Optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia Majerné Baranyi Krisztina Adányiné Dr. Kisbocskói Nóra

Átírás

1 Optikai hullámvezető fénymódus spektoszkópia Majené Baanyi Kisztina Adányiné D. Kisbocskói Nóa NAIK ÉKI 1022 Budapest, Heman Ottó út épület Az optikai hullámvezető fénymódus spektoszkópia (OWLS) olyan valós idejű és nagyézékenységű szenzotechnika, amely lehetővé teszi a hatáfelületen lejátszódó folyamatok valós idejű, jelölésmentes vizsgálatát. Az OWLS technika alkalmas: fehéjék felületi adszopciójának vizsgálatáa kémiai szenzoként páatatalom és különböző gázok méésée asszociációs és disszociációs kinetika tanulmányozásáa antitest/antigén, illetve ligand/ecepto kötődés vizsgálatáa immunszenzoként antigének, illetve antitestek méésée fehéje - DNS kölcsönhatás tanulmányozásáa Méés technikai háttee Az integált optikai hullámvezető szenzo alapját a szenzo (chip) adja, amely egy kb. 200 nm vastagságú üveglemeze felvitt nagy töésmutatójú SiO 2 -TiO 2 étegből áll, amelyben finom optikai ácsot alakítanak ki. Ez az optikai ács csatolja be a méés soán a lineáisan polaizált He-Ne léze fényt a hullámvezető étegbe egy pontosan meghatáozott szögnél. A becsatolás szöge ézékenyen változik a felületen lezajló folyamatoka (adszobció, deszobció). A becsatolás szöge a felületen található anyag és a szenzo komplex töésmutatójának függvénye. A becsatolt fény teljes visszaveődések soozatával tejed a hullámvezetőben, intenzitását a szenzo 2 végén elhelyezett fotodiódákkal detektáljuk. A becsatolás szöge pontosan meghatáozható, belőle pedig a felületen megkötött anyag étegvastagsága, töésmutatója, egységnyi felülete eső mennyisége számolható. E két paaméte ismeetében a Fejte képlet felhasználásával pedig az egységnyi felülete abszobeálódott tömeget kaphatjuk meg. A dn/dc a felülete abszobeálódott anyag töésmutatójának koncentációtól való függésée jellemző, és étéke fehéjék többségée univezális és állandó (0,182 cm 3 /g). - Az OWLS beendezés működési sémája

2 A OWLS működésének sematikus ábája Ahhoz, hogy ezeket a szenzookat egeneálható bioszenzoként alkalmazhassuk, fontos, hogy a mééshez használt biomolekulát a szenzo felületén minél eősebb kötéssel, lehetőség szeint kovalens kötéssel ögzítsük anélkül, hogy jelentősen megváltoztatnánk annak aktivitását, illetve, anélkül, hogy a szenzo felületén töténő változtatásokkal számottevően befolyásolnánk a szenzo intenzitásspektumát (tozítanánk azt). A szenzo jellemzése A szevetlen SiO 2 -TiO 2 hodozóként töténő alkalmazása számos előnyt jelent a szeves hodozókkal szemben, elsősoban fizikai tulajdonságai alapján. A szevetlen hodozók nagyobb mechanikai ellenállóképessége, hőstabilitása, szeves oldószeekkel ill. mikóbákkal szembeni ellenállóképessége, egyszeűbb egeneálhatósága, hosszú élettatama alkalmasabbá teszi az ipai felhasználása. A hullámvezető anyaga SiO 2 -TiO 2 75%-25% aányú keveékéből áll, de egyes iodalmi adatok alapján a TiO 2 mennyiség aká a 40%-ot is eléheti. A szenzo felületén szilanol ill. tianol csopotok találhatók, melynek mennyisége a SiO 2 -TiO 2 aányától illetve a hullámvezető éteg kialakításánál használt hőméséklettől függ. Minél több a TiO 2 aánya annál jobban nedvesíthető a felület. Minél magasabb a hullámvezető éteg kialakításánál használt hőméséklet annál hidofóbbá válik a felület, annál nehezebb a ehidatáció. A szenzo felületének módosítása A hullámvezető felületén lévő OH csopotok kevés lehetőséget biztosítanak a biomolekulák kovalens ögzítésée, ezét a szenzo felületét módosítani kell. A felületmódosítása leggyakabban alkalmazott eljáás a szilanizálás. Az eljáás célja, hogy kialakítható legyen a hodozó és a biomolekula közötti kovalens kötés. E mellett a szilanizálás csökkenti a nemspecifikus adszopciót, ellenállóbbá teszi a felületet a külső hatásokkal szemben, pl.: a lúgokkal szembeni ézékenység csökken. A szilanizálási folyamat megkezdése előtt a hodozót meg kell tisztítani minden szennyeződéstől. A felülettisztítás lehet igen egyszeű vagy többlépcsős bonyolult fizikai, vagy kémiai eljáás. A legegyszeűbb módsze a hőkezelés, melynek soán olyan magas hőméséklete hevítik a hodozót, hogy leég óla az adszobeált anyag. Egy másik eljáás soán a hodozót 5%-os salétomsav oldatban 45 pecig foaljuk, majd ezt követően desztillált vízzel lemossuk a savat. A szilánok általános képlete: R n Si X (4-n) Az R nem hidolizálható funkciós csopot, amely a ögzítendő molekulával közvetlenül, vagy keesztkötő vegyületek segítségével közvetetten tud kapcsolódni. Az X egy hidolizálható csopot, amely lehet alkoxi-, amino- vagy kloo csopot. Az X csopot vesz észt a szilán és a hodozó között kialakuló sziloxán kötésben. A leggyakabban alkalmazott alkoxi csopotok a metoxi és etoxi csopotok, melyek a kötés kialkulásako melléktemékként metanolt és etanolt képeznek. A klooszilánok melléktemékként sósavat képeznek, ezét alkalmazásuk jóval szűkebb köű.

