A laryngealis tumorok többsége T2 (4/7), míg a többi T3 és egy eset T4 stádiumú volt. Fatális kimenetelűnek csak ez utóbbi T4-es eset bizonyult. Megdöbbentő volt látni azonban, hogy a hypopharyngealis tumorok mind T4 stádiumban kerültek felismerésre, egy esetet kivéve (1. táblázat) és az öt hypopharyngealis eset közül a követési idő végét csak egy beteg élte meg. 1. ábra. Gége keresztmetszete. A pontozott terület a hangszalagból kiindult (glottikus) tumort jelzi. A laryngealis epithelium a basalis és spinocellularis rétegben az intercellularis junctiok területén mutatott CD44v6 pozitivitást (2.A ábra). CD44v6 immunreakció intenzitása 30

32 változó volt a daganatokban; egyes esetekben jelen volt a junctionalis területeken (2.B ábra), de máskor hiányzott. 2. ábra. CD44v6 (A,B) és v3 (D,E) expresszió gége ép (A,D) és tumoros (B,E) szövetében A gége ép laphámsejtes epitheliuma intenzív CD44v3 jelölést mutatott, mely a basalis és spinocellularis réteg intercellularis junctioinak területeire lokalizálódott. A sejtek keratinizációjával párhuzamosan a jelölés gyengült, illetve negatívvá vált (2.D ábra). Az ép szövetben mind NM23H1 és az MMP2 immunreakció negatívnak mutatkozott. A CD44v3 expressziója karcinómákban szintén heterogénnek bizonyult, főleg a basospinocellularis területeken jelentkezett. Mind a pozitív sejtek aránya, mind a jelölés intenzitása az egyes tumorok között igen változó volt (2.E. ábra). Az NM23H1 expresszió szempontjából a daganatokat pozitív (3.B ábra), illetve negatív (3.A. ábra) esetekre osztottuk. Az NM23H1 protein az epithelsejtek citoplazmájára lokalizálódott, a limfociták belső pozitív kontrollként szolgáltak (3.A. ábra). A pozitív tumorok között voltak olyanok, amelyek az antigént gyengén, ill. erősen expresszálták. 31

33 Utóbbi csoportba azokat soroltuk, melyeknek sejtjei legalább 50%-ban kifejezték az NM23H1 proteint. 3. ábra. NM23H1 protein expresszió gégettumorban. A: negatív gégerák, B: pozitív gégerák. Az MMP2 fehérjét csak ritkán sikerült azonosítanunk a daganatsejtekben és az főleg az elszarusodó laphámsejt fészkek sejtjeinek citoplazmájára lokalizálódott (4. ábra). Ezen kívül stromális sejtek (fibroblasztok és hisztiociták) rendszeresen intenzív reakciót mutattak. 4. ábra. Fejnyaki daganatok MMP2 exprssziója. A bal oldali képen negatív tumor, jobb oldalon MMP2 pozitv tumor látható, barna reakció mutatkozik tumorsejtek citoplazmájában. Utóbbi képen jól látható az intratumorális expresszió heterogenitása. A 15 esetből hét az ép epithelium fenotípusát mutatta (CD44v3 pozitív/nm23h1 negatív/mmp2 negatív) (4. táblázat). Ezek közül csak egyetlen esetben mutatkozott MMP2 pozitivitás. 15 mintából 9 esetben csökkent a CD44v3 expressziója a normál 32

