DOKTORI ÉRTEKEZÉS A FO HISZTOKOMPATIBILITÁSI KOMPLEX (MHC) ÉS SZEREPE KÜLÖNBÖZO AUTOIMMUN BETEGSÉGEKBEN

Átírás

1 DOKTORI ÉRTEKEZÉS A FO HISZTOKOMPATIBILITÁSI KOMPLEX (MHC) ÉS SZEREPE KÜLÖNBÖZO AUTOIMMUN BETEGSÉGEKBEN Dr. Vatay Ágnes Témavezeto: Prof. Dr. Füst György Semmelweis Egyetem, Budapest Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok Elméleti és Klinikai Immunológia Program 2004

2 TARTALOMJEGYZÉK 1.1 ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 7 2. ELOZMÉNYEK A HUMÁN 6. KROMOSZÓMA FELÉPÍTÉSE A FO HISZTOKOMPATIBILITÁSI KOMPLEX (MHC) II IMMUNFOLYAMATOKBAN BETÖLTÖTT SZEREPE Az MHC molekulák szerkezete Az antigén prezentáció folyamata Az MHC genetikája AZ MHC I ÉS MHC II SZEREPE KÜLÖNBÖZO MEGBETEGEDÉSEKBEN A HLA BETEGSÉG ASSZOCIÁCIÓK PATHOMECHANIZMUSA A TUMOR NECROSIS FAKTOR (TNF) A TNF alfa szekréció genetikai szintu szabályozása A TNF alfa és a CRP gén szabályozása közötti kapcsolat AZ RCCX MODUL A 8.1 OSI (ANCESTRAL) HAPLOTÍPUS EGYES BETEGSÉGEK GENETIKAI HÁTTERE Diabetes mellitus A gyulladásos bélbetegségek KUTATÁSI CÉLOK A TNF-a gén promoter polimorfizmus, az RCCX modul variánsok, a C4A és C4B variánsok és az RCCX modul variánsok közötti kapcsolat vizsgálata AZ MHC II (DR, DQ) és MHC II (TNF-a) régióban kódolt allélok vizsgálata autoimmun diabetesben A TNF-a gén promoter polimorfizmus vizsgálata gyulladásos bélbetegségben. A TNF-a gén plazma CRP szintekre kifejtett hatásának vizsgálata ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK VIZSGÁLT BETEGCSOPORTOK A TNF-a gén promoter polimorfizmus, az RCCX modul variánsok, a C4A és C4B variánsok vizsgálata két kaukázusi populációban A HLA-DR, DQ és a TNF-a vizsgálata autoimmun diabetesben 41 2

3 A TNF-a gén promoter polimorfizmus és a szérum CRP szintek vizsgálata gyulladásos bélbetegségben Alkalmazott módszerek DNS szeparálás HLA meghatározás A TNF-a promoter polimorfizmus vizsgálata Az RCCX modul tanulmányozására alkalmazott módszerek Komplement C4 allotipizálás és immunblot analízis A szérum C4 koncentráció meghatározása és a C4A és C4B fehérjék immunblot analízise Szérum CRP koncentráció meghatározása Statisztikai módszerek EREDMÉNYEK A KOMPLEMENT KOMPONENS C4A ÉS C4B DIVERZITÁSOK ÉS A TNF ALFA PROMOTER POLIMORFIZMUS KÖZÖTTI KAPCSOLAT A TNF alfa 308 és 238 promoter polimorfizmus frekvenciája két egészséges kaukázusi populációban A különbözo RCCX modulok frekvenciája a TNF alfa 308 A allél jelenlétében, illetve anélkül a két egészséges kaukázusi populációban A C4AQ0 és B1 allélt tartalmazó lehetséges haplotípusok frekvenciája a TNF alfa 308 polimorfizmus függvényében a két egészséges kaukázusi populációban A C4A6 és B1 allélt tartalmazó lehetséges haplotípusok frekvenciája a TNF alfa 238 polimorfizmus függvényében a két egészséges kaukázusi populációban A TNF alfa 308 promoter polimorfizmus és a C4A, C4B és össz C4 szérumkoncentráció közötti összefüggések A LÁTENS AUTOIMMUN DIABETES (LADA) ÉS AZ 1-ES TÍPUSÚ DIABETES MELLITUS GENETIKAI HÁTTERE A TNF-a promoter polimorfizmus csökkent frekvenciája LADA betegek körében Az 1-es típusú diabetes és a LADA kapcsolata bizonyos DR és DQ allélokkal Az 1-es típusú diabetes és a LADA kapcsolata bizonyos haplotípusokkal A 8.1 osi (ancestral) haplotípus jelenléte 1-es típusú diabetesben és LADA betegségben A SZÉRUM C-REAKTÍV PROTEIN (CRP) SZINTEK ÉS A TNF ALFA PROMOTER POLIMORFIZMUS KÖZÖTTI KAPCSOLAT GYULLADÁSOS BÉLBETEGSÉGBEN A TNF alfa 308 promoter polimorfizmus vizsgálata gyulladásos bélbetegségben (IBD) A TNF alfa 238 promoter polimorfizmus vizsgálata gyulladásos bélbetegségben (IBD) A TNF alfa promoter polimorfizmus, a klinikai állapot és a szérum CRP szint közötti kapcsolat MEGBESZÉLÉS A komplement komponens C4A és C4B diverzitások és a TNF alfa 308 promoter polimorfizmus közötti kapcsolat 63 3

4 6.2. A 8.1 osi haplotípus és az autoimmun betegségek közötti kapcsolat lehetséges pathomechanizmusa A komplement komponens diverzitások és a TNF alfa 238 promoter polimorfizmus közötti kapcsolat két kaukázusi populációban A látens autoimmun diabetes (LADA) és az 1-es típusú diabetes mellitus genetikai háttere közötti különbségek és hasonlóságok A látens autoimmun diabetes (LADA) és az 1-es típusú diabetes mellitus genetikai háttere és a klinikai lefolyás közötti kapcsolat A TNF alfa promoter polimorfizmus és a gyulladásos bélbetegség közötti kapcsolat A szérum C-reaktív protein (CRP) szintek és a TNF alfa promoter polimorfizmus közötti kapcsolat gyulladásos bélbetegségben AZ ÉRTEKEZÉSBEN LEÍRT LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA, KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOM PUBLIKÁCIÓK 92 4

5 1.1 ÖSSZEFOGLALÁS A fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) és szerepe egyes megbetegedésekben A fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) gén termékeinek immunfolyamatokban betöltött szerepe jól ismert. Az MHC I, II és III. régióban található gének bizonyos alléljai, illetve e gének polimorfizmusa szoros összefüggést mutatnak egyes autoimmun megbetegedések, így 1-es típusú diabetes mellitus, gyulladásos bélbetegség, rheumatoid arthritis, psoriasis, stb. kialakulásával. Az MHC régióban található gének között eros linkage disequilibrium áll fenn, az MHC I és II régió génjeinek bizonyos alléljai együtt öröklodnek az MHC III régióban kódolt bizonyos gének egyes alléljaival. A tudomány fejlodésével újabb és újabb génekrol derül ki, hogy részei ennek a linkage disequilibriumnak. Tanulmányuk célja kettos volt. Egyrészt célunk volt az MHC gének közötti linkage disequilibrium vizsgálata két egészséges kaukázusi populációban, másrészt vizsgáltuk egyes autoimmun megbetegedések, így az 1-es típusú diabetes mellitus és a gyulladásos bélbetegség és az MHC gének közötti kapcsolatot. Vizsgálatainkból kiderült, hogy igen eros összefüggés van a TNF-? 308 A allél és a mono-s RCCX szerkezetu C4AQ0-C4B1 haplotípus között. A TNF-? 308 A allél, a C4AQ0 haplotípus és a monomoduláris RCCX struktúra rövid C4B gén is a 8.1 osi haplotípus része. A 8.1 osi haplotípus pedig bizonyos betegségek kialakulásának magasabb kockázatával jár együtt. Mivel a C4A immun-komplex kezelo képessége hatékonyabb, mint a C4B fehérjéé, elképzelheto, hogy emiatt nagyobb a haplotípust hordozók körében az autoimmun betegségek kialakulásának kockázata. Az irodalmi adatokból a bizonyos MHC II (HLA-DR és DQ) gének és az 1-es típusú autoimmun diabetes közötti kapcsolat jól ismert. Kevéssé ismert azonban e gének és az autoimmun diabetes egy késoi formájának, a látens autoimmun diabetesnek (LADA) a kapcsolata. Eredményeink alapján eros pozitív kapcsolat figyelheto meg a HLA- DR4/DQ8 haplotípus és mind az 1-es típusú diabetes, mind a LADA kialakulása között, míg a HLA-DR3/DQ2 haplotípus, illetve a tumor necrosis faktor alfa (TNF-? ) 308 polimorfizmus tekintetében a két betegség között különbségek vannak. Kapcsolatot találtunk továbbá a TNF alfa 308 polimorfizmus és a gyulladásos bélbetegség (IBD) között; a TNF-? 308 A allél frekvenciája szignifikánsan alacsonyabb a gyulladásos bélbetegségben szenvedok körében, ráadásul a TNF-? 308 A allélt hordozóknál a CRP szintek a betegség aktív fázisában szignifikánsan magasabbak, mint a betegség inaktív fázisában, míg ez a különbség nem szignifikáns a 308 GG homozigótáknál. 5

6 1.2 SUMMARY The main histocompatibility complex (MHC) and its role in different autoimmune diseases Experiments summarised in this work are focused on the linkage disequilibria between the different MHC genes, and the relationship between the different autoimmune diseases (autoimmune diabetes, IBD) and some genes encoded in the MHC II and MHC III region. We described strong positive correlation between the presence of the TNF-? 308 A allele mono-s RCCX structure C4AQ0-C4B1 haplotype. The TNF-? 308 A allele, the C4Aqo haplotype and the monomodular RCCX structure with short C4B gene also take part of the 8.1 ancestral haplotype. In Caucasian populations the presence of the 8.1 ancestral haplotype is associated with an increased risk to develop a variety of diseases including autoimmune diseases. The ability of C4A for handling immune complexes is better than that of C4B, a carriage of the 8.1 AH may be associated with impaired handling of circulating immune complexes, and this could be one of the factors responsible for developing autoimmune diseases among 8.1 AH carriers. The relationship between the type 1 autoimmune diabetes and the genes encoded in the MHC II region (HLA-DR and DQ) is well known. However the relationship between the genes encoded in the MHC II region and the slowly form of type 1 autoimmun diabetes, the Latent Autoimmune Diabetes in Adult (LADA) is not clear. According to our results there is a strong positive association between the presence of the HLA-DR4/DQ8 haplotype and the development of both type 1 diabetes and LADA, while there are differences between the two disease entities in respect of the HLA-DR3/DQ2 haplotype and the tumour necrosis factor alpha promoter polymorphism. Among LADA patients the presence of the TNF-? 308 A allele (which is known to be associated with elevated TNF-? production) is significantly less frequent, and could be one of the factors responsible for the relatively slow progression. We found, that the HLA-DR3/DQ2/ TNF-? 308 A haplotype (designated the 8.1 ancestral haplotype, 8.1 AH) was more frequent among type 1 diabetes than LADA patients. According to our results the frequency of the TNF-? 308 A allele was significantly increased in inflammatory bowel disease (IBD). The median CRP levels were significantly higher in the active phase of the disease than in the inactive phase among the 308 A allele carriers, while this difference was not significant among those patients who not carried the mentioned allele. The decreased frequency of the TNF alpha 308 A allele in IBD may modify the pathogenesis of this chronic inflammatory disease. 6