3 A kötési folyamat négylépcsős eakcióban játszódik le 1. Előszö megtöténik az X csopot hidolízise, melynek soán eaktív szilanol csopot keletkezik. A hidolízishez szükséges víz számos foásból számazhat. Lehet hozzáadott víz, de a felületen jelenlevő víz is betöltheti e szeepet, vagy az atmoszféából illetőleg a felhasznált oldószeből is számazhat. 2. Ezt követően a szilánmolekulák oligomeekké kapcsolódnak. 3. A hamadik lépésben az oligomeek a hodozó hidoxil csopotjához hidogénkötésekkel kapcsolódnak. 4. Végül pedig egy száítási folyamat következik, melynek soán vízkilépés kíséetében kialakul a hodozó és a szilán közt a kovalens kötés. Szilánmolekula kiválasztása Azt, hogy egy adott biológiailag aktív molekula kötéséhez milyen szilánt használjunk a szilanizálási folyamathoz, általában empiikus úton hatáozzuk meg. A kötés kialakulását nagymétékben befolyásolja, hogy az adott szilánmolekula hány hidolizálható csopotot tatalmaz. Leggyakabban háom hidolizálható csopotot tatalmazó szilánmolekulákat alkalmaznak. A tifunkciós szilánok meev felületet, de maximális hidilitikus stabilitást biztosítanak. A bifunkciós szilánok kevésbé igid felületet biztosítanak. Az egy funkciós csopotot tatalmazó szilánok monomolekuláis éteget képeznek, eősen hidofób felületet adnak, de hidolitikus stabilitásuk kicsi. A hidolitikus stabilitás fokozható, ha a funkcionális szilánokat nem funkcionális szilánnal keveik. Általában ezek 3:1 aányú keveékét használják. A szilanizálás a használt oldószet tekintve lehet vizes ill. szeves szilanizálás. Vizes fázisban töténő szilanizálásnál az előkészített hodozót 10%-os vizes szilán oldatba meítik. A ph-t HCl-val ph=4 e állítják, majd az egészet 75 C-a melegítik 3-5 óa hosszat. Ezt követően desztillált vízzel mossák, majd 110ºC-on egy éjszakát száítják, hogy növeljék a stabilitást. Az eljáás soán vékony egyenletes szilánéteget lehet képezni, habá kevesebb funkciós csopot vihető így fel, mint szeves szilanizálással. Szeves szilanizálásnál valamilyen illékony oldószeel 5-10%-os szilán oldatot készítenek, és azzal kezelik a felületet. Ez töténhet bemeítéssel, bepálással, alacsony hőmésékleten töténő elpáologtatással vagy ágőzöléssel. A folyamat az alkalmazott hőméséklettől függően (20-120ºCon) 2-48 óa lehet. Ezt követően az adott oldószeel töténő mosás következik, majd száítás, végül hőkezelés ºC-on 1,5-12 óáig. Eedményként sokkal vastagabb, nem olyan egyenletes, de több funkciós csopotot tatalmazó felületet éhetõ el. Hodozó aktiválása A biomolekulák számos eaktív csopottal endelkeznek, melyek felhasználásával kovalenskötés kialakításáa nyílik lehetőség. Ezek közül leggyakabban az amino-, szulfhidil-, kaboxil- és aomás csopotokat használjuk. Ahhoz hogy a biomolekula kötődjön a hodozóhoz aktiváni kell a hodozót, tehát olyan funkciós csopotot kell kialakítani a felületén, amely a biomolekula funkciós csopotja számáa támadási felületet biztosít. Az OWLS vizsgálatokhoz aminoszilanizált szenzookat használunk, melyek aktiválása lehet kétlépcsős folyamat, mely soán övid bifunkciós keesztkötő vegyületeket alkalmazunk. A kötővegyület lehet homobifunkciós, ilyenko mindkét végén ugyan azt a funkciós csopotot tatalmazza, és heteobifunkciós, amiko a két vége különböző funkciós csopotból áll. A leggyakabban alkalmazott bifunkcós molekula a glutáaldahid, mely két végén található aldehidcsopottal két aminocsopot összekapcsolásáa alkalmas. Glutáaldehid adagolása után a fehéje közvetlenül köthető a felülethez. Az aminoszilanizált chipek másik aktiválási módja az, amiko a kialakított aminocsopotot szukcinanhididdel kaboxil csopottá alakítjuk át, melyet EDC/NHS technikával aktiválunk. Ebben az esetben a fehéje közvetlenül a kaboxil csopothoz kötődik.

