MEDIPOLISZ. Dél-Dunántúli Regionális Egyetemi Tudásközpont ÉVES JELENTÉS. Életminôséget Javító Gyógyszerek és Gyógyító Eljárások Fejlesztése

Átírás

1

2

3 MEDIPOLISZ Dél-Dunántúli Regionális Egyetemi Tudásközpont ÉVES JELENTÉS 2008 Életminôséget Javító Gyógyszerek és Gyógyító Eljárások Fejlesztése 3

4 Tartalom Küldetésnyilatkozat Stratégiai célkitûzés...5 Átfogó cél A kutatás-fejlesztési program... A központnak a befogadó egyetemen belül betöltött szerepe... 7 A Pécsi Tudományegyetem mint befogadó intézmény szerepe és bemutatása... 8 A Tudásközpont szervezeti felépítése és tudományos, szakmai és pénzügyi tervezési folyamatai... 9 Ipari együttmûködés...10 A kutatási programok beszámolói 1. Fájdalomcsillapító gyulladásgátló gyógyszerjelöltek kutatása fájdalomérzô nociceptív idegvégzôdések mûködésének gátlásán keresztül Új hatásmódú kapszaicin receptoron ható fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztése Központi idegrendszeri gyógyszer-targeteken ható endogén és exogén anyagok kutatása A TT-232 nem-peptid követô molekulák kötôdési és hatástani vizsgálata Széles spektumú analgetikus és gyulladásgátló gyógyszerjelöltek fejlesztése PannonPharma együttmûködés új gyógyszerkészítmények bevezetése, iparjogvédelem megszerzésére Gyógyszer hatóanyagok gyógyszerkészítményekben és biológiai mintákban történô meghatározása Povidon-jód szemcsepp gyártástechnológiai fejlesztése, Melfen drazsé A ÁOK Gyógyszerészeti Intézet által elvégzett tevékenységek Aszeptikus technológiával gyártható készítmények kifejlesztése Diagnosztikai eljárások fejlesztése a gyógyszeres-terápia és egyéb gyógyító eljárások hatékonyságának javítása érdekében Ultraszenzitív laboratóriumi technikák kifejlesztése bioaktív anyagok kimutatása céljából Gyógyszeres kezelésekre kialakuló rezisztencia megítélése a P-glycoproteinen (MDR1) és a citokróm P-450-en alapuló gén-polimorfizmusok azonosításával Szteroidok elemzése GC-MS eljárással; elektroforézis chip-technológia kidolgozása Diagnosztikai laboratóriumok akkreditálása Szakmai-gazdasági szempontból koordinált, hatékony regionális laboratóriumi ellátórendszer kialakítása, a regionális diagnosztikai beteg-utak modelljének kimunkálása Klinikai biokémikus szakirányú szakképzés Technológia-transzfer A projekt megvalósításában résztvett személyek Publikációk A tudásközpont médiaszereplései Monitoring mutatók Finanszírozás, összesített pénzügyi mutatók

5 É VES J ELENTÉS 2008 Küldetésnyilatkozat A MEDIPOLISZ Dél-Dunántúli Regionális Egyetemi Tudásközpont küldetése kutatás-fejlesztési innovációs és oktatási kiválósági központ létrehozása a gazdasági szféra és egyetem együttmûködésén alapuló orvostudományi fejlesztések hatékony kiaknázása céljából. Életminôséget javító versenyképes gyógyszerek és gyógyeljárások felfedezése, új biotechnológiai módszerek bevezetésén alapuló diagnosztikai eljárások kidolgozása valamint a Nemzeti Fejlesztési Tervben a régió egészségipari pólus programjainak megalapozása a kitûzött cél. Stratégiai célkitûzés A MEDIPOLISZ Regionális Egyetemi Tudásközpont a Dél-Dunántúli régiónak olyan innovatív kutatás-fejlesztési és tudományos utánpótlást képzô konzorciuma, amely a Nemzeti Fejlesztési Tervben regionális prioritásként megjelölt egészségipari pólusprogram alapját kell, hogy képezze. A régióban az ipartelepítés jelentôsen elmaradt az országos átlagtól és így az állami és vállalati kutatásfinanszírozás megroppant, természettudományos kutatóintézet hiányzik és az eddigi egyetemi MTA támogatás is visszaszorult. A Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kara a Gyógyszerész szakkal kiegészülve Kiválóság Központ minôsítést kapott, s így jelentôs nemzetközi színvonalú kutató-oktatói gárdával rendelkezik amely angol, német, magyar nyelvû graduális képzésen kívül évente mintegy 50 új PhD doktor képzését biztosítja. Ez a meglévô szakember-kapacitás, késôbbiekben a más karaival valamint a Kaposvári Egyetemmel kiegészülve biztos alapot képez gazdasági partnerekkel való együttmûködésre és fejlesztési célú kutatási célok elérésére. A Tudásközpont stratégiai célja új termékek kifejlesztése, versenyképes innovatív vállalkozások bôvítése, tudásalapú termékstruktúra kialakítása, új munkahelyek létesítése és kutatói utánpótlás képzése. 5

