Száraztészták tojástartalmának meghatározása ELISA-val

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat VARGA VIKTÓRIA EVELIN Száraztészták tojástartalmának meghatározása ELISA-val Témavezető: Eke Zsuzsanna, PhD Analitikai Kémia Tanszék Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest,

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés Irodalmi áttekintés A tojás összetétele A tojásfehérje A tojássárgája Száraztészták tojástartalmának meghatározása Koleszterintartalom meghatározása Tojásfehérjék meghatározása Keverék módszerek Az ELISA Célkitűzés Kísérleti rész Anyagok és eszközök ELISA kit További felhasznált eszközök Minták A tészták készítése Mintaelőkészítés A teszt menete Az eredmények kiértékelése Saját eredmények Saját készítésű tészták Bolti tészták Különböző tojásokkal késztett tészták Problémák magas tojástartalmú száraztészták esetén...26 Köszönetnyilvánítás...30 Irodalomjegyzék

3 1. Bevezetés A száraztészták a Magyar Élelmiszerkönyv (MÉK) szabályai szerint Triticum aestivum (közönséges búza) vagy Triticum durum (durum búza) őrleményből, tojásból vagy a nélkül, víz és esetleg egyéb élvezeti- vagy tápértékjavító adalékanyagok hozzáadásával készülhetnek [1]. A tojás felhasználásával készült tészták minősége, fizikai és élvezeti tulajdonságaik legfőképpen tojástartalmuktól függ, továbbá a tojás számos, az emberi szervezet számára fontos ásványi anyagot is tartalmaz. A vásárlók számára ezért nagyon fontos, hogy tudják, tényleg olyan minőségű száraztészta készítményt vásárolnak, mint amilyennek az a csomagoláson fel van tüntetve. Minőségellenőrzési szempontból tehát mindezek miatt fontos, hogy a megfelelő analitikai módszerekkel pontosan meg tudjuk határozni e termékek tojástartalmát. A tojás felhasználásával készült tésztáknak a Magyar Élelmiszerkönyv [1] előírása szerint legalább annyi darab tojást egy darab tojás ebben az esetben 45 g héj nélküli tojást jelent - kell tartalmazniuk száraztészta kg-onként, ahány tojásosnak a tészta a csomagoláson fel van tüntetve. Ennek az ellenőrzésére megfelelően pontos analitikai módszer kidolgozása még manapság is kihívást jelent

4 2. Irodalmi áttekintés 2.1 A tojás összetétele A tojás, a C-vitamin kivételével, tartalmaz minden az emberi szervezet számára szükséges tápanyagot. Alapvetően három részből áll: tojáshéj (~10%), tojásfehérje (~60%) és tojássárgája (~30%) [2]. A tojás alkotórészeinek összetétele kis mértékben változhat a tojás méretével. Nagyobb mértékű eltérések figyelhetők meg egyes komponensek esetén a különböző tyúkok tojásai között illetve még inkább különböző fajtájú tyúkok tojásainak összehasonlításakor [3] A tojásfehérje A tojásfehérje nagyrészt vizet, ezen kívül főleg fehérjéket valamint kis mennyiségben ásványi anyagokat és szénhidrátokat tartalmaz. A fehérje frakció főbb alkotóelemei a következőek: ovalbumin, conalbumin vagy ovotranszferrin, ovomucoid, lizozim, ovomucin, avidin, ovoglobulinok, ovoinhibitor és flavoproteinek [3]. Néhány fehérje antibakteriális hatású, aminek a tojások költési ideje alatti mikrobiális invázió elleni védekezésben van fontos szerepe. Ezek a mechanizmusok az emberi fogyasztásra szánt tojásoknál is ugyanilyen hatásosan működnek. A tojásfehérje egyáltalán nem tartalmaz zsírokat. A tojásfehérje vitamin tartalma könnyen módosítható a szárnyas étrend vitamintartalmának módosításával. Az ásványi anyag tartalma szintén módosítható. Az fehérjék aminosav összetétele is módosítható a szárnyasok étrendjének módosításával [2] A tojássárgája A tojássárgája mindössze 48% vizet tartalmaz. A többi része két harmad részt zsírokat, egy harmad részt fehérjéket, valamint kis mennyiségben ásványi anyagokat és szénhidrátokat tartalmaz. A tojássárgája lipoproteinek keveréke, kivétel a foszvitin, ami egy foszfoprotein és nincs lipid része [2]. A tojássárgájában a fehérjetartalom körülbelül 16%, a lipid tartalom 32%-35%-ig változik a tyúk fajtájától függően. A lipid frakció körülbelül 66%-a trigliceridekből, 28%-a foszfolipidből, 5% koleszterinből és további kis mennyiségű egyéb lipidekből áll [4]. A zsírsavösszetétel változtatható, ha az állat - 4 -

5 étrendjét különböző összetételű zsírokkal egészítjük ki [5,6,7]. A tojásban a koleszterin csak a tojássárgájában van jelen. A koncentrációja szárnyasonként különbözik. A tojás méretével a koleszterin tartalma is magasabb. A tojássárgájának a vitamin és ásványi anyag összetétele is megváltoztatható az étrend módosításával [2]. 2.2 Száraztészták tojástartalmának meghatározása A száraztészták tojástartalmának meghatározását számos különböző módszerrel végezték már. Ezek között leggyakoribbak, amelyek tészta egyes komponenseinek, különböző elválasztástechnikai módszerekkel történő meghatározásán alapulnak. Előfordult már erre a célra teljesen új módszer ismertetése is, mint például a Fourier transzformációs közeli infravörös (FT-NIR) spektroszkópia [8]. Magyarországon a MSZ 20500/4-87 szabvány [9] száraztészták tojástartalmának meghatározására alkalmazható analitikai módszereket ismertet: egy gyors, nyers zsírtartalom alapú meghatározást, valamint a döntő, koleszterin tartalom meghatározásán alapuló mérési módszert Koleszterintartalom meghatározása A száraztészták tojástartalmának meghatározására leginkább a koleszterintartalom mérésén alapuló módszereket alkalmaznak [10-13]. A száraztészták koleszterin tartalmának meghatározása többféle módszerrel történt már. Az legelőször alkalmazott módszerek egyike a Liebermann-Burchard-féle színreakció volt [9]. Azóta koleszterintartalom mérés végezték már folyadékkromatográfiával [20,21], spektrofotometriásan [22], de a gázkromatográfiával történő mérés a leginkább alkalmazott módszer erre a célra [10-13]. Számos alkalommal bizonyították már, hogy a tojás koleszterin tatalma széles tartományon belül változik. Ezt befolyásolja a baromfival etetett táp összetétele, a tyúk fajtája, tartásának módja [23,24]. A tyúk kora szintén befolyásolja a tojás koleszterin tartalmát. Ez a hatás annak tudható, hogy a tojássárgája a baromfi korának előrehaladtával egyre nagyobb lesz. A tojás koleszterin koncentrációját főként a táplálék módosításával lehet változtatni [2]. A tojás koleszterintartalma akár a mg/100 g héj nélküli tojás tartományon belül is változhat [19]. A koleszterintartalom mérése alapján történő tojástartalom meghatározás tehát önmagában nem megbízható

