A magyarországi krónikus C vírushepatitises betegek vírustípus- és szubtípus-meghatározása

Átírás

1 A magyarországi krónikus C vírushepatitises betegek vírustípus- és szubtípus-meghatározása Gervain Judit dr., Simon Gábor jr. dr. 1, Papp Istvánné 2 és Szabóné Bartha Katalin 2 Fejér Megyei Szent György Kórház, Székesfehérvár, I. Belgyógyászat, Hepato-Pancreatologiai Részleg (részlegvezető főorvos: Gervain Judit dr.) Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Szent-Györgyi Albert Orvos- és Gyógyszerésztudományi Centrum, Gyermekklinika (igazgató: Túri Sándor dr.) 1 Fejér Megyei Szent György Kórház,Székesfehérvár,I. Belgyógyászat,Vírusszerológiai Laboratórium (vezető: Gervain Judit dr.) 2 A hepatitis C-vírus nagy variabilitása közismert. A különbözõ földrajzi területeken talált nukleotidszekvencia-változás klinikai jelentõsége a típusok eltérõ patogenitásában és a terápiára adott válaszkészségükben van. A szerzõk elsõként határozták meg a magyarországi krónikus C-vírushepatitises betegek vírustípus- és szubtípus-összetételét. Jelen munkájukban ismertetik az alkalmazott módszereket és a kapott eredményeket. Vírusszerológiai Laboratóriumukban az 1996-ban bevezetett, ellenanyag-analízisen alapuló HCV Serotyping 1-6 Assay metodikával 127 betegben 75,5% 1-es típusú, 2,5% 4-es, 9% kevert (1 + 2, 3, 4, 5, 6) típusú, 13% nem tipizálható, nem reagáló antitestet találtak óta alkalmazzák a direkt vírusantigén reverz polimeráz láncreakció és a típusspecifikus mintákhoz történõ reverz hibridizációs módszer kombinációját, mellyel 211 beteg genotipizálása: 1a:6%, 1b: 85,5%, 1a + 1b:3%, 1b + 2:1%, 3:0,5%, kevert szubtípusú: 4% eredményû lett. Összefüggést találtak az 1b szubtípus és a magasabb vírustiter között. A fentiek alapján megállapítható, hogy a magyarországi populáció 90%-ban a legellenállóbb, az 1b szubtípusú C -vírussal fertõzött. Ez magyarázza, hogy az interferon-monoterápiára csupán betegeik 20%-a vált tartósan vírusmentessé. Az eredmények ismeretében a terápiás protokollban a nagyobb dózisú, tartós és kombinációs kezelést javasolják. Kulcsszavak: hepatitis C-vírus, krónikus C hepatitis, reverz transzkripció, polimeráz láncreakció, reverz hibridizáció, szerotípus, genotípus Analysing the type and subtype of hepatitis virus C of chronic viral hepatitis patients in Hungary. The huge variability of hepatitis virus C is well-established. The geographical differences in its nucleotide sequence have important clinical significance by causing variant pathogenicities and affecting sensitivity to therapy. The authors pioneered the determination of the viral type and subtype in patients suffering from chronic viral hepatitis in Hungary. In this present work they report the applied methods and the results. In their virusserological laboratory was introduced the test HCV Serotyping 1-6 Assay, which is based on the analysis of antibodies, in By this method they examined the samples of 127 patients and they found type 1 in 75,5%, type 4 in 25%, mixed types (type 1 + 2,3,4,5,6)in 9%and nonclassifyable, non-reacting antibodies in 13% of the cases. Since 1999 they have used the combination of direct reverse-pcr of the viral antigen and reverse hybridization to type-specific specimens. These results, from 211 patients show