VIZELETSZTEROID-PROFILOK OSZTEOPORÓZISBAN ÉS NŐGYÓGYÁSZATI MEGBETEGEDÉSEKBEN

Átírás

1 VIZELETSZTERID-PRFILK SZTEPRÓZISBAN ÉS NŐGYÓGYÁSZATI MEGBETEGEDÉSEKBEN PhD értekezés Bufa Anita Témavezetők: Dr. Gőcze Péter Miklós, Dr. Kilár Ferenc Pécsi Tudományegyetem Általános rvostudományi Kar Klinikai rvostudományok Doktori Iskola 2009

2 Tartalomjegyzék TARTALMJEGYZÉK... 2 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 4 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 5 BEVEZETÉS... 7 IRDALMI ÁTTEKINTÉS VIZELETSZTERID-PRFIL MÓDSZER Szteroid hormonok Szteroid hormonok típusai, szerkezete Szteroid hormonok metabolizmusa A vizeletszteroid-profil vizsgálat alapjai Előzetes mintaelőkészítés A szteroidok gázkromatográf-tömegspektrometriája Vizeletszteroid-profil a klinikai diagnosztikában NŐKET ÉRINTŐ MEGBETEGEDÉSEK ÉS A SZTERID RMNK KAPSLATA sontritkulás (szteoporózis) Méhtest daganat Mióma Méhnyálkahártyarák Petefészek daganat ám eredetű petefészek daganat Granulózasejtes petefészek daganat Méhnyakrák Endometriózis ÉLKITŰZÉSEK... 1 ANYAGK ÉS MÓDSZEREK BETEGANYAG sontritkulásos betegek Méhtest daganatos betegek Miómás betegek Méhnyálkahártyarákos betegek Petefészek daganatos betegek ám eredetű petefészek daganatos betegek Granulózasejtes petefészek daganatos betegek Méhnyakrákos betegek Endometriózisos betegek VIZELETSZTERID-PRFIL ELEMZÉS Minták gyűjtése és tárolása Mintaelőkészítés Szteroidok kivonása Konjugátumok hidrolízise és kivonása Származékképzés Tisztítás Gázkromatográf-tömegspektrometria Gázkromatogfráf-tömegspektrometriai mérések Minőségi és mennyiségi analízis Eredmények normalizálása, statisztikai értékelése EREDMÉNYEK SZTERID PRFIL VIZSGÁLATK SNTRITKULÁSS NŐKNÉL SZTERID PRFIL VIZSGÁLATK MÉTEST DAGANATS NŐKNÉL Vizsgálatok miómás betegeknél Vizsgálatok méhnyálkahártyarákos betegeknél SZTERID PRFIL VIZSGÁLATK PETEFÉSZEK DAGANATS NŐKNÉL Vizsgálatok hám eredetű petefészek daganatos betegeknél Vizsgálatok granulózasejtes petefészek daganatos betegeknél SZTERID PRFIL VIZSGÁLATK MÉNYAKRÁKS NŐKNÉL

3 5. SZTERID PRFIL VIZSGÁLATK ENDMETRIÓZISS NŐKNÉL EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE... 7 ÖSSZEFGLALÁS IVATKZÁSK JEGYZÉKE FÜGGELÉK AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK EGYÉB KÖZLEMÉNYEK

4 Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik hozzájárultak ahhoz, hogy ez a munka elkészülhessen. Mindenek előtt köszönettel tartozom két témavezetőmnek, Prof. Dr. Gőcze Péternek és Prof. Dr. Kilár Ferencnek, akik 2004 óta vezettek, szakmai segítséget nyújtva, emberileg támogatva, bíztatva munkám során. Köszönöm a PTE ÁK Bioanalitikai Intézet és a Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika dolgozóinak, hogy készségesen együttműködtek a kutatásom során. Köszönöm Dr. Poór Viktóriának, hogy megosztotta velem tapasztalatait, segített és bíztatott, ha szükségem volt rá. Köszönettel tartozom Golobné Wassenszky Ritának, aki rengeteget segített a mindig jó hangulatú laboratóriumi munkában, emberileg támogatott és bíztatott. Köszönöm Dr. Juricskay Istvánnénak, hogy értékes tanácsokkal segítette a munkámat. És nem utolsó sorban köszönetet mondok családomnak türelmükért és bíztatásukért. 4

5 Rövidítések jegyzéke Szteroid-metabolitok rövidítései RÖVIDÍTÉS TUDMÁNYS NÉV TRIVIÁLIS NÉV An 5α-androsztán-α-ol-17-on androszteron 5-AT 5-androsztén-β,16α,17β-triol androszténtriol atb 5α-pregnán-α,11β,21-triol-20-on allotetrahidrokortikoszteron atf 5α-pregnán-α,11β,17α,21-tetrol-20-on allo-tetrahidrokortizol α 5β-pregnán-α,11β,17α,20α,21-pentol α-kortol α L 5β-pregnán-α,17α,20α,21-tetrol-11-on α-kortolon β L 5β-pregnán-α,17α,20β,21-tetrol-11-on β-kortolon DEA 5-androsztén-β-ol-17-on dehidroepiandroszteron DEAS 5-androsztén-β-ol-17-on szulfát dehidroepiandroszteronszulfát E 2 ösztrán-,17β-diol 17β-ösztradiol Et 5β-androsztán-α-ol-17-on etiokolanolon F 4-pregnén-11β,17α,21-triol-,20-dion kortizol IS 5α-androsztán-β,17β-diol 5α-androsztándiol KB β-hidroxi-5-kolesztén--butirát koleszteril-butirát 11--An 5α-androsztán-α,11β-diol-17-on 11β-hidroxi-androszteron 16--DEA 5-androsztén-β,16α-diol-17-on 16α-hidroxi-DEA 11--Et 5β-androsztán-α,11β-diol-17-on 11β-hidroxi-etiokolanolon 11--PT 5β-pregnán-α,17α,20α-triol-11-on 11-keto-pregnántriol P 4-pregnén-,20-dion progeszteron PD 5β-pregnán-α,20α-diol pregnándiol 5-PD 5-pregnén-β,20α-diol pregnéndiol PT 5β-pregnán-α,17α,20α-triol pregnántriol 5-PT 5-pregnén-β,17α,20α-triol pregnéntriol SS 5,22-kolesztadien-24β-etil-β-ol sztigmaszterol T 4-androsztén-17β-ol--on tesztoszteron 5

6 TA 5β-pregnán-α,21-diol-11,20-dion tetrahidro-11- dehidrokortikoszteron TB 5β-pregnán-α,11β,21-triol-20-on tetrahidrokortikoszteron TE 5β-pregnán-α,17α,21-triol-11,20-dion tetrahidrokortizon TF 5β-pregnán-α,11β,17α,21-tetrol-20-on tetrahidrokortizol TS 5β-pregnán-α,17α,21-triol-20-on tetrahidro-11-deoxikortizol Egyéb rövidítések BMI A FS GnR L Max Me Min StAR protein Q 1, Q testtömeg index (body mass/index) congenitalis adrenalis hyperplasia (veleszületett adrenogenitális szindróma) follikulus stimuláló hormon gonadotropin releasing hormon luteinizáló hormon maximum érték gyakorisági eloszlás középső értéke (medián) minimum érték szteroidgenezis akut szabályozó fehérje (steroidogenic acute regulatory protein) alsó és felső negyedelő értékek (kvartilisek) 6