6 2.2.2 Tojásfehérjék meghatározása A tojás alkotóelemei közül, a koleszterinen kívül egyes tojásfehérjék mennyiségi meghatározását is ismertették már különböző élelmiszerekből (sajtok, borok, snack-ek, mirelit készételek) [14-18]. A tojás számos allergén fehérje fő forrása. Ezeknek a fehérjéknek a különféle élelmiszerekből történő kimutatása ezért is nagyon fontos. Mérésükre, az élelmiszerek tojástartalmának meghatározására való estleges alkalmazhatóságán túl, ezért is irányul külön figyelem. Az allergén tojásfehérjék élelmiszerekből történő kimutatása végezhető elektroforézissel [25], tömegspektrometiával [26], folyadékkromatográfiával [14] és immunoesszékel [16,17]. Ezek közül az ELISA különös figyelmet érdemel, egyszerű kivitelezhetősége, magas érzékenysége és specifikussága miatt. Létezik csak kvalitatív és kvantitatív formája is. Az ovalbumin csak a tojásban előforduló és ott a legnagyobb mennyiségben jelen lévő fehérje. Z. H. Reed és munkatársai [27] indirekt ELISA-val határozták meg az ovalbumin mennyiségét rákfalatkákban, egérben termeltetett ovalbuminra specifikus monoklonális antitestek felhasználásával. Y. Watanabe és munkatársai [28] szintén ovalbumin mennyiségi meghatározását végezték el különféle élelmiszer mintákból ovalbuminra specifikus antitesteket alkalmazó szendvics ELISA-val. A lizozim egy másik, a tojásban megtalálható szintén allergén fehérje. Gram pozitív baktériumok sejtfalára gyakorolt lítikus hatása miatt az élelmiszeriparban gyakran tartósítószerként alkalmazzák. Számos, akár tojás felhasználása nélkül készült élelmiszerben, mint például sajtokban és borokban is megtalálhatjuk a gyártás során alkalmazott tartósítási folyamatok maradványaként. A gyártási folyamat végeztével viszont jelenlétük általában, főként allergénhatásuk miatt, az előírások szerint már nem kívánatos ezekben a termékekben [6]. Az első kísérletek melyek a lizozim detektálására és mennyiségi meghatározására irányultak, főként a lizozim lítikus aktivitásának mérésén alapuló mikrobiológiai módszerek voltak másrészről mérését végezték már SDS-gélelektroforézissel [16] vagy éppen MALDI-TOF-MS-sel is [26]. Mindezen módszerek kivitelezése viszont bonyolult, ráadásul túlzottan anyag- és időigényesek, tehát nem megfelelőek rutin analízis céljából. Lizozim kvalitatív és kvantitatív meghatározása komplex élelmiszermátrixokból, ugyanakkor elvégezhető folyadékkromatográfiával vagy ELISA-val is [14,16,17]

7 2.2.3 Keverék módszerek A közelmúltban történt olyan összetett kísérlet, amelyben párhuzamosan több tojás alkotórész (lizozim tartalom, koleszterin tartalom, teljes zsírtartalom és zsírsavösszetétel) mérését végezték el száraztésztából és ezeknek a mérési eredményeknek a felhasználásával számolták ki a száraztészták tojástartalmát [19]. 2.3 Az ELISA Az ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) széles körben alkalmazott technika a különböző humán allergének élelmiszerekből történő kimutatására és mennyiségének meghatározására. Ennek oka a módszer egyszerűsége, specifikussága és érzékenysége. Könnyen standardizálható és automatizálható, ami nagy mennyiségű minta vizsgálatát teszi lehetővé. Számos élelmiszerallergén kvalitatív és kvantitatív meghatározására alkalmas, kereskedelmi ELISA készlet létezik már. Egyes ELISA-k bizonyos fehérje csoportokat detektálnak, míg mások akár lehetnek csak egyetlen fehérjére specifikusak [29, 30]. Az ELISA egy immunanalitikai módszer, mely során enzimreakció segítségével történik a mintában jelen lévő antigén vagy antitest detektálása. Az ELISA technikának számos változata létezik. Az élelmiszer vizsgálatok esetén a két leggyakrabban alkalmazott típusú ELISA, az indirekt- és a szendvics ELISA. Az ELISA végrehajtása legtöbbször 16x8 darab azonos térfogatú cellát tartalmazó műanyag tálcán, úgynevezett microtiter plateken történik. Léteznek olyan kiszerelésű kitek is, melyek a cellákat és a cellatartót külön tartalmazzák. A cellák szükség esetén törhetők a minta darabszámának megfelelően és a cellatartóba illeszthetők (1. ábra)