6 Átfogó cél Innovatív termékfejlesztés Gazdasági szereplôk bevonása a régió kutatás-fejlesztési programjaiba Együttmûködésen alapuló tudás- és technológiatranszfer hatékony mûködtetése Egészségügyi ellátás és megelôzés terén költségcsökkentô innovatív eljárások kidolgozása Nemzetközi szintû tudományos tevékenység erôsítése Tudományos utánpótlás képzése A kutatás-fejlesztési program A kutatási programokat az egyetem kutatói bázisa és az együttmûködô vállalati partnerek által közösen preferált célkitûzések összehangolása alapján alakították ki. Két alprogram közül, az egyik a gyógyszerkutatás témakörében kilenc altémát tartalmaz, melynek keretében hangsúlyos szerepet kap a farmakológusképzés és új kutatói laboratóriumok kialakítása. A másik alprogram diagnosztikai eljárások fejlesztését tûzte ki célul a gyógyszeres terápia és egyéb gyógyító eljárások hatékonyságának javítása érdekében. Ez utóbbi témakörbe hat altéma tartozik beleértve a klinikai biokémikus és genetikai szakirányú szakképzés bevezetését. Fontos eleme a Tudásközpontnak a technológia-transzferiroda kialakítása, iparjogvédelem, egyetemi szellemi tulajdon menedzselésének megszervezése, oktatása és együttmûködése a Pécsi Tudományegyetem, valamint a Dél-Dunántúli régió innovációs szervezeteivel. Prof. Dr. Szolcsányi János Projektvezetô

7 É VES J ELENTÉS 2008 A központnak a befogadó egyetemen belül betöltött szerepe A tízkarú a szakképzés szinte teljes vertikumát lefedi, ezzel a hazai felsôoktatásban egyedülálló helyzetet teremtve a multidiszciplináris megközelítésû kutatásokra, a kutatás-fejlesztésekre és ezáltal a regionális innovációs folyamatokba történô sokoldalú bekapcsolódásra. A Dél-Dunántúlon a elsôsorban annak angol és német nyelvû képzést folytató több mint 80 éves orvoskara, amely az elmúlt években a gyógyszerész szakkal kibôvülve, valamint a 15 éve megalakult Természettudományi Karral együttmûködve képezi és képezheti azt a kritikus kutatói bázist, amely a Régió legszélesebb körû kutatói hálózatát képezi. A központ a kutatói képzés bôvítésében a fókuszált alkalmazott kutatási irányok terén létesítendô együttmûködések koordinálásában fog hosszú távon is meghatározó szerepet játszani. A Tudásközpont felépítését és mûködését tehát alapvetôen meghatározza a jelenlegi struktúrája, ugyanakkor létrehozása dinamikusan visszahat a egészének mûködésére. Konzorciumi partnerek Pécsi Tudományegyetem a konzorcium vezetô intézménye Biostatin Gyógyszerkutató-Fejlesztô Kft. Csertex Kereskedelmi és Tanácsadó Kft. Diagnosticum ZRt. HC Pointer Kft. Richter Gedeon NyRt. Társult tagok PannonPharma PannonPharma Gyógyszergyártó Kft. Roche Diagnostics Roche (Magyarország) Kft. InnovAID Bt. Mineral-Kies Kft. Pro-Pharma Kft. Supertech Kft. A Pécs Egészségipari Innovációs Központ Zrt (PEIK) alábbi két ipari partnere: Biotechnológia Innovációs Bázis spin-off vállalat, OsTendo Szolgáltató Kft. Neuro CT Pécsi Diagnosztikai Központ Kft. Zsigmondy Vilmos Harkányi Gyógyfürdôkórház Kht. Együttmûködô partnerek Dél-Dunántúli Regionális Innovációs Ügynökség Nonprofit Kft. 7