4 NH2 szukcinanhidid COOH APTS amino kaboxil OH glutáaldehid SiO2-TiO2 felület EDC/NHS GOPS H2C HC O CM-dextan COOH COOH epoxi lúgos közeg kaboxil CMD mátixban APTS - 3-aminopopil-tietoxi szilán GOPS - 3-glicidoxipopil-timetoxi szilán EDC - 1-etil-3-(3-dimetil-aminopopil) kabodiimid hidokloid NHS - N-hidoxiszukcinimid CMD - kaboximetil-dextán OWLS méőendsze felépítése A szenzo felület módosításának és aktiválásának lehetőségei A mééshez OW 2400 típusú amino funkcionalizált integált optikai hullámvezető szenzot (chip) (MikoVakuum Kft, Budapest) használunk, és a MikoVakuum Kft. által gyátott OWLS 120-as típusú beendezéssel dolgozunk. A műszet a BioSense 2.2 szofte vezéli. A szenzo időben állandó, stabil működésének édekében az OWLS szenzot folyamatosan áamló injektálásos endszeben (FIA) működtetjük. A szenzot a méőbeendezés mintatató átfolyó cellájába helyezve használjuk. Az állandó áamlási sebességet egy Gilson Minipulse 3 peisztaltikus pumpa biztosítja. A mintatató átfolyó cella hőmésékletének szabályozását az OWLS TC hűtő/fűtő egység kontolálja. A endsze egy Rheodyne típusú injektoal van felszeelve, mely 200 µl-es mintavevő hukot tatalmaz. Az eedmények kiétékelését a MikoVakuum Kft. BioSense 2.6 szoftve-el végezzük. A FIA endszeel ellátott OWLS 120 méőműszet mutatja be. Tevezett méési gyakolat Az aminoszilanizált szenzo felületén 20 µg/ml BSA molekulát 2,5 %-os glutáaldehiddel kovalensen ögzítünk és méjük a szenzo által a különbözőkoncentációjú (10, 25, 50, 100, 200 µg/ml) antiteste adott válaszok nagyságát. Az amino funkcionalizált felületen a kisebb móltömegű BSA molekulát ögzítjük és vizsgáljuk diekt méési módszeel a különböző koncentációjú antitest oldatoka adott szenzoválaszokat. Immunszenzook alkalmazása A szenzot a méőbeendezés mintatató átfolyó cellájába helyezve használjuk (4.1. ába). A méésnél a hullámvezetőn lévő ácsot polaizált He-Ne léze (632,8 nm) fénnyel alulól világítjuk meg. A szenzot tengelye mentén kis szögtatományban (±10 ) fogatva a lézenyaláb felett, a fény a ácson megtöik illetve szóódik, és meghatáozott szögétékeknél az ún. becsatolási szögnél belép a hullámvezetőbe, ahol teljes visszaveődések soozatával tejed.