8 1. ábra: 16x8 darab helyet tartalmazó cellatartó tálca. A képen 17 db kivehető cella látható benne. A szendvics ELISA során (2. ábra) az antigénre, vagyis a mintában lévő meghatározandó anyagra specifikus antitestek minden egyes lyukban, ugyanannyi mennyiségben a szilárd fázis felszínéhez vannak rögzítve. A minta hozzáadásakor a benne lévő, kimutatni kívánt antigének specifikusan kötődnek az antitestekhez. Ezután rendszerint mosási lépésekkel eltávolítjuk a minta egyéb nem kötődött felesleges komponenseit. Majd egy második, enzimkapcsolt antitest hozzáadása következik, amely az antigén egy másik epitópjához (antigén molekula antitestkötő helye) kötődik specifikusan. Így az antigénünk szendvicsszerűen a két antitest közé lesz zárva. Majd végül a második antitesthez kapcsolt enzim kromogén szubsztrátjának a hozzáadása következik, melynek enzimatikus átalakítását színváltozás kíséri. A végén a reakciót gyenge savval leállítjuk, majd fotometriás mérés következik. Minél több antigént tartalmazott a mintánk a kapott szín annál erősebb, tehát a mért jel arányos lesz a mért anyag mintabeli koncentrációjával. A kvantifikálás a target molekula ismert koncentrációjú oldatának hígítási sorából mért abszorbancia után készült standard görbe alapján történik

9 ábra: A szendvics ELISA sémája. 1. Antitestek a felszínhez immobilizálva. 2. A mintában lévő antigének specifikusan kötődnek az antitestekhez. 3. Az antigén másik epitópjára specifikus enzimkonjugált antitest kötődése. 4. Kromogén szubsztrát hozzáadása és színreakció Az indirekt ELISA kissé eltérő (3. ábra). A mikrotiter plate-en lévő lyukak felszínére antigének vannak kikötve. A mintában jelen lévő, kimutatni kívánt antitestek ezekre az antigénekre specifikusak és az inkubáció során ennek megfelelően kötődni fognak hozzájuk. Ezután, a kötődött antitestre specifikus, úgynevezett másodlagos antitest hozzáadása következik. A másodlagos antitest egy enzim konjugátum. Végső lépésként itt is az enzim szubsztrátjának hozzáadása történik, amit színváltozás kísér, majd az enzimreakció leállítása következik. A kialakult szín itt a mintában jelenlévő antitest mennyiségével egyenesen arányos. Olyan változata is lehet, amikor az antigént akarjuk kimutatni, ez ugyanezen az elven történik, csak ekkor először a mintában jelenlévő antigéneket mi rögzítjük a szilárd fázis felszínéhez ábra: Az indirekt ELISA sémája. 1. Antigének a felszínhez immobilizálva. 2. A mintában lévő antitestek specifikusan kötődnek az antigénekhez. 3. Az elsődleges antitestre specifikus, úgynevezett másodlagos, enzimkonjugált antitest kötődése. 4. Kromogén szubsztrát hozzáadása és színreakció - 9 -

10 A fehérjék komplex élelmiszermátrixokból ELISA-val történő meghatározásakor kapott értékek nagymértékben torzíthatak. Ennek többféle oka is lehet. Előfordulhat fals negatív eredmény az élelmiszer mátrixból történő nem megfelelő extrakció esetén. Az ELISA csak intakt fehérjék kimutatására alkalmas, ezért ha egy fehérje, akár csak limitált mértékben is, de hidrolizálva van, előfordulhat, hogy megszűnik vele szemben az ELISA immunreaktivitása. A meghatározandó fehérjék illetve annak, az ELISA szempontjából fontos epitópjai kémiailag módosulhatnak egyes élelmiszereknél az élelmiszer feldolgozási folyamatok során, ami szintén a teszt immunreaktivitásának csökkenéséhez vezethet [29]. Előfordulhat, hogy a kimutatni kívánt fehérje interakcióba lép az élelmiszermátrix egyéb komponenseivel. Ez immunogenitásának csökkenését okozhatja, ezért nem kerül detektálásra. Az élelmiszermátrix egyéb komponensei keresztreakcióba is léphetnek a kimutatni kívánt fehérjékre specifikus antitestekkel, ami fals pozitív eredményt okoz. A száraztészta egy viszonylag egyszerű élelmiszermátrix (lásd 1. fejezet). A mátrixkomponensek esetleges keresztreakcióinak és a kimutatni kívánt fehérjékkel való interakcióknak a valószínűsége ezért jelentősen kisebb

11 3. Célkitűzés Magyarországon, megfelelően pontos analitikai módszer a száraztészták tojástartalmának meghatározására a mai napig kihívást jelent. Egyértelmű azonban, hogy bármely a célnak megfelelő analitikai módszer alapja valamely tojásra jellemző összetevő mérése kell, hogy legyen. Az élelmiszerek tojásfehérje tartalmának meghatározására gyakran ELISA alkalmaznak. Ez a módszer egyszerű, érzékeny és nagyon specifikus. Könnyen standardizálható és automatizálható, ami nagy mennyiségű minta vizsgálatát teszi lehetővé. Ezért célkitűzésem az volt, hogy egy, a tojásfehérjék különböző élelmiszerekből történő megahatározására való standardizált ELISA kit használatával kiderítsem, hogy a több tojásfehérjére specifikus ELISA alkalmas lehet e száraztészták tojástartalmának meghatározására

12 4. Kísérleti rész 4.1 Anyagok és eszközök ELISA kit A méréseket a Ridascreen FAST Ei/Egg protein (R-Biopharm, Németország) ELISA kittel végeztem. Ez különböző élelmiszerekből (tészták, salátaöntetek, borok, kenyér, fagylalt) történő tojástartalom kvantitatív meghatározására szolgáló szendvics ELISA. A tojástartalom meghatározás a 2.3-es fejezet szendvics ELISA-ra vonatkozó részben leírt elv alapján történik. A microtiter plate-eken lévő lyukak felszínére ovomucoid, ovalbumin ovotranszferrin és lizozim specifikus antitestek vannak rögzítve. Ezen fehérjék mennyiségének mérésével határozzuk meg a tojástartalmat. A teszt végén a szubsztrát/kromogén oldat hozzáadásakor az enzim konjugátum a kromogént kék színű termékké alakítja át, majd a stop raegens hozzáadása kékről sárgára történő színváltozást okoz. A mérés fotometriásan történik, 450 nm-en. Az abszorbancia a minták tojásfehérje tartalmával arányos. Egy Ridascreen FAST Ei/Egg protein ELISA kit a következő reagenseket tartalmazza: 48 darab tojásfehérje specifikus antitesttel borított cella, cellatartó tálcával (6 darab 8asával kiszerelt törhető cellák) 5 db standard oldat: 0 mg/kg (zero standard), 0,5 mg/kg, 1,5 mg/kg, 4,5 mg/kg és 13,5 mg/kg tojást tartalmazó mintának megfelelő egész tojáspor vizes oldatai. Peroxidáz konjugált antitest (20xos koncentrátum, desztillált vízzel hígítjuk) Szubsztrát/kromogén oldat Extrakciós puffer (10xes koncentrátum, desztillált vízzel hígítjuk) Mosó puffer (10xes koncentrátum, desztillált vízzel hígítjuk) Stop reagens További felhasznált eszközök További felhasznált eszközök: Daráló: Grindomix GM200, gyártó: Retsch. ELISA reader: Microplate Reader Model Σ960, gyártó: Metertech, értékelő szoftver: Ridasoft Win

