A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának lehetőségei és klinikai indikációi

Átírás

1 A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának lehetőségei és klinikai indikációi Prohászka Zoltán Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratórium MTA-SE Gyulladásbiológiai és Immungenomikai Kutatócsoport

2 A komplementaktiváció áttekintése A veleszületett immunitás része Plazmában és egyéb testfolyadékokban kaszkádszerűen működő szerin-proteáz rendszer Összességében (faktorok oldott és sejtfelszíni regulátorok, komplement receptorok) több, mint 45 fehérje alkotja Opszonizáció Antigénprezentáció B-sejt aktiválás Antitesttermelés C3 C5 C5b-9 (MAC) Anafilatoxinok (C3a, C5a) Kemotaxis Gyulladásos válasz Membránkárosító komplex (C5b-9), Lízis (Baktérium, sejt), direkt toxikus hatások (apoptózis)

3 A komplementaktiváció áttekintése Alternatív út (Idegen felszín D, B, Properdin) C3 C5 C5b-9 (MAC) Csalánozók, ~1300 millió éve

4 A komplementaktiváció áttekintése Klasszikus út Immunkomplex, CRP, C1q-rs, C4, C2) Lektin út (szénhidrát struktúra, MBL, ficolin, MASP2, C2, C4) Alternatív út (Idegen felszín D, B, Properdin) C3 Porcos halak (pl. cápák) ~500 millió éve C5 C5b-9 (MAC) Előgerinchúrosok (pl. zsákállatok) ~900 millió éve

5 Klasszikus út Immunkomplex, CRP, C1q-rs, C4, C2) Komplement regulátorok Lektin út (szénhidrát struktúra, MBL, ficolin, MASP2, C2, C4) Alternatív út (Idegen felszín D, B, Properdin) C1-INH C4-Binding protien C3 Factor H, Factor I C5 S protein, Clusterin C5b-9 (MAC) CRI, DAF, MCP, CD59

6 Komplementreceptorok Klasszikus út Immunkomplex, CRP, C1q-rs, C4, C2) Lektin út (szénhidrát struktúra, MBL, ficolin, MASP2, C2, C4) Alternatív út (Idegen felszín D, B, Properdin) C1q-R CR2 C3 C3a-R C5aR CR1 C5 CR3 CR4 C5b-9 (MAC)

7 Klasszikus út Lektin út Alternatív út Terminális út

8 Molecular Intercommunication between the Complement and Coagulation Systems J Immunol Nov 1;185(9): Epub 2010 Sep 24.

9 A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának lehetőségei és klinikai indikációi Csoport: Immundeficienciák immun fenotípus Szisztémás autoimmun betegségek Ritka betegségek nem-immun fenotípus Klinikai állapot/ betegség: Patofiziológia: Diagnosztika:

10 A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának lehetőségei és klinikai indikációi Csoport: Immundeficienciák immun fenotípus Szisztémás autoimmun betegségek Ritka betegségek nem-immun fenotípus Klinikai állapot/ betegség: Rekurrens infekciók Bakteriális meningitis Patofiziológia: Diagnosztika: Csökkent funkcionális aktivitás WIELISA rendszer A hiányzó faktor azonosítása hiányplazmákkal és tisztított faktorokkal.

11 A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának lehetőségei és klinikai indikációi Csoport: Klinikai állapot/ betegség: Immundeficienciák immun fenotípus Szisztémás autoimmun betegségek pl. SLE, de sok egyéb is Ritka betegségek nem-immun fenotípus Patofiziológia: Fokozott aktivitás majd konszumpció Diagnosztika: Össz-komplement C3 C4 (aktivációs termékek) Fejlődés várható iránya: Sepsis, pancreatitis (C3a-ARDS) Koraszülöttek (C3a-ARDS) Habituális abortus, magzati károsodás előrejelzése IgA nephropathia (aktivált C3-progresszió) Vese transzplantáció (C5a, C4d-rejekció) Csontvelő transzplantáció (C4d, C1INH-capillary leak sy.)

12 A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának klinikai indikációi és a vizsgálatok sémás áttekintése Csoport: Klinikai állapot/ betegség: Immundeficienciák immun fenotípus Szisztémás autoimmun betegségek Ritka betegségek nem-immun fenotípus HANO HUS AMD Patofiziológia: Diagnosztika: Egyetlen komplement faktor öröklött vagy szerzett sérüléséből származó működési zavar Egyedi, összetett

13 A komplement diagnosztikában használatos módszerek áttekintése 1, Funkcionális mérések Birka-vörösvértest lízis mérésén alapuló eljárások Összkomplement titrálás: CH50/ml = a beteg 1 ml szérumának azzal a részével, amely 1 ml 2%-os szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre (72 CH50/mL= 1/72 ml szérum okozza az 50%-os lízist) A rendszer módosításával lehetőség van az alternatív út és a H faktor vizsgálatára is, azonban ezek nem terjedtek el Szilárdfázisú technikán alapuló eljárások (Wielisa rendszer) A csökkent működésű, vagy hiányzó komponensek A funkcionális tesztben mért aktivitás Klasszikus Lektin Alternatív C1q, C1r, C1s Alacsony Normál Normál C4, C2 Alacsony Alacsony Normál MBL, MASP2 Normál Alacsony Normál B, D, P Normál Normál Alacsony C3, C5, C6, C7, C8, C9 Alacsony Alacsony Alacsony