5 tömeg/felület (egység) intenzitás 40 B puffe A BSA TE TM TM TE puffe idő (min) A hullámvezető felszínén a megkötődött éteg vastagságának, felületi boítottságának ábázolása a lézefény beesési szögének függvényében (A (inzet) adott chipe jellemző pillanatnyi intenzitásspektum, TE - tanszvez elektomos fénymódus becsatolási szöge, TM tanszvez mágneses fénymódus becsatolási szöge, B a hullámvezető felszínén a megkötődött éteg vastagságának időbeli alakulása) A m in ta a n tig é n k o n ju g á tu m p o lik lo n á lis sz é u m an tigén p o lik lo n á lis s z é u m + m in ta 1 :1 B A vizsgált immunszenzook működésének elvi vázlata (A nem vesengő, diekt méés, B vesengő méés) A szenzofejlesztések soán két immunszenzotípust alakítható ki, a diekt (nem vesengő) illetve a vesengő elendezést. A nem vesengő vagy diekt méés (A) esetében a hullámvezető felületén a specifikus széum megfelelő hígítású oldatát ögzítettük kovalensen, és közvetlenül métük a kimutatni kívánt vegyületeket tatalmazó standadoka, illetve mintáka adott szenzoválaszok nagyságát. A vesengő (kompetitív) immunszenzo (B) kifejlesztése soán a

6 tömeg/teület (egység) vizsgálandó antigén vagy az antigénmolekuláknak fehéjével képzett konjugátuma keült ögzítése. A méések soán a standadoldatokat, illetve mintákat ismet mennyiségű antitestet tatalmazó széummal elegyítettük, inkubáltuk, majd injektáltuk a méőendszebe. A méésnél így a mintában lévő antigének által meg nem kötött, szabad antitestek mennyiségét hatáoztuk meg, és ebből a jelből következtettünk a minták eedeti antigéntatalmáa. A szilanizált szenzook alkalmazásával a BSA anti-bsa IgG molekulapá immuneakcióját vizsgáljuk, a BSA molekulákat glutáaldehiddel kovalensen ögzítve a szenzo felületén és méve a különböző koncentációjú antitest oldatoka adott szenzoválaszokat. A mééseket FIA endszeben végezzük. Az alkalmazott áamlási sebesség 0,18 ml/pec. A kíséletek soán, a méőcellán előszö desztillált vizet áamoltatunk (A), majd a endszebe glutáaldehid oldatot (2,5% deszt. vizes) injektáljunk (B). Az oldat kimosódását követően a desztillált vizet TRIS puffee (42 mmol/l, ph 7,4) cseéljük (C). A BSA ögzítése injektálással (D). A ögzítési lépés után a szenzot övid ideig puffeel mossuk a meg nem kötődött molekulák eltávolításáa, majd 0,1 mol/l HCl-at injektálunk. Az ézékenyített szenzofelület ezt követően alkalmas a minták méésée. Az egyes IgG standadok méése között a felület egeneálása, a megkötődött IgG molekulák lemosása ugyancsak 0,1 mol/l sósavoldat injektálásával töténik BSA anti-bsa IgG D B C 0 A idő (min) BSA ögzítése aminofunkcionalizált szenzofelületen és különböző koncentációjú anti-bsa oldatoka adott jelei (A desztillált víz; B 2,5% glutáaldehid; C TRIS puffe (42 mmol/l, ph 7,4); D 200 μg/ml BSA; 0,1 mol/l HCl; μg/ml anti-bsa; μg/ml anti-bsa; μg/ml anti-bsa; μg/ml anti-bsa; μg/ml anti-bsa)