34 epitheliumhoz viszonyítva, míg 8 esetben jelent meg az NM23H1 fehérje. A tumorok kisebb hányadában (15 esetből hatban) mutatkozott szórványos MMP2 pozitivitás a tumorsejtekben. TNM beosztás és a fenotípus korrelációja Amikor a tumorokat TNM kategóriákba soroltuk (4. táblázat) megfigyeltük, hogy a T2 és T3 esetek fenotípusa igen hasonló és jellemezhető a CD44v3 csökkent, de szignifikáns kifejeződésével és esetenkénti MMP2 pozitivitással. A T4-es kategóriában a csökkent CD44v3 expressziót mutató tumorok gyakorisága nem különbözött jelentősen a többi stádiumban megfigyelttől, de mind az NM23H1 és az MMP2 pozitív tumorok gyakrabban fordultak elő ebben a kategóriában (5/6, illetve 4/6). Nem találtunk korrelációt a nyirokcsomó pozitivitás és az egyes markerek expressziója között. 4.táblázat. Fejnyaki rákok metasztázis-asszociált markereinek expressziója. A számadatok a daganatsejtek pozitivitásának %-os arányát mutatja. Stage CD44v3 NM23 MMP2 ép epithel G1 T2N0M G2 T2N0M G4 T2N0M pozitív G5 T2N0M eset 3/4 csökkent 1/4 nőtt 1/4 nőtt G7 T3N0M G6 T3N0M G3 T3N0M H1 T3N2M pozitív G8 T3N2M eset 3/5 csökkent 2/5 nőtt 1/5 nőtt G9 T4N0M H5 T4N0M pozitív H3 T4N0M H4 T4N0M pozitív H2 T4N2M pozitív H6 T4N3M pozitív 6 eset 3/6 csökkent 5/6 nőtt 4/6 nőtt Anatómiai lokalizáció és a fenotípus kapcsolata Amikor ezen daganatokat anatómiai lokalizációjuk szerinti kategóriákba soroltuk, függetlenül azok stádiumbeosztásától (5. táblázat) az egyes markerek kifejeződése 33

35 jellegzetesebbé vált az adott kategóriára. A laryngeális tumorok T2 stádiumú eseteiben csökkent a CD44v3 expressziója és csak esetenkénti NM23H1 és MMP2 kifejeződés volt megfigyelhető. A laryngealis tumorok T3 stádiumú eseteiben csökkent CD44v3 mellett nőtt az NM23H1 pozitív tumorok gyakorisága. A hypopharyngealis tumorok esetében a CD44v3 expresszió csökkenése kevésbé volt kifejezett, de az NM23H1 pozitív esetek gyakoriságán kívül az MMP2 pozitivitás fémjelezte őket. 5. táblázat. A metasztázis-asszociált markerek és a tumor loklaizációjának kapcsolata. Az adatok a + tumorsejtek %-os arányát jelzik. lokalizáció térfogat (cm 3 ) CD44v3 NM23 MMP2 ép epithel G1-T2 6, G2-T2 3, G4-T2 3, pozitív G5-T2 3, T2 4,5+-0,7 3/4 csökkent 1/4 nőtt G6-T G7-T3 12, G3-T G8-T3 17, G9-T4 26, /4 nőtt T3/4 18,7+-4,0 3/5 csökkent 2/5 nőtt 0/5 nőtt laryngeális összesen 6/9 csökkent 3/9 nőtt 1/9 nőtt H1-T3 0, pozitív H2-T4 1, pozitív H3-T4 3, H4-T pozitív H5-T4 1, pozitív H6-T4 0, pozitív hypopharyngeális összesen 1,54+-0,48 3/6 csökkent 5/6 nőtt 5/6 nőtt 34

36 3.2. CD44v3 és T-sejtek CD44v3, v6 expresszió humán T-sejteken A már tárgyalt tanulmány során figyeltünk fel arra, hogy a vizsgált inváziós markerek közül a CD44v3 nemcsak a tumorsejtfészkekben, hanem a limfoid infiltrátum sejtjein is epresszálódik. Összesen 32 eset vizsgálata alapján mind a laryngeális, mind pedig a hypopharyngeális daganatok eseteinek körülbelül 50 %-ában volt megfigyelhető CD44v3 pozitív TIL. Adataink szerint a TIL populációt a T- és B- sejtek 50-50%-ban teszik ki. A T-sejtek megközelítőleg 50%-a CD8 pozitív (6. táblázat). 6. táblázat. Tumor infiltráló mononukleáris sejtek CD44v3 expressziója. A számok esetszámot jelentenek (+/-TIL/összes eset) CD44v3 TIL+ TILfej-nyaki rák 17/32 15/32 laryngeális 13/23 10/32 hypopharingeális 4/9 5/9 CD44v3 expressziója humán perifériás vérből izolált T-sejteken CD44 standard formájának illetve CD44v3 és CD44v6 variánsát tartalmazó izoformáinak expresszióját tanulmányoztuk humán perifériás vérből izolált, nylon gyapottal dúsított T-sejteken áramlásos citometria alkalmazásával. A T-sejtek azonosítására anti-cd3 antitestet használtunk, míg anti-cd25 (IL-2 receptor) antitestet az aktiváció monitorozására alkalmaztunk. Mint ahogy már számos szerző (73, 189, 190, 223) közölte, aktiválatlan T-limfociták a CD44 standard formáját expresszálják felszínükön, míg a variáns izoformák kifejeződése immuncitokémiailag nem volt detektálható (5., 6.A, 7.A ábra). A sejtek anti-cd3 antitesttel és interleukin-2-vel vagy forbol-észterrel (PMA) történt in vitro aktivációja a CD44 standard formájának valamint a CD44v3 és CD44v6-ot hordozó epitopjainak fokozott felszíni expresszióját eredményezte (5., 6.A és 7.B ábrák). Konfokális mikroszkóppal készült felvételek tanúsága szerint a CD44v3 véletlenszerű sejtfelszíni receptor aggregátumok formájában jelenik meg (7.C, D). A v3 reakció sejtfelszíni intenzitása 24 órás T-sejt aktivációt követően a CD44v6 expressziójának intenzitásával azonos mértékűnek bizonyult (6.A ábra), és nemcsak a jelölés intenzitása, de a pozitív sejtek aránya is hasonló volt a két antigén tekintetében. Forbol-észter aktivációt követően 40-70% közötti, anti-cd3 + IL- 35