7 Bevezetés A szteroid hormonok minőségi és mennyiségi meghatározása, a szervezet fiziológiás folyamataiban betöltött összetett szerepük miatt fontos az orvosi diagnosztikában és a különböző betegségek patofiziológiájának felderítésében. A szteroid hormonok és metabolitjaik mérésére alkalmazható többféle módszer közül napjainkban legelterjedtebbek a kromatográfiai módszerek és az immunoesszék használata. A szérumból, plazmából és egyes komponensek esetében nyálból és vizeletből történő egyedi szteroid mérések (általában immunoesszék) gyorsan végezhetők, könnyen kivitelezhetők és többnyire automatizálhatók, de csak a mintavétel pillanatában, a keringésben lévő szteroidokról adnak információt (Andrew, 2001). A vizeletből történő mérések eredményei azonban tájékoztatást adnak a mirigyekben és a periférián történő szteroid metabolizmusról is. A vizeletszteroid-profil néven ismert gázkromatográfiai módszer lehetővé teszi több szteroid csoport egyidejű mérését. Kiküszöbölve az egyes szteroidokra jellemző napi ingadozást, a 24 órán át gyűjtött vizeletből történő mérés átfogó képet nyújt az egy napi szteroid anyagcseréről, a szteroidok metabolikus útjairól és a szintézisben résztvevő enzimek működéséről is. A vizeletszteroid-profil módszer több endokrin megbetegedés differenciál diagnosztikájában és kutatásában (Juricskay és Telegdy, 2000; Szilágyi és mtsai, 2000; Poór és mtsai, 2005) kiemelkedő fontossággal bír. Magyarországon rutinszerűen egyedül a PTE ÁK Bioanalitikai Intézetében végezhető vizeletszteroid-profil vizsgálat, a módszerrel dolgozó laboratóriumokat összefogó nemzetközi szervezet tagjaként. Kutatásunk során olyan nőgyógyászati megbetegedések vizsgálatára fektettük a hangsúlyt, melyek patofiziológiája nem teljesen felderített és kapcsolatba hozható a szteroid metabolizmus módosulásával. élcsoportjaink a napjainkban is nagy jelentőséggel bíró népbetegségnek számító csontritkulás, a ma is a vezető halálozási okok közé tartozó női nemi szervi daganatok. Az endometriózissal szorosan összefüggő meddőség az emelkedő incidenciája miatt került a figyelmünk előterébe. 7

8 Irodalmi áttekintés 1. Vizeletszteroid-profil módszer 1.1 Szteroid hormonok Szteroid hormonok típusai, szerkezete A szteroid hormonokat az élő szervezetben betöltött biológiai hatásuk alapján mineralo- és glükokortikoidokra, ill. szexuálszteroidokra (androgének, ösztrogének, gesztagének) oszthatjuk fel. A mineralokortikoidok az ásványi, a glükokortikoidok a szénhidrát anyagcserében játszanak szerepet, a szexuálszteroidok a nemi működést befolyásolják. A mineráló- és glükokortikoidok a mellékvesekéregben, a szexuálszteroidok kisebb részt a mellékvesekéregben, nagyobb részt pedig az ivarmirigyekben keletkeznek. Az emberi szervezetben termelődő szteroid hormonokat az 1. táblázat mutatja. 1. táblázat Főbb szteroid hormonok az emberi szervezetben Neve Az elválasztott végtermék Fő hatása Mellékvesekéreg Zona glomerulosa Zona fasciculata Zona reticuláris aldoszteron kortizol dehidroepiandroszteron dehidroepiandroszteron-szulfát mineralokortikoid glükokortikoid gyenge androgén ere tesztoszteron erős androgén Petefészek progeszteron androszténdion ösztradiol gesztagén gyenge androgén ösztrogén Méhlepény progeszteron ösztradiol ösztriol gesztagén ösztrogén ösztrogén Minden szteroid hormon szintézise azonos szubsztrátból (koleszterin) indul ki, és a szintézis nagy része azonos enzimek közreműködésével történik. A kémiai szerkezetükben közös, hogy ciklopentanoperhidrofenantrén (szterán) vázat tartalmaznak (1. ábra). Az elválasztásra kerülő hormonok azonban mind kémiai szerkezetüket, mind biológiai hatásaikat tekintve nagymértékben különbözőek. A különböző szteroidok a szénatomok számában, a 8

9 kettőskötések helyzetében és a különféle szubsztituensek jelenlétében és helyzetében térnek el egymástól. Szénatomszámuk alapján három csoportba oszthatók: a 18 szénatomból álló ösztrán az ösztrogének, a 19 szénatomból álló androsztán az androgének, a 21 szénatomból álló pregnán pedig a kortikoszteroidok és a gesztagének alapvázát képezi (1. ábra) A B D ábra Szterán váz és a szteroidok alapvázai 1. szterán váz, 2. ösztrán,. androsztán, 4. pregnán vázak Szteroid hormonok metabolizmusa A szteroidok metabolizmusának két fő útja van. Az egyik az, hogy az endokrin mirigyben termelődött szteroid más szervekben egy másik, még mindig hatásos vegyületté alakul át (pl. a tesztoszteron hatásosabb dihidrotesztoszteronná redukálódik, az androgének egy része más szövetekben ösztrogén hormonná alakulhat). A másik út a szabályos inaktiválódás, amely során az aktív hormonból inaktív vegyületek képződnek. Az inaktiválódás közben a hormonok redukciós folyamatok során elveszítik biológiai hatásosságukat, majd vízoldékony formává alakulnak át. Mindkét átalakulás elsősorban a májban játszódik le. A redukciós folyamatok alapja hasonló a legtöbb szteroid (androgének, progesztagének, kortikoszteroidok, aldoszteron) esetében: az A gyűrűben (4. és 5. szénatom közötti kettős kötésnél) és a keto csoportokon (, 11 és 20 helyzetben) redukció történik. 9

10 A redukciós lépések után, a már inaktivált szteroidok szulfáttal, vagy glükuronsavval konjugálódnak, és a keletkezett szteroid-szulfátokat vagy szteroid-glükuronidokat a vese választja ki, és így a vizeletben ürülnek. A α-hidroxi-5α és a α-hidroxi-5β szteroidok glükuronid, a β-hidroxi-5-én szteroidok pedig mono-, vagy diszulfát formában választódnak ki. Bizonyos konjugált formák (pl: DEAS) a keringésben maradva visszaalakulhatnak szabad formájukká (Shackleton, 1986). A vizelettel ürülő szteroid-metabolitok nagy része a mellékvese hormonjaiból, kisebb része az ivarmirigyek hormonjaiból származik, és vannak olyan metabolitok, amelyek mindkét szervben termelődő hormonokból származnak. Szintjük magába foglalja a periférián keletkezett, a keringésbe nem kerülő hormonok metabolitjait is (Wudy és mtsai, 2004). A 2. ábrán foglaltam össze a klinikai diagnosztikában leggyakrabban vizsgált androgén, kortikoid és progeszteron vizeletszteroid-metabolitok eredetét. 10