8 8 A Pécsi Tudományegyetem mint befogadó intézmény szerepe és bemutatása A Tudásközpont létrehozására irányuló konzorcium vezetôje a Pécsi Tudományegyetem. A Pécsi Tudományegyetem a felsôoktatási integrációs folyamat keretében január 1-jén, a Janus Pannonius Tudományegyetem, a Pécsi Orvostudományi Egyetem és a Szekszárdi Tanárképzô Fôiskola egyesülésével jött létre. Oktató/kutató összesen Ebbôl az ÁOK keretében MTA tagja 7 4 MTA doktora Kandidátus/PhD PhD hallgató A legutóbbi akkreditációs adatai alapján Az egyetemen több mint nappali és több mint 1000 levelezô tagozatos hallgató tanul. Az egyetem nemzetközi kapcsolatai nagy hagyományokkal rendelkeznek Közép- és Kelet Európában, Nyugat-Európában, az Amerikai Egyesült Államokban és a Távol Keleten egyaránt. A szakember- és hallgatócsere kiválóan mûködô TEMPUS-, CEEPUS- és ERASMUS - programokon keresztül zajlik. Ami a nemzetközi kutatási kapcsolatokat illeti, bilaterális szerzôdések, nemzetközi hálózatok és EU - programok egyaránt növelik az egyetem ismertségét és elismertségét. Ipari partnerek Biostatin Gyógyszerkutató-Fejlesztô Kft. Fô tevékenységi köre a gyógyszerkutatás és fejlesztés. Fôleg daganatos betegségek elleni gyógyszerek, fájdalomcsillapítók és gyulladásgátlók fejlesztésével foglalkozik. Csertex Kereskedelmi és Tanácsadó Kft. A cég tevékenysége: az egészségügyi intézetek ellátásával foglalkozó üzletág a kórházi laboratóriumok, illetve gyógyító részlegek ellátásával foglalkozik. Kiemelten a diagnosztikai laboratóriumok, mikrobiológiai egységek gépekkel, mûszerekkel és fogyóanyagokkal való ellátása területén. Diagnosticum Zrt. A cég profilja megalakulásától kezdve orvosi laboratóriumi diagnosztikumok fejlesztése, gyártása, forgalmazása, valamint az ezekhez kapcsolódó eszközök, mûszerek forgalmazása és szervize. HC Pointer Kft. A HC Pointer Kft. három üzletága a Gyógyszerészi & Egészségügyi Üzletág, a Kereskedelmi Üzletág, a Kórházi & Szakmai Fejlesztések Üzletág. A cég fô profilja a készletgazdálkodást segítô alkalmazások fejlesztése, amelyek IBM kompatibilis PC bázison mûködnek. Pannonpharma Gyógyszergyártó Kft. A Pannonpharma Kft. tevékenységi köre az alábbi területeket fedi le: mintegy 70 forgalmazott termék; több, mint 40 termék törzskönyvezés alatt. Termékeik forrása ma még elsôsorban a licenc-alapú együttmûködés, de forgalmaznak egyedi készítményeket is és fejlesztenek, értékesítenek generikus gyógyszereket saját márkanéven. A társaság 1997 óta folyamatosan együttmûködik a -vel. Richter Gedeon Nyrt. Humán kiszerelt gyógyszerek, hatóanyagok és intermedierek kutatás-fejlesztésével, gyártásával és forgalmazásával foglalkozik. A cég mintegy száz féle gyógyszert gyárt, több mint 170 kiszerelési formában. Termékeik számos terápiás területet lefednek, ezen belül kiemelt szerepe van a központi idegrendszerre ható, a fekélyellenes, a kardiovaszkuláris és az emésztôrendszeri készítmények, valamint az orális fogamzásgátlók gyártásának-fejlesztésének. Az innováció kiemelt szerepet tölt be a társaság stratégiájában. Originális kutatási tevékenységük kizárólag a központi idegrendszeri szerek kutatására irányul, ezen belül elsôsorban a krónikus fájdalom, a fájdalmas izomspazmus és a skizofrénia, a szorongás és az Alzheimer-kór kezelésére irányuló készítményekre összpontosítanak. Roche (Magyarország) Kft. A bázeli központú svájci Roche csoport a világ egyik vezetô, kutatás-orientált, gyógyszerek kifejlesztésével, gyártásával és diagnosztikus eszközök létrehozásával kiemelkedô helyet kivívó szervezete, és egyben a világ egyik legnagyobb vitamin, aroma és illat-anyagok elôállítója. A géntechnológiában betöltött egyedülálló szerepét igazolja, hogy az egyik legfejlettebb biotechnológiai háttérrel is rendelkezik, ezáltal is tovább erôsítve a Roche elôkelô helyét az egészségügyi piacon. Arculatának kialakulásához nagyban hozzájárul a betegségek korai diagnózisának és kezelésének eszméje. A polimeráz láncreakció (PCR) Nobel-díjas technológiájának felfedezését követôen 1991-ben a Roche megszerezte a jogot a PCR diagnosztikai alkalmazása felett, ezáltal e technológiában a világ vezetôjévé lépett elô.