37 2 kezelés után 20-50% közötti volt a pozitív sejtek aránya, mind a két variáns esetében. A PMA hatását humán T-sejt leukémia vonalakon is tanulmányoztuk (MOLT-4 és CCRF-CEM). Mindkét splice variáns hiányzott a felszínről stimulálatlan MOLT-4 sejteken, míg az expresszió igen alacsony szintje volt detektálható CCRF-CEM sejteken. PMA kezelést követően mind a CD44v3, mind a CD44v6 expressziója emelkedett mindkét sejtvonalon (6.B). Az in vitro aktivált T-sejteken megfigyelt CD44v3 antigén expresszió átmenetinek bizonyult, hasonló kinetikát mutatva, mint a CD44v6 esetében, melyet már korábban leírtak (190). Az expresszió csúcsa 24 és 48 óra közé esett (8. ábra). MOLT-4 illetve CCRF-CEM sejtvonalak esetében hasonló eredményre jutottunk. A T-sejt subpopulációk azonosítására anti-cd4, illetve anti-cd8 antitesteket alkalmaztunk. Ezek segítségével kimutattuk, hogy T-sejteken a fokozott CD44v3 expresszióért elsősorban a CD4+ subpopuláció felelős (9. ábra). 5. ábra. 24 órás PMA vagy anti-cd3+il-2 kezelést követő felszíni CD44v3 expresszió vizsgálata áramlásos citometriával CD3 pozitív sejtekre kapuzva. A sejteket anti-cd44v3, anti-cd25 (az aktiváció 36

38 pozitív kontrollja) és IgG 2 b (izotípus kontroll) antitesttel jelöltük. Az adatok 6 független kísérlet reprezentatív eredményei. 6. ábra. Nyugvó, 24 órás PMA vagy anti-cd3+il-2 kezelést követő felszíni CD44v3 és CD44v6 expresszió vizsgálata áramlásos citometriával T-sejteken (A) és stimulálatlan vagy 24 h PMA-aktivált T- sejt leukémia vonalakon (B). Az eredmények az átlagos fluoreszcencia intenzitást mutatják az izotípus 37

39 kontroll levonása után. (A) Az értékek az átlag+-sd-t mutatják 5 független kísérlet alapján, (B) Az értékek két kísérlet reprezentatív eredményét mutatják. 7. ábra. CD44v3 immunfluorescencia lokalizációja T-sejteken. (A) Nyugvó T-sejtek felszíni jelölése. A specifikus jelölés hiányzik (zöld). Vörös: magfestés (propidium jodid); 700x. (B) PMA-aktivált T-sejtek felszíni jelölése. A sejtek többsége intenzív felszíni zöld jelölést mutat; 700x. (C) PMA-aktivált T-sejtek felszíni jelölésének konfokális mikroszkópos képe. Véletlenszerűen elszórt fluoreszcens jel; 2800x. (D) PMA-aktivált CD44v3 és CD3 kettősjelölt T-sejtek konfokális mikroszkópos képe (felszín). Zöld (CD44v3) és vörös (CD3) fluoreszcencia szuperponált képe. A kettős jelölés a CD44v3 antigén CD3 pozitív sejteken való jelenlétéről tanúskodik; 1500x. (E) CCRF-CEM sejtek intracelluláris CD44v3 jelölése. Konfokális mikroszkópos felvétel. CD44v3 tartalmú tubulusok és vezikulák polarizált perinukleáris lokalizációban. Magfestés (vörös) és CD44v3 (zöld) fluoreszcencia szuperpozíciója; 2800x. 38