13 4.1.3 Minták Az egyes kísérleteknél különböző gyártóktól származó, különböző tojástartalmú és alakú száraztészták (3. táblázat), valamint saját kezűleg elkészített száraztészta minták (4. táblázat) mérését végeztem. Ezeket az egyes kísérleteknek megfelelően többféle liszt (1. táblázat) és kétféle tojás (2. táblázat) kombinált felhasználásával készítettem el. 1. táblázat: kísérletek során felhasznált lisztek Liszt jelölése Név Gyártó/Forgalmazó Lejárati dátum BL Nagyi titka Búzafinomliszt Pannonmill Malomipari Zrt BL2 SBudget Búzafinomliszt Sikér Zrt. Bicskei malom DL Organic Biodurumliszt Biorganic Kft TKL Natur Pur Bio Teljes kiőrlésű búzaliszt SPAR Magyarország kereskedelmi Kft táblázat: a kísérletek során felhasznált tojások Tojás jelölése Tojás neve Forgalmazó Lejárati idő T1 Tesco Value tojás (10 db-os) Tesco Zrt T2 Friss tojás (6db-os) Biotojás Kft táblázat: gyárilag előállított száraztészta minták Minta neve Feltüntetett tojástartalom Tészta formája Gyártó Lejárati dátum S0sz 0 szarvacska Soós Kft S4e 4 eperlevél Soós Kft S8b 8 boglyas cérna Soós Kft S8fm 8 fektetett metélt Soós Kft S8fc 8 fektetett cérna Soós Kft S8c 8 csiga Soós Kft E10cs 10 cérna Elyon Kft

14 4. táblázat: a kísérletek során felhasznált saját kezűleg elkészített száraztészta minták: Felhasznált Minta Pontos tojástartalom Felhasznált Készítés tojás jelölése (db) liszt jelölése időpontja jelölése A1 0,988 BL T A2 1,965 BL T A3 3,530 BL T A4 3,938 BL T A5 5,157 BL T A6/1 6,040 BL T A6/2 5,857 BL T A6/3 6,030 BL T A7 6,937 BL T A8 7,613 BL T A9 9,161 BL T A10 8,557 BL T B2 1,994 BL T B6/1 5,662 BL T B6/2 5,573 BL T B6/3 5,602 BL T B9 8,470 BL T C3 3,103 BL2 T C5 5,152 BL2 T C8 7,266 BL2 T D3 2,932 DL T D5 5,027 DL T D8 7,180 DL T E3 3,047 TKL T E5 5,097 TKL T E8 7,950 TKL T A tészták készítése A száraztésztákat úgy készítettem, hogy a tojásokat feltörtem egy külön tálba, majd alaposan felvertem. Ebből a homogenizált tojáskeverékből mértem be az egyes, különböző tojásos tésztáknak megfelelő mennyiségeket egy másik tálba. Majd hozzáadtam az előre bemért megfelelő mennyiségű lisztet. Ezután összegyúrtam a lisztet és a tojást, annyi desztillált víz adagolása közben, amennyi szükséges volt a megfelelő állag eléréséhez. Egy kis lisztet a bemért mennyiségből meghagytam a tészta nyújtásához. Ezt követően kinyújtottam a tésztákat, majd szobahőmérsékleten hagytam

15 teljesen kiszáradni. Miután teljesen kiszárítottam a tésztákat, egyenként lemértem a pontos tömegüket. A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből minden esetben visszaszámoltam az 1 kg-ra vonatkoztatott tojástartalmat. A tojástartalmat minden esetben darabszámban adtam meg, ahol az egy darab tojás 45g héj nélküli tojást jelent. 4.2 Mintaelőkészítés Használat előtt a 10szeres koncentrátum formában kapott extrakciós puffert először 37 o C-os vízfürdőbe helyeztem pár percre, hogy az esetleg jelen lévő kristályok feloldódjanak, majd jól összerázva homogenizáltam. Ezután 10szeresére hígítottam desztillált vízzel

16 5. táblázat: A protokoll szerinti és a kísérletek során történt mintaelőkészítés leírása Mintaelőkészítés a A tojásfehérjék fokozott RIDASCREEN FAST Ei/Egg A kísérletek során elvégzett extrakciója céljából végzett Protein ELISA kit-hez mintaelőkészítés mintaelőkészítés az 5.5-ös mellékelt használati fejezetben leírt kísérlet során utasítás szerint 5g mintát óvatosan összetörünk, majd teljesen Kb. 5g mintát darálóban porszerűre darálunk Kb. 5g mintát darálóban porszerűre darálunk homogenizáljuk 1g-ot mintához hozzáadunk 20 ml előre felhígított extrakciós puffert és 10 percig 60C o -os vízfürdőben extraháljuk. Az extrakciós puffer hozzáadás előtt már kb. 60C o -ra legyen felmelegítve. 200 mg-ot bemérünk a mintából fiolába, hozzáadtam 20 ml előre felhígított extrakciós puffert és 10 percig 60 o C-os vízfürdőben, időközönkénti rázogatással extraháltam. Az extrakciós puffer hozzáadás előtt már kb. 60 o C-ra felmelegítettem. 100 mg-ot bemérünk a mintából fiolába, hozzáadtam 25 ml előre felhígított extrakciós puffert és 10 percig 60 o C-os vízfürdőben, időközönkénti rázogatással extraháltam. Az extrakciós puffer hozzáadás előtt már kb. 60 o C-ra felmelegítettem. Centrifugálás: 10 perc/2500g Centrifugálás: 10 perc/2400rpm Centrifugálás: 10 perc/2400rpm A mintából 100 µl-t használunk egy mérésnél lyukanként Mérőlombikban a felülúszóból pipettázott mintát még 2000szeresére hígítottam, a felhígított extrakciós pufferrel A felülúszót átpipettáztam egy üres főzőpohárba, majd a fiola alján maradt mintához ismét adtam 25 ml előre felmelegített extrakciós puffert A mintából 100 µl-t használtam egy mérésnél lyukanként 10 percig 60 o C-os vízfürdőben, időközönkénti rázogatással extraháltam Centrifugálás: 10 perc/2400rpm A felülúszót átpipettáztam az első extrakciós lépés után leszedett felülúszót tartalmazó főzőpohárba. Ezt homogenizáltam, majd mérőlombikban 400szorosára hígítottam a felhígított extrakciós pufferrel A mintából 100 µl-t használtam egy mérésnél lyukanként A mintáink előkészítésénél az ELISA kit használati utasításában leírtaktól összességében annyiban tértem el, hogy szeresére hígítottam a mintáimat