7 1.3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE HLA: humán leukocita antigén; MHC: Fo hisztokompatibilitási komplex (Major Histocompatibility Complex); TNF-? : tumor necrosis faktor alfa; Bf: komplement faktor B; C2: komplement komponens 2; C21B: 21-? hidroxiláz; C4A és C4B: C4 komplement komponenst kódoló 4A és 4B gén; HSP: hosokk-protein; LTA és LTB: limfotoxin? és? ; P450: citokróm P-450; TAP1 és TAP2: transzporter asszociált protein 1 és 2; Ig: immunglobulin; ER: endoplazmatikus retikulum; TCR: T-sejt receptor; TNFR: Tumor necrosis faktor alfa receptor; TNFA: TNF alfa 238 A allél; TNF2: TNF alfa 308 A allél; RCCX modul: RP-C4-CYP 21-TNX modul; C4: komplement komponens 4; TNX: extracelluláris mátrix protein tenascin-x; CYP21: citokróm 21-hidroxiláz gén, szteroid hidroxiláz gén; SLE: szisztémás lupus erythematodes; LADA: Látens Autoimmun Diabetes Felnottkorban; IBD: gyulladásos bélbetegség (Inflammatory Bowel Disease); CD: Crohn betegség; CU: Colitis Ulcerosa; AH: osi (ancestral) haplotípus 7

8 2. ELOZMÉNYEK 2.1 A HUMÁN 6. KROMOSZÓMA FELÉPÍTÉSE A humán 6. kromoszóma rövid karján találhatók a fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) I, II, és III génjei (1. ábra). Az immunrendszer muködése szempontjából legfontosabb gének a nagyfokú genetikai polimorfizmussal rendelkezo úgynevezett klasszikus MHC gének. A klasszikus MHC gének két fo régiója az MHC I és az MHC II osztályban található. Ezen MHC gének glikoprotein termékei a sejtfelszínen expresszálódnak. Az MHC I gének az MHC I molekula (2.2. ábra)? polipeptid láncainak kódolásáért felelosek; az MHC I molekula?-láncának génje, a? 2 -microglobulin gén a 15. kromoszómán található. Az MHC II gének az MHC II molekula? és a? polipeptid láncainak szintéziséért egyaránt felelosek. Lókuszaik elnevezése három betubol áll: az elso (D) jelöli az osztályt, a második (M, O, P, Q, vagy R) jelöli a családot, a harmadik (A vagy B) határozza meg a láncot (?, illetve? láncot) ábra. Az MHC komplex elhelyezkedése a 6. kromoszómán. A komplexet hagyományosan 3 részre osztják: MHC I, MHC II és MHC III. Mindegyik régió számtalan locust (gént) tartalmaz. Bf: komplement faktor B; C2: komplement komponens 2; C21B: 21-? hidroxiláz; C4A és C4B: komplement komponens 4A és 4B; HFE: hemochromatosis; HSP: 70 kd hosokk-protein; LMP: nagy multifunkcionális proteáz; LTA és LTB: limfotoxin? és?; MICA és MICB: fo hisztokompatibilitás komplex lánc gén A és B; P450: 8

9 citokróm P-450; PSMB8 és 9: proteoszóma? 8 és 9; TAP1 és TAP2: transzporter asszociált protein 1 és 2; TAPBP: TAP köto protein (tapasin); TNF-? : tumor necrosis faktor?. [Klein J, Sato A: The HLA system. Part I. (2000). The N Engl J Med 343(10): ]. Az MHC I fehérjék gyakorlatilag minden magvas sejt membránján megjelennek, bár sejtfelszíni expressziójuk mértéke függ az adott szövettol is. Ezzel ellentétben az MHC II fehérjék kizárólag az úgynevezett hivatásos antigénprezentáló sejteken, makrofágokon, dendritikus sejteken, B-limfocitákon, stb. expresszálódnak. IFN? jelenléte esetén azonban egyéb sejtek is képesek az MHC II fehérjék expressziójára. Az MHC II molekulák fo feladata az antigén eredetu rövid peptidek bemutatása a T- limfocitáknak, egy folyamat, ami elindítja az adaptív immunválaszt (1-3). Az MHC III osztályban található gének nem kapcsolódnak szorosan sem szerkezetileg, sem pedig funkcionálisan az MHC I és MHC II génekhez. Itt található a komplement faktor B, a komplement komponens 2 (C2), a 21-? hidroxiláz (C21B), a citokróm P450, a C4 komplement komponenst kódoló két gén (C4A és C4B), a haemochromatosis, a 70 kd hosokkfehérje (HSP70), a lymphotoxin? és? (LTA és LTB), a transzporter asszociált fehérjék (TAP1 és TAP2), valamint a tumor nekrózis faktor? (TNF-? ) génjei A FO HISZTOKOMPATIBILITÁSI KOMPLEX (MHC) II IMMUNFOLYAMATOKBAN BETÖLTÖTT SZEREPE Az MHC molekulák elsodleges szerepe az antigének prezentációja, bemutatása a T sejtek számára. A T sejtek antigén receptorai ugyanis képtelenek az antigén közvetlen felismerésére, csak azon idegen antigének felismerésére képesek, melyek rövid peptid szegmensei az MHC molekulához kötodtek (4). Az MHC molekulák antigén prezentációban betöltött szerepére eloször az MHC függo antigén felismerésnek nevezett jelenség hívta fel a figyelmet (5), késobb azonban tisztított MHC molekulákkal és T sejt receptorokkal be is bizonyították (4, 6-8). Egymagukban sem az antigénbol származó peptidek, sem pedig az MHC molekulák nem képesek a T sejt válasz stimulálására, erre kizárólag a peptid-mhc komplex képes. A peptidek megkötéséért elsosorban az MHC molekula felszínén elhelyezkedo peptidköto hely zsebei felelosek. Egy adott aminosav szekvenciával rendelkezo MHC molekula többféle peptid megkötésére képes, 9

10 a szervezet saját és nem saját fehérjéinek megkötésére egyaránt alkalmas, így antigén specificitással nem rendelkezik. Az MHC molekulák olyan peptidköto receptorok, melyek nem képesek különbséget tenni a tolerálható és az antigén eredetu peptidek között, képesek azonban azok megkötésére. Az immunrendszer muködésében betöltött szerepük kettos: a saját peptidekbol álló MHC-peptid kombinációkat a sejtfelszínen folyamatosan expresszálva a T sejtek számára folyamatosan bemutatják a tolerálandó saját peptideket, míg az idegen fehérjeantigének bemutatásával az adaptív immunválaszt indukálják Az MHC molekulák szerkezete Az MHC I és II molekula szerkezete különbözik egymástól. Az MHC I molekula két láncból, egy?, vagy nehéz láncból, és egy? 2 -mikroglobulinból áll (2.2 ábra). Az? lánc 5 doménbol épül fel: két peptidköto doménbol (? 1 és? 2 ), egy immunglobulin szeru doménbol (? 3 ), egy transzmembrán régióból és egy citoplazmatikus farokból. Az? lánchoz a sejtfelszínen nem kovalensen kötodik a? 2 -mikroglobulin (2). Az? 1 és? 2 domének a molekula külso felszínén egy kb. 2,5x1,0x1,1 nm-es bemélyedést hoznak létre, melynek az oldalát? -helikális részek, alapját pedig? redozött lemezek képezik, ez a felszíni zseb szolgál a fehérjék lebontása során keletkezett peptidek kötohelyéül (1, 2.2. ábra). 10

11 2.2. ábra. Az MHC I és II molekulák felépítése. Az MHC I molekula egy polimorf? és egy közös béta 2 - mikroglobulin láncból felépülo heterodimer. Az MHC I molekula? lánca két peptidköto doménnel (? 1 és? 2), egy immunglobulinszeru doménnel (? 3), egy transzmembrán régióval (TM) és egy citoplazmatikus farokkal rendelkezik. Az MHC II molekula egy polimorf? és egy polimorf? láncot tartalmazó heterodimer szerkezetet mutat. Minden MHC II? és? lánc 4 doménnel rendelkezik: peptidköto doménnel (? 1 és?1), immunglobulin-szeru domén (? 2 és?2), transzmembrán régió és citoplazmatikus farok. A peptidköto helyet kialakító domének mind az MHC I, mind pedig az MHC II molekulában inkább a hosokk fehérjékkel mutatnak rokonságot, az MHC I molekula? 3 doménje, az MHC II molekula? 2 és?2 doménjei, valamint a? 2 mikroglobulin az Ig szuperfamília tagjaira jellemzo szerkezettel rendelkeznek. [Klein J, Sato A: The HLA system. Part I. (2000). The N Engl J Med 343(10): ]. 2.3 ábra. Az MHC I peptidköto rész térbeli (negyedleges) szerkezetének szalagmodellje. [Klein J, Sato A: The HLA system. Part I. (2000). The N Engl J Med 343(10): ]. Az MHC I molekulákhoz kötodo peptidek mérete szigorúan meghatározott, a legtöbb esetben 9, kivételesen 8, vagy 10 aminosavból állnak. A különbözo MHC allotípusokhoz kötodni képes peptidek bizonyos pozíciókban tulajdonságaikban hasonló, úgynevezett horgonyzó aminosavakat tartalmaznak, a szekvencia többi része igen eltéro lehet. A horgonyzó aminosavak oldalláncai az allélokra jellemzo zsebekbe illeszkednek, a kölcsönhatásokat a peptidváz és az MHC molekula konzervatív aminosavai alakítják ki (2.4. ábra). 11

12 Az MHC II molekula két komplex láncból, egy? és egy? polipeptid láncból épül fel. Az? lánc és a? lánc egyaránt két extracelluláris domént (? 1 és? 2 ;? 1 és? 2 ), egy transzmembrán régiót, és egy rövid citoplazmatikus részt tartalmaznak, a két lánc egymáshoz nem kovalensen kapcsolódik (2.2. ábra). Az? 2 és a? 2 domének immunglobulinszeru szerkezettel rendelkeznek, a peptidköto helyet kialakító? 1 és? 1 domének pedig inkább a hosokk fehérjékkel mutatnak rokonságot. Az MHC II molekulákhoz kötodo peptidek mérete az MHC I molekulákkal ellentétben kevésbé korlátozott, átlagosan 9-25 aminosavból állnak (2.4. ábra), legjellegzetesebb tulajdonságuk, hogy az 1. pozícióban általában aromás, vagy alifás aminosav található. A zsebekhez történo kötodésben itt is fontos szerep jut a horgonyzó aminosavaknak (1) ábra. Az MHC I molekula aminosavakat befogadó zsebei a peptid N- (P2, P3) és C-terminális (P7, P9) aminosavainak oldalláncaival alakítanak ki nem kovalens kölcsönhatásokat. Az illeszkedo peptidek optimális mérete 9 aminosav, de okta- és dekapeptidek is kapcsolódhatnak. Az MHC II molekula nyitott kötohelye hosszabb peptidek kötodését is megengedi. Az eltéro hosszúságú átfedo peptidek megfelelo aminosav oldallánca (P1) egy minden MHC II molekulára jellemzo mély hidrofób zsebbe illeszkedik, a többi horgonyzó aminosav oldalláncai ettol az elso zsebtol megfelelo távolságban (P4, P6, P9) levo mélyedésekbe illeszkednek Az antigén prezentáció folyamata Az MHC molekulák legfontosabb biológiai funkciója a szervezetben termelodo, vagy oda bekerülo fehérjék részleges lebontásakor keletkezo peptidek megkötése és bemutatása a T-sejtek számára. Az antigének bemutatása (prezentációja) során a fehérjetermészetu antigének lebontásával keletkezett peptidek az MHC molekulákhoz kötodve megjelennek az antigén prezentáló sejt külso membránján. Az antigének lehetnek a sejten belül szintetizálódó endogén (tumorantigének, vírusfehérjék), illetve a sejtbe bejutó exogén eredetuek. Az endogén antigének bemutatása elsosorban MHC I 12