11 Koleszterin it P-450 koleszterin oldallánc hasítás Pregnenolon 17α-hidroxiláz 17α--pregnenolon 17α-hidroxiláz/17, 20 liáz Dehidroepiandroszteron 17β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz Androszténdiol β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz Progeszteron 17α-hidroxiláz 17α--progeszteron 17α-hidroxiláz/17, 20 liáz Androszténdion 17β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz Tesztoszteron 21-hidroxiláz 11β-hidroxiláz 21-hidroxiláz Aromatáz Aromatáz 11-dezoxikortikoszteron 11β-hidroxiláz Kortikoszteron 21-dezoxikortizol 11-dezoxikortizol 11β-hidroxiláz 21-dezoxikortizon 11β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz Kortizon Kortizol 11β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz 11β-hidroxiláz Ösztron Ösztradiol 17-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz 11β-hidroxiláz 11-hidroxi-androszténdion Szérum 5-PD PD TA TB atb 5-PT PT 11--PT TE α-l β-l TF atf α- F TS DEA 5-AT 16--DEA An Et 11--An 11--Et Vizelet 2. ábra A klinikai diagnosztikában leggyakrabban vizsgált, vizeletben ürülő szteroid-metabolitok eredete Az ábra a főbb szteroidok kialakulásának reakcióit és fontosabb metabolitjainak eredetét szemlélteti. Az átalakulásban résztvevő enzimek piros színnel vannak feltüntetve. A szervezetben nincs olyan sejt, amelyikben valamennyi átalakulás végbemenne. A rövidítések jelentése a RÖVIDÍTÉSEK fejezetben található (5. o.). (Andrew, 2001; omma és mtsai, 200; onour, 1997a közleményei alapján). 11

12 A tesztoszteron és az androszténdion vizeletben ürülő fontosabb metabolitjai az androszteron (An) és az etiokolanolon (Et), amelyek származhatnak mind a mellékvese, mind az ivarmirigy eredetű hormonokból. A dehidroepiandroszteron (DEA) és fő metabolitjai a 16α-hidroxi-DEA (16-- DEA) és az androszténtriol ( 5-AT), a mellékvese androgén termelését jellemzik. A 11-hidroxi-17 ketoszteroidok: a 11β-hidroxi-androszteron (11--An) és a 11βhidroxi-etiokolanolon (11--Et) gyenge androgén hatású metabolitok, amelyek oldallánc hasítással kortizolból is keletkezhetnek. A petefészekben termelődő progeszteron legfontosabb vizeletben ürülő metabolitja a pregnándiol (PD), amelynek szintje pontos jelzője a progeszteron mennyiségének, ezért ciklusmonitorozásra, sárgatest funkció megítélésére használatos. A progeszteronból származó kortikoszteron termelését jellemzik a tetrahidro-11- dehidrokortikoszteron (TA), tetrahidrokortikoszteron (TB) és allo-tetrahidrokortikoszteron (atb) metabolitok. A 11-oxo-kortizol (kortizon) metabolitok: a tetrahidrokortizon (TE), α-kortolon (α- L), β-kortolon (β-l), és a 11-hidroxi-kortizol (kortizol) metabolitok: a tetrahidrokortizol (TF), allo-tetrahidrokortizol (atf) és α-kortol (α-) összege a napi kortizol termelést jellemzi. A vizeletszteroid-profil módszerrel a különböző szteroid hormonok metabolitjait egyidejűleg tudjuk mérni, ezáltal lehetővé válik, hogy az egyes metabolitok egymáshoz viszonyított arányát is nyomon kövessük, és információt kapjunk a metabolizmusban szerepet játszó enzimek működéséről. A metabolikus utak köztitermékei: a pregnéndiol ( 5-PD), pregnántriol (PT), pregnéntriol ( 5-PT), 11-keto-pregnántriol (11--PT) és a tetrahidro-11-deoxikortizol (TS) metabolitok mennyiségének megváltozása központi jelentőségű a veleszületett adrenogenitalis szindróma betegségcsaládba tartozó enzimműködési zavarok diagnosztizálásában (bővebben lásd az 1. alfejezet) (Shackleton, 1986; Sólyom, 1998, 2001). 12

13 1.2 A vizeletszteroid-profil vizsgálat alapjai Több szteroid csoport egyidejű, gázkromatográfiai vizsgálatával 1966 óta találkozunk az irodalomban, és azóta a módszerben a technikai fejlődéseknek köszönhetően jelentős változások történtek (Shackleton és onour, 1976; Shackleton és Whitney, 1980a; Shackleton 1986; Shackleton és mtsai, 1990; onour, 1997a) Előzetes mintaelőkészítés A biológiai minták gázkromatográfiai analízise előtt általában több munkafolyamatból álló mintaelőkészítésre van szükség. A kvantitatív vizeletszteroid-profil meghatározáshoz az alábbi feltételeknek kell teljesülnie (Shackleton 1986): 24-órás vizeletgyűjtés a minta megfelelő tárolása a gyűjtés és a feldolgozás közötti időszakban a konjugált szteroidok kvantitatív kivonása vizeletből a konjugált szteroidok tökéletes hidrolízise a felszabadított szteroidok kvantitatív visszanyerése az összes szteroid kvantitatív átalakulása illékony származékokká szennyeződések elkerülése A szteroidok vizeletből történő kivonása során korábban alkalmazott oldószeres extrakciót ma már felváltotta az egyszerűbb és lényegesen kevesebb időt igénylő szilárd fázisú kivonás. A folyamat során szűrők közé töltött, konjugált és szabad szteroidok kivonására is alkalmas, oktadecilszilán fázist tartalmazó kis oszlopokat használnak (Shackleton és Whitney, 1980a). Az extrakciós lépést a szteroid konjugátumok kémiai (szolvolízis), vagy enzimatikus hidrolízise követi, melynek során a szteroid-szulfátként, illetve glükuronidként ürülő metabolitokat felszabadítják a konjugált formáikból. Az összes vizelet szteroid kvantitatív hidrolízisének megvalósítása igen nehéz. Többféle enzim alkalmazható (pl.: bakteriális /Escherichia coli/ és marhamáj enzimek), de a legelterjedtebb az éti csiga (elix pomatia) emésztőenzimeinek használata, amelyek alkalmasak az összes szteroid glükuronid és a legtöbb szulfát forma hidrolizálására (Shackleton, 1986). A konjugátumok hidrolízise után a felszabadított szteroidokat ismét szilárd fázisú extrakcióval nyerik vissza. 1

14 A szteroid-metabolitok kis illékonyságú és magas hőmérsékleten erősen bomlékony anyagok, ezért a gázkromatográfiás analízis előtt olyan kémiai átalakítást szükséges végezni rajtuk, melynek során a metabolitok illékonysága és hőstabilitása is megnő. Az eljárás során a hőbomlást és az illékonyságot befolyásoló poláris csoportok (keto és hidroxil csoportok) átalakítása történik. Többféle származékképzési eljárás ismert. A szteroidok hidroxilcsoportjait általában trimetil-szililoxi, az oxo-csoportokat pedig -metiloxim származékká alakítják át. Mindkét funkciós csoport jelenléte esetén -metiloxim-trimetil-szililoxi származékokat képeznek. Az átalakítás során először az enolizációra hajlamos keto-csoportok blokkolása történik metoxim képzéssel, majd a hidroxil csoportok hidrogénjét cserélik inaktív, trimetil-szilil csoportokra (Shackleton és mtsai, 1990) (. ábra). a., R== + 2 N.l R==N l b., R- + Me X R-Me + X. ábra Származékképzési reakciók Az a., reakció a keto csoportok metoxim származékokká történő átalakítása. A reagens metoxiamin-hidroklorid 2%-os piridines oldata. A b., reakció a trimetil-szililezési reakció általános sémája. Az általunk alkalmazott szililezőszer: trimetilszililimidazol (TMSI). Egyes szililező reagensek (pl.: TMSI) roncsolhatják a gázkromatográfiai mérésekhez használt kapilláris oszlopot, ezért a feleslegét a mérés előtt el kell távolítani a mintákból. Ez a folyamat általában gél-kromatográfiás technikával történik Lipidex 5000 géloszlop segítségével A szteroidok gázkromatográf-tömegspektrometriája Napjainkban a szteroidok származékainak minőségi és mennyiségi meghatározására leginkább alkalmazott módszer a gázkromatográf-tömegspektrometria. A szteroid-metabolitokat folyadék halmazállapotban juttatják a gázkromatográfba. Nagyon fontos, hogy a minta pillanatszerűen és kvantitative elpárologjon a mintaadagolás folyamán. Számos mintaadagoló rendszer közül az ún. Split-splitless mintabeviteli rendszer a leggyakrabban alkalmazott. Ebben az esetben a mintát mikrofecskendő segítségével juttatják a többnyire szilikon szeptummal lezárt, 1-2 cm térfogatú üvegbetétet tartalmazó, fűthető 14