40 8. ábra. A CD44v3 és CD44v6 expresszió kinetikája PMA (A) vagy anti-cd3+il-2 (B) kezelés hatására humán T-sejteken. A sejteket a 2. ábránál leírtak szerint jelöltük és vizsgáltuk. Az adatok két független kísérlet reprezentatív eredményei. 9. ábra. Nyugvó és anti-cd3+il-2-vel aktivált T-sejt altípusok felszíni CD44v3 expressziója. A sejteket a 2. ábránál leírtak szerint jelöltük és vizsgáltuk. Az adatok három független kísérlet reprezentatív eredményei. 39

41 Humán T-sejteken és T-sejt vonalakon a CD44v3 expressziója konstitutív Annak érdekében, hogy v3, illetve v6 exon által kódolt epitopokat hordozó izoformák intracellularis expresszióját a perifériás T-sejtek, illetve T-sejtvonalakon tanulmányozni tudjuk, az immunreakciót formaldehid fixált és permeabilizált sejteken is elvégeztük. A nyugvó T-limfociták intenzív intracellularis CD44v3 pozitivitást mutattak, míg CD44v6-ra negatívnak bizonyultak (10.A ábra). Konfokális mikroszkóppal és optikai szeleteléssel megállapítottuk, hogy a CD44v3 intracelluláris raktára egy tubulovezikuláris perinukleáris struktúra formájában mutatkozik (7.E. ábra). A CCRF- CEM és a MOLT-4 T-sejtvonalak vizsgálata hasonló, rögös intacelluláris jelet adott CD44v3 jelölés alkalmával (10.B. ábra). Ezek az eredmények a v3 exon tartalmú CD44 variánsok konstitutív proteinexpressziójára utaltak. Ezt a felvetést RT-PCR vizsgálat is alátámasztotta: a két sejtvonal a CD44v3 exon mrns-ének konstitutív expresszióját mutatta (11.A. ábra). A PCR termékeket szekvencia analízissel azonosítottuk. A fő PCR termék mellett, - mely 346 bázispár hosszúságú, a variábilis exonok közül csak a v3-at tartalmazza (direkt hasított v3 exon), és amely mindkét sejtvonalban jelen van -, a CCRF sejtekben egy nagyobb terméket is azonosítani sikerült, mely 475 bázispár hosszúságú és valószínűleg a v2 és v3 exont reprezentálja. Western blot analízis során a MOLT-4 és CCRF-CEM sejtvonalak lizátumából egy igen erős 120 kda-os és egy gyengébb, kb. 180 kda-os terméket sikerült kimutatni (11.B ábra). Egy másik kísérlet során azt találtuk, hogy a T-sejtek 15 perces forbol-észter (PMA, protein kináz C direkt aktivátora) kezelése egyik CD44 variáns felszíni expresszióját sem indukálta, szemben a hat órás kezeléssel. Az említett megfigyelés azt sugallta, hogy a vizsgált variánsok sejtfelszíni expressziójához de novo protein szintézis szükséges. Ezt a feltételezést alátámasztandó, 6 órás PMA kezelést alkalmaztunk proteinszintézis gátló cycloheximid jelenlétében. A 12.A ábrán látható, hogy a CD44v3 variánsának PMA általi sejtfelszíni indukciója cycloheximid hatására nem következett be. Ugyanez a hatás volt megfigyelhető a CD44v6 esetében is, míg a sejtfelszínen konstitutívan jelenlévő CD44s expresszióját a cycloheximid nem befolyásolta. Amikor a T-sejteket brefeldin A-val (168, 169) kezeltük, mely hatóanyag az endoplazmatikus retikulum felöl a Golgi felé történő protein transzlokációt gátolja, a PMA-indukált sejtfelszíni CD44v3 expresszió fokozódás szintén elmaradt (12.B ábra). 40