13 molekulákon, míg az exogén antigének bemutatása elsosorban MHC II molekulán keresztül történik (2.5. ábra). Az antigénprezentáció endogén, citoplazmatikus útja. Az MHC I molekulák a durva endoplazmatikus retikulumban (ER) szintetizálódnak, majd a Golgi-készüléken átjutva poszttranszlációs módosításokon keresztülmenve a sejtfelszínre jutnak. Már képzodésük helyén, az ER-ben peptideket kötnek meg, amennyiben erre nincs lehetoségük, ki sem jutnak a sejtfelszínre. Az MHC I molekulák számára felismerheto peptidek elsosorban a citoplazmában, a proteoszóma enzimkomplex közremuködésével keletkeznek. Egy speciális szállítófehérje (transzporter) juttatja el oket az ER-be, ahol a peptidek találkoznak az ott szintetizálódó MHC I molekulákkal. Ez a transzporter az ATP-köto kazettafehérjék családjába tartozik, két alegységbol, a TAP1 és a TAP2 alegységbol áll (TAP: Transporter Associated with antigen Processing), melynek génje szintén a 6. kromoszómán, az MHC III régióban található. A proteoszóma, a TAP és az MHC I nem tud különbséget tenni a sejt saját, vagy a sejtben képzodo antigénbol (pl. vírusfehérje) származó peptidek között. A saját és az antigén eredetu peptidek intracelluláris koncentrációjuk és peptidköto helybe való kötodési képességük alapján jelennek meg a sejtfelszínen. Az MHC I + saját fehérjébol, illetve endogén antigénbol származó peptid komplex a CD8+ citotoxikus T sejtek receptorához (TCR) kötodik (, 2.5. ábra, 1-3). Az antigénprezentáció exogén, endoszomális útja. Az MHC II molekulák szintén az endoplazmatikus retikulumban szintetizálódnak. Az? és a? láncok alkotta dimerhez keletkezésük pillanatában egy szállítófehérje, az invariáns lánc (Ii) kapcsolódik, ami a dimerek kialakulásakor chaperonként szerepel, kapcsolódása befedi, vagy deformálja a peptidköto helyet, megakadályozva az ER-ben jelen lévo peptidek bekötodését, végül pedig az MHC II molekulákat az endo-/lizoszóma rendszer vezikulumaiba irányítja. Itt az MHC II molekulák találkozhatnak a külso környezetbol bekerült (exogén) fehérjékkel. Az endo-/lizoszóma enyhén savas ph-ja, illetve a savas proteázok segítségével az invariáns lánc lassanként lehasad az MHC II-rol, csak végterméke, az ún. CLIP (Class II associated Invariant chain Peptide) marad az MHC II-n, az azonban addig rajta marad, amíg egy másik peptid le nem szorítja. Az invariáns lánc egy ideig visszatartja az MHC II molekulákat az endoszóma vezikulumaiban, így megfelelo ido jut a peptidek kötodésére. A peptidek kötodése az MHC II molekulában olyan térszerkezeti változást idéz elo, amelynek eredményeként a csapdába ejtett peptid mintegy bezáródik a kötohelybe, és ez a peptid által stabilizált komplex jut ki a sejtfelszínre. Az MHC II + peptid komplex ezek után a CD4+ helper T sejtek receptorához (TCR) kötodik (2.5. ábra, 1-3). 13

14 2.5. ábra. Az antigén prezentáció folyamata. Az A ábra az MHC I molekulán keresztül történo antigén prezentációt ábrázolja. A citoszolban lebontott proteineket a proteoszómák peptidekké bontják, a kiválasztott peptidek az endoplazmás retikulumba kerülnek, ahol az újonnan szintetizálódott MHC I molekulák felveszik oket. Az MHC I-peptid komplex a Golgi apparátuson keresztül a sejtfelszínre kerül. Vírusinfekció esetén a vírus DNS vagy RNS a nucleusba kerül, ahol replikálódni kezd. A virális mrns aztán a citoszolba kerül, és segítségével protein szintetizálódik, a protein a proteoszómákban lebomlik, a kiválasztott peptidek az endoplazmás retikulumban az MHC I molekulákra kerülnek, és az MHC I-peptid komplex kijut a sejtfelszínre. A B ábra mutatja az extracelluláris proteinek bemutatását. A saját, vagy idegen proteinek endocytosissal kerülnek be a citoszolba, és az endoszómákban sequestrálódnak. Az endoplazmás retikulumban szintetizálódott MHC II molekulák a Golgi apparátusba, majd a korai lizoszómákba kerülnek, melyek fuzionálnak a korai endoszómákkal, ez az úgynevezett MHC II kompartment. A degradálódott peptidek az MHC II molekulára kerülnek. Az MHC II-peptid komplex a sejtfelszínre kerül. [Klein J, Sato A: The HLA system. Part I. (2000). The N Engl J Med 343(10): ]. 14

15 2.2.3 Az MHC genetikája A humán fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) vagy ahogy korábban nevezték, a HLA (Humán Leukocita Antigén) régió, egyike az elmúlt két évtizedben leginkább vizsgált genetikai régióknak. A genom körülbelül 0.1%-át (a DNS-bol 4Mb-nyi területet) foglalja el. Jelen ismeretünk szerint közel 220 gén található az MHC-n belül, e gének termékeinek legalább 10%-a az immunrendszerrel áll kapcsolatban. Az MHC-t hagyományosan három részre, az MHC I, MHC II és az MHC III régióra osztják. Genetikai tanulmányok arra mutattak rá, hogy az MHC-n belüli gének tehetok felelossé többek között az immun-mediált megbetegedések, mint az inzulin dependens diabetes mellitus, a rheumatoid arthritis, a spondylitis ankylopoetica (SpA, Bechterew kór) kialakulásáért (9-11). MHC I régió. Az MHC I régió 2 Mb DNS-t ölel át. Ez az MHC legkevésbé jól karakterizált területe. E területen három fo funkcionális locus található, a HLA-A, a HLA-B és a HLA-C, mindegyikük igen nagy polimorfizmussal rendelkezik (12). Ezek a gének az emberi I osztályba tartozó MHC molekulák polimorf? láncának szintéziséért felelosek, a legtöbb testi sejtben expresszálódnak. Az MHC I molekulák megjelennek a sejt felszínén, és fontos szerepet töltenek be az antigének bemutatásában a citotoxikus T limfociták felé. Szerológiai módszerekkel 24 HLA-A, 52 HLA-B, és 11 HLA-C géntermék különítheto el, PCR-SSP módszerrel azonban jóval több allél azonosítható. Az MHC I hiánya a maternofoetalis felületen elosegítheti a foetalis szövet mint allograft túlélését az anyai szervezetben. Egyre több bizonyíték szolgál arra is, hogy a HLA-Cnek fontos szerepe van az NK sejtek célsejt felismerésében (13). A nem klasszikus MHC locusok közé tartozik a HLA-E, HLA-F és a HLA-G, melyek sokkal kisebb polimorfizmussal rendelkeznek (14). MHC II régió. Az MHC II molekulákat kódoló gének emberben a HLA-D régióban, egy 800 kb hosszúságú DNS szakaszon találhatók. A DP, DQ és DR molekulák? és? láncait kódoló polimorf gének találhatók itt. A mindig elol található? láncot kódoló B gént követi az? láncot kódoló A gén. Emberben a HLA-DP, DQ és DR az antigénprezentáló sejtek felszínén expresszálódik. A DP, DQ és DR molekulák láncait kódoló lókuszok külön szubrégiókat alkotnak. Az? és a? lánc lókuszai mindig párokban vannak jelen (mint DRB és DRA, DQB és DQA, illetve DPB és DPA). Az 15

16 egyes MHC II lókuszoknak megfeleloen 2 vagy több funkcionális B- (? láncot kódoló) és 1 vagy 2 funkcionális A- (? láncot kódoló) gén van. A DR gének között csak egy A gén (DRA) van, amelynek terméke a funkcionális B gének (DRB1, DRB3, DRB4 és DRB5) termékeivel is kapcsolódhat (a DRB2 pszeudogén). Szerológiai módszerekkel legalább 18 HLA-DR típus különböztetheto meg, az allélok tényleges száma ennél nagyobb. A DQ és DP szubrégiókban 2-2? -, illetve? -láncot kódoló gén van (1, 4). A HLA-D régióban a legtöbbet vizsgált gének a HLA-DR és DQ gének, ezeket a géneket, valamint a HLA-A, B és C géneket határozzák meg többek között az esetleges transzplantáció során a recipiens számára immunológiailag legmegfelelobb donor kiválasztása céljából, illetve apasági vizsgálatok során. A HLA-DR és DQ gének meghatározása korábban szerológiai módszerekkel történt, ma inkább a DNS szintu HLA tipizálás használatos, a meghatározás PCR-SSP módszerrel történik. A HLA-DR és DQ nevezéktan igen bonyolult, részint, mert a nomenklatúra egy része még a szerológiai módszerekkel történo meghatározást követi, más része pedig már az új, DNS szintu tipizáláson alapul. Szerológiai módszerekkel 8 DQ típus ( táblázat) és 18 DR típus ( táblázat) különböztetheto meg. Szerológia DNS szintu meghatározás, DQB1 allél DQ2 DQB1*0201, 0202, 0203 DQ3 DQB1*0306, 0307, 0308, 0309, 0310 DQ4 DQB1* DQ5 (DQ1) DQB1* DQ6 (DQ1) DQB1* DQ7 (DQ3) DQB1*03011, 03012, 0304 DQ8 (DQ3) DQB1*0302 DQ9 (DQ3) DQB1* Táblázat. HLA-DQ nomenklatúra. A DQ szerológiai módszerekkel történo, illetve DNS szintu meghatározása. 16

17 Szerológia DNS szintu meghatározás, DRB1 allél DR1 DRB1* , DR103 DRB1*0103 DR2 (DR15 és DR16) A korábban használt DR2 elnevezés helyett két csoport lett, a DR15 (DRB1*1501 ) és a DR16 (DRB1*1601) DR3 (DR17 és DR18) A korábban használt DR3 elnevezés helyett két csoport lett, a DR17 (DRB1*0301 ) és a DR18 (DRB1*0302, 0303) DR4 DRB1* DR5 (DR11 és DR12) A korábban használt DR5 elnevezés helyett két csoport lett, a DR11 (DRB1*1101 ) és a DR12 (DRB1*1201 ) DR6 (DR13 és DR14) A korábban használt DR6 elnevezés helyett két csoport lett, a DR13 (DRB1*1301 ) és a DR14 (DRB1*1401 ) DR7 DRB1* DR8 DRB1* DR9 DRB1*09012 DR10 DRB1* DR11(5) DRB1* DR12(5) DRB1* DR13(6) DRB1* , DR14(6) DRB1* , , DR15(2) DRB1* DR16(2) DRB1* DR17(3) DRB1* , DR18(3) DRB1* Táblázat. HLA-DR nomenklatúra. A DR szerológiai módszerekkel történo, illetve DNS szintu meghatározása. A korábban használt HLA-DR3 elnevezés helyett a technika fejlodésével két csoport lett, a DR17 és a DR18. A DR17(3) allélt tartják felelosnek a korábban leírt HLA-DR3- betegség asszociációkért. A DR3-hoz hasonlóan a DR2, a DR5 és a DR6 is két 17

18 alcsoportra oszlik, a DR2-bol DR15 és DR16, a DR5-bol DR11 és DR12, a DR6-ból pedig DR13 és DR14 lett. MHC III régió. A DNS I-es és II-es régiójától különálló 1100 kb-nyi szegmense körülbelül 70 gént tartalmaz. Az MHC III régióban igen eros a gén denzitás, átlagosan minden 10 kb-ra egy gén jut, és a gének többsége egymáshoz igen közel helyezkedik el. A duplikált C4/P450c21/X/Y gén clustert tartalmazó 120 kb-nyi DNS darab egyike a humán genom legösszetettebb géncsoportjának. Míg az MHC I és II régióra a gén duplikációk nagy száma és a kiterjedt gén polimorfizmus a jellemzoek, addig ez a III régióra kevésbé jellemzo, bár a C4A és C4B gének is igen polimorfok. Ebben a régióban található a komplement komponens C2, C4 és B faktor (Bf) génje, a 70 kda hosokk protein család (hsp70) két tagjának génje, a citokinek közül a tumor nekrózis faktor alfa (TNF-? ), a limfotoxin alfa (LT-? ) és béta (LT-? ) génje. Egyre nyilvánvalóbbá válik, hogy a III. régióban kódolt gének igen nagy százalékának termékei gyulladásos folyamatokkal vannak kapcsolatban (4). Az MHC I és MHC II régióban eloforduló HLA gének populációbeli megoszlása a populáció földrajzi elhelyezkedésétol függoen igen különbözo lehet. A Kárpát medencében a megoszlás igen hasonlóan alakult az osztrák, a cseh, a szlovák, a lengyel és a magyar populációban (lásd 5.1 fejezet). Az MHC-n belül megfigyelheto linkage disequilibriumnak köszönhetoen nagy kiterjedésu konzervált génszakaszok maradtak fenn, az úgynevezett ancestral (osi) haplotípusok. Az ancestral haplotípusok konzervációjának foka egymástól nagyban eltérhet. Az érdeklodés középpontjában a 8.1 osi (ancestral) haplotípus áll (HLA-A1, B8, TNFA-308*2, DRB1*0301, DQA1*0501, DQB1*0201), mert igen sok immunológiai rendellenességgel összefüggést mutat, köztük coeliakiával, myasthenia gravissal, 1-es típusú diabetessel (15). 18