9 É VES J ELENTÉS 2008 A kutatási eredmények hasznosítása A MEDIPOLISZ altémáinak közvetlen célkitûzése az eredmények hasznosítása. Ez a cél két altémában jelentôs alapkutatási eredményeken alapuló új célmolekulán ható fájdalomcsillapító-gyulladásgátló részben szabadalmaztatott ígéretes gyógyszerjelöltek preklinikai vizsgálatait tartalmazza. A további altémák célkitûzése kifejezetten innovatív termékfejlesztés. A diagnosztikai eljárások fejlesztésének témakörében egyaránt szerepelnek szabadalmaztatható módszerek kidolgozását, a gyógyszeres kezelés költséghatékonyságának fokozását, a költség-takarékos diagnosztikai módszerek bevezetését valamint gyógyszerkutatáshoz akkreditált laboratórium kialakítását megvalósító egészségügyben hasznosítható célkitûzések. A Tudásközpont szervezeti felépítése és tudományos, szakmai és pénzügyi tervezési folyamatai Régió vállalk. Régió vállalk. Spin-off vállalk. Spin-off vállalk. Technológia Transzfer Iroda Konzorciumi tagok Tud.közp. Igazgató Tanácsa Tud.közp. Koordinációs Igazgatósága 1. alprogram 2. alprogram InnovAID Bt. Pénzügyi asszisztens A Tudásközpont tervezési folyamata: Pénzügyi folyamatok: Kutatási információ: Üzleti kommunikáció: Találmányhasznosítási folyamatok: A konzorcium vezetô intézménye a Pécsi Tudományegyetem. Döntéshozó testülete a Tagok Összességének Tanácsa, melynek tagjai: Dr. Szolcsányi János a Tudásközpont igazgatója Pécsi Tudományegyetem Dr. Szüts Tamás ügyvezetô igazgató Biostatin Kft. Dr. Cserta Gábor ügyvezetô igazgató Csertex Kft. Torzsa Tibor ügyvezetô igazgató HC Pointer Kft. Pallos József Péter ügyvezetô igazgató PannonPharma Kft. Dr. Péterfy Ferenc elnök Diagnosticum ZRt. Dr. Hodossy Lajos divízióvezetô Roche (Magyarország) Kft. Bogsch Erik vezérigazgató Richter Gedeon NyRt. A Tudásközpont menedzsment feladatait a Projektkoordinációs Igazgatóság, élén Dr. Szekeres Péter menedzser igazgató látja el. Az Igazgatóságon a menedzser igazgató munkáját egy kommunikációs menedzser, egy projekt adminisztrátor, egy pénzügyi menedzser, egy pénzügyi asszisztens és egy szakmai koordinátor segíti. Elkészült a Tudásközpont web-helye, mely a címen található. A Technológia Transzfer Iroda vezetôje Dr. Kiefer Éva jogász. Az 1. és 2. sz. kutatási programban összesen 15 altémában indult kutató-fejlesztô munka. 9