15 elpárologtatóba. A kétféle mintabeviteli technika közül a split mintabemérés során a mintából képződő gőz bizonyos hányadát egy mintaáram elosztó segítségével a szabadba engedik, és csak a kisebb, szükséges hányad jut az oszlopra. A splitless technika esetén a minta bevitelét követően a teljes elpárologtatásig nem alkalmaznak mintaáram elosztást. Mivel a legtöbb szteroid forráspontja 150 feletti, ezért a mintabemérő hőmérséklete a mintaadagolás során 00 körüli. A legtöbb szteroid-metabolit elválasztása, kémiai tulajdonságaiknak megfelelően, apoláris vagy kismértékben poláris állófázisokat (nem-szelektív, metilszilikon fázisok) tartalmazó kapilláris oszlopokon [pl.: P-1-MS oszlop (Agilent ompany)] történik. Az oszlopok hossza általában 15-0 m, belső átmérője 0,2-0,4 mm, állófázisuk vastagsága 0,1-0, µm. A komponensek elválasztására hőmérsékleti programot alkalmaznak. Az oszlopot, a minta bejuttatását követően, rövid várakozási idő (1-2 perc) után gyorsan felfűtik az analitikus hőmérsékletre (180 ), majd lassan (kb. 2 /perc) tovább emelik a legkevésbé illékony összetevő forráspontjáig kb. 00 -ig (Shackleton és mtsai, 1990). A szteroidok elválasztására alkalmazott oszlopok kis kapacitásúak, mivel vékony állófázis réteget tartalmaznak, ezért nagy érzékenységű detektorra van szükség. A sokféle gázkromatográfiás detektor közül napjainkban a leginkább alkalmazott, legsokoldalúbb a tömegspektrométer, amely nagy érzékenységű és szelektivitású. A tömegspektrométer gázhalmazállapotú ionok (töltéssel rendelkező gáz molekulák), tömegük alapján történő szétválasztására szolgál. A tömegspektrometriai mérés részfolyamatainak vákuumban (10 - Pa) kell végbe mennie, amelyek sorrendben a következők: a minta gázállapotba hozása ionizáció a keletkezett ionok elektromos térben történő felgyorsítása az elektromos és mágneses térben az m/z (töltésegységre jutó tömeg) szerint elválasztott ionnyalábok regisztrálása A tömegspektrometria analitikai alkalmazása azon alapul, hogy gondosan ellenőrzött, azonos kísérleti körülmények között a molekulák fragmentációja azonos módon történik. Ezen túlmenően a fragmensek tömege és mennyisége a molekula szerkezetének, funkciós csoportjainak függvénye. Így a tömegspektrum adataiból a molekula szerkezetére is következtethetünk. 15

16 A szteroid komponensekből álló minta minőségi és mennyiségi analízisére legcélszerűbb a belső standard módszert alkalmazni, ezáltal kiküszöbölhetők a mintaelőkészítés és a mintabemérés bizonyos hibái. A módszer azon alapul, hogy a mintaelőkészítés során, vagy a mintabemérés előtt a mérendő elegyhez hozzáadnak egy olyan komponenst (belső standard), amelynek csúcsa teljesen elválik a többi csúcstól, nincs jelen a vizsgálandó mintában és nincs semmilyen zavaró hatása. Ez a módszer kalibrációs görbe segítségével dolgozik, de lényegében relatív kalibrációt alkalmaz. A kalibrációs görbét ismert mennyiségű, meghatározni kívánt anyagok és a belső standard keverékével készítik el előzetesen. A modern gázkromatográf-tömegspektrometriai készülékek lehetővé teszik az ún. szelektív ionkereséssel (SIM) történő analizálást. A meghatározni kívánt komponenseknél és a belső standardnál kiválasztanak néhány jellemző tömegiont, egy céliont és 1-2 minősítő iont. A komponenseket a relatív retenciós idők, valamint az egyes anyagok célionjának és minősítő ionjainak egymáshoz viszonyított aránya alapján azonosítják. A mennyiségi meghatározás során az összes mért komponens, a kalibráció során meghatározott érzékenységi faktorokkal korrigált célion csúcs alatti területét viszonyítják a belső standard célion csúcs alatti területéhez. A szteroidok mérésénél gyakori a belső standard: az 5α-androsztán-β,17β-diol (IS), a sztigmaszterol (SS) és a koleszteril-butirát (KB) együttes használata. Az 5α-androsztán-β, 17β-diolt a mennyiségi és minőségi analízisben használják. A sztigmaszterolt a származékképzés ellenőrzésére alkalmazzák. Erre azért van szükség, mert a trimetil-szilil származékok nagyon érzékenyek, viszonylag könnyen hidrolizálódnak, ha víz vagy sav nyomok maradnak a mintában. A sztigmaszterol trimetil-szilil származéka különösen könnyen hidrolizálódik, így a folyamat során bekövetkező hiba esetén a csúcs alatti területe azonos mennyiség esetén is jelentősen kisebb lesz, mint a koleszteril-butirát standardé (Shackleton, 1986; onour, 1997a). 16

17 1. Vizeletszteroid-profil a klinikai diagnosztikában A normál vizeletbe ürülő szteroid-metabolitok szintje nem és életkor szerint változik, amit figyelembe kell venni a klinikai diagnosztikában. Az életkori és nemi sajátosságok miatt szteroid-profil meghatározások esetében szükség van nem és életkor szerinti referencia értékekre (onour, 1997a; Shamin és mtsai, 2000). Referencia értékek találhatók Weykamp és mtsai (1989), onour (1990) és omma és mtsai (200) közleményeiben. A vizeletszteroid-profil módszer kiemelkedő fontossággal bír olyan betegségek hátterében álló okok felderítésében, amelyek befolyásolják a szteroidok szintézisét és metabolizmusát. Ezen betegségek többsége a normáltól lényegesen eltérő, jellegzetes vizeletszteroid-profilokat ad. Ilyen betegségek pl.: a sóvesztő állapotok, magas vérnyomás (hypertonia), kövérség (obesitas), havi vérzés elmaradása (amennorhea), korai adrenarche, szeméremszőrzet korai megjelenése (pubarche praecox), korai nemi érés (pubertas praecox), bizonytalan neműség (intersex genitaliák), nőknél a férfias jelleg megjelenése (virilizáció) és hiperandrogén állapotok (pl. policisztás ovárium szindróma PS). A vizeletszteroid-profil módszer bizonyos betegségeknél, mint pl. a szteroid-termelő tumorok esetén, segítik az egész életen át tartó kezelés monitorozását. A legismertebb, jellegzetes profillal rendelkező betegségcsalád a veleszületett adrenogenitalis szindróma (congenitális adrenális hyperplasia, A, AGS). Ebbe a betegségcsaládba a szteroidszintézis ötféle veleszületett enzimműködési zavara tartozik (2. táblázat), melyek a mellékvese és az ivarmirigyek szteroidképzésének összetett rendellenességét okozzák, elégtelen kortizolképzéshez vezetnek változatos tünetekkel kísérve (Sólyom, 2001). Jellegzetes profilt ad még a 11β és 17β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzimek, az 5αreduktáz elégtelen működése is, a ushing szindróma, továbbá egyes szteroid-termelő tumorok (Shackleton és mtsai, 1990). A 2. táblázatban néhány, jellegzetes szteroid-profillal rendelkező betegséget és jellemzőit foglaltam össze. 17