14 A Wieslab funkcionális ELISA rendszer működési elve Komplementaktiváció indukciója mikrolemezben (immunkomplex vagy mannan vagy LPS, lemezhez kötve) A komplementaktiváció irányítása a puffer és a hígítás fokának megválasztásával Ca ++, Mg ++ : klasszikus, lektin és terminális út működéséhez kell Mg ++ (EGTA mellett) elegendő az alternatív működéséhez Klasszikus és lektin út: 1:100 vagy magasabb hígítás mellett is működik, alternatív: 1:20 alatt működik A mikrolemezben keletkező terminális (lítikus) komplex detektálása

15 A komplement diagnosztikában használatos módszerek áttekintése 1, Funkcionális mérések C1-inhibitor aktivitás meghatározás (Quidel) Szilárdfázisú assay a C1r-C1-inhibitor kovalens kapcsolatának detektálására. Csak funkcionálisan aktív C1 inhibitor esetén keletkezik jel. A C1r enzimatikus aktivitásának gátlásán alapuló teszt is forgalomban van (kromogén szubsztrát)

16 A komplement diagnosztikában használatos módszerek áttekintése 2, Komplementfehérje (antigenikus) mérések Immunturbidimetria (C3, C4) Radiális immundiffúzió (IF, BF, C1-INH, C1q) ELISA (HF, C4bBP)

17 A komplement diagnosztikában használatos módszerek áttekintése 3, Komplement komponensek elleni autoantitestek mérése Anti-C1 inhibitor (G/A/M) Anti-C1q (G) Anti-H faktor (G) C3-nefritikus faktor (funkcionális mérés)

18

19 A komplementvizsgálatok orvosi indikáció: deficiencia immun fenotípussal 5 éves fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat. Jó általános állapot, megfelelő tápláltság Krónikus betegség hiánya Gyakori infekcióhajlam Primer immundeficiencia gyanú majd kivizsgálás Immundeficiencia gyanú miatti kivizsgálás Immunglobulin szintek, (alosztályok) Komplement aktivitás Fagocita funkció Limfocita populációk vizsgálata (citometria) Aktív immunizálás hatásának lemérése Immunglobulin szintek IgG 11,3 g/l, IgA 0 g/l, IgM 0,4 g/l Komplement funkcionális szűrőtesztek Klasszikus reakcióút aktivitás 67% Alternatív reakciót aktivitás 93% Lektin reakcióút aktivitás 4% Komplement fehérje meghatározás Komplement C3 1,28 g/l Komplement C4 0,38 g/l

20 A komplementvizsgálatok orvosi indikáció: deficiencia immun fenotípussal 5 éves fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat. Jó általános állapot, megfelelő tápláltság Krónikus betegség hiánya Gyakori infekcióhajlam Primer immundeficiencia gyanú majd kivizsgálás Diagnózis: szelektív IgA hiány és komplement lektin-út (MBL) hiány Közönséges variábilis immundeficiencia (<4 g/l immunglobulin) funkcionális lektin út hiánnyal Hátterében a mbl2 gén polimorfizmus, vagy a ficolinok zavara állhat

21 A komplementvizsgálatok orvosi indikáció: deficiencia immun fenotípussal Klasszikus reakcióút funkcionális hiánya esetén: S. pneumoniae fertőzések Alternatív reakcióút funkcionális hiánya esetén (D és P faktor): Meningococcus meningits, férfi dominancia, felnőttkori kezdet, egy epizódos, rossz prognózisú forma Terminális (lítikus) út funkcionális hiánya esetén (C5, C6, C7, C8, C9): Meningococcus meningits, férfi-nő arány 2,2:1, gyermekkori kezdet, több epizód, alacsony mortalitás

22 A komplementvizsgálatok orvosi indikáció: deficiencia nem-immun fenotípussal: HANO 25 éves nőbeteg Mater és fiú testvére megfulladtak, gége ödéma következtében. 6 éves kortól visszatérő végtag ödémák, rohamok alatt több esetben végtag gipszrögzítése. 18 évesen tonsillectomiat követően gége ödéma. Visszatérő hasi panaszok, appendectomia, 2 esetben laparoscopia. Arc és felső légúti ödémák, lassan vonultak vissza GCS, antihisztamin, tonogen kezelésre, egy alkalommal urgens tracheotomia történt. Komplement vizsgálat: Dg: HANO I. típus: C1-inhibitor aktivitás és antigén alacsony, C4 alacsony, CH50 alacsony, C3 és C1q referens tartományban Hátterében C1-inh gén mutációja áll