that 6% belong to 1a, 85.5% to 1b, 3% to 1a + 1b, 1% to 1b + 2, 0.5% to 3 and 4% to mixed subtypes. Genotype 1b was associated with higher viremia. On the basis of the above they can conclude that 90% of the Hungarian population are infected by the most resistant 1b subtype of hepatitis virus C. It could explain the fact that only 20% of their patients with interferon monotherapy have become permanently virus-free. In view of these results they recommend combined, higher dose, long-lasting treatment in therapeutic protocolls. Key words: hepatitis C virus, chronic hepatitis C, reverse transcription, polymerase chain reaction, reverse hybridization, serotype, genotype Az év a jelenkori hepatológia egyik mérföldköve volt. Ekkor vált ismertté az addig non-a,non-b hepatitisnek nevezett kórkép fő kórokozója,a C-vírus. Azóta világszerte intenzív kutatások folynak a vírus epidemiológiai,immunológiai,patogenetikai sajátosságainak,de elsősorban az ezek alapját képező molekuláris genetikai tulajdonságainak tisztázására. Ez az egyszálú RNS-vírus kb nukleotidból áll, melyek megközelítően 3010 aminosavat,ún. strukturális (core,e1,e2/ns1) és non-strukturális (NS2,NS3,NS4A, NS4B,NS5A,NS5B) proteineket kódolnak (1. ábra). Szerkezete nem egységes és nem stabil,több típusa és szubtípusa van (24). A szerkezeti különbségek vizsgálatának epidemiológiai és terápiás jelentősége van,mivel a vírus világszerte elterjedt,de az egyes földrészeken más-más típusa fordul elő. A különböző típusok pedig meghatározói a terápia eredményességének és befolyásolják a kórkép súlyosságát is. Magyarországon 1992-ben kezdtük meg a krónikus C vírus hepatitises betegek interferon-kezelését. A korrekt diagnosztikához és a terápia követéséhez szükséges vizsgálatokat osztályunk Vírusszerológiai Laboratóriumában vezettük be és végezzük azóta is az ország Hepatológiai Centrumai számára. A HCV 6 fő típusának meghatározását 1996-ban kezdtük meg. A beteg savójában és plazmájában az infekció során a vírus típusára jellemző ellenanyag alakul ki. Ezen típusspecifikus ellenanyagok vizsgálatát nevezzük szerotipizálásnak,mellyel a vírus fő típusait tudjuk elkülöníteni ben kidol- Orvosi Hetilap 2001, 142 (25),

2 1. ábra: A HCV-genom szerkezete (P.Simmonds szerint, 1998.) goztuk a C-vírus-antigén elemzésén alapuló genotípusmeghatározást,mellyel a típusokon belül a szubtípusokat is detektálni tudjuk. Így ma már lehetőségünk van a vírus-pozitív betegnél a szubtípusok analízisére, gyógyult betegnél pedig a savóból utólag a fertőző vírus típusának meghatározására. Betegek és módszerek Betegek: 127 krónikus C vírushepatitises betegünk (nő: 58,férfi: 69) szerotipizálásával a vírus típusainak és 211 betegünk (nő: 104, férfi: 107) genotipizálásával a típusok és ezek szubtípusainak meghatározását végeztük. Összefüggést kerestünk a szubtípusok és a betegek terápia előtti vírustitere között. A krónikus C vírus hepatitis diagnózisát a 6 hónapon túl is emelkedett alaninaminotranszferáz (ALT/SGPT),a HCV-RNS reverz polimeráz láncreakcióval igazolt pozitivitása és a máj hisztológiai vizsgálata alapján állítottuk fel. Módszer: A szerotípus vizsgálata szérumból vagy plazmából HCV Serotyping 1-6 Assay (Murex,Abbott) teszttel,plate-enzimimmunoassay módszerrel történt (lásd Murex: Anti-HCV Serotyping 1-6. Módszertani leírás) (12,14,19,20). Az analízis a HCV NS4 régiója elleni ellenanyag meghatározásán alapul. A vizsgálat időtartama kb. 3 óra. Műszerigénye: plate-eia mosó és leolvasó. A módszer előnye,hogy időtakarékos,mérsékelt költségigényű és gyógyult betegnél is meghatározható a vírus 6 fő típusa. Hátránya,hogy szubtípust nem tudunk vele elkülöníteni. Immunhiányos kórképekben vagy alacsony ellenanyagszintnél,például immunszuppresszív kezelésnél,hiv-fertőzötteknél, hemodializáltaknál,haemophiliásoknál ún. non-reaktív (NR) eredményt kapunk. Ha blokkoló fehérjék vannak a vérben, például herpes simplex vírus koinfekció esetén,ún. non-type specific (NTS), értékelhetetlen lesz a reakció. A genotípus meghatározását a beteg terápia előtti szérumából vagy plazmájából Amplicor (Roche) és INNO-LiPA HCV II. (Innogenetics) tesztek kombinációjával végeztük (lásd INNO- LiPA HCV II. INNOGENETICS Módszertani leírás) (10, 29). A módszer a vírus stabil 5 NCR régiójának szubtípusokra jellemző variabilitásán alapszik. A vizsgálattal a 6 fő típus és ezek szubtípusainak egyidejű meghatározása lehetséges. Első lépésben a virális RNS-t izoláljuk,majd reverz transzkripcióval cdns-t szintetizálunk. Az így létrehozott nukleinsavat biotinilált primerekkel,polimeráz láncreakció módszerével amplifikáljuk. A megsokszorozódott,biotinnal jelölt termékeket egy típusspecifikus ellenanyagokat tartalmazó nitrocellulóz membránhoz reverzibilisen hibridizáljuk. A kötődés a membránnak csak azon a részén jön létre,mellyel a vírusrészecske nukleotidszekvenciája tökéletesen kompatíbilis. A biotinilált hibrideket ezután színreakcióval jelenítjük meg. A pozitív csíkokból diagram segítségével tudjuk leolvasni a jelenlevő szubtípusokat (2. ábra). A vizsgálat időtartama kb. 7 óra. A módszer előnye, hogy szubtípus meghatározására alkalmas,hátránya,hogy idő-,műszer-,költségigényes- és nagy gyakorlattal rendelkező asszisztenciát kíván. Igen alacsony vírustiterű mintánál nem 2. ábra: A HCV-genotípus-meghatározás eredménye INNO-LiPA HCV II. módszerrel kapunk értékelhető reakciót. Műszerigénye: thermocycler,speciális rázógép, vízfürdő vagy száraz inkubátor. Kvantitatív vírusszám-meghatározás: Kezelés előtti szérumból vagy plazmából Amplicor (Roche) teszttel,reverz transzkripció és polimeráz láncreakció módszerével történt (lásd Roche: Amplicor. Módszertani leírás). Terápiás protokoll: A betegek antivirális kezelése között interferon-monoterápiával történt (48 vagy 52 hétig heti 3 4,5 MU vagy 6 MU interferon-alfa 2a vagy 3 5 MU interferon-alfa 2b). A jelenleg alkalmazott kombinációs terápiában az interferon mellé napi mg ribavirint kapnak a betegek. Eredmények A hepatitis C-vírus NS4 régiójával szemben kialakult ellenanyag analízisén alapuló HCV Serotyping 1-6 Assay metodikával 124 betegünkben 75,5% (94) 1-es, 2,5% (3) 4-es és 9% (11) kevert típusú ellenanyagot találtunk. A minták 8%-a (10) nem volt tipizálható (NTS) és 5%-a (6) nem adott reakciót (NR) (3. ábra). A kevert vírustípusok megoszlása a következők voltak: 1+2,1+3,1+4,1+4+5,1+6. Közöttük több egészségügyi dolgozó illetve politranszfundált volt. 211 betegünk direkt vírusantigén reverz polimeráz láncreakció (Amplicor) és a típusspecifikus mintákhoz történő reverz hibridizációs módszer (INNO-LiPA HCV II) kombinációjával végzett vizsgálata azt igazolta,hogy a magyarországi betegek 90%-a 1b szubtípusú C-vírussal fertőződött. Részletes eredmények: 1a 6% (13),1b 86% (181),1a + 1b 3% (6),1b+21%(2),kevert szubtípusú 4% (9) (4. ábra). Az utóbbi csoportban haemophiliás,iv. droghasználó és többszöri műtéten átesett betegek találhatók. Az 1a genotípusnál a vírustiter-megoszlás az alábbi volt: 70% (9) alatti,30% (4) alatti. Az 1b típusú betegeknél ezt a határt figyelembevéve a megoszlás 10%/42% (18/76) lett. A betegek 48%-ánál (87) az induló vírusszám feletti értéket mutatott (1. táblázat). A különböző betegcsoportokban a nemi megoszlás közel azonos volt. 1316

3 2. táblázat: Az interferon-monoterápia eredménye a különbözõ HCV-szubtípusokban Szubtípus Véglegesen vírusmentes Részlegesen gyógyult Nem reagált 1b (n=181) 36 (20) 26 (14) 119 (66) 1a (n=13) 10 (77) 3 (23) Kevert (n=9) 4 (44) 1 (12) 4 (44) Összehasonlítottuk a különböző genotípusoknál az interferon-monoterápiával elért eredményeket. Betegeinknél azt találtuk,hogy az 1b szubtípusúak 20%-a (36),az 1a szubtípusúak 77%-a (10) lett tartósan vírusmentes,gyógyult (ún. sustained response). A kevert genotípusú betegeink közel fele,44% (4) gyógyult meg. Az utóbbi két csoport összesen 22 beteget jelent,így ebből messzemenő következtetést nem szabad levonni (2. táblázat). Megbeszélés 3. ábra: A HCV-szerotípusok százalékos megoszlása betegeinkben 4. ábra: A HCV-szubtípusok százalékos megoszlása betegeinkben 1. táblázat: HCV-szubtípusok és a vírusszám közötti összefüggés Szubtípus < > a (n=13) 9 (70) 4 (30) 1b (n=181) 18 (10) 76 (42) 87 (48) 1988-ban a HCV-cDNS klónozásával valósággá vált a non-a,non-b hepatitisnek nevezett kórkép legfontosabb, addig ismeretlen kórokozója. Sok mindent tudunk ma már róla,de az eltelt 12 év sem volt elég,hogy tisztázzuk molekuláris jellemzőit és hogy patomechanizmusának minden részletét megértsük. A vírus nagy variabilitását hamar felismerték. Már 1991-ben leírták a Japánban elsőként izolált kórokozók közötti 8%-os,ezek között és az USA-ban analizált vírustípus között a 21%-os nukleotidszekvencia-eltérést (3). Egyrészt a törzsfejlődése alatti mutációk következtében genetikusan heterogénné vált,másrészt az infekció tartama alatt a betegben is változtatja szerkezetét. Legvariánsabb részei a 3 NCR,E1,E2/NS1 és NS2,legstabilabbak az 5 NCR,core,NS4B és NS5B régiók. Egyes földrészeken más-más típus fordul elő. A kutatók a core/e1 és NS5B szekvencia filogenetikai elemzése során 11 típust és kb. 90 szubtípust különítettek el,közülük 6 típusnak és 11 szubtípusnak van patogenetikai jelentősége. Az azonos típusú genomok között 68 77%-os,a szubtípusok között 77 90%-os nukleotidszekvencia-egyezés van (1,2,5,14, 18,28). Az egy betegből izolált,10%-nál kevesebb,főleg az envelope protein régióban megjelenő,pontmutációk általi variánsok a quasispeciesek. Nagy valószínűséggel ez adja a vírus szerkezeti plaszticitását,mely lehetővé teszi számára az antivirális terápia és a gazdaszervezet immunrendszere előli kimenekülést (7,14,25). A különböző kutatócsoportok (Simmonds,Houghton,Cha, Chan,Okamoto,Mori,Enomoto,Tsukiyama és mtsai) attól függően,hogy mely országban izoláltak egy-egy vírustípust a szerkezeti azonosság ellenére más-más elnevezést adtak neki,így rövid időn belül klasszifikációs káosz alakult ki. Ennek megszüntetésére 1994-ben Simmonds vezetésével egységes nómenklatúrát dolgoztak ki,melyben 1-6 típusokat és a-c szubtípusokat különítettek el (18,26,27,29) (5. ábra). Néhány szubtípus az egész világban megtalálható,ezek az 1a,1b,2a,2b,a többinek jellegzetes földrajzi előfordulása van,például 5a, 6a (3. táblázat). A nagyobb országok és régiók már tisztázták a területükön előforduló HCV-szubtípusokat (2, 17,21,23,32). Hazánkban a beteganyag ilyen típusú rep- 1317

4 5. ábra: A különbözõ földrajzi területeken analizált HCV-típusok és szubtípusok összetartozása (Okamoto, Mori, Chan és Simmonds szerint, 1998.) 3. táblázat: A HCV-szubtípusok földrajzi megoszlása USA, Kanada, Északnyugat-Európa 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a Délkelet-Európa 1b Japán 1a, 1b Thaiföld, Kína 1b, 2a, 2b Észak-Közép Afrika, Ázsia 4 Dél-Afrika 4a, 5a Hong-Kong, Macao 6a Vietnám 7, 8, 9 Dél-Ázsia 3 Nepál 3a Indonézia 10a rezentatív felmérése jelen munkánk előtt nem történt. Kisszámú betegcsoport szérumát vizsgálták külföldi laboratóriumban,innen sejtettük,hogy nálunk főleg az 1-es típus található (15). Kutatók a vírus szerkezeti elemzéséből próbálták megállapítani a vírus származásának földrajzi helyét és idejét. A szekvenciaváltozás rátájából (0,14 0,19%/hely/év), a típusok jelenlegi előfordulási helyeiből és számából arra következtettek,hogy egy új szubtípus kialakulásához év,új típushoz kb. 400 év kellett. A fentiek alapján állítható,hogy a vírus vagy több ezer év óta jelen van a humán populációban,vagy egy evolúciós robbanást kell feltételeznünk, mely felgyorsította a genom differenciálódási folyamatát. Ma még az is tisztázandó kérdés,hogy egy bizonyítottan parenteralisan transzmittálódó kórokozó ilyen hosszú időn keresztül milyen mechanizmusokkal tudta magát az élővilágban fenntartani (27). A különböző szubtípusok azonos dózisú és időtartamú interferon-kezelésre más-más gyógyulási hajlamot mutatnak. Meghatározásuknak ez a fő klinikai értéke. A terápia hatékonyságában a vírusszám mellett a típusnak van bizonyítottan prediktív értéke. Az 1. és a 4. közismerten a rosszul reagálók közé tartoznak,a típusoknál kétszer több a gyógyultak száma (5,11,20,28,33). Az 1a és az 1b szubtípusok gyógyulási hajlamának megítélésében az irodalmi adatok eltérő véleményűek, az azonban biztos,hogy legnehezebben gyógyul az 1b (28,33). Szubtípus-analízises eredményeink a magyarországi betegek 90%-os 1b,illetve 85%-os 1. típusú fertőzöttségét igazolták. [A szerotipizálással és a genotipizálással elért eredmények közötti minimális különbség a szerotípus-meghatározással eredményt nem adó betegek (13%) száma miatt van.] Ennek alapján érthető,hogy az interferon-monoterápiára betegeink közül igen kevés,kb. 20% lett tartósan vírusmentes. Az interferon+ribavirin kombinációs kezeléseink nagy része még az utánkövetés fázisában van,ezért erről végleges eredményt mondani korai lenne. Szubtípustól függő a májtranszplantált betegeknél észlelhető reinfekció. Az 1b fertőzés esetén gyorsabb,agresszívebb és gyakoribb a transzplantátum reinfekciója. Az 1a esetében ún. benignus reinfekciót találtak (8, 22). Szoros összefüggés a szubtípus és a betegség progressziója között nincs,patogenetikai hatása