42 10. ábra. Nyugvó és anti-cd3+il-2-vel aktivált T-sejtek, illetve T-sejt vonalak felszíni és intracelluláris CD44v3 és CD44v6 expressziójának összehasonlítása. A sejteket a 2. ábránál leírtak szerint jelöltük és vizsgáltuk. Az adatok három kísérlet átlagát+-sd reprezentálják. 41

43 kda 120 kda 11. ábra. A CD44v3 expresszió detektálása MOLT-4 és CCRF-CEM sejtekben RT-PCR (A) és Western blot (B) által. (A) cdns mintákat CD44v3 és GAPDH specifikus primerekkel amplifikáltuk. 1. oszlop: negatív kontroll, 2. oszlop: kezeletlen MOLT-4, 3. oszlop: PMA stimulált MOLT-4, 4. oszlop: kezeletlen CCRF-CEM; 5. oszlop: PMA stimulált CCRF-CEM. (B) 1. oszlop: negatív kontroll, 2. oszlop: MOLT-4, 3. oszlop: CCRF-CEM. 12. ábra. Cikloheximid (A) és brefeldin A (B) hatása PMA indukálta CD44v3 expresszióra T-sejteken. A sejteket PMA-val kezeltük 6 órán (A) vagy 15 percen (B) keresztül cikloheximid (CY) (A) vagy brefeldin A (BFA) (B)hiányában illetve jelenlétében. A sejteket a 2. ábránál leírtak szerint jelöltük és vizsgáltuk. Az adatok négy kísérlet átlagát+-sd (A) vagy 2 független kísérlet eredményeit reprezentálják. 42

44 3.3. Tumorasszociált erek fenotípusa CD44v3 expressziója humán endothel sejteken RT-PCR Három sejtvonalat vizsgáltunk reverz PCR-rel a CD44s regió specifikus 5 és CD44v3 exon specifikus 3 primerrel, mellyel a CD44v3 konstitutív expresszióját találtuk két humán endothelkultúrákban (HUVEC és KS-Imm). Ezekkel szemben humán az agyi mikroendothel (HBE) primer kultúrájának korai passzázsából származó minta negatív eredményt adott (13. ábra). A körülbelül 347 bázispár hosszú PCR-terméken kívül (v3), mely mindkét pozitív mintában jelen volt, egy nagyobb termék is megjelent (hozzávetőleg 476 bázispár), mely valószínűleg a v3+v2 együttes átítródásának felel meg. (Ezt az izoformát találtuk T-sejt vonalakban is.) A v3-specifikus 5 primer és a CD44 standard régióra specifikus 3 primer a két említett pozitív mintában egy terméket eredményezett (193 bázispár), jelezve egyéb variábilis exonok (v4-10) hiányát. A termékeket szekvenálással azonosítottuk. A CD44v3 hasonló splice mintázata a KS- Imm sejteken és HUVEC-en azt mutatja, hogy a KS-Imm sejtek a normál endothelhez hasonlóak, amit egyéb markerek expressziója (mint a CD34 vagy a F-VIII) is igazolt (170). 13.ábra. Humán endothelsejtek CD44v3 mrns expressziójának detektálása in vitro RT-PCR-rel. HBE: 1-3. oszlop; HUVEC: 4-6. oszlop; KS-Imm: 7-9. oszlop. 1.,4., 7. oszlop: ß-actin; 2.,5.,8. oszlop: s- 5 +v3-3 primerek; 3.,6.,9. oszlop: v3-5 +s-3 primerek; 10. oszlop: molekulasúlymarker; 11. oszlop: H 2 O. 193bp= v3 + CD44s-5, 347bp= v3 +CD44s, 476bp= v2 + v3 + CD44s. A CD44v3 fehérje immunhisztokémiai vizsgálata humán endothel sejteken CD44v3 proteinexpressziót szintén normál (HUVEC) és transzformált (KS-Imm) humán endothelen tanulmányoztuk. Permeabilizált HUVEC-en az intracelluláris lokalizáció diffúz citoplazmatikus mintázatot mutatott, mely a sejtek többségét 43