17 4.3 A teszt menete Adott kísérletben mért minták számának megfelelő számú cellát egy üres cellatartó tálcába helyeztem. Az első 5 pozícióba felvitt standard sor (lásd: 4.4 fejezet) után következő pozíciókba mintáinkból mértem be 100 µl-eket. Az asztalon tartva kézzel óvatosan megrázogattam a tálcát majd a felvitt standard oldatokat és mintákat inkubáltam 10 percig szobahőmérsékleten. Ha letelt az inkubációs idő a folyadékot egy határozott mozdulattal a kiöntöttem a csapba, majd legalább háromszor hozzácsaptam abszorbens papírhoz erőteljesen, hogy a folyadékot teljesen eltávolítsam a lyukakból. Ezután mosási lépések következtek, a felesleges minta komponensek eltávolítására. Az előzőleg 37 o C-os vízfürdőben történő melegítéssel és összerázással szintén homogenizált és 10szeresére hígított mosó pufferből 250 µl-t pipettáztam a lyukakba. Ezt egyből, az előzőhöz azonos módon határozott mozdulattal a csapba öntöttem, majd a tálcát háromszor erőteljesen abszorbens papírhoz csaptam. Ezt a mosási lépést még kétszer megismételtem. Ezután a lyukakba pipettáztam 100 µl a desztillált vízzel 11szeresére hígított enzim konjugátumot, finoman az asztalon tartva rázogattam kis ideig a tálcát, majd 10 percig ismét szobahőmérsékleten történő inkubáció következett. Inkubáció után a felesleges folyadékot leöntöttem, abszorbens papírhoz csaptam háromszor a tálcát, majd az előzőekhez hasonlóan megint három egymást követő mosási lépés következik, mindegyiknél 250 µl hígított mosó puffer hozzáadásával. Ezt azért tettem, hogy biztosan eltávolítsam az összes nem kötődött enzim konjugátumot. Ha ezzel végeztem egyből hozzáadtam a lyukakhoz 100 µl szubsztrát/kromogén oldatot, finoman kézzel kissé ráztam a tálcát, majd 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben történő inkubáció következett. Ennek a letelte után 100 µl stop reagenst adunk az összes mintánkhoz és standard-ekhez. Ekkor, a kromogén szubsztrát enzimatikus átalakítása miatt már különböző mértékben kék színű mintáim sárga színűek lettek. A színváltozás mértékét fotometriásan mértem 450 nm-en. 4.4 Az eredmények kiértékelése Az első öt pozícióba minden mérés esetén, a kitben megtalálható öt standard oldatot (0,0ppm; 0,5ppm; 1,5ppm; 4,5ppm és 14,5ppm) pipettáztam és ezekkel ugyanúgy végeztem el a tesztet, mint az összes többi mintával. Ezen standard minták mért abszorbancia értékei alapján, harmadfokú egyenes illesztésével végezte el a Ridawin szoftver a kalibrációt, és számította ki az egyes minták tojásfehérje koncentrációit. Ezek után a tésztáknál kapott koncentráció értékeket valós tojástartalmuk

18 függvényében ábrázoltam. Az ábrázolt pontokra másodfokú egyenest illesztettem, majd ezen egyenes egyenlete alapján kiszámoltam a tészták mért tojástartalmát

19 Koncentráció (ppm) 5. Saját eredmények 5.1 Saját készítésű tészták Az összes saját készítésű tészta (1. táblázat) egyszerre történő mérése után kapott abszorbancia értékekből számolt tojásfehérje koncentrációkat ábrázoltam a tojástartalom függvényében az 4. ábrán. Azt látjuk, amit várnánk is, hogy a tojásfehérje koncentráció egyenesen arányos a tészták tojástartalmával. Ez alól kivétel a 7 tojásos mintánk (A7), ahol kissé alacsonyabb értéket kaptunk a vártnál y = 1,1777x + 0,8805 R² = 0, Tojástartalom (db) 4. ábra: Az 1. táblázatban feltüntetett tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva. A pontokra illesztett egyenes egyenlete alapján a tojásfehérje koncentráció értékeket behelyettesítve, kiszámoltam a tészták tojástartalmát. Majd a kapott tojástartalom és az egyes tésztáknál a készítés után kiszámolt pontos tojástartalom alapján kiszámoltam a torzítatlanság értékeket, vagyis hogy hány százalékban egyeznek meg a kapott és a várt tojástartalmak (6. táblázat). Két, külön készített 6 tojásos száraztészta mintát is mértem, az egyik hat tojásosat pedig egyszerre háromszor (A6/1a, A6/1b, A6/1c). Egyazon 6 tojásos tészta háromszori méréseiből kapott tojásfehérje