19 2.3 AZ MHC I ÉS MHC II SZEREPE KÜLÖNBÖZO MEGBETEGEDÉSEKBEN A HLA BETEGSÉG ASSZOCIÁCIÓK PATHOMECHANIZMUSA E mechanizmusok igazolására számtalan kísérleti modell áll rendelkezésre. Az egyik legjobban ismert és legtöbbet tanulmányozott kísérleti állatmodell a nem obez diabetikus (NOD) egér modell, a humán inzulin dependens diabetes mellitus kísérleti modellje. A NOD egerekben a spontán kialakuló diabetes karakterisztikus jellemvonása az insulitis, és a hasnyálmirigy? -sejtjeinek pusztulása. Nem vitatott, hogy a betegség kialakulásában több gén lókusz is érintett. A betegség kialakulásában a NOD egerek esetén a H-2Ab gén egyetlen allélje, a H-2Ab NOD valószínuleg kulcsszerepet játszik (16). Ezt az Ab allélt egy teljesen normális Aa d gén kíséri. Az Ab NOD gén termékébol az 57. pozícióban hiányzik a negatív töltésu aszpartát. Az A? emberi megfelelojében, a DQ? -ban az 57. pozícióban hiányzó aszpartát pedig úgy tunik, a humán inzulin dependens diabetes kialakulásának hajlamával mutat szoros kapcsolatot (17). A NOD egerek másik sajátsága a H-2E gének defektusa, aminek következtében egyáltalán nem expresszálódik H-2E molekula. Az MHC - betegség asszociációkért felelos mechanizmusok vizsgálatát igen megnehezíti, hogy a hasnyálmirigy autoantigén egyelore nem ismert. Bizonyítékok vannak azonban arra, hogy az Ab NOD gén megléte és a H-2E expresszió hiánya egyaránt a betegség kialakulásához vezethetnek egerekben (18-19). Valószínu, hogy egerekben a betegség kialakulásában mindhárom fent említett mechanizmus szerepet játszik. Emberi 1-es típusú diabetes esetén a DQ? lánc 57-es pozíciójában lévo töltéssel rendelkezo aminosavmaradék protektív szerepe jól ismert. Sot már azt is leírták, hogy azok a HLA allélok, melyek a legerosebben kapcsolódnak a betegséggel (DQB1*0201 és DQB1*0302), olyan termékeket kódolnak, melyen a peptidköto rész azonos (3, 4), ami megkülönbözteti oket a többi DQ molekulától. Úgy látszik, ez a peptidkötodést erosen befolyásolja. Ez a determináns szelekció szerepét támasztja alá, bár hogy ez hogyan függ össze a diabetesre való hajlammal (például egy immunogén peptid megkötése, vagy a potenciálisan önreaktív T sejt klónok fennmaradása), egyelore ismeretlen (4). 19

20 2.4. A TUMOR NECROSIS FAKTOR (TNF) A tumor necrosis faktor az akut fázis válaszban és a szisztémás gyulladásos folyamatok kialakulásában fontos szerepet játszó citokincsalád. A TNF alfát (TNF-? ) elsosorban aktivált makrofágok, a TNF bétát (TNF-? ) pedig aktivált T-sejtek termelik, citotoxikus hatásúak, aktiválják az endothel sejteket. A TNF-a-t eloször tumorsejteket ölo és általános leromlást (cachexiát) okozó hatása alapján írták le (ez utóbbi miatt cachektinnek is nevezték). A TNF-a 25 kda molekulatömegu II. típusú membránfehérjeként szintetizálódik, amibol proteolitikusan hasad le a 17 kda méretu szekretált forma, amely stabil homotrimereket alkot. A szolubilis TNF-? egész sor inflammatórikus és immunmoduláns hatással rendelkezik, melyek a szervezet védekezésében fontosak.; a gyulladás legfobb mediátora, mind a szöveti destrukcióban, mind pedig a szövetkárosodás rekonstrukciójában fontos szerepet játszik. A szérum TNF-? szint szabályozása különbözo szinteken zajlik: gén transzkripció, az mrns stabilitás poszt-transzkripciós kontrollja, a membrán forma szolubilis formává alakulása és a receptorok expressziója (21). A TNF-? hatását két sejtfelszíni receptorhoz, a TNFR1-hez, illetve a TNFR2-höz kötodve fejti ki. A TNFR2 nagyobb affinitással köti meg a TNF-a-t, és úgy tunik, jobban köti a TNF-a-t alacsonyabb koncentrációk esetén. A TNFR receptoron keresztüli jelátviteli mechanizmusok pedig befolyásolják a T sejt proliferációt és a proinflammatórikus választ. Mind a TNFR1, mind pedig a TNFR2 receptor leválhat a sejt felszínérol, és szolubilis formát alkothat (22), ez a TNF funkció regulációjának újabb szintje. A szolubilis TNFR ugyanis neutralizálja a TNF-? aktivitást, versenyre kel a sejtfelszíni receptorokkal, de ezzel együtt stabilizálja is a TNF-a molekulát és meggátolja lebomlását (23). TNFR1 TNFR2 Apoptózis (Intracelluláris adaptor TRADD Antiinflammatórikus és antiapoptotikus és FADD molekulán keresztül, caspase 8 válasz (Intracelluláris adaptor modulátor és 3 aktiváció) TRAF1-gyel kötodve) Antiapoptotikus válasz (Intracelluláris Bizonyos körülmények között szintén adaptor modulátor RIP1 és TRAF2-vel mediálhat apoptózist és gyulladást. kötodve aktiválják a downstream géneket) 2.4. Táblázat. A TNF-a a TNFR1 és a TNFR2 receptoron keresztül közvetített hatásai (20). 20

21 A TNF-a szerepe igazolt autoimmun folyamatokban, rheumatoid arthritisben, szeptikus shockban és egyéb gyulladásos folyamatokban. A TNF-? úgy tunik, az eltéro betegségek pathomechanizmusában ellentétes szerepet játszik; bizonyos megbetegedések kialakításában elosegíto tényezo, míg más megbetegedéseknél az anti- TNF-? monoklonális antitesttel történo kezelés során a betegség fellángolását figyelték meg. A folyamatban lévo alapkutatások és klinikai vizsgálatok igazolták, hogy a TNF-a kulcsszerepet játszik a rheumatoid arthritis patogenezisében, a betegek kétharmada nagyon jól válaszol a TNF-? blokádra, akár monoklonális antitesttel, akár szolubilis TNF receptorral történik az (24). A magasabb TNF-a termelodéssel járó 8.1 osi haplotípus (HLA-A1, B8, TNFA- 308(2), TNFa2b3, DR3, DQ2, lásd késobb) bizonyos autoimmun betegségekre, így 1-es típusú diabetes mellitusra is prediszponál (lásd fejezet). A betegségek e nagy csoportjába tehát olyan betegségek tartoznak, melyeknél a TNF gátlásának terápiás hatása van; ide tartozik a rheumatoid arthritis, a Crohn betegség és a psoriasis. A rheumatoid arthritis esetén az anti-tnf és a szolubilis TNFR terápia egyaránt hatékony, a feltételezett mechanizmus a TNF-indukált gyulladásos válasz gátlása, illetve a csökkent makrofág aktiváció lehet (27). A Crohn betegségrol a késobbiekben részletesen szó lesz ( ), úgy tunik, az anti-tnf és a szolubilis TNFR kezelés csökkentik a monocyta-makrofág aktivációt (28). Psoriasis esetén leginkább az anti-tnf kezeléssel kapcsolatban vannak tapasztalatok, a kezelés hatására a borelváltozások drámaian javulnak, és az arthisises tünetek mérséklodnek, ennek hátterében valószínuleg a TNF által indukált immunválasz blokádja áll (29). Ugyanakkor egyre több bizonyíték áll rendelkezésre a tekintetben is, hogy a TNF-? blokád a betegeknél és a kísérleti állatoknál egyaránt fokozza bizonyos T-sejt dependens autoimmun megbetegedések súlyosságát. Ide tartozik a sclerosis multiplex (25), a kísérletes allergiás encephalomyelitis (26), és bizonyos szerzok szerint az 1-es típusú autoimmun diabetes NOD egerekben (24) A TNF alfa szekréció genetikai szintu szabályozása A TNF-? gén cluster a nagy polimorfizmussal jellemezheto MHC III régióban található. Számtalan nukleotid polimorfizmus (single nucleotid polymorphism, SNP) lehetséges a TNF-? génen belül. A promoter szakaszon belül ezek a következo pozíciókban vannak 21

22 (a transzkripció kezdeti helyéhez viszonyítva): 1031 (T? C), 863 (C? A), 857 (C? A), 851 (C? T), 419 (G? C), 376 (G? A), 308 (G? A), 238 (G? A), 162 (G? A) és 49 (G? A), bár a 419, a 163 és a 49 pozícióban a kaukázusi populációban a mutáció ritka (30). A TNF-? gén 5 régiója tehát igen nagyfokú polimorfizmussal rendelkezik. Ráadásul az elso exon + 70 pozíciójában egy citozin insertio (31), az elso intron pozíciójában pedig egy G? A szubsztitúció, a es pozícióban pedig egy guanin deléció lehetséges (32). Ezzel ellentétben a TNF-a gén 3 régiója igen konzervatívnak tunik. Waldron-Lynch és munkacsoportja vizsgálta a TNF-? 3 régióját rheumatoid arthritises betegek esetén, és egyetlen polimorfizmust sem találtak (33). A TNF gén clusteren belül is számtalan polimorfizmus létezik. Eddig 6 mikroszatellitát azonosítottak ( Táblázat, 34-35). Mikroszatellita TNFa TNFb* TNFc TNFd TNFe TNFf Repeat (GT)n (G/A)n (GA)n (GA)n (GA)n (CA)n szekvencia Allélszám Táblázat. Mikroszatellita markerek a TNF gén clusteren belül * A TNFb mikroszatellita mononukletotid tandem ismétlodésekbol áll. Bár 7 allélja lehetséges, európai populációban az allél 2 és az allél 6 nem fordulnak elo. Különbözo tanulmányok eredményei szerint eros linkage disequilibrium figyelheto meg e mikroszatelliták bizonyos alléljai és az MHC I és MHC II lókuszok között (36). A Táblázat e linkage disequlibriumokat ábrázolja. AH HLA-B HLA- HLA- TNF TNFa TNFb TNFc TNFd TNFe DRB1 DQB G G * A G G Linkage disequilibrium bizonyos HLA allélok és TNF mikroszatellita allélok között. AH: osi haplotípus 22