45 jellemezte (14.A és B ábra). A sejtfelszíni jelölés gyengébb volt és csak a sejtnyúlványokra koncentrálódott (14.C és D, 15 A,B ábra). KS-Imm sejteken az antigén lokalizációja a citoplazmában vezikuláris volt (16.A és B. ábra), míg a felszíni jelölés kis, laterális membrándoménekre korlátozódott (16.C és D ábra). 14. ábra. Konfokális mikroszkópia: CD44v3 fehérje lokalizációja HUVEC immuncitokémiában. (A) Intracelluláris lokalizáció permeabilizált sejtekben. Perinukleáris és citoplazmatikus vezikuláris zöld jel. (B) Fáziskontraszt kép. (C) PFA- fixált sejtek felszíni jelölése. Sejtnyúlványon körülírt membránjelölés. (D) Fáziskontraszt kép. 1200x-os nagyítás. 15. ábra. Kitapadt HUVEC sejt felszini CD44v3 expressziója. Jobb oldali kép: bal oldali endothelsejt fáziskontraszt képe. Fluoreszcens mikroszkópos felvétel. 44

46 16. ábra. Konfokális mikroszkópia: CD44v3 fehérje lokalizációja KS-Imm immuncitokémiában. (A) Intracelluláris lokalizáció permeabilizált sejtekben. Citoplazmatikus vezikuláris zöld jel. (B) Fáziskontraszt kép. (C) PFA- fixált sejtek felszíni jelölése. Membránjelölés laterális sejtmemránszakaszon. (D) Fáziskontraszt kép. 1200x-os nagyítás. CD44v3 fehérje expresszió kvantitatív mérése áramlási citométerrel Permeabilizált HUVEC-en a CD44v3 pozitív sejtek gyakorisága 80%-nak bizonyult mindkét vizsgált mintában, alátámasztva immunfluoreszcenciával tett megfigyelésünket (14., 15. ábra). A sejtfelszíni jelölés eredménye képpen a HUVEC populáció 1/3-a bizonyult CD44v3 pozitívnak. Sem a pozitív sejtek frekvenciája, sem az expresszió sejtenkénti mértéke nem változott VEGF vagy bfgf stimuláció hatására (17. ábra). Percentage of positive cells ,6 32,5 13,35 13,85 10,6 SFM VEGF b-fgf 45

47 17. ábra. CD44v3 expresszió kvantitálása angiogén faktorokkal stimulált HUVEC (teli oszlop) és KS- Imm (üres oszlop) sejtek felszínén áramlásos citométerrel. Az adatok a pozitív sejtek százalékos arányát adják meg. Az eredmény két független kísérlet átlaga. A CD44v3 expressziója KS-Imm sejteken lényegesen alacsonyabb volt, mint HUVECen, mely csak 36 órás forbol észter kezeléssel (TPA 10 ng/ml) volt fokozható (nem mutatott adatok). CD44v3 szerepe a migrációban A CD44v3 migrációban betöltött szerepét Boyden-kamrában végzett migrációs assayvel vizsgáltuk. A HUVEC-eket a molekula extracelluláris doménjén levő v3 epitópot felismerő antitesttel preinkubáltuk, ahol annak izotípus kontrollját (IgG2b) alkalmaztuk negatív kontrollként. A migráció kiváltására kemoattraktánsként NIH3T3 felülúszót használtunk VEGF hozzáadása mellett. Az anti-cd44v3 antitest kezelés 70%-kal csökkentette a HUVEC migrációját (18. ábra), mely a vizsgált sejtfelszíni proteoglikán funkcionális jelentőségére utal. 18. ábra. CD44v3 szerepe humán endothelsejtek migrációjában. (A) Anti-CD44v3 antitest hatása HUVEC migrációjára. Az adatok a filterenként migrált sejtek számát jelzik. Az eredmény három párhuzamos kísérlet átlagolásából (+-SD) adódik. A matrigél endothel általi inváziója az elvégzett vizsgálatban feltételezi mátrix metalloproteinázok aktív közreműködését, amilyen a MMP-2 is. Ugyanakkor a CD44v3 molekula sejtnyúlványokra történő lokalizációja (14., 15., 16. ábra) is arra utalt, hogy a MMP-2 részt vehet az endotheliális invázióban. Ezért kettős jelölést végeztünk 46