20 koncentrációk relatív szórása (RSD%) 3,70%. Az összes 6 tojásos tészta tojásfehérje koncentráció értékeiből kapott RSD% pedig 7,40%. A várt és a kapott tojástartalmak alapján számolt torzítatlanság értékek 79,56% - 118,58% között változnak. 6. táblázat: Saját készítésű tészták mérési eredményei Készített Pontos Számolt Minta tészta Konc. Torzítatlanság tojástartalom tojástartalom jele megcélzott (ppm)** (%) (db)* (db)*** tojástartalma A1 1 0,988 1,96 0,917 92,775 A2 2 1,965 3,29 2, ,119 A3 3 3,530 5,81 4, ,575 A4 4 3,938 6,24 4, ,562 A5 5 5,157 6,81 5,035 97,631 A6 /1a 6 6,040 7,98 6,028 99,806 A6/1b 6 6,040 7,84 5,909 97,838 A6 /1c 6 6,040 7,23 5,391 89,262 A6/2 6 5,857 8,66 6, ,783 A7 7 6,937 7,38 5,519 79,556 A8 8 7,613 9,39 7,226 94,910 A9 9 9,161 12,28 9, ,659 A ,557 11,54 9, ,774 * A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció *** A 4. ábrán látható egyenes egyenletéből visszaszámolt pontos tojástartalom 5.2 Bolti tészták A 7. táblázatban szereplő, különböző gyártóktól származó bolti tészta mintákon elvégzett ELISA eredményeinek a kiértékelése után egyáltalán nem a vártnak megfelelő eredményeket kapunk. Szintén ábrázoltam az egyes tészták Ridawin szoftver által kiszámolt koncentráció értékeit a csomagoláson feltüntetett tojástartalmuk függvényében (5. ábra). Ezeknek a tésztáknak az esetében azonban nincs lineáris összefüggés a

21 Koncentráció (ppm) tojásfehérje koncentráció és a feltüntetett tojástartalom között, nem illeszthető egyenes az ábrázolt pontokra. A 8 tojásos tésztákból három különböző fajta tésztát is mértem, valamint ezek közül a 8 tojásos boglyas tésztából három ismételt mérést végeztem el (S8b/1, S8b/2, S8b/3). A 8 tojásos boglyas tészta ismételt méréseiből kapott tojásfehérje koncentráció RSD%-a 1,09%. Az összes 8 tojásos tészta tojásfehérje koncentráció eredményeiből számolt RSD%, ami tartalmazza a nyolc tojásos tészták közül kiugróan alacsony értékű fektetett metéltet is, pedig 10,73% Tojástartalom (db) 5. ábra: Az 1. táblázatban feltüntetett bolti tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva

22 7. táblázat: Bolti tészták mérési eredményei Minta neve Tojástartalom (db)** Abszorbancia Konc (ppm)*** DL 0 0,042 nem értelmezhető BL 0 0,039 nem értelmezhető S4e 4 1,164 4,76 S8b/1 8 1,505 6,49 S8b/2 8 1,502 6,47 S8b/3 8 1,481 6,36 S8fc 8 1,538 6,67 S8fm 8 1,222 5,03 E10c 10 1,237 5,11 ** A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. *** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció Csak a saját készítésű tészták esetén kaptam értékelhető, a várthoz közeli eredményeket. A bolti tésztáknál a tojásfehérje koncentráció értékek összefüggéstelen módon változnak a tojástartalommal. Ez több ok miatt is lehet. A gyárilag előállított tésztáknak különböző a lejárati dátumuk. Nagy valószínűséggel előfordulhatott, hogy a különböző tészták gyártásánál az alapanyagokat tekintve történtek olyan változtatások illetve akár adalék anyagok hozzáadása, amelyek befolyásolhatták a mérés eredményét. Az is előfordulhat, hogy ugyanúgy, mint a koleszterin esetében is a es fejezetben leírt tényezők miatt, a különböző helyekről származó tojások fehérjetartalma is eltérő lehet. 5.3 Különböző tojásokkal késztett tészták Ahogy az előzőekben már említettem, a totál tojásfehérje tartalom változhat a tojás származása szerint, különböző tényezőktől függően, mint ahogyan pl. a koleszterin tartalmuk is változik. Ezért a következő kísérlet célja az volt, hogy teljesen újonnan vásárolt, más helyekről származó tojásokból elkészített száraztészták ELISA-val történő mérési eredményeit összehasonlítsuk az előzőekkel. Az új, T2 tojások felhasználásával

23 készítettem 2, 6 és 9 tojásos száraztésztát. A 6 tojásos tésztát háromszor készítettem el. Ezekkel végeztem el a következő mérést. A 6 tojásos tészták közül az egyiket háromszor is mértem (B6/3a, B6/3b, B6/3c). Párhuzamosan szintén mértem T1 tojásokkal készített és gyárilag előállított különböző tojástartalmú száraztészta mintákat (3. táblázat). A gyárilag készített tésztaminták közül az egyikkel 3 ismételt mérést végeztem (S4e/1, S4e/2, S4e/3). A várt és a kapott tojástartalmakból számolt torzítatlanság értékek a T2 és a T1 tojásos tésztáknál 88,96% - 113,87% között változnak. 8. táblázat: különböző tojásokkal készített, saját készítésű száraztészták Minta jele Készített tészta megcélzott tojástartalma Tojástartalom (db)* Konc. (ppm)** Számolt tojástartalo m (db)*** Torzítatlanság (%) BL - 0 nem értelmezhető - - B2-1,994 2,58 2, B6/1 6 5,662 7,23 6, B6/2 6 5,573 6,74 5, B6/3a 6 5,602 6,18 5, B6/3b 6 5,602 5,88 4, B6/3c 6 5,602 5,88 4, B9 9 8,470 10,89 9, A3 3 3,530 5,73 3, A5 5 5,157 7,47 4, A8 8 7,613 12,41 7, S0sz - nem 0 nem értelmezhető értelmezhető nem értelmezhető S4e/1 - nem 4 3,60 értelmezhető nem értelmezhető S4e/2 - nem 4 3,17 értelmezhető nem értelmezhető S4e/3 - nem 4 3,18 értelmezhető nem értelmezhető E10c - nem 10 5,61 értelmezhető nem értelmezhető S8cs - nem 8 0,72 értelmezhető nem értelmezhető * A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom

24 Koncentráció (ppm) ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció *** A 6. ábrán látható két egyenes egyenleteiből visszaszámolt pontos tojástartalom Az egyik 6 tojásos tészta (B6/3) ismételt méréseiből kapott tojásfehérje koncentráció RSD%-a 2,90%. Az összes 6 tojásos tészta tojásfehérje koncentráció eredményeiből számolt RSD%, pedig 9,24% Az Se4 jelű minta tojásfehérje koncentráció eredményeiből számolt RSD%, 7,40% y = 1,2164x - 0,182 R² = 0,9675 y = 1,5974x - 0,107 R² = 0,9922 T2 tojással készített tészták T1 tojással készített tészták Bolti tészták Tojástartalom (db) 6. ábra: A 8. táblázatban feltüntetett tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva. Az 6. ábrán láthatjuk, hogy mind a T1 tojásokból, mind a T2 tojásokból készült tészták méréseinek eredményeiből kapott pontokra külön-külön egyenes illeszthető. A tojásfehérje koncentráció lineárisan nő a tojástartalommal. Viszont a kétféle tojásból készült tészták ELISA-val történő méréséből kapott eredményei nem illeszthetők egyetlen közös egyenesre. Ez azt jelenti, hogy a tojás különböző fehérjéinek mennyisége függ a tojás származásától, azaz befolyásolhatja akár a baromfi kora, tartásának módja, táplálékának összetétele. Ez megmagyarázná azt, amit a 3. ábrán a bolti tészták esetén megfigyelhetünk, vagyis hogy az ebben az esetben a kapott pontok egyáltalán nem mutatnak linearitást. Ez tehát lehet azért, mert ezek a tészták különböző helyekről illetve különböző időpontokban beszerzett tojások felhasználásával készültek

25 5.4 Különböző lisztekkel készített száraztészták A következő kísérlet arra irányult, hogy kizárjam azt, hogy a tojáson kívül a gyártás során felhasznált liszt típusától is függhet a mérési eredmény, vagyis hogy a lisztben jelen lévő fehérjék keresztreakciót okozhatnak a teszt során. Ezért a következő mérést különböző típusú lisztekkel készített száraztésztákon végeztem el (9. táblázat). 9. táblázat: Saját készítésű, különböző időpontokban illetve különböző típusú lisztekkel elkészített száraztészták mérési eredményei Minta neve Készített tészta megcélzott tojástartalma Tojástartalom (db)* Koncentráció (ppm)** Számolt tojástartalom (db)*** Torzítatlanság (%) BL 0 nem értelmezhető - - A3 3 3,530 5,73 3,654 96,49 A5 5 5,157 7,47 4, ,02 A8 8 7,613 12,41 7,836 97,07 ÚBL 0 0, C3 3 3,103 5,19 2, ,74 C5 5 5,152 7,82 4, ,05 C8 8 7,266 12,62 7,696 94,08 TKL 0 1, E3 3 3,047 5,3 3,544 83,68 E5 5 5,097 7,5 5,663 88,89 E8 8 7,950 9,3 7, ,96 DL 0 nem értelmezhető - - D3 3 2,932 5,011 3,459 82,04 D5 5 5,027 8,26 6,114 78,37 D8 8 7,180 8,37 6, ,59 *A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció *** A 6. ábrán látható két egyenes egyenleteiből visszaszámolt pontos tojástartalom

26 Koncentráció (ppm) BL jelű lisztből készített tészták 10 8 BL2 jelű lisztből készített tészták 6 4 TKL jelű lisztből készített tészták Tojástartalom (db) DL jelű lisztből készített tészták 7. ábra: A 3. táblázatban feltüntetett, különböző típusú lisztek hozzáadásával készült tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva A 7. ábrán azt látjuk, hogy az összes tészta esetén a mért pontok egy egyenesre illeszthetők. Kissé kilógnak a magasabb tojástartalmú, 8 tojásos durumlisztből és 8 tojásos teljes kiőrlésű lisztből készített száraztészták esetén számított tojásfehérje koncentráció értékek. A különböző lisztekkel elkészített száraztészták mérési eredményeiből tehát arra lehet következtetni, a magas tojástartalmú két 8 tojásos tészták kivételével, hogy a liszt fehérjéi nem okoznak keresztreakciót az ELISA során, így a liszt illetve a liszt típusa nem befolyásolja a mérési eredményeinket. A kapott tojástartalom és az egyes tésztáknál a készítés után kiszámolt pontos tojástartalom alapján ez esetben is kiszámoltam a torzítatlanság értékeket, melyek 78,37%-113,59% között változnak (9. táblázat). 5.5 Problémák magas tojástartalmú száraztészták esetén Az 5.1-es fejezetben elvégzett kísérletnél a 4. ábrán látható, hogy a 7 tojásos tésztánál a tojásfehérje koncentráció kiugróan alacsony, a magas tojástartalomhoz képest. Ugyanez látható a 7. ábrán a BL jelű liszt és a TKL jelű liszt felhasználásával készített 8 tojásos tészták esetén is. Továbbá az 5. ábrán alacsony a kapott fehérjekoncentráció érték a gyárilag előállított 10 tojásos tésztánál is. Tehát magas

27 Koncentráció (ppm) tojástartalmú tészták esetén előfordult többször is hogy a várthoz képes jóval alacsonyabb tojásfehérje koncentráció értékeket kaptunk. Ez a jelenség több ok miatt is lehet. Lehet az ún. hook effektus vagy kioltási effektus miatt, ami azt jelenti, hogy azért kapunk túl alacsony értékeket, mert a mintánkban túl sok az antigén, ez esetben a tojásfehérje. Ilyenkor az antigén antitest komplexek felbomlanak és emiatt kapunk tévesen alacsony eredményt. A másik lehetséges magyarázat az lehet, hogy a nagyon magas tojástartalmú tészták esetén már nem megfelelő az extrakciós eljárás hatásfoka. A következő kísérlet célja az volt, hogy kiderítsem, az egyes elkészített magas tojástartalmú tészták fals negatív eredményét az elégtelen extrakció okozza-e, vagy a hook effektus. Elvégeztem a mintaelőkészítést a többi kísérletnél is elvégzettek szerint, BL jelű liszttel, az A3, A5, és A8 jelű tészta mintával, valamint három alkalommal is az A10 jelű tésztával. Emellett az 5. táblázatban leírt, tojásfehérjék fokozott extrakciója céljából végzett mintaelőkészítést is elvégeztem az A8 és az A10 jelű mintákkal. Az A10 jelű tésztával ezt három párhuzamos alkalommal végeztem el. A 10. ábrán az látszik, hogy a 10 tojásos tészta esetén a fokozott extrakcióval előkészített mintáknál jelentősen magasabb tojásfehérje koncentráció értékeket kaptunk. Ugyanakkor a másik eljárás szerint előkészített, 10 tojásos tésztával végzett méréseknél a kapott fehérjekoncentráció értékek túlzottan alacsonyak, nem arányosak a tojástartalommal. A 8 tojásos tésztánál a két mintaelőkészítési eljárással végzett mérési eredmények között már kevésbé jelentős az eltérés. Tehát a magas tojástartalmú tészták esetleges fals negatív eredményeit az extrakció nem megfelelő hatásfoka okozta. Az előírt extrakcióval előkészített három 10 tojásos tészta kapott tojásfehérje koncentráció értékeinek RSD%-a, 3,20%, míg a fokozott extrakcióval előkészített mintáké 3,47%, míg az összes 10 tojásos mintáé 6,32% Tojástartalom (db)