18 2. táblázat Endokrin betegségek és jellemző vizeletszteroid-profiljaik Betegség k Vizeletszteroid-profil változásai ongenitalis adrenalis hyperplasia (A) ushing szindróma 21-hidroxiláz hiány 11β-hidroxiláz hiány β-hidroxi-szteroiddehidrogenáz hiány 17α-hidroxiláz hiány StAR fehérje hiány csökkent kortizol metabolitok emelkedett 21-deoxi-szteroidok (17--Pg, PT, 11-- PT) és androgén metabolitok enyhe formájában (néhány későn manifesztálódó formában is) a kortizol metabolitok szintje normális, de a 17-hidroxi-progeszteron és a kortizol metabolitok aránya megnövekszik teljes defektusnál alig detektálhatók a kortizol metabolitok emelkedett 11-deoxi-kortizol (TS) és 11 -deoxiandrogén metabolitok (An, Et) csökkent kortizol metabolitok emelkedett β-hidroxi-5-én szteroid szulfátok (p1.: 5-PT) leányoknál túlzott, férfiakban elégtelen androgén termelés teljes defektusnál a kortizol és androgén metabolitok alig detektálhatóak fő vizelet szteroidok a kortikoszteron metabolitjai (TB, atb) csökkent szteroid metabolit szintek emelkedett az összes kortizol metabolit szintje hormontermelő tumorok mellékvese tumorok bizonyos szteroidok szintje emelkedett (p1.: βhidroxi-5-én szteroidok, 11--An) ivarmirigy tumorok különféle típusú petefészek (PT), ill. here eredetű metabolitok emelkedett szintje (tesztoszteron és metabolitjai, és β-hidroxi-5-én szteroidok) androgéntermelés 5α-reduktáz hiány 5α-redukált szteroidok alacsony szintje zavarai csökkent 5α/5β metabolit arány pl.: An/Et, TF/aTF 17β-hidroxi-szteroiddehidrogenáz emelkedett An és Et szint hiány alacsony ösztrogén termelés terhesség alatt méhlepény-szulfatáz hiány β-hidroxi-5-én szteroidok emelkedett szintje a terhes nő vizeletében, alacsony ösztriol szint policisztás ovárium szindróma emelkedett 5α/5β metabolit arány (Shackleton, 1986; Shackleton és mtsai, 1990; Sólyom, 1998; Szilágyi és mtsai, 2000; Wudy, 2004 közlemények alapján). 18

19 2. Nőket érintő megbetegedések és a szteroid hormonok kapcsolata Napjainkban, a nőket leginkább veszélyeztető betegségek közé tartozik a csontritkulás, a mióma, a méhnyálkahártyarák, a petefészek daganatok, a méhnyakrák és az endometriózis. Kialakulásukban számos kockázati tényező ismert. Ebben a fejezetben rövid áttekintést adok ezen nőgyógyászati megbetegedésekről, melyek patofiziológiája nem teljesen felderített és kapcsolatba hozható a szteroid metabolizmus módosulásával. 2.1 sontritkulás (szteoporózis) A csontritkulás (4. ábra) a társadalom széles rétegeit érintő népegészségügyi probléma, a csontrendszer szisztémás, progresszív megbetegedése, melyet a csonttömeg fogyása mellett a csont szerkezeti megváltozása és mindezek miatt a csont törékenységének fokozódása jellemez. Fiatal korban vagy terhesség alatt is jelentkezhet, de leggyakoribb a menopauzás nőknél (I. típus). Öregedés során (65 év felett) a betegség mindkét nemet érinti (II. típus). 4. ábra sontritkulás 19

20 2001): Az oszteoporózis kialakulásának hajlamosító tényezői jól ismertek (Westfall és mtsai, dohányzás alkoholizmus mértéktelen kávé fogyasztás családi halmozódás női nem magasabb életkor endokrin betegségek (férfi nemi hormon hiánya, pajzsmirigy túlműködés, ushing-szindróma) szteroidkészítmények tartós használata A szexuálszteroidok alapvető szerepet játszanak a csontok homeosztázisában. Az ösztrogének jelentősége a csonttömeg fenntartásában posztmenopauzás nőknél ismert. Ezt támasztják alá azok a tanulmányok, amelyek a menopauzában az ösztrogén hormonpótló terápia (Lindsay és Tohme, 1990; Sowers és mtsai, 199) és az ösztrogén-progesztogén kombinált kezelés hatásait vizsgálták az oszteoporózis megelőzésében (Goeretzlehner, 2001). Az androgének is fontos fiziológiás szerepet játszanak a csontállomány fenntartásában, a csontokra antireszorptív módon hatnak. Ez részben a közvetlen androgén hatásnak köszönhető, valamint az androgének indirekt módon is hatnak az aromatizáción keresztül az androgénekből szintetizált ösztrogének révén (Davis, 1997; Sasano és mtsai, 1997). Az androgének stimulálják a csontsejtek proliferációját és differenciálódását (Munoz- Torres és mtsai, 1995; Kasperk és mtsai, 1997), befolyásolhatják az inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1) szintézisét (Barett-onnor és Goodman-Gruen, 1998), valamint a D-vitamin és az ösztrogén receptorok mennyiségét is (Davis és mtsai, 1994; tremski és mtsai, 1997). A glükokortikoid többlet a csontritkulás kialakulásában jelentős szerepet játszik. A glükokortikoidok növelik a csontreszorpciót, gátolják a csontképződést és indirekt módon hatnak a csontokra az intesztinális a 2+ abszorpció csökkentésével, a D-vitamin metabolizmus módosításával. Továbbá hiperkalciuriát tartanak fenn, gátolják a gonadotróp és szomatotróp tengelyt (Manelli és Giustina, 2000). 20

21 2.2 Méhtest daganat Mióma Méhtestből kiinduló mesenchymalis eredetű leiomyoma (5. ábra) a női szervezet leggyakoribb daganata, a méheltávolító műtétek (hysterectomia) 0-40 %-a emiatt történik, az esetek 0,1-0,5 %-ában alakul át rosszindulatú daganattá. A reproduktív életkorban levő nők %-ában kimutatható, gyakoriságának maximumát a korai változókorban (premenopauza) éri el. Ugyanakkor a nőgyógyászati panaszok 2- %-ért felelős. 5. ábra Mióma A mióma kialakulásának oka, valamint a növekedés ütemét befolyásoló tényezők ma még tisztázatlanok. Kialakulásában örökletes faktorok is szerepet játszhatnak, színesbőrűekben gyakrabban fordul elő. 21