23 A komplementvizsgálatok orvosi indikáció: deficiencia nem-immun fenotípussal: AANO 45 éves férfi beteg Családban allergiás, angioödémás betegség nem volt. 41 éves korától visszatérő végtag ödémák, arc-, nyelv ödéma. Hasi panaszok, GI kivizsgálás: egy esetben hasi CT során bélfal ödéma, szabad hasűri folyadék. Felső légúti ödéma GCS, antihisztamin, tonogen hatástalan, urgens tracheotomia, MGUS. Komplement vizsgálat: C1-inhibitor aktivitás csökkent, anti-c1-inh antitest pozitív, CH50 alacsony, C4 és C1q alacsony, C3 referens tartományban Dg: AANO-C1-INH (Autoimmun eredetű angioneuroticus ödéma) Hátterében leggyakrabban autoimmun, lymphoproliferativ vagy infektív kórkép áll A betegnél 2 év múlva lymphoma alakult ki

24 A komplementvizsgálatok orvosi indikáció: deficiencia nem-immun fenotípussal: HUS Hemolitikus urémiás szindróma (atípusos lefolyással) A legújabban felismert komplementdeficiencia nem immun fenotípussal (2000-es évek) Hátterében a komplement alternatív út szabályozási zavara áll Öröklött Szerzett

25 Klinikai gyanú: hányás, hasmenés, anaemia, thrombocytopaenia, veseelégtelenség, neurológiai tünetek Klinikai diagnózis: Thrombotycus microangiopathia (TMA) Haemolyticus anaemia (Htk<30%) LDH (>450 U/l) indirekt Bi, vizelet ubg haptoglobin szabad haemoglobin fragmentocyták, schistocyták reticulocytosis Coombs negatív Egyéb okok kizárása Thrombocyta szám (< /l) Veseelégtelenség: HUS (Gasser-sy) Neurológiai tünetek: TTP (Moschcowitz sy) Slide thanks to Dr. Kline Bolton, UVA. Thromboticus microangiopathia (TMA): Olyan veselaesio, amelyben a glomerulusokban és a kis arteriolákban thrombusok vannak Curtesy of Diana Krapman

26 A thromboticus microangiopathiák klinikai lefolyása Predispositio Közvetlen kiváltó ok Akut shub: hemolízis, alacsony thrombocytaszám Gyakori szövődmény, tartós károsodás D+HUS Shiga-like toxint termelő kórokozó ahus Komplement defektus (mutáció, autoantitest) ESRD, dialízis, tx P-HUS Invazív pneumococcus infekció? TTP (Moschcowitz sy) DR11/DQ3 hordozás Anti-ADAMTS13 Neurológiai deficit ADAMTS13 mutáció Congenitalis TTP (Upschaw-Schulman sy) Neurológiai deficit Szekunder HUS/TTP? Súlyos alapbetegség; ennek resolutioja esetén gyógyulás

27 V. Dorina, szül: hónapos korától atípusos HUS miatti kezelések, 11 hónapos korától ESRD, peritoneális dialízis Csökkent C3 szint és alternatív-összkomplement aktivitás, kóros HF funkcionális teszt Dg: Haemolyticus uraemias sy, atípusos Nehezen uralható anémia, transzfúziós haemosiderosis, hypertonia, uraemia Transzplantáció közben exitus 38 hónapos korában Jelmagyarázat: Mutációk Rizikó haplotípusok CFH R1210C CFH H3 ahus beteg HUN12 (VD) CFH Thr1216del MCPggaac A CFH gén 23. exonjának szekvenálásával kapott kromatogramok részlete az anya (felső), az apa (középső) és a beteg (alsó) esetében. Mindhárom kromatogram a 23. exon nukleotidjait mutatja (a nukleotidok számozása az irodalomnak megfelelően a cdns-beli pozíciót jelöli).

28 Komplementvizsgálatok autoimmun betegségek esetén Betegségaktivitási marker Emelkedett C3: akut fázis reakció Alacsony C3, kóros túlaktiválódás, konszumpció Szintjének értékelésekor figyelembe kell venni a fehérjevesztés mértékét is Klasszifikációs marker Anti-C1q pozitivitás esetén a lupus nephritis kialakulásának/fennállásának esélye sokszorozódik Hypokomplementaemias vasculitis (ANCA, urtica, IgE) Glomerulonephritis Izolált, csökkent C4: Cryoglobulin, cryofibrinogen

29 Vizsgálati minta küldése, konzultáció: Preanalitika! Csak friss, azonnal szállított és/vagy fagyasztott minta alkalmas komplementvizsgálatra. A legtöbb vizsgálathoz szérum megfelelő, az aktivációs termékekhez EDTA plazma szükséges. (1) Dóczy Andrásné, Márta (Komplement), Dr. Varga Lilian (lvarga@kut.sote.hu) Szilágyi Ágnes, genetikai meghatározások , szilagi@kut.sote.hu Prohászka Zoltán , 57379, prohoz@kut.sote.hu