azonban az 1b-nek a legsúlyosabb. Az irodalmi adatok alapján megállapítható,hogy ennél gyakoribb a cirrhosis megjelenése és a primer hepatocellularis carcinoma előfordulása. A 2a szubtípussal összehasonlítva az 1b-nél 3,8 gyakoribbnak találták a tumor előfordulását (27). Szintén itt a leggyakoribb a normál ALT/SGPT mellett fennálló krónikus C vírus hepatitis (13). Következtetések 1992 óta végezzük osztályunk Víusszerológiai Laboratóriumában országos ellátás keretében a krónikus vírushepatitises betegek szerológiai diagnosztikáját. Az egységes módszertan,valamint a specifikus és szenzitív tesztek alkalmazása lehetővé teszi az összes kezelt betegnél a terápia hatékonyságának követését. Diagnosztikai panelünk két új módszerének eredményeit foglaltuk össze beszámolónkban. Az 1996-ban bevezetett C-vírus szerotipizálás és az 1999 óta végzett genotipizálás módszertanával igazoltuk,hogy a magyarországi betegek 90%-a 1b szubtípusú vírussal fertőzött. Ennek klinikai jelentősége,hogy ez a legellenállóbb,legnehezebben eliminálható típusú vírus,így az antivirális terápiában az 1999-es párizsi konszenzus konferencia ajánlásával összhangban (6) a nagyobb dózisú,tartós interferon+ribavirin kombinációs kezelés indokolt. A közelmúltban ennek alapján módosítottuk a hazai terápiás protokollokat. Köszönetnyilvánítás: Somorácz György dr.-nak,a dunaújvárosi Szent Panthaleon Kórház infektológus főorvosának a betegek előszűrésében végzett aktív közreműködéséért. IRODALOM: 1. Bartenschlager, R., Lohmann, V.: Replication of the hepatitis C virus. Bailliére s Clinical Gastroent.,2000,2, Beard, R. M., Abell, G., Honda, M. és mtsai: An infectious molecular clone of a Japanese genotype 1b hepatitis C virus. Hepatology,1999,30, Choo, Q. L., Richman, K. H., Han, J. H. és mtsai: Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Biochemistr.,1991,88, Doorn, L. J., Kleter, B., Stuyver, L. és mtsai: Analysis of hepatitis C virus genotypes by a line probe assay and correlation with antibody profiles. J. Hepatol.,1994,21, Dusheiko, 1318

5 G., Simmonds, P.: Sequence variability of hepatitis C virus and its clinical relevance. J. Viral. Hepatol.,1994,1, EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Paris, February,1999. J. Hepatol.,1999,30, Enomoto, N., Kurosaki, M., Tanaka, Y. és mtsai: Fluctuation of hepatitis C virus quasispecies in persistent infection and interferon treatment revealed by single-strand conformation polymorphism analysis. J. Gen. Virol.,1994,75, Féray, C., Gigou, M., Samuel, D. és mtsai: Influence of the genotypes of hepatitis C virus on the severity of recurrent liver disease after liver transplantation. Gastroenterol.,1995,108, Giannini, C., Thiers, V., Nousbaum, J. B. és mtsai: Comparative analysis of two assays for genotyping hepatitis C virus based on genotype-specific primers or probes. J. Hepatol.,1995,23, Germer, J. J., Rys, P. N., Thorvilson, J. N. és mtsa: Determination of hepatitis C virus genotype by direct sequence analysis of products generated witht he Amplicor HCV test. J. Clin. Microbiol.,1999,37, Koizumi, K., Enomoto, N., Kurosaki, J. és mtsai: Diversity of quasispecies in various disease stages of chronic hepatitis C virus infection and its significance in interferon treatment. Hepatology,1995,22, Kuhiniko, H.: Diagnosis of hepatitis C. Intervirology, 1994, 37, Mallat, D., Schiff, E.: Viral hepatitis. Gastroenterol.,2000,3, Maertens, G., Stuyver, L.: Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. The molecular medicine of viral hepatitis. Szerk.: Harrison,T. J.,Zuckerman, A. J McOmish, F., Yap, P. L., Dow, B. C. és mtsa: Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors: An international collaborative survey. J. Clin. Microbiol.,1994,32, Mellor, J., Hawkins, A., Simmonds, P.: Genotype dependence of hepatitis C virus load measurement in commercially available quantitative assays. J. Clin. Microbiol.,1999,37, Nousbaum, J. B., Stanislav, P., Bertrand, N. és mtsai: Hepatitis C virus type 1b (II) infection in France and Italy. Ann. Int. Med.,1995,122, Okamoto, H., Kurai, I., Okada, S. I. és mtsai: Full-length sequence of a hepatitis C virus genome having poor homology to reported isolates: Comparative study of four distinct genotypes. Virology,1992,188, Orito, E., Mizokami, M., Mizoguchi, N. és mtsai: Hepatitis C virus serotype II responds more favorably to interferon-α therapy. J. Hepatol.,1994, 21, Pár, A., Gervain, J., Gógl, Á.: Hepatitis C virus infection: pathogenesis,diagnosis and treatment. Scand. J. Gastroenterol.,1998,33, Preignoux, M. M., Roudot-Thoraval, F., Mendel, I. és mtsai: Hepatitis C virus genotypes in France: relationship with epidemiology,pathogenicity and response to interferon therapy. J. Viral Hepatol., 1999, 6, Prieto, M., Berenguer, M., Rayón, M. J. és mtsai: High incidence of allograft cirrhosis in hepatitis C virus genotype 1b infection following transplantation: Relationship with rejection episodes. Hepatol.,1999,1, Qu Di, Ji-Su Li, Vitvitski, L. és mtsai: Hepatitis C virus genotypes in France: comparison of clinical features of patients infected with HCV type I and type II. J. Hepatol.,1994,21, Reed, E. K., Rice, M. C.: Molecular characterization of hepatitis C virus. In Hepatitis C virus. Szerk.: Reesink,H. W. Karger, 1998,Basel old. 25. Simmonds, P.: Variability of the hepatitis C virus genome. In Hepatitis C virus. Szerk.: Reesink,H. W. Karger,Basel.1998, old. 26. Simmonds, P., Alberti, A., Alter, J. H. és mtsai: A proposed system for the nomenclature of hepatitis C viral genotypes. Hepatology,1994,5, Simmonds, P., Marcellin, P.: HCV genotyping: the science and the practice. Yamanouchi,England Smith, D. B., Pontisso, P.: Heterogeneity of hepatitis C virus. Gastroenterol.,1996,2, Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A. és mtsai: Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen. Virol.,1993,74, Stuyver, L., Van Arnhelm, W., Wyseur, A. és mtsai: Classification of hepatitis C viruses based on phylogenetic analysis of the envelope 1 and nonstructural 5B regions and identification of five additional subtypes. Biochem.,1994,91, Van der Pool, C. L., Coypers, H. T., Reesink, H. W.: Hepatitis C virus six years on. Lancet,1994,344, Vince, A., Palmovic, D., Kutela, N. és mtsai: HCV genotypes in patients with chronic hepatitis C in Croatia. Infection,1998,3, Webster, G., Barnes, E. és mtsai: HCV genotypes role in pathogenesis of disease and response to therapy. Bailliére s Clinical Gastroenterol., 2000, 14, (Gervain Judit dr., Székesfehérvár, Seregélyesi u ) 1319