28 8. ábra: A 10. táblázatban feltüntetett tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin szoftver által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva 10. táblázat: Az extrakció hatásának vizsgálatához használt száraztészták és mérési eredményeik Minta jele Tojástartalom (db)* Koncentráció (ppm)** BL 0 nem értelmezhető A3 3,53 6,34 A5 5,157 8,14 A7 6,937 7,68 A ,27 A10 8,557 10,09 A11 8,557 9,99 A12 8, A8 7,613 11,84 A10 8,557 13,22 A11 8,557 12,46 A12 8,557 11,58 *A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció 6. Összefoglalás A több tojásfehérjére specifikus ELISA, száraztészták tojástartalmának a meghatározására önmagában nem megfelelő módszer. Annak ellenére sem, hogy a liszt fehérjéi nem okoznak keresztreakciót és a magas tojástartalmú tészták túlzottan alacsony eredményei az extrakció hatásfokának növelésével kiküszöbölhetők. Olyan tészták esetén, melyek ugyanazon lejárati idejű és valószínűleg ugyanazon helyről származó tojásokkal készültek sem elég pontos a tojástartalom ELISA-val történő meghatározása. Továbbá a többféle helyről származó tojásokkal elkészített tészták mérési eredményei egyáltalán nem vethetők össze. Ezek szerint, ha a tojás ugyanarról a helyről származik, akkor valószínűleg a fehérjetartalmát befolyásoló tényezők nem

29 változnak olyan mértékben, hogy azt jelentősen módosítsák. Viszont a különböző helyekről származó tojások fehérjetartalma nagymértékben változhat. Bár az ELISA önmagában nem bizonyult alkalmas módszernek a száraztészták tojásfehérje tartalmának meghatározására, más tojás alkotórészek méréseivel együtt, kombinált módszerben alkalmazva, még mindig fontos szerepet kaphat a száraztészták tojástartalmának meghatározásában

30 Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném megköszönni Dr. Eke Zsuzsannának azt a sok segítséget és hasznos tanácsot, amit szakdolgozatom elkészítésében nyújtott

31 Irodalomjegyzék [1] Magyar Élelmiszerkönyv, II. Kötet [2] W. J. Stadelman, Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition 2nd Ed. (2003) [3] W. J. Stadelman, Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition 2nd Ed. (2003) [4] S. Fredriksson, K. Elwinger, J. Pickova, Food Chem. 99 (2006) [5] M. C. Milinsk, A. E. Murakami, S. T. M. Gomes, M. Matsushita, N. E. de Souza, Food Chem., 83 (2003) [6] S. Samman, F. P. Kung, L. M. Carter, M. J. Foster, Z. I. Ahmad, J. L. Phuyal, P. Petocz, Food Chem., 116 (2009) [7] A. Cobos, L. de la Hoz, M. I. Cambero, J. A. Hordónez, Food Research Int., 28 (1995) [8] M. Fodor, A. Woller, S. Turza, T. Szigedi, J. of Food Engineering, 107 (2011) [9] MSZ 20500/4-87 [10] E. Agulló, B. S. Gelós, Food Research Int., 29 (1996) [11] B. S. Hwang, J. T. Wang, Y. M. Choong, Journal of Food Comp. and Anal., 16 (2003) [12] J. D. Beyer, F. X. Milani, M. J. Dutelle, J. AOAC Int., 72 (1989) [13] M. I. P. Kovacs, J. of Cereal Sci., 11 (1990) [14] L. Pellegrino, A. Tirelli, Int. Diary Journal, 10 (2000) [15] 0, 0. M. Williams, C. D. Westphal, J. AOAC Int., 87 (2004) [16] M. L. Vidal, J. Gautron, Y. Nys, J. Agric. Food Chem., 53 (2005) [17] B. Kerkaert, F. Mestdagh, B. De Meulenaer, Food Chem., 120 (2010) [18] N. Schneider, I. Weigel, K. Werkmeister, M. Pischetsrieder, J. Agr. Food Chem., 58 (2010) [19] H. Čížková, V. Prokorátová, M. Kvasnička, V. Soukupová, Czech J. Food Sci., 22 (2004) [20] A. Daneshfar, T. Khezeli, H. J. Lotfi, J. Chrom. B, 877 (2009) [21] Y. T. Lin, S. S. Wu, H. L. Wu, J. Chrom. A, 1156 (2007) [22] SOP [23] L. Vorlová, E. Sieglová, R. Karpíšková, V. Kopřiva, Acta Vet. 70 (2001)

32 [24] Ľ. Zemková, J. Simeonovová, M. Lichovníková, K. Somerlíková, Czech J. Anim. Sci., 52 (2007) [25] F. Kwasnicka, Electrophoresis, 24 (2003) [26] N. Schneider, C. M. Becker, M. Pischetsrieder, J. Chrom. B, 878 (2010) [27] Z. H. Reed, J. W. Park, Food Chem., 118 (2010) [28] Y. Watanabe, K. Aburatani, T. Mizumura, S. Muraoka, J. Imm. Methods, 300 (2005) [29] S. L. Taylor, J. A. Nordlee, L. M. Niemann, Anal. Bioanal. Chem., 395 (2009) [30] C. D. Amigo, Anal. Biol. Chem., 3 (2010)