22 Minden egyes góc egy sejtből eredő, monoclonalis tumor. ormondependens daganat, ösztrogén receptorokat tartalmaz (Wilson és mtsai, 1980; Sudan és mtsai, 1987; Fujii, 1992; Brandon és mtsai, 1995; Kokawa és mtsai, 2002; Leitao és mtsai, 2004). Növekedésében az ösztrogénhormonok jelentőségét több tényező bizonyítja (Ichibura és mtsai, 1998): menarche előtt nem fordul elő menopauza után általában nem alakul ki, a meglévő gócok általában fokozatosan kisebbednek terhesség idején mérete nő, a gyermekágyban visszafejlődik gyakran fordul elő fokozott ösztrogénhatásra utaló állapotokkal együtt (endometriózis, endometriumhiperplázia, melldaganat, policisztás ovárium (P)-szindróma stb.) Az esetek egy részénél azonban nem mutatható ki az ösztrogénhormonok daganatnövekedést serkentő hatása (Potgieter és mtsai, 1995; Wu és heng, 1995) Méhnyálkahártyarák A méhnyálkahártyarák (6. ábra) általában a méh nyálkahártyájából (endometrium) alakul ki, amely a leggyakoribb női nemi szervi daganat. Általában éves korban fordul elő, azonban az esetek 5 %-a 40 éves kor előtt kerül felismerésre (Bray és mtsai, 2005). Mivel a méhtestrák gyakrabban fordul elő túlsúlyos, dohányzó, magas vérnyomásban és cukorbetegségben szenvedő nőknél, ezért ezek a betegség hajlamosító tényezői (Austin és mtsai, 1991; ill és Austin, 1996; Troisi és mtsai, 1997; Bjorge és mtsai, 2007). A daganat kialakulása után igen lassan nő, korai stádiumban okoz klinikai tüneteket (rendetlen vérzés), hosszú ideig nem ad más szervekbe áttétet, ezért kórjóslata a méhnyakráknál lényegesen kedvezőbb. 22

23 6. ábra Méhnyálkahártyarák Az endometrium daganat kifejlődésének pontos oka nem ismert, kialakulásában az ösztrogénhormonok szerepe azonban bizonyítottnak tekinthető. Gyakran ösztrogéntúlsúllyal járó állapotokkal társul (Escobedo és mtsai, 1991; Parazzini és mtsai, 1991; Potischman és mtsai, 1996; Weiss és ill, 1996; Modan és mtsai, 1998; Niwa és mtsai, 2000; Emons és mtsai, 2000; Akhmedkhanov és mtsai, 2001; Zeleniuch-Jacquotte és mtsai, 2001; Kaaks és mtsai, 2002; Lukanova és mtsai, 2004): ösztrogéntermelő petefészek daganat gyakori anovulációs ciklusok (P-szindróma, korai menarche, késői menopauza) kóros elhízás (csökken a keringő progeszteron és a nemihormon-kötő fehérje (SBG) szintje, ezért emelkedik a szabad ösztradiol szintje, továbbá az androgének a zsírszövetben is ösztrogénné alakulhatnak) ösztrogéntartalmú gyógyszerek Az esetek egy részénél azonban nem mutatható ki az ösztrogének emelkedett szintje (Judd és mtsai, 1980; Falsetti és mtsai, 198; Bonney és mtsai, 1986). A progeszteron protektív hatását több tényező valószínűsíti. Azokban a nőkben, akik életük során terhesek voltak, ritkábban alakul ki a betegség, valamint a kombinált hormonális fogamzásgátlók szedése is protektív hatású (Weiderpass és mtsai, 1999). Néhány tanulmány szerint az androgének emelkedett szintje is elősegítheti a daganat kialakulását (Gimes és mtsai, 1986; Nagamani és mtsai, 1986; Austin és mtsai, 1991; Parazzini és mtsai, 1991; Potischman és mtsai, 1996). Vannak azonban olyan kutatási 2

24 eredmények is, melyek nem igazolják az androgének emelkedett szintjét (Judd és mtsai, 1980; Falsetti és mtsai, 198; Bonney és mtsai, 1986). Genetikai faktorok is szerepet játszanak a méhtest daganat kialakulásában. Azokban a családokban, ahol petefészek-, emlő- és vastagbél daganat fordul elő (Lynch-szindróma II.), nagyobb a méhtest rák kialakulásának a kockázata (Dunlop és mtsai, 1997; hen és mtsai, 2007). 2. Petefészek daganat 2..1 ám eredetű petefészek daganat A női kismedencei nemi szervek rosszindulatú daganatainak 25 %-a indul ki a petefészekből. Ezzel a rosszindulatú nemi szervi tumorok között Magyarországon a harmadik leggyakoribb, a daganatos halálozást tekintve azonban első, megelőzve a méhtest és a méhnyak tumorait. Ez annak tulajdonítható, hogy korai stádiumban nem ad tüneteket, megbízható szűrőmódszerek nem állnak rendelkezésre, és a felismerésre általában csak előrehaladott stádiumban kerül sor, amikor a terápiás lehetőségek már korlátozottak. A petefészek daganatainak %-a indul ki az embrionális coelomahám multipotens sejtjeiből származó petefészek felszíni hámból, amelynek sejtjei a felső genitális traktus valamennyi hámfélesége irányába differenciálódhatnak, előidézve a hám eredetű petefészek daganatok (7. ábra) szövettani sokféleségét. 7. ábra ám eredetű petefészek daganat 24

25 A petefészek hám eredetű daganatainak kóreredete az esetek többségében ismeretlen. vulációkor a petefészkek felszíni hámja sérül, a hám helyreállításához fokozott sejtszaporodás szükséges. Feltehetően ekkor nagyobb esély van a proliferációt szabályozó gének mutációjára, mely a tumorképződés kialakulásához vezet (o, 200). Azok az állapotok, melyekben az ovulációk száma kevesebb, csökkentik a hám eredetű petefészek daganatok kialakulásának valószínűségét (Rossing és mtsai, 1994; Ness és mtsai, 2002; Riman és mtsai, 2002; Folsom és mtsai, 2004; Tung és mtsai, 2005; hoi és mtsai, 2007; Zheng és mtsai, 2007): krónikus anovuláció terhesség szoptatás orális fogamzásgátlók használata Több szerző azt feltételezi, hogy a szteroid hormonoknak is szerepe lehet a daganat kialakulásában (Lukanova és Kaaks, 2005; Zheng és mtsai, 2007). Az androgének emelkedett szintje elősegítheti a daganat kifejlődését, ezt több tanulmány is alátámasztja (Wiegratz és mtsai, 1995; elzlsouer és mtsai, 1995; oenen és mtsai, 1996; Schildkraut és mtsai, 1996; Ilekis és mtsai, 1997; ottreau és mtsai, 200). Az emelkedett ösztrogénhatás szerepet játszhat a daganat kialakulásában (Syed és mtsai, 2001; Lindgren és mtsai, 2001; Riman és mtsai, 2002; o, 200; Folsom és mtsai, 2004), azonban vannak ennek ellentmondó irodalmi adatok is (elzlsouer és mtsai, 1995; Lukanova és mtsai, 200). A progeszteron protektív hatását több tényező is valószínűsíti. A kombinált hormonális fogamzásgátlók használata protektív hatású, valamint a terhesség is gátolja a daganat kifejlődését (Adami és mtsai, 1994; Bu és mtsai, 1997; Risch, 1998; Yu és mtsai, 2001; Schildkraut és mtsai, 2002). 25

26 A betegség kb. 10 %-ában családi halmozódás figyelhető meg. A familiáris daganatok három formája ismert (hen és mtsai, 2007; Ramus és mtsai, 2008): helyspecifikus familiáris petefészekrák (autoszomális domináns öröklődésű) familiáris emlő/petefészekrák szindróma (a 17. kromoszómán található BRA1, ritkábban a 1. kromoszómán levő BRA2 tumorszupresszor gén mutációja okozza, autoszomális domináns öröklődésű) Lynch-szindróma II (a 2. kromoszómán található MS2, illetve a. kromoszómán levő ML1 gén mutációja okozza) 2..2 Granulózasejtes petefészek daganat Az ivarléc és sztróma eredetű petefészek tumorok 80 %-át, az összes petefészek daganat 2- %-át granulózasejtes daganatok (8. ábra) alkotják (Schumer és annistra, 200). Bármely életkorban előfordulhat, leggyakrabban éves korban alakul ki (Savage és mtsai, 1998). 8. ábra Granulózasejtes petefészek daganat Kóreredete ismeretlen, nem tudnak olyan faktorokról, amelyek granulózasejtes daganat kialakulására hajlamosítanának. ormonálisan aktív tumor (hel és mtsai, 198; Pectasides és mtsai, 2008), általában ösztrogéneket termel (Kaye és Davies, 1986; Lappohn és mtsai, 1989; Rey és mtsai, 1996), 5 %-ban méhtest- és emlőrák is kialakulhat a fokozott ösztrogénhatás miatt (Bennington és mtsai, 1968; Evans és mtsai, 1980). Az esetek 2- %-ára nem ösztrogén, hanem androgén 26