48 permeabilizált HUVEC és KS-Imm sejteken CD44v3 és MMP-2 kimutatására. A citoplazmában a CD44v3 és a MMP-2 diffúzan ábrázolódik a citoplazmában (19B), míg a sejtfelszínen a két molekula gyakori kolokalizációját figyeltük meg a sejtnyúlványokon (19C ábra). 19.B,C ábra. CD44v3 és MMP-2 kettősjelölt, permeabilizált, fibronektinhez kötődő KS-Imm sejtek konfokális mikroszkópiája. Erős CD44v3 membrán jel (zöld), jól megkülönböztethető MMP-2 jelölés (vörös) a sejtnyúlványon (filopodium). A két antigén kolokalizációja csak bizonyos membránszakaszokon a sejtnyúlványokon (C) látható. 1800x-os nagyítás. CD44v3 detektálása peritumorális erekben in vivo 32 humán melanoma és 28 glottikus tumor esetének fagyasztott metszetein vizsgáltuk az erek CD44v3 expresszióját. Az erek azonosítására laminin és CD44v3 kettős jelölést végeztünk. Mindkét szövettípus esetében a többrétegű laphám szolgált belső pozitív kontrollként (20.A és C ábra). A bőr (20.A és B) és a glottis ( 20.C,D) peritumorális erei gyakori luminális CD44v3 pozitivitást mutattak (14/28 melanoma és 21/28 glottikus tumor esetében). A CD44v3 reakció elsősorban vezikuláris jellegű volt konfokális mikroszkóppal vizsgálva is (20.D ábra). A nem tumoros bőr és glottikus szövet nem tartalmazott CD44v3 pozitív ereket, mely megfelel a korábbi megfigyelésnek (nem mutatott adatok) (89). 47

49 20. ábra. Immunfluoreszcens mikroszkópia: peritumorális mikroerek CD44v3 és laminin kettősjelölése melanoma malignumban (A, B) és fejnyaki tumorokban (C, D). (A) Peritumorális bőrerek kis nagyítású képe. 400x-os nagyítás. (B) Bőr mikroerek nagy nagyítású képe. Intenzív zöld jel az erek keresztmetszetében. 800x-os nagyítás. (C) Gégedaganat peritumorális erei kis nagyítással. 400x-os nagyítás. (D) Gégetumor nagy nagyítású erei. Luminális CD44v3 (zöld) szignál, granuláris citoplazmatikus mintázat. 800x-os nagyítás. Az epidermis és az epithelium szolgált belső pozitív kontroll gyanánt (nyíl A és C képen). 48

50 Tumor asszociált erek VAP-1 expressziója melanoma malignumban Dermális és melanoma erek VAP-1 expressziója Egészséges bőrmintákat vizsgálva konfokális mikroszkópiával azt találtuk, hogy megközelítőleg 50 nm-rel a dermoepidermális junkciótól a VAP-1 expressziója főleg a kapilláris endothelsejtekre korlátozódott (21.A ábra), míg növelve a távolságot az epidermisztől az expresszió a periciták felé tolódott el (21.B ábra). Elektronmikroszkópos vizsgálataink szerint VAP-1 főleg az endotheliális sejek és a periciták sejtmembránján volt jelen (21.C ábra). 21. ábra. Bőr mikroereinek VAP-1 expressziója. (a) és (b) dermális mikroerek VAP-1 expressziójának konfokális mikroszkópos detektálása. A laminin vörös, a VAP1 zöld és a sejtmag kék fluoreszcenciát mutat. (a) Dermo-epidermális junkcióhoz közeli mikroerek: VAP-1 jelölés látható az endothel sejteken. (b) Dermális mikroerek: VAP-1 pozitivitás nem endotheliális sejteken. (c) Dermális mikroerek VAP-1 immunelektronmikroszkópos vizsgálata. VAP-1 felszíni expressziója endothelsejteken (e) és pericitákon (p). 49