10 Ipari együttmûködés A Richter Gedeon Nyrt. közremûködésével, három kutató és két doktorandusz alkalmazásával Analgetikum Kutatólaboratórium került kialakításra, felszerelése, és bevezetésre került a Richter Gedeon Nyrt. high throughput screening (HTS) módszertana; A Biostatin Kft. mindegy 80 újonnan szintetizált vegyületet bocsátott a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet számára, ahol az anyagok neurogén gyulladást okozó ágensek felszabadulását gátló hatásának vizsgálata történik. A Biostatin Kft. folyamatosan biztosítja a tesztvegyületek minôségi ellenôrzését és elegendô mennyiségben történô elôállítását; A Pannonpharma Kft. közremûködésével orális, hatóanyagként capsaicint tartalmazó készítmény kidolgozása folyik, továbbá iparjogvédelmi oltalom nyerése a készítmény(ek)re, a készítmények törzskönyvezése és forgalomba hozatala; A Pannonpharma Kft. közremûködésével helyi kezelésre alkalmas gombaellenes készítmény kifejlesztése és szabadalmaztatása történik; A Gyógyszerészi Kémiai Intézetében a laboratórium fejlesztésének célja, hogy a gyógyszerfejlesztés (Pannonpharma Kft.) során keletkezô minták elemzése a gyógyszergyártás, illetve a gyógyszerfejlesztés során elôírt követelményeknek megfelelô minôsítéssel rendelkezô laboratóriumi környezetben elvégezhetô legyen; A Pannonpharma Kft.-vel az ibuprofen hatóanyagot tartalmazó drazsék gyártás-technológiai korszerûsítése történik; A HC Pointer Kft.-vel együttmûködve a gyógyszerek hazai, hivatalos alkalmazási elôiratának elemzése és a gyógyszerkölcsönhatások szûrését lehetôvé tevô genetikai laboratórium és adatbázis kidolgozása történik; A OEKK KK I. sz. Belgyógyászati Klinika Klinikai Farmakológiai Osztálya aktív részt vállal az ipari partner (Pannonpharma Kft.) klinikai fázis I-II vizsgálataiban; A Diagnosticum Zrt. közremûködésével citokinek mérésére alkalmas SPR (Surface Plasmon Resonance) módszer- és mûszerfejlesztés folyik; A Roche (Magyarország) Kft. és a Csertex Kft. közremûködésével a gyógyszeres kezelésekre kialakuló rezisztencia vizsgálatára alkalmas laboratóriumi módszerek kidolgozása történik; A Csertex Kft.-vel közösen került kialakításra szteroidok GC-MS eljárással való elemzésére laboratórium, továbbá új elektroforézis chip-technológia kerül kidolgozásra; A Roche (Magyarország) Kft. és a Csertex Kft. közremûködésével történik a gyógyszerkutatással foglalkozó laboratóriumok egy részének akkreditálása, továbbá a regionális laboratóriumi diagnosztikai betegutak felmérése, a költséghatékony gyógyszerelés szempontjából. A Roche (Magyarország) Kft., Csertex Kft. és Diagnosticum Zrt. közremûködésével három kutatólaboratórium került kialakításra és felszerelésre, melynek átadására május 4-én megtörtént. Kutatási programok beszámolói 1. alprogram: Fájdalomcsillapító gyulladásgátló gyógyszerjelöltek kutatása fájdalomérzô nociceptív idegvégzôdések mûködésének gátlásán keresztül (Dr. Szolcsányi János alprogram vezetô) 1.1. altéma: Új hatásmódú kapszaicin receptoron ható fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztése (Témavezetô: Dr. Szolcsányi János) Résztvevôk Dr. Szolcsányi János akadémikus, egyetemi tanár Dr. Pethô Gábor egyetemi docens Dr. Szôke Éva tudományos munkatárs Dr. Sándor Zoltán Richter, -RG Analgetikum Kutatólab. Dr. Tihanyi Károly Richter, -RG Analgetikum Kutatólab. Dr. Bölcskei Kata Richter, -RG Analgetikum Kutatólab. Dr. Dézsi László Richter, -RG Analgetikum Kutatólab. Tékus Valéria Richter, -RG Analgetikum Kutatólab. Tóth Dániel Márton Richter, -RG Analgetikum Kutatólab. 10