27 hormonok termelése jellemző (Lappohn és mtsai, 1989). Ez defeminizációval, virilizációval jár (hirzutizmus, a beszédhang elmélyülése, nőies zsírpárnák eltűnése, kopaszodás). Az esetek egy részében a granulózasejtes daganatok inhibint termelnek, amely tumormarkerként alkalmazható (Petraglia és mtsai, 1998; Robertson és mtsai, 1999). 2.4 Méhnyakrák Az európai nők körében a méhnyakrák (9. ábra) ma is a második leggyakoribb ráktípus. Magyarországon évente új esetet diagnosztizálnak és évente kb. 500 nő halálát okozza ez a betegség. A betegség leggyakrabban 5-65 éves nőkben alakul ki, de a betegek 10 %-a 65 év feletti, és egyre gyakrabban figyelhető meg 5 éves kor előtt is. 9. ábra Méhnyakrák A méhnyakrák kialakulásában a humán papillomavírus (PV) egyes típusainak szerepe bizonyított. A több mint 100 különböző típusú PV közül 15 magas kockázatú rákkeltő (onkogén). A PV-16, 18, 1, és 45 típusok valamelyike a tumorszövetek 90 %- ában kimutatható (Mitchell és mtsai, 1986; Mitchell és mtsai, 1997). A hengerhám-laphám átmenetnél (transformációs zóna = squamo-columnáris junctio), illetve szexuális együttlét során fellépő hámsérüléseken (mikroabráziókon) keresztül a vírus bejut a bazálsejtekbe. A gazdasejtekbe jutott vírus saját szaporodása érdekében integrálódik a sejt genomjába. Az integrálódott vírus DNS korai génszakaszainak (early=e) átíródása a vírus replikációs képességének elvesztésével és a gazdasejt carcinogenesisével jár együtt. Az E6-E7 onkogének által kódolt onkoproteinek a sejt tumorszuppresszor (p5, prb) rendszerének felfüggesztését eredményezik, így a sejt az apoptozis helyett a korlátlan osztódás útjára lép. 27

28 A PV fertőzés nem minden esetben vezet méhnyakrák kialakulásához. A fertőzés az esetek 80 %-ában átmeneti jellegű, mert az immunrendszer a fertőzött sejteket eliminálja. 20 %-ban azonban a fertőzés tartóssá válik, így a jó osztódó képességgel rendelkező bazálsejtekből daganat fejlődik ki. A normál epitheliumból a daganat kialakulását megelőző (praecancerosus) állapot hónapok, az invazív daganat évek-évtizedek alatt fejlődik ki. Ugyanakkor nem minden onkogén PV fertőzés állandósul, ami arra utal, hogy esetenként más tényezők is hozzájárulhatnak a rákkeltő PV törzsekkel történt fertőzés talaján kialakuló méhnyakrák kifejlődéséhez. Ezek közé tartozik (Schneider és mtsai, 1987, Lindström és mtsai, 2000; Salazar és mtsai, 2001; Mori és Sagae, 2001; Lee és mtsai, 200; Lindström és mtsai, 2008): dohányzás fogamzásgátló tabletták hosszú távú alkalmazása szülések magasabb száma korán elkezdett szexuális élet gyakori partnerváltás immunológiai tényezők hormonális státusz a beteg kórelőzményében szereplő más, nemi úton terjedő betegségek Jelenleg nem tisztázott, hogy a rákos elváltozások kialakulásához az egyes kofaktorok pontosan milyen mértékben járulnak hozzá, és milyen kölcsönhatással vannak az onkogén PV fertőzésre. Néhány tanulmány arra utal, hogy a módosult ösztrogén metabolizmus és a legtöbb ösztrogén érzékeny sejt a méhnyakrák kockázati tényezője lehet. Az ösztradiol fokozott átalakulása 16α metabolitokká az ösztrogén érzékeny sejtekben a PV-függő daganat jelzője lehet (Auborn és mtsai, 1991; Sepkovic és mtsai, 1995). Terhesség alatt, amikor emelkedett az ösztrogének szintje, nő a papillomavírussal fertőzött terület (Schneider és mtsai, 1987). Mai ismeretek szerint örökletes tényezők nem játszanak szerepet a betegség kialakulásában. 28

29 2.5 Endometriózis Az endometriózis (10. ábra) a reproduktív kor betegsége, 95 %-ban a termékeny életszakaszban fordul elő, meddő nőkben gyakoribb. Menopauzában ritka, a posztmenopauzális endometriózis általában exogén ösztrogénkezeléssel van összefüggésben. 10. ábra Endometriózis Az endometriózis betegségben a méh nyálkahártyájához (endometrium) hasonló szövet található a szervezet más területein, a méh üregén kívül. Az endometriózisos csomók leggyakoribb elhelyezkedése a hasüreg, de ritkán előfordulhat bármely szervben: húgyhólyagban, köldökben, belekben, tüdőben, izületekben. Az endometriózisos csomók a méh nyálkahártyájához hasonlóan reagálnak az ösztrogén és progeszteron hormonokra a menstruációs ciklus során. Minden hónapban hasonlóan felépülnek, és menstruációs vérzés formájában leválnak. Szemben a méh nyálkahártyájával, a méh üregén kívül elhelyezkedő endometriózis szövet számára nincs lehetőség a testüregből való kijutásra. Ennek eredménye belső hasüregi vérzés, a szövettörmelék szétesése majd kijutása a csomóból, a csomót övező területen következményes gyulladással és összenövésekkel. Az endometriózis oka ismeretlen. Számos elméletet dolgoztak ki, de ezek közül egyik sem ad magyarázatot valamennyi esetre (Matsuura és mtsai, 1994; Giudice, 2004; Zheng és mtsai, 2005). Legelfogadottabb, a "retrográd menstruáció" elmélete, amely szerint a menstruáció során a menstruációs szövettörmelék a petevezetőkön keresztül a hasüregbe jut vissza, ott megtapad a hashártyán, és növekedésnek indul. Valószínűleg az immunrendszer elváltozása 29

30 teremti meg a feltételeket, hogy a szövettörmelék a hashártyán megtapadjon, és növekedésnek induljon, amely folyamatot különböző citokinek és növekedési faktorok segítik elő. Másik elmélet szerint az endometriális szövet a méhüregből a nyirok- és vérkeringés útján terjedhet szét a test különböző részeire. A genetikai elmélet szerint bizonyos családok génállományában endometriózisra hajlamosító területek fordulnak elő. Újabb elmélet szerint a nők embrionális korából származó szövet maradványok alakulhatnak át a felnőtt korban később endometriózissá. A sebészi transzplantáció lehetőségét olyan esetekben vetették fel, ahol endometriózist találtak hasi műtéti hegekben. A betegség kezelésénél műtéti és gyógyszeres kezelés egyaránt szóba jöhet. Gyógyszerek alkalmazása esetén, az endometriózissal kapcsolatos tünetek kezelésében nagy szerep jut a petefészek működését (ösztrogén termelést) gátló különböző szereknek. Legelterjedtebb a gonadotropin releasing hormon (GnR) agonisták alkalmazása, ugyanis bizonyított tény, hogy ösztrogénszegény környezetben az endometriózis visszafejlődik, és a tünetek javulnak (ughes és mtsai, 199; Lessey, 2000). 0