23 A TNF-? termelés genetikailag is szabályozott. Jó néhány tanulmány kimutatta, hogy eros korreláció figyelheto meg bizonyos HLA allélek jelenléte és az in vitro TNF-? termelés között. A HLA-DR3, DR1, DR4 és DR7 magasabb TNF-? termeléssel, míg a DR2 és a DR5 alacsonyabb TNF-? termeléssel járnak együtt (21). E jelenséget valószínuleg a TNF-? polimorfizmus és a HLA-DR típusok közötti eros linkage disequilibrium magyarázza. A promoter szakaszon kódolt SNP-k közül a legtöbbet tanulmányozott és a legjobban ismert a 308 pozícióban történo G? A szubsztitúció, az úgynevezett TNF2 allél. A G? A szubsztitúció fokozza a TNF-? transzkripcióját in vitro és in vivo egyaránt (21, 37). Két további tanulmány beszámolt arról, hogy a GG homozigótákból származó sejtek in vitro kisebb TNF-? termeléssel rendelkeznek, mint a GA heterozigótákból származó sejtek (38-39). Génesszé segítségével vizsgálva a 308 pozíció polimorfizmusát a tanulmányok egy része szerint az A allél jelenléte magasabb TNF-? termeléssel jár együtt (40), bizonyos tanulmányok szerint pedig az A allél a transzkripciót nem befolyásolja (41). Európában az egészséges populáció 29 34%-a TNF2 allél hordozó. A másik gyakrabban tanulmányozott polimorfizmus a 238 pozícióban lévo G? A szubsztitúció, az úgynevezett TNFA allél. Az eredmények a polimorfizmussal kapcsolatban igencsak ellentmondásosak. Egy tanulmányban a vad típusú G allél jelenlétében magasabbnak találták a TNF-? expressziót (41), ezt azonban mások nem erosítették meg. Magyarországon az egészséges populáció 5%-a TNFA allél hordozó. A 238 és a 308 promoter polimorfizmus szérum TNF-? szinteket, úgy tunik, nem befolyásolja (42, 43). A betegségek patogenezisében azonban a lokális TNF-? koncentrációk valószínuleg nagyobb jelentoséggel bírnak. Gyulladásos bélbetegségek esetén például azt figyelték meg, hogy a TNF-a mrns expresszió a bélfal mucosájában fokozódott, elsosorban a betegség inaktív stádiumában (44) A TNF alfa és a CRP gén szabályozása közötti kapcsolat A TNF-a közvetve egyéb citokinek és gyulladásos markerek szintézisét is befolyásolja. A CRP expressziójának szabályozása elsosorban transzkripciós szinten történik (45), a gén maga az emberi 1. kromoszómán található. A CRP transzkripciós szinten történo szabályozását kiterjedten tanulmányozták in vitro és in vivo egyaránt. Az összesített eredmények alapján a CRP gén legfontosabb induktora az interleukin-6 (IL-6), míg az interleukin-1 (IL-1), a glukokortikoidok és néhány egyéb faktor, mint a komplement 23

24 aktivációs termékek szinergista módon erosítik az IL-6 hatását (46). Az IL-6 szoros expressziós kontrol alatt áll, hormonok, citokinek és azok transzkripciós faktorai befolyásolják termelését (47). Ezek közül az IL-1 és a TNF-a aktiválják, míg az ösztradiol és a glükokortikoidok elnyomják az IL-6 gén transzkripciót (48). Vagyis a megnott IL-1/TNF-a termelés és a csökkent ösztrogén termelés fokozzák az IL-6 expressziót, ami a CRP szintézis növekedéséhez vezet. 24

25 2.5. AZ RCCX MODUL A humán fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) centrális régiójában elhelyezkedo másik igen nagy heterogenitású génszegmense az úgynevezett RCCX modul, ami közvetve vagy közvetlenül részt vesz sok MHC-asszociált betegség pathomechanizmusában. Az MHC középso régiójában elhelyezkedo RCCX (RP-C4- CYP21-TNX) modul körülbelül 200 kb hosszúságú, és az MHC II régióhoz képest telomerikusan helyezkedik el (49, 50) Az RCCX modul négy, tandem módon elhelyezkedo génbol áll, melyek a következok: RP, komplement komponens 4 (C4), szteroid-21-hidroxiláz (CYP-21) és tenascin X (TNX, 51). Az RCCX modul karakterisztikus jellemvonása a szerin/treonin kináz RP (STK 19-ként is ismert), és az extracelluláris mátrix protein tenascin-x (TNX) duplikációja, valamint a komplement komponens C4 és a citokróm 21-hidroxiláz gén (CYP21) komplett duplikációja. Egy MHC haplotípusban 1 3 RCCX modul lehet jelen, bár mind ázsiai, mind pedig kaukázusi populációkban találtak quadrimoduláris RCCX haplotípust négy C4 génnel (52). A diploid genomban szereplo C4 gének száma (vagyis a gén dózisa) elsosorban egyénenként 2 és 6 között változhat. C4 gének. A C4 protein a klasszikus komplement kaszkád nélkülözhetetlen alkotórésze. Aktivált formájában a C3 és a C5 konvertázok alkotórésze, ezek az enzimatikus komplexek aktiválják a C3-a és a C5-öt a klasszikus, illetve a lektin komplement aktiváció folyamán. A konvertázok termékei a C3a illetve a C5a, melyek anaphylatoxikus hatással rendelkeznek, valamint a C3b, és a C5b. A C5b fragmentum az antigén felületére kötodik, és a membrán attak komplex (MAC) kialakításában vesz részt. A C4 protein hiánya vagy túl magas szintje befolyásolja a szervezet védekezo képességét. A C4 protein hiánya az immunkomplexek eliminálásának károsodásához, rossz memória B sejt funkcióhoz, valamint a bakteriális és virális infekciók perzisztálásához, a kompelment komponens C4 túlzott termelodése pedig a komplement útvonal fokozott aktiválódásához vezethet (53-56). A C4-nek két fenotípusa létezik, a C4A (savas, acidic) és a C4B (bázikus, basic), összesen több mint 34 allotípussal.(57). A C4A és a C4B proteinek kovalens kötési képessége egymástól kissé eltéro. A C4 poligenikus és génméret variációk eredményeként az egyén C4 protein szérum koncentrációja 100 és 1000 mg/l között igen különbözo lehet, a C4A és C4B gének relatív mennyiségétol függoen (58). Bár ezt a jelenséget körülbelül egy évtizeddel ezelott már felismerték, a humán komplement komponens C4 qualitatív és quantitatív variációinak okát nem tudták pontosan megmagyarázni. 25

26 A C4A és a C4B proteinek szekvenciája 99%ban azonos, az elektroforetikus aktivitás, a hemolitikus aktivitás és a kémiai reakciókészség tekintetében azonban egymástól igen különböznek: a C4A 100-szor erosebben köti kovalens kötéssel az amino-csoportot vagy a peptid antigéneket, mint a C4B, míg a C4B tízszer hatékonyabban kötodik a hydroxil csoportokhoz, vagy a szénhidrát antigénekhez. A C4A emiatt háromszor hatékonyabban kötodik immunkomplexekhez, mint a C4B. Mind a C4A, mind pedig a C4B esetén találtak olyan protein variánsokat, melyek hemolitikus aktivitása alacsony. A C4B proteinek valószínuleg hagyományos szerepet töltenek be a komplement aktivációs útvonal beindításában és a membrán attak komplex létrejöttében, valamint az anaphylatoxinok képzodésében. A C4A proteinek pedig valószínuleg az opszonizáció és az immunoclearance folyamatában játszanak szerepet. A C4A és C4B genetikai kifinomultsága az intakt immunitás számtalan variációját teszi lehetové az emberi populációkban (52, 59). A C4 gének kódolják a C4A és/vagy C4B proteineket. A kaukázusi populációban a C4 gének körülbelül háromnegyede tartalmaz egy endogén retrovírust, a HERV-K-t. A HERV-K (C4) a 9. intronba épül be, ami dichotomiát okoz a C4 gén méretében, melynek hosszúsága az endogén retrovírus nélkül 14,2 kb, az endogén retrovírussal együtt pedig 20,6 kb (52, 60). A C4 genetikájának komplexitása elképeszto: a variációk frekvenciája szokatlanul nagy mind a gének száma, mind pedig azok mérete tekintetében. A C4 hiány gyakori a populációban, a C4A null allélfrekvenciája 5 15%, a C4B null allélfrekvenciája pedig 10 20% között mozog (51), bár a C4AQ0 és a C4BQ0 homozigóták elofordulási gyakorisága igen ritka, 1-2%. A C4A és C4B komplett hiánya tehát igen ritka, ez azonban súlyos immunkomplex betegséggel jár együtt. Majdnem mindegyik komplett C4 deficiens beteg SLE-ben, DLE-ben, vagy egyéb immunkomplex betegségben szenved. A C4A vagy C4B deficiencia legtöbbször a specifikus C4A vagy C4B gén hiánya vagy deléciója miatt jön létre, de létrejöhet a mini deléciók vagy pontmutációk következtében létrejött úgynevezett pseudogének miatt is (51). A C4 gének száma a kaukázusi populációban a diploid genomban egyénenként általában 2 és 5 között van, igen ritkán elofordul, hogy egy egyén hat C4 génnel rendelkezik. Az egyének többségének genomjában négy C4 gén található. Az összes C4 gén átlagosan 75%-a tartalmazza a HERV-K retrovírust (53), vagyis hosszú (20 kb) C4 gén, 25%-uk pedig nem tartalmazza a retrovírust, vagyis rövid (14 kb) C4 gén. A genomban a C4 gének átlagos száma a kaukázusi populációban 3,8, a C4A gén index 2, a C4B gén index pedig 1,8 (58). 26

27 A C4A és C4B qualitatív variációi. A C4A-nak számtalan allotípusa létezik, a leggyakoribb a C4A3, viszonylag gyakori a C4A2, C4A6 és a C4AQ0 is. A C4B protein leggyakoribb allotípusa a C4B1, viszonylag gyakori a C4B2, a B92, és elofordulhat C4BQ0 is (58). A C4A és C4B quantitatív diverzitása. A szérum C4 koncentráció és a C4 gének száma között eros pozitív korreláció figyelheto meg; a kevés C4 génnel (2-3) rendelkezo egyéneknél a C4 szérum koncentráció alacsonyabb, mint a 4 vagy 5 C4 génnel rendelkezoknél. Az össz C4 koncentráció szignifikánsan magasabb a 2, 3 vagy 4 C4A génnel rendelkezok körében, mint azoknál, akiknek 0 vagy 1 C4 génjük van. Az C4B gének száma és az össz C4 szérum koncentráció között pedig úgy tunik, nincsen összefüggés (58). Hemolitikus aktivitás. Az átlagos C4 hemoltitikus aktivitás és a genomban lévo C4 gének száma között egyenes arányosság figyelheto meg; a több C4 génnel rendelkezo egyének C4 hemolitikus aktivitása magasabb. Azoknál az egyéneknél, akik több (2, 3 vagy 4) C4A génnel rendelkeznek, a hemolitikus aktivitás magasabb, mint azoknál, akik nulla vagy 1 C4A génnel rendelkeznek; míg a C4B gének száma és a C4 hemolitikus aktivitás között pedig úgy tunik, nincsen kapcsolat. A C4 hemolitikus aktivitás független a hosszú C4 gének (L) számától, míg átlagosan magasabb, ha az egyén több (1-3) rövid, retrovírust nem tartalmazó C4 génnel rendelkezik. A C4 hemolitikus aktivitás egyenes arányban van a szérum C4, C4A és C4B koncentrációkkal (58). Szteroid 21-hidroxiláz gének, CYP21A és CYP21B. A szteroid 21-hirdoxiláz a glukokortikoidok és a mineralokortikoidok szintézise során kulcsszerepet játszik. A CYP21 teljes hiánya sóvesztéshez, alacsony aktivitása virilizációhoz vezet. A CYP21A pszeudogén, mert három deléciós mutációt tartalmaz. Amennyiben a CYP21A deléciós mutációi a CYP21B génbe is beépülnek, vagy a CYP21B gén deléció áldozatául esik, a betegnél congenitalis adrenalis hyperplasia lép fel. Tenascin TNXA és TNXB gének. A congenitalis adrenalis hyperplasiában szenvedo noket vizsgálva kiderült, hogy a TNXA és a TNXB gének átfedik a CYP21A és CYP21B géneket. A TNXA és TNXB transzkripciós orientációja a CYP21-gyel és a C4- gyel éppen ellentétes. A TNX funkciója nem teljesen ismert. A TNXB transzkriptumai következetesen expresszálódak a foetusban, a legmagasabb szinteket az izomzatban és a herékben érik el. 27