51 Humán melanoma mintákban ezzel szemben a peritumorális érplexus erős és gyakori VAP-1 expressziót mutatott, ezzel szemben a molekula intratumorális ereken való kifejeződése lényegesen alacsonyabb volt (22. ábra). Mind a jelölés erőssége, mind pedig a pozitív erek gyakorisága csökkent. Immun-elektronmikroszkópia tanúsága szerint az expresszió csökkenése az intratumorális erek estében mind az endothelsejteken, mind pedig a pericitákon megfigyelhető volt (IV). 22. ábra. VAP-1 expressziója bőr malignus melanomájában. (konfokális mikroszkópia). Intenzív VAP-1 expresszió a peritumorális zónában (zöld illetve sárga szin) és jelentős expresszió csökkenés intratumorális ereken. PT= peritumorális terület, IT= intratumorális terület. 28 primer melanomát vizsgálva az intratumorális VAP-1 pozitív erek százalékos aránya 15,6±18,4% volt, míg ugyanez az érték peritumorális erek esetében 70,6±9,3%-nak bizonyult. Ez a különbség statisztikailag erősen szignifikáns (p<0,01). Amikor a VAP-1 kifejeződését a tumorok vastagságához hasonlítottuk, kiderült, hogy a csökkent intratumorális VAP-1 expresszió független a melanoma vastagságától (23. ábra). 50

52 23.ábra.Különböző vastagságú malignus melanomák VAP-1 pozitív érdenzitása. 28 mintában az intra- és peritumorális (IT/PT) régióban is megállapítottuk a VAP-1 pozitív erek gyakoriságát. Paraffinos metszeteken laminin/vap-1 kettősjelölést végeztünk. Az eredmény a pozitív és az összes ér százalékos számarányát mutatja (átlag+-sem). A tumorokat Breslow szerint kategorizáltuk (1-2 mm, n=5; 2-4 mm, n=11; >4 mm, n=12). *P<0,05 VAP-1 expresszió lokalizációja Az említett megfigyeléseket a következő képpen magyarázhatjuk: szerkezeti különbség van peritumorális és intratumorális erek között, az intratumorális erek endotélsejtjei különböznek az extratumorálisokétól, az intratumorális erek fenotípusának eltérése érinti mind az endothel, mind pedig a simaizomsejteket és pericitákat. A kérdés eldöntésére paraffinba ágyazott melanomamintákon vizsgáltunk a daganatos ereket CD34 és simaizom aktin jelöléssel. A CD34 az endotélsejtek, a simaizom aktin pedig a periciták és simaizomsejtek markere. Adataink azt mutatták, hogy a peritumorális erekhez hasonlóan (24.A ábra) a melanomák intratumorális erei 100%-ban simaizom aktin pozitívak (24.B ábra). Ezek az adatok elektronmikroszkópos megfigyeléseinkkel is korreláltak (21.C ábra). Ebből arra következtettünk, hogy humán melanoma intratumorális erei pericitákat és simaizomsejteket tartalmaznak és az intratumorális erekben csökkent VAP-1 expresszió oka nem ezen sejtek hiányában keresendő. 51

53 24. ábra. Peri- és intratumorális erek immunhisztokémiája malignus melanomában. (a) peritumorális mikroerek, (b) intratumorális mikroerek. Mindkét lokalizációban teljes az erek pericita borítása (kék). Vaszkuláris VAP-1 pozitivitás klinikopathológiai jelentősége A 26 melanomás esetünket a VAP-1 expresszió szempontjából magas, illetve alacsony intenzitású csoportokba soroltuk és vizsgáltuk ennek összefüggését különböző klinikopatológiai tényezőkkel. A magas intenzitású csoportba azokat az eseteinket soroltuk, amelyekben az intratumorális erek legalább 25%-a VAP-1 pozitivitást mutatott. A tumorvastagság tekintetében a két csoport nem különbözött jelentősen (alacsony: 4,8±2,9 mm, szemben a magas intenzitású csoporttal 6,0±7,7 mm). A CD8 pozitív citotoxikus T-limfociták vagy pedig a CD1a pozitív dendritikus sejtek intratumorális sűrűsége sem mutatott jelentős különbséget a két csoport között. Az 5 éves túlélést vizsgálva azt találtuk, hogy az alacsony VAP-1 intenzitású csoportban ez az érték 26,3%, míg a magas intenzitású csoportban 42,6% volt. Bár a különbség statisztikailag nem szignifikáns (p=0.0632), érdekes kérdéseket vett fel és további vizsgálatokat tesz szükségessé (25. ábra). 52