31 élkitűzések lyan komplex endokrin hátterű, nőket érintő megbetegedéseknél (csontritkulás, mióma, méhnyálkahártyarák, petefészek daganatok, méhnyakrák, endometriózis) vizsgáltuk a vizeletszteroid-profilokat, amelyek viszonylagos gyakoriságuk miatt napjainkban is nagy jelentőséggel bírnak. Ezen betegségek patofiziológiája nem teljesen felderített, és kapcsolatba hozható a szteroid metabolizmus módosulásával, melyet illetően ellentmondásosak az irodalmi adatok. élunk volt ezen nőgyógyászati megbetegedések klinikumának jobb megismerése, hormonális hátterével kapcsolatos ismeretek bővítése. Vizsgálni kívántuk, létezik-e ezekre a kórképekre specifikusan jellemző vizeletszteroid-profil, illetve a detektált változások értelmezhetők-e a diagnosztika, valamint a terápia szintjén. Vizsgálni kívántuk az androgének és a kortikoszteroidok érintettségét a posztmenopauzában kialakuló csontritkulásban. Premenopauzában kialakult miómás nők vizeletszteroid-profiljait elemeztük méheltávolító műtét előtt és után. élunk volt a szteroid metabolizmus változásainak megismerése a kezelés előtti és utáni időszakban. Vizsgálni kívántuk a posztmenopauzában kialakuló méhnyálkahártyaráknál az androgének valamint a túlsúly, mint kockázati tényező érintettségét. élunk volt az androgén és progeszteron metabolitok szintjének vizsgálata, ill. egyedi vizeletszteroid-profil felállítása a posztmenopauzában kialakuló hám eredetű petefészek daganatnál. Premenopauzában lévő granulózasejtes petefészek daganatos nők szteroid-profiljait elemeztük. Vizsgálni kívántuk az androgének feltételezett szerepét ezen betegségben. élunk volt a posztmenopauzában kialakuló méhnyakráknál vizsgálni az androgének szerepét. Fiatal, endometriózisos nők vizeletszteroid-profiljait elemeztük GnR analóg kezelés közben. Vizsgálni kívántuk a kezelés hatására kialakuló szteroid metabolizmus változásait. 1

32 Anyagok és módszerek 1. Beteganyag Munkánk során 24 órán át gyűjtött vizelet-mintákkal dolgoztunk. A betegcsoportokat a Pécsi Tudományegyetem Általános rvostudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika betegei közül választottuk ki, szigorú kritériumoknak megfelelően, a klinika orvosainak segítségével. A kutatást a PTE E Regionális Kutatás Etikai Bizottság 2785 és 2998 számú határozataiban engedélyezte. A tanulmányban azon személyek vehettek részt, akik hozzájárultak a kutatásban való részvételhez, nem szenvedtek egyéb súlyos egészségkárosító ill. endokrin betegségekben, a vizeletgyűjtés megkezdése előtt nem részesültek szteroid metabolizmust befolyásoló, valamint daganatellenes gyógyszeres kezelésben és a mintagyűjtést pontosan végezték. Ezen kritériumok miatt a csoportonként minimálisan 10 (granulózasejtes petefészek daganat esetén 2) értékelhető beteg vizsgálatba történő bevonása hosszú időt vett igénybe. Tekintettel a szteroid metabolizmus életkori sajátosságaira, az egyes csoportokat úgy alakítottuk, hogy a korösszetételük homogén legyen. Kontroll csoportként a legtöbb esetben a Pécsi Tudományegyetem Általános rvostudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika illetve a Bioanalitikai Intézet azonos nemű és hasonló korosztályú egészséges dolgozóinak közreműködését kértük. A vizsgált betegségeket, a beteg és kontroll személyek számát és kor szerinti megoszlását a. táblázatban foglaltam össze. Kiegészítő adatként a szérum-hormonok közül a progeszteron (P), dehidroepiandroszteron-szulfát (DEAS), ösztradiol (E 2 ), tesztoszteron (T), follikulus stimuláló hormon (FS) és a luteinizáló hormon (L) szintjei is meghatározásra kerültek. (Ez alól kivételt képez a csontrikulás vizsgálata). A szérum minták vételezése ugyanazon a napon (reggel 7 és 8 óra között) történt, mint a vizelet minták gyűjtése. A mintákat a feldolgozásig fagyasztva (-20 ) tároltuk. A szérum-hormonok mennyiségi meghatározása elektrokemilumineszcens immunoesszé technikával történt a Pécsi Tudományegyetem Általános rvostudományi Kar Laboratóriumi Medicina Intézetben. 2

33 . táblázat A vizsgált betegségek, a beteg és kontroll személyek száma (n) és kor szerinti megoszlása Betegségek Betegek Kontrollok Tartomány értékek; Tartomány értékek; n átlag életkor (év) n átlag életkor (év) sontritkulás posztmenopauzás nők ; 5, ; 56,6 Mióma premenopauzás nők ; 49, ; 4,4 Méhnyálkahártyarák posztmenopauzás nők ; 67, ; 58,7 ám eredetű petefészek daganat posztmenopauzás nők ; 60, ; 58,7 Granulózasejtes petefészek daganat premenopauzás nők ; ; 4,4 Méhnyakrák posztmenopauzás nők ; 59, ; 58,7 Endometriózis fiatal nők ; 28, ; sontritkulásos betegek lyan csontritkulásos betegeket választottunk ki, akiknél a posztmenopauzában alakult ki a betegség. Az utolsó, petefészekhormonok által kiváltott havivérzés a menopauza, amelyet egy éven belül nem követ másik. A menopauza előtti életszakaszt premenopauzának, az utána következőt posztmenopauzának nevezzük. Az utolsó havivérzés körüli, 2-2 éves időszakot pedig perimenopauzának hívjuk. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1.2 Méhtest daganatos betegek Miómás betegek lyan, műtét előtt álló betegek kerültek kiválasztásra, akiknél a premenopauzában alakult ki a mióma. A kiválasztott személyektől a vizelet és a szérum minták vételezése műtét előtt és a műtét utáni hatodik héten történt. A kontroll személyek premenopauzában lévő, egészséges egyetemi dolgozók voltak.

34 1.2.2 Méhnyálkahártyarákos betegek lyan, kezelés előtt álló betegeket választottunk ki, akiknél a posztmenopauzában fejlődött ki a méhnyálkahártyarák. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1. Petefészek daganatos betegek 1..1 ám eredetű petefészek daganatos betegek lyan, kezelés előtt álló petefészek daganatos betegek kerültek kiválasztásra, akiknél a posztmenopauzában alakult ki a betegség. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak Granulózasejtes petefészek daganatos betegek A granulózasejtes petefészek daganat ritka előfordulása miatt csak két premenopauzában lévő beteget választottunk ki. A kontroll személyek premenopauzában lévő nők voltak. 1.4 Méhnyakrákos betegek lyan, kezelés előtt álló beteg személyek kerültek kiválasztásra, akiknél a posztmenopauzában fejlődött ki a méhnyakrák. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1.5 Endometriózisos betegek lyan fiatal, premenopauzában lévő endometriózisos betegeket választottunk ki, akik a két hónapos GnR analóg kezelést követően szolgáltatták a vizelet és a szérum mintákat. A kontroll személyek az egyetem fiatal dolgozói voltak. 4