28 RP1 és RP2. Az RP1 (más néven G11) és az RP2 a humán C4A és C4B gének kezdeténél találhatók. A TNX-hez hasonlóan az RP is részlegesen duplikált. Az RP2 duplikált génszakasza az RP1 utolsó 913 bázispárjával azonos, és nem valószínu, hogy génterméket kódolna. Az RP2 és a TNXA génszegmensei chimera szerkezetet formálnak a CYP21A és a C4B között. Az RCCX modul (RP-C4-CYP21-TNX) moduláris variációi. A négy tandem módon szervezodött gén, az RP, a komplement C4, a szteroid 21-hidroxiláz (CYP21) és a tenascin TNX úgy tunik, genetikai egységbe szervezodtek. A C4 gének duplikációját vagy delécióját mindig az RCCX modulban szereplo szomszédos gének kísérik. Az RCCX modul duplikációja vagy triplázódása egy 32,5, vagy egy 26,2 kb nagyságú génszegmens hozzáadása eredményeként jön létre: egy hosszú, vagy rövid C4 gén, a CYP21 gén, és a TNXA-RP2 chimera. Az RCCX bimoduláris haplotípusban a két C4 locus között elhelyezkedo gének/gén szegmensek, a CYP21A, a TNFA és az RP2 mind hibás szekvenciák, funkcionális termékeik nincsenek. Egy RCCX monomoduláris haplotípusban az intakt RB1 és TNXB gének mindig egy C4A vagy C4B génnel, és egy CYP21A vagy CYP21B génnel együtt vannak jelen. A C4A vagy C4B gének lehetnek rövidek, vagy hosszúak. A relatíve ritka trimoduláris haplotípusokat kizárva négy fo RCCX moduláris struktúra lehetséges a populációban. L vagy mono-l monomoduláris, egy hosszú C4 génnel S vagy mono-s monomoduláris, egy rövid C4 génnel LL bimoduláris, két hosszú C4 génnel LS bimoduláris, egy hosszú és egy rövid C4 génnel SS bimoduláris, két rövid C4 génnel LLL trimoduláris RCCX három hosszú C4 génnel LSS trimoduláris egy hosszú és két rövid C4 génnel LLS trimoduláris két hosszú és egy rövid C4 génnel LLLL quadrimoduláris, 4 hosszú C4 génnel ábra. Az RCCX modul nomenklatúrája. 28

29 Ábra. Az RCCX moduláris variációi. [Blanchong et al; Int Immunopharm 2001; 1: ] Az egészséges kaukázusi populációban a haplotípusok a következoképpen alakulnak: 55,9% bimoduláris L-L, 29,7% bimoduláris L-S, 3,5% monomoduláris L és 10,7% monomoduláris S. Más szavakkal a 6. kromoszómák 85%-a bimoduláris, 15%-a monomoduláris RCCX-szel rendelkezik. A C4 gének 78%-a hosszú, 22%-a rövid. A 29

30 RCCX modul igen gyakori méretbeli és számbeli különbözoségei, az RP2 és a TNXA részleges duplikációja, és a CYP21A pszeudogén jelenléte nagy valószínuséggel hozzájárulnak az MHC III. régió genetikai variabilitásához és instabilitásához. Az RCCX modulok közötti rekombináció gén delécióhoz vagy duplikációhoz vezethet. Az RCCX bimoduláris és monomoduláris struktúrája közötti rekombináció (1) a komplement C4 lókuszok közötti szekvenciák kicserélodéséhez vagy homogenizációjához, (2) a pszeudogén CYP21A, vagy a TNXA génszegmens szerzett deléciójához vezethetnek (61). 30

31 2.6. A 8.1 OSI (ANCESTRAL) HAPLOTÍPUS A fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) génjei között igen eros kapcsolt öröklodés, linkage disequilibrium figyelheto meg. Az MHC-n belül megfigyelheto linkage disequilibriumnak köszönhetoen nagy kiterjedésu konzervált génszakaszok maradtak fenn, az úgynevezett ancestral (osi) haplotípusok ( táblázat). Osi haplotípus HLA-B TNFAB C4A C4B TNF-? 308 HLA- DRB1 HLA- DQB a11b4 2 1 G a2b3 0 1 A a2b G a7b4 3 1 G a2b1 3 3 G Táblázat. Osi haplotípusok Az érdeklodés középpontjában a 8.1 ancestral haplotípus áll, melynek kapcsolata a különbözo autoimmun betegségekkel jól ismert. A 8.1 osi haplotípus a következo allélokból tevodik össze: HLA-A1, B8, TNFa2b3, C2C, BfS, C4AQ0, C4B1, HERV(C4)0, TNFA-308*2, DRB1*0301, DQA1*0501, DQB1*0201 (15, 62-65). Saját és egyéb kutatócsoportunk is beszámolt már korában arról, hogy a 8.1 osi haplotípus rövid C4B1 génnel rendelkezik, ami egy monomoduláris RCCX struktúra része (66-68) Ez a haplotípus igen gyakori Észak-Európában, és számtalan immunpatológiai megbetegedéssel mutat összefüggést. A 8.1 osi haplotípust hordozó egészséges egyéneknél az immunválasz számtalan alterációja figyelheto meg. A 8.1 osi haplotípus mind in vivo, mind pedig in vitro magas TNF-a termelodéssel jár együtt, ami felelos lehet az emelkedett selam-1, a kortizol és IL-10 szérum szintekért. A fokozott TNF-? termelés legalábbis részben magyarázhatja az autoimmun betegségekkel és az immunválasz hibás regulációjával mutatott összefüggést (69). 31

32 2.7. EGYES BETEGSÉGEK GENETIKAI HÁTTERE Diabetes mellitus A WHO 1998-as ajánlása szerint a diabetest ma a következoképpen osztályozzák (70): 1-es típusú diabetes (Korábban IDDM, béta sejt destrukció, ami általában abszolút inzulin hiányhoz vezet, szigetsejtes autoantitestek (ICA, GADA) jelenléte) - Autoimmun diabetes. Két formája ismeretes, az 1-es típusú diabetes és a Látens Autoimmun Diabetes Felnottkorban (LADA). A LADA esetén a betegség 35 év felett kezdodik, a betegek legalább fél évig nem szorulnak inzulinkezelésre, és esetükben legalább 1 autoantitest pozitivitás kimutatható. Az 1-es típusú diabetes progressziója gyorsabb, a betegség átlagosan korábban kezdodik, azonnali inzulinadást igényel. - Idiopathiás diabetes 2-es típusú diabetes (Széles tartományban változhat; lehet elsosorban inzulin rezisztencia relatív inzulin hiánnyal, illetve elsosorban szekréciós defektus inzulin rezisztenciával vagy anélkül) Egyéb típusok Béta sejt funkció genetikus defektusa Inzulin hatásmechanizmusának genetikus defektusa Exocrin pancreas megbetegedései Endocrinopathiák Gyógyszer indukálta diabetes Fertozések Gesztációs diabetes A HLA és a diabetes kapcsolata Az 1-es típusú, autoimmun, inzulin dependens diabetes mellitus és a humán leukocita antigén (HLA) közötti kapcsolatot kiterjedten tanulmányozták az elmúlt évtizedben (71-74). E tanulmányokból a következo sajátosságok váltak nyilvánvalóvá:? Elsosorban a HLA II gének (MHC II) felelosek az autoimmun diabetes és a fo hisztokompatibilitási komplex (MHC) gének között megfigyelt igen eros asszociációért. 32

33 ? Az asszociációban elsodleges szerepet játszanak a HLA-DQ lókusz specifikus alléljai.? A folyamatban különbözo HLA allélok játszhatnak szerepet, melyek a vizsgált populációkban igen eltéroek lehetnek.? A betegséggel legerosebb asszociációt a HLA-DQB1*0302 allél jelenléte mutatja a legtöbb vizsgált populációban.? A HLA-DQB1*0302 allél jelentette kockázatot más gének, ide sorolva a többi MHC gént is, igen eroteljesen befolyásolhatják. Az 1-es típusú diabetes mellitus igen erosen asszociált az MHC II génekkel, a HLA-DQval és DR-rel, de egyéb genetikai tényezok, mint a 11. kromoszómán található inzulin gén, vagy a 12. kromoszómán található citotoxikus T limfocita antigén is szerepet játszhatnak a betegség kialakulásában (75). Az 1-es típusú diabetes pozitívan asszociált a DQB1*0302 (DQ8), a DQB1*0201 (DQ2), a DQB1*0604 (DQ6), a DRB1*03 (DR3), illetve A DRB1*04 (DR4) allélok jelenlétével, míg a DQB1*0602 (DQ6), a DQB1*0301 (DQ7) allélok protektív tényezoként szerepelnek betegség kialakulásával szemben ( Táblázat, 76-77). Egyes szerzok negatív asszociációt találtak a betegség kifejlodése és a DRB1*11, illetve a DRB1*15 allélok jelenléte között (77-78). Bizonyos irodalmi adatok szerint a hajlamosító HLA gének jelenléte és a betegség kezdete között eros korreláció figyelheto meg; azoknál a betegeknél, akiknél a diabetes kezdete késobbre teheto (15 évnél idosebbek), a hajlamosító allélok frekvenciája jóval kisebb (79). Horton és kollégái a UKPDS tanulmányban kimutatták, hogy az 1-es típusú diabetes manifesztációjának idopontját legalábbis részben befolyásolta a DRB1/DQB1 genotípus. Minél idosebb volt a vizsgált korcsoport a diabetes kezdetekor, annál alacsonyabb volt a hajlamosító DRB1*03/DRB1*04/DQB1*0302 genotípus frekvenciája. A szigetsejtes antitestek (ICA) és a glutaminsav dekarboxiláz antitestek (GAD) jelenléte pedig fiatalkorban igen eros korrelációt mutatott a DRB1*03/DRB1*04/DQB1*0302 genotípussal, míg 55 év felett igen kicsi volt a HLA gének és a szigetsejtes antitestek jelenléte közötti kapcsolat (80). MHC II hajlamosító gén DQ-DR haplotípus Relatív kockázat DQB1*0302 DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*04 8 szoros DQB1*0201 DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*03 4 szeres Táblázat. HLA -DQB1 hajlamosító gének autoimmun diabetesben. 33

34 A HLA-DQB1*0302 és a DQB1*0201 allélok együttes jelenléte növeli a betegség kialakulásának kockázatát ( Táblázat). Irodalmi adatok szerint a DQB1*0302/DQB1*0602 heterozigótáknál a diabetes kialakulásának kockázata csökken (77). DQ-DR haplotípus Relatív kockázat DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*04 / DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*03? 20 DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*03 / DQB1*0303-DQA1*0301-DRB1*09? 8 DQB1*0402-DQA1*0301-DRB1*08 / DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*04? Táblázat. MHC II heterozigótáknál látható szinergizmus az 1-es típusú diabetes kialakulásának kockázatára A HLA-DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*04 és a DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*03 haplotípusok a legtöbb tanulmányozott populációban igen eros betegség asszociációt mutatnak, míg a HLA-DQB1*0602-DQA1*0102-DRB1*15 protektív tényezoként szerepelnek (81). Az MHC-n belül megfigyelheto linkage disequilibriumnak köszönhetoen nagy kiterjedésu konzervált génszakaszok maradtak fenn, az úgynevezett ancestral (osi) haplotípusok. Az érdeklodés középpontjában a 8.1 ancestral haplotípus áll (HLA-A1, B8, TNFA-308*2, DRB1*0301, DQA1*0501, DQB1*0201), melynek kapcsolata a különbözo autoimmun betegségekkel, köztük az 1-es típusú diabetessel jól ismert. Cheong és munkatársai B8-, DR3+ diabeteses betegeket és kontrollokat vizsgálva azt is kimutatták, hogy ezt módosíthatják a 8.1 osi haplotípus TNFA-308/D6STNFa és HLA-B közötti alléljai, melyek szignifikánsan nagyobb frekvenciával fordulnak elo a B8-, DR3+ diabeteses betegeknél, mint a B8-, DR3+ kontrollok körében; e területen a legmarkánsabb a BAT1 és a MIB mikroszatellita allél polimorfizmusa volt (82). Az antitestekkel és a T sejt receptorokkal ellentétben az MHC gének által kódolt molekulák repertoárja egyénenként igen korlátozott. A szükség diktálja, hogy az immunválasz megkezdése érdekében minden egyes MHC II protein multiplex peptid ligandok megkötésére kell alkalmas legyen. A HLA gén lókusz bár egyike a legnagyobb polimorfizmust mutató régióknak, a különbözo allélok szekvenciája igen nagy fokban homológ. A horgony köto régióban a DQ? és? láncok szekvenciája közel 95%-ban azonos. 34

35 A HLA-DQ3.2 molekula (DQB1*0302-DQA1*0301) igen eroteljesen asszociált az 1-es típusú diabesessel, míg a DQ3.1 (DQB1*0301-DQA1*0301) és a DQ3.3 (DQB1*0303- DQA1*0301) nem. E három MHC molekula? lánca teljesen megegyezik, a? láncok homológiája pedig közel 97-99%-os. A peptid köto régióban a DQ3.1 és a DQ3.2 négy ponton különbözik; a 13., a 26., a 45. és az 57. pozícióban (1, 4, 6 és 9 relatív pozíciók). A DQ3.3 az 57. pozíció kivételével azonos a DQ3.2-vel. Ismert az is, hogy a diabetes kialakulásában szerepet játszó glutaminsav dekarboxiláz 65 (GAD65) 13-reziduum fragmense erosen kötodik a DQ3.2-höz, míg igen gyengén kötodik a DQ3.3-hoz, és egyáltalán nem kötodik a DQ3.1-hez (83). A GAD65 feltételezhetoen 1-es típusú diabetes autoantigén (84), a 13-reziduum peptid fragmens (más néven 34p) nagy szekvencia homológiát mutat a Coxsackie vírus B4 P2-C fehérjéjébol származó legeroteljesebben immunogén peptidjével, amirol köztudott, hogy az 1-es típusú diabetes egyik legeroteljesebb környezeti trigger tényezoje (85) A TNF alfa és a diabetes kapcsolata Az 1-es típusú diabetes és az MHC III gének, így a tumor nekrózis faktor alfa gén közötti kapcsolat nem teljesen ismert. Amint már korábban is szó volt róla, a TNF alfa gén promoter régió 308 pozíciójában lévo G? A csere (a TNF2 allél) in vitro és in vivo tanulmányok eredményei szerint fokozza a TNF-a transzkripcióját (37), a mutáció magasabb TNF-a termeléssel jár együtt (38-40). Mitchell és munkatársai (86) valamint Lio és munkatársai (69) pedig arról számoltak be, hogy a magasabb TNF-a termeléssel járó 8.1 osi haplotípust (HLA-A1, B8, TNFA 308(2), TNFa2b3, DR3, DQ2) hordozó egyének körében nagyobb valószínuséggel fejlodik ki autoimmun betegség, így 1-es típusú diabetes. Az 1-es típusú diabetes és a TNF-a mikroszatelliták közötti kapcsolatot többen is tanulmányozták. Obayashi és kollégái (87) tanulmányai szerint a TNFa2 és a TNFa9 allélok szignifikánsan gyakrabban fordultak elo a fiatalkorban kezdodo 1-es típusú diabeteses betegek esetén, mint a kontroll csoportban, míg ugyanez a különbség nem volt látható a felnottkorban kezdodo 1-es típusú diabetes és a kontroll csoport között. Hajeer és munkatársai pedig arról számoltak be, hogy a TNFa2 allél frekvenciája szignifikánsan magasabb volt 1-es típusú diabeteses betegek körében, és a TNFa2 allélrol ismert, hogy in vitro magasabb TNF-a termelodéssel jár együtt (21). Egyes szerzok összefüggést találtak a TNFa12 allél jelenléte és a felnottkori 1-es típusú diabetes kialakulása között; a TNFa12 allél jelenléte felelos lehet az inzulin függoség progressziójáért (87-88). 35

36 A gyulladásos bélbetegségek A gyulladásos bélbetegség (IBD, Inflammatory Bowel Disease) a gastrointestinális traktus krónikus gyulladásos bántalma. Két nagy csoportja ismert, a Crohn betegség (CD) és a colitis ulcerosa (CU) (89, 90). Az IBD valószínuleg a mucosális immunrendszer nem megfelelo, folyamatos aktivációjának eredményeképpen jön létre a normál bélflóra jelenléte mellett (91). Pontos etiológiája egyelore ismeretlen, multifaktoriális megbetegedés, melynek kialakulásában multiplex gének és a környezeti tényezok együttesen játszanak szerepet. A környezeti tényezok közül a legjobban a dohányzás szerepe ismert, a tobacco hatása azonban ellentétes a Crohn betegség és a colitis ulcerosa esetén. A legfontosabb kockázati tényezo a pozitív családi anamnézis, ami a betegség genetikai prediszpozíciójára utal. A különbözo populációk között a CD és a CU incidenciája és prevalenciája igen eltéro, továbbá a betegségre a családi halmozódás is jellemzo. Tanulmányok bebizonyították, hogy az elsofokú rokonok között a betegség kialakulásának kockázata közel 7%, ami a háttér populáció kockázatának populációtól függoen 4-20 szorosa (92). Egypetéju ikreknél a betegség konkordancia aránya Crohn betegség esetén 20 44%, colitis ulcerosa esetén pedig 6 16%. Az IBD etiológiájában legeloször a 6. kromoszóma szerepe vetodött fel. Genom vizsgálattal egyéb olyan lókuszokat is azonosítottak, melyek szerepet játszhatnak a betegség kialakulásában; az IBD1 lókuszt a 16. kromoszómán, egyéb lókuszokat az 1., a 3., a 4. és a 7. kromoszómákon (92) HLA és a gyulladásos bélbetegségek A 6. kromoszóma úgy tunik, fontos szerepet játszik a betegség kialakulásában. Számos tanulmány számolt be a betegség és az MHC I, II, és III. régióban található allélok közötti összefüggésrol (93). Számtalan kísérlet történt a betegséggel akár pozitívan, akár negatívan asszociált HLA antigének meghatározására. Az eredmények mind a Crohn betegség, mind pedig a colitis ulcerosa esetén igen változatosak voltak. A betegek egy kis csoportjával kapcsolatban megegyeznek a tanulmányok; amennyiben a gyulladásos bélbetegséghez Bechterew kór (spondylitis ankylopoetica, HLA-B27 érintettség), vagy sclerotizáló cholangitis (HLA-DR3(DQ2, vagy DR2) is társul (94). Crohn betegség esetén a tanulmányok többsége egyetért abban, hogy a CD nem asszociált a HLA génekkel (95-97); míg mások a DR7 hajlamosító szerepét, a DR3 protektív szerepét írták le (99, 100). Egyes szerzok szerint a HLA-DRB1*03 jelenléte védettséget biztosít a fistulaképzodés ellen (97). 36

37 A colitis ulcerosa kialakulásában úgy tunik, fontos szerepe van a HLA-DRB1*0103 és a DRB1*15 (DR2) allélok jelenlétének; míg a DRB1*04 (DR4) és a DRB1*13 (DR6) allélok jelenléte protektív tényezonek bizonyult (96, 98, ). A DRB1*03/DQB1*0302 (DR3/DQ8) haplotípus jelenléte nokben és férfiakban egyaránt hajlamosít az extenzív colitis ulcerosa kialakulására (94), de nem mutat összefüggést a sebészi beavatkozás indikációjával A TNF alfa és a gyulladásos bélbetegségek kapcsolata A tumor necrosis faktor alfa kulcsszerepet játszik a betegség kórélettanában (94). IBDben a TNF-a mrns expresszió a bélfal mucosájában fokozódik, foleg a betegség inaktív stádiumában (44). Ráadásul a klinikai vizsgálatokban az anti-tnf-a monoklonális antitest terápia bizonyítottan hatékony volt a Crohn betegség kezelésében (103). A TNF-a gén az MHC III régióban 850 kb távolságra helyezkedik el a HLA-DR géntol. A kromoszomális elhelyezkedés és a funkcionális összefüggés miatt felmerült, hogy a Crohn betegség és a HLA-DRB1 gének közötti kapcsolat legalábbis részben a TNF-a gén polimorfizmusainak köszönheto. Kawasaki és kollégái ezzel ellentétben arról számoltak be, hogy a HLA-DRB1 és a TNF-a promoter polimorfizmus egymástól függetlenül járulnak hozzá a Crohn betegség kialakulásához (104). A TNF-a gén promoter régiójának polimorfizmusát a 238 (G/A) és a 308 (G/A) pozícióban, és annak betegség asszociációit kiterjedten tanulmányozták, Kawasaki és munkacsoportja pedig a TNF-a promoter régiójában a 1031, a 863 és a 857 pozíciót vizsgálták, eredményeik szerint a TNFA-UO3 promoter haplotípus ( 1031C, 863A és 857C) frekvenciája nott, a TNFA-UO4 haplotípus ( 1031C, 863C és 857C) frekvenciája pedig csökkent Crohn betegségben (104). Más szerzok a TNFA és TNFB lókuszokhoz közel elhelyezkedo TNF-a mikroszatellitákkal mutattak ki kapcsolatot (105, 106). A legtöbbet vizsgált 308-as és 238-as polimorfizmus tekintetében az eredmények igen ellentmondásosak. Egyes szerzok szerint a TNF2 allél frekvenciája enyhén, de nem szignifikánsan csökkent a Crohn betegek körében az egészséges populációval összehasonlítva (100), vagyis a 308 pozíció polimorfizmusa befolyásolhatja a Crohn betegség természetét. A TNF2 allél hordozása kedvezhet a szteroid dependens, illetve a kevésbé kiterjedt fistulaképzo betegség kialakulásának, ami valószínuleg az intenzívebb TNF-a gyulladásos válasz következménye (107). Más szerzok szerint a TNF2 allél szignifikánsan ritkábban fordul elo a colitis ulcerosás betegek körében, mint a kontroll 37

38 populációban (38), megint más szerzok semmilyen szignifikáns különbséget nem találtak a TNF2 carrier frekvencia tekintetében az IBD-s betegek és a kontroll csoport között (108, 109). Alcsoport analízis során azonban kiderült, hogy a TNF2 allélt hordozók száma szignifikánsan magasabb volt az extensív colitises nok, mint a distalis colitises nok körében (31%, illetve 12%), a különbség statisztikailag is szignifikánsnak bizonyult (110). Alcsoportokat vizsgálva az is kiderült, hogy a HLA-DRB1*03, amennyiben a vele eros kapcsoltságot mutató TNF-a 308 polimorfizmusban nincs G? A csere, védettséget nyújt a Crohn betegség fistulaképzodéssel járó alcsoportjával szemben. Bouma és kollégái (97) perianalis fistulával rendelkezo Crohn betegeket vizsgáltak, eredményeik szerint a DRB1*03 allél frekvenciája a betegek körében eroteljesen csökkent, a HLA-DRB10* allélal eros linkage disequlilibriumot alkotó TNF2 allél frekvenciája azonban nem különbözött a kontroll csoportétól (34%). A japán populációról közölt eredmények a fent említettektol némiképp különböznek; Japánban a TNF2 allél frekvenciáját négyszer gyakoribbnak találták a colitis ulcerosás betegek, mint az egészséges populáció körében (110). Igaz, hogy amíg Európában az egész populációban a TNF2 karrierfrekvenciája 29-34%, addig Japánban a karrierfrekvencia 4%. 38

39 3. KUTATÁSI CÉLOK 3.1. A TNF-a gén promoter polimorfizmus, az RCCX modul variánsok, a C4A és C4B variánsok és az RCCX modul variánsok közötti kapcsolat vizsgálata Vizsgálatunk célja a TNF-a gén promoter régió polimorfizmusának vizsgálata volt a 308 és 238 pozíciókban két egészséges kaukázusi populációban, egy közép-európai és egy Egyesült Államokbeli populációban. Vizsgáltuk továbbá a két populációban a komplement komponens C4A és C4B genomikus diverzitását, az RCCX modul hosszúsági variánsokat, a C4A és a C4B polimorfizmust a TNF alfa promoter polimorfizmus függvényében. A Yu és munkacsoportja által kifejlesztett módszer az elso olyan vizsgálati technika, mellyel frappánsan meg lehet határozni az RCCX modult, így a kapcsoltsági öröklodés vizsgálata is könnyebbé vált AZ MHC II (DR, DQ) és MHC II (TNF-a) régióban kódolt allélok vizsgálata autoimmun diabetesben A tanulmány célja elsosorban annak tisztázása volt, hogy van-e genetikai különbség az MHC II és III régióban az 1-es típusú diabetes mellitus és a Látens Autoimmun Diabetes (LADA) között. Az 1-es típusú diabetes mellitus és bizonyos MHC II gének közötti összefüggés jól ismert, e gének és a LADA közötti lehetséges összefüggésrol azonban korábbi irodalmi adatok nincsenek. A két betegség kialakulásában autoimmun folyamatok szerepét feltételezik; a két betegség klinikai viselkedése azonban eltéro. Kérdés, hogy magyarázza-e valamilyen genetikai eltérés, hogy míg az egyik betegség, az 1-es típusú diabetes mellitus lefolyása igen gyors, a betegek igen gyorsan inzulinkezelésre szorulnak, addig a LADA betegség esetében az autoimmun béta-sejt pusztulás lefolyása elhúzódó, a betegek akár hosszú ideig is megvannak inzulinkezelés nélkül, bár a betegség végül ez esetben is a béta sejtek kimerüléséhez és végül inzulinkezeléshez vezet. Vizsgálatunk elsodleges célja a HLA-DR és DQ haplotípusok, valamint a tumor necrosis faktor a gén promoter 308 és 238 pozíciójában lévo polimorfizmus meghatározása volt 1-es típusú autoimmun diabetesben, és annak késoi formájában, a Látens Autoimmun diabetesben (LADA), valamint az egészséges magyar populációban. Az 1- es típusú autoimmun diabetes és a különbözo HLA gének közötti kapcsolat jól ismert, kevesen vizsgálták azonban a LADA-t, mint különálló betegséget, és eddig senki nem vizsgálta a diabetes és a tumor necrosis faktor a promoter régióbeli polimorfizmusa 39

40 közötti kapcsolatot. Elsosorban arra kerestük a választ, hogy van-e valamilyen különbség a két betegség genetikájában, illetve ez a különbség felelos lehet-e a két betegség eltéro viselkedéséért, hiszen az egyik betegség igen rapid lefolyású, már a diagnózis felállításakor inzulin kezelést tesz szükségessé, míg a LADA lefolyása ennél jóval enyhébb, késobb kezdodik, a betegek késobb szorulnak inzulin kezelésre, bár mindkét betegség autoimmun eredetu A TNF-a gén promoter polimorfizmus vizsgálata gyulladásos bélbetegségben. A TNF-a gén plazma CRP szintekre kifejtett hatásának vizsgálata. Vizsgálatunk célja a TNF-a gén promoter régiójának 308 és 238 pozíciójában kódolt allélok frekvenciájának meghatározása volt a gyulladásos bélbetegség (Crohn betegség, colitis ulcerosa) és az egészséges kontrollcsoport esetén. Meghatároztuk a szérum CRP szinteket Crohn betegek és colitis ulcerosás betegek körében, valamint az egészséges populációban. A CRP szint a betegség aktivitásának fontos meghatározója. Elsosorban arra kerestük a választ, hogy a betegség és a TNF-a asszociációjával kapcsolatos eltéro irodalmi adatok Magyarországon hogyan érvényesülnek, valamint van-e kapcsolat a plazma CRP szintek és a TNF-a promoter régióbeli polimorfizmusa között a különbözo klinikai státuszú gyulladásos bélbetegségben szenvedo betegek körében. Irodalmi adatok szerint ugyanis a hepatikus CRP termelés egyik legfobb regulátora a TNF-a. 40

41 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Vizsgált betegcsoportok A TNF-a gén promoter polimorfizmus, az RCCX modul variánsok, a C4A és C4B variánsok vizsgálata két kaukázusi populációban Az egyik kaukázusi csoport 80 Ohio Állambeli nobol állt, a másik csoportot 125 (38 férfi, 87 no) egészséges magyar ember képezte. A vizsgálatokhoz minden résztvevo írásos beleegyezését adta A HLA-DR, DQ és a TNF-a vizsgálata autoimmun diabetesben 69 1-es típusú diabeteses beteget (35 no, 34 férfi, átlag életkor 39,8 +/- 1,44 év volt), valamint 42 LADA beteget (22 no, 20 férfi, átlag életkor 56,9 +/- 2,3 év volt) vizsgáltunk. A vizsgálatokhoz minden beteg írásos beleegyezését adta. Az 1-es típusú diabeteses csoport inzulin kezelést igényelt a diabetes felállításától kezdve. A LADA csoportba kizárólag olyan betegek kerültek, akik életkora legalább 35 év volt, autoantitest pozitívak voltak, és a diagnózis felállításától számított fél éven belül inzulin kezelést nem igényeltek. Kontroll csoportnak az egészséges vesedonorok HLA-adatbázisa, illetve 138 egészséges önkéntes DNS mintája szolgált A TNF-a gén promoter polimorfizmus és a szérum CRP szintek vizsgálata gyulladásos bélbetegségben A vizsgálatban 74 Crohn beteg (42 no, 32 férfi, átlag életkor: 37,4 +/- 1,5 év), és 51 colitis ulcerosás beteg vett részt (28 no, 22 férfi, átlag életkor: 41,2 +/- 2,1 év). Sachar és munkatársai ajánlása szerint (111) a Crohn betegséget 3 alcsoportra osztottuk: elsosorban fibrostentikus, fistulaképzo, vagy foként gyulladásos Crohn betegség. A Crohn betegség aktivitását a Best index alapján határoztuk meg (112). A 150 alatti aktivitás értékkel rendelkezo betegek a betegség inaktív stádiumába tartoztak, míg a 150 feletti Best pontszámmal rendelkezok aktív Crohn betegek voltak. Colitis ulcerosa esetén a betegség aktivitását Truelove és Witts módszere alapján határoztuk meg (113). A betegség inaktivitásának kritériumai a következok voltak: tünetek, a hasi görcsök, a fogyás hiánya, a normális testhomérséklet, az ESR 30 pont alatti értéke és a jó étvágy. Crohn betegek esetén az átlagos követési ido 6 év volt (3 10 év). A Crohn betegség alcsoportjai esetén az átlagos követési ido a következoképpen alakult: 9 év (6 12 év) a 41

42 fibrostenitukus, 6 év a fistulaképzo (4 10,5 év) és 5 év (4 11 év) az elsosorban gyulladásos alcsoport esetén. Colitis ulcerosás betegeknél az átlagos követési ido 8 év (3,5 12 év) volt. Minden megvizsgált betegnél rögzítettük az egyéb extraintestinális tünetek (arthritis, arthralgia, primer sclerotizáló cholangitis, erythema nodosum) meglétét, valamint a sebészi beavatkozások számát (bélrezekció, hemicolectomia, teljes colectomia, abscessus rezekció) is. A kontroll csoport 138 egészséges önkéntesbol (96 no, 42 férfi, átlag életkor: 44,4 +/- 1,8 év) állt. A Crohn betegek, a colitis ulcerosás betegek és az egészséges populáció között nem volt szignifikáns különbség a nem az átlagéletkor, és a követés ideje tekintetében. A vizsgálatokhoz minden résztvevo írásos beleegyezését adta Alkalmazott módszerek DNS szeparálás A DNS szeparálás Miller módszere szerint történt (114). A vérmintákat EDTÁ-val bevont csövekbe vettük le, a vörösvérsejteket ammonium-kloriddal lizáltuk, a fehérvérsejteket többször mostuk. A mosott fehérvérsejteket 56?C-on proteináz K-val és 20%-os SDS-sel inkubáltuk. Az oldott DNS-t NaCl oldattal tisztítottuk meg a fehérjétol, izopropanollal kicsaptuk és desztillált vízben feloldottuk. A DNS izolálás Ohioban Pure- Gene izolációs kittel (Gentra Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) történt HLA meghatározás A HLA-DR és DQ allélokat szekvencia specifikus primer (SSP-) PCR módszerrel határoztuk meg Olerup SSP TM DR és DQ kitekkel (Olerup SSP AB, Saltsjöbaden, Svédország). A HLA-DR és DQ genotípusokat Olerup SSP kittel határoztuk meg, a PCR terméket agaróz gélen futtattuk (2%) és ethidium bromiddal jelöltük. Az eredményeket UV transzilluminátor segítségével értékeltük ki és dokumentáltuk ( ábra). A HLA haplotípust lot-specifikus táblázatok segítségével határoztuk meg. 42

43 Ábra. HLA meghatározás elektroforetikus képe. Az alsó három sorban látható összesen 24 reakció segítségével a DR allél, a felso sorban látható 8 reakció segítségével pedig a DQ allél határozható meg. DR17(3) esetén az 5-ös, 6-os és 17-es reakció, valamint a 21-es belso kontroll pozitív, DR4 esetén a 8-as reakció és a 22-es belso kontroll pozitív. DQ2 esetén a 3-as és 4-es reakció, DQ8 esetén pedig az 5-ös és a 7-es reakció pozitív. A képen látható HLA haplotípus: DR3/DQ2 DR4/DQ8 heterozigóta A TNF-a promoter polimorfizmus vizsgálata A TNF-? promoter polimorfizmus meghatározása a 308 és a 238 pozícióban PCR- RFLP módszerrel történt Day és munkatársai által javasolt primerekkel (37). A PCR terméket 37?C-on MspI enzimmel emésztettük a 238 pozíció polimorfizmusának, és NcoI enzimmel emésztettük a 308 pozíció polimorfizmusának meghatározása érdekében, majd ethidium bromiddal jelöltük, agaróz gélen (3%) futtattuk. (4.2.2 ábra) Az RCCX modul tanulmányozására alkalmazott módszerek Az RCCX modul tanulmányozására Southern Blot analízist alkalmaztunk. A meghatározás alapjául szolgáló DNS próbák és a C4 mutánsok meghatározása Blanchong szerint történt (53) Komplement C4 allotipizálás és immunblot analízis A komplement C4 allotipizálás és immunblot analízis hagyományos módszerek szerint EDTA plazmából történt (115). 43

44 ábra. A TNF alfa promoter polimorfizmus vizsgálata, PCR-RFLP és emésztés után a termékeket agaróz gélen futtattuk. Két oldalon a nyilak az emésztetlen PCR terméket mutatják. A 238 pozícióban az MspI enzim a vad G típust hasítja, a mutáns A allélt nem, így a G allél a PCR terméknél tovább fut, az A allél azzal egyvonalban látható. A 308 pozícióban az NcoI enzim a vad G típust hasítja, a mutáns A allélt nem, így a G allél a PCR terméknél tovább fut, az A allél azzal egyvonalban látható. A bal oldalról elso emésztett PCR termék alapján tehát a beteg genotípusa a 238 pozícióban GG, a 308 pozícióban pedig GA, a jobb oldalról elso emésztett PCR termék alapján pedig a beteg genotípusa a 238 pozícióban GA, a 308 pozícióban pedig GG A szérum C4 koncentráció meghatározása és a C4A és C4B fehérjék immunblot analízise A szérum C4 koncentráció meghatározása egyszeru radialis immundiffúziós módszerrel történt (RID, 116), a kereskedelemben forgalomban lévo C3 és C4 antitestek segítségével (DiaSorin Inc., Stillwater, MN, USA).A C4A és C4B allotípusok relatív sávintenzitását denzitometria segítségével határoztuk meg minden mintában (Epson 44