11 É VES J ELENTÉS 2008 Célok és rövid áttekintés A fájdalomérzô idegvégzôdéseken található TRPV1 kapszaicin receptor fájdalomkeltô anyagok és forró ingerek közös jelfogó molekulájának bizonyult. Így világszerte mintegy 55 gyógyszer- és biotechnológiai gyárban intenzív kutatás indult e receptoron ható új típusú fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztésére, eddig összesen mintegy 1 milliárd dollár költséggel. A AOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetben felhalmozott négy évtizedes kapszaicin kutatási tapasztalat és egy klónozott TRPV1-et kifejezô sejtvonal elôállítása lehetôséget nyitott, hogy a Richter Gedeon gyógyszergyár szintetikus kémiai bázisán és nagy hatékonyságú sorozatvizsgálatra alkalmas in vitro tesztrendszerével meginduljon hazánkban is ilyen irányú gyógyszerfejlesztés. A célok elérése érdekében az altéma keretében a Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyilvánosan Mûködô Rt és a Pécsi Tudományegyetemen Analgetikum Kutatólaboratóriumot létesített az Egyetem területén. Elvégzett tevékenység, fontosabb eredmények részfeladat: A projekt céljaira alkalmas laboratórium felépítése, berendezése, a munkavégzéshez szükséges felszerelések, módszerek beállítása. A Kórélettani Intézetében kialakított RG Analgetikum kutatólaboratóriumban a mûszerpark kialakítása és az alap módszerek beállítása lényegében már a projekt elsô részében megvalósult. A projekt során felmerülô igényeknek megfelelôen azonban az idei ciklusban is sor került új módszerek bevezetésére, mint például az pontban részletezett posztoperatív hiperalgézia modell és környezeti hômérséklet-preferencia vizsgálatok részfeladat: A -n létrehozott TRPV1 receptort stabilan expresszáló sejteken módszer fejlesztése a vanilloid receptoriális hatás mérésére. Ezen részfeladat során az elsô ciklusban sikeresen elôállítottunk emberi és patkány TRPV1 receptort kifejezô sejtvonalakat, melyeket az résztéma keretében a nagy áteresztôképességû szûrôvizsgálatokban sikeresen alkalmaztunk. A gyógyszerjelölt molekulák optimalizálása céljából az elôzô ciklusban megkezdtük a lipid raftok szerepének tisztázását. Ezen vizsgálatok folytatásaként különbözô kísérleti elrendezésekben vizsgáltuk, hogy a plazma membrán koleszteroltartalmának depléciója metil-b-cyclodextrinnel (MCD), valamint spingomyelinase, myriocin, és D-PDMP kezelés, melyek a sphingolipid háztartást befolyásolják, milyen hatással vannak a TRPV1 receptor funkciójára. Trigeminális ganglionsejteken fluoreszcens Ca-szint méréssel sikerült bizonyítanunk, hogy a lipid raftok károsítása jelentôs mértékben csökkenti a capsaicin és RTX TRPV1 receptor aktiváló hatását, amint azt az alábbi ábra mutatja. TRPV1 receptort expresszáló CHO sejteken, melyeket radioaktív 45Ca-izotóp akkumulációs kísérletben vizsgáltunk, szintén kifejezett volt ez a gátló hatás, azonban RTX-el kiváltott receptor aktivációt csak a sphingolipid bioszintézisét gátló szerek csökkentették. Az idegvégzôdésekbôl TRPV1 receptor aktiváció során felszabaduló CGRP-t mértük RIA módszerrel. Hasonlóan az elôbbi eredményekhez, az MCD és a sphingomyelinase ebben a kísérleti elrendezésben is csökkentette a TRPV1 receptor aktivációt. Ezen eredmények mutatják, hogy különbözô kísérleti körülmények között a lipid raftok fontos összetevôinek depléciója vagy bioszintézisének gátlása befolyásolja a TRPV1 receptor aktiválhatóságát. A különbség a capsaicin és RTX gátolhatóságában a két agonista által indukált receptor aktiváció eltérésre utal, ami feltehetôen alloszterikus kötôhelyen jön létre, amely információ jelentôs a gyógyszerfejlesztés szempontjából részfeladat: Nagy áteresztôképességû szûrési teszt (HTS) kidolgozása és futtatása A korábbi ciklusok során a Richter Gedeon gyógyszergyárban befejezôdött a HTS rendszer futtatása, mely eredménye képen 15 találati csoportot és mintegy 400 további vizsgálatra alkalmas vegyületet azonosítottunk. Az HTS eredményeképp azonosított és in vitro körülmények közt bizonyítottan TRPV1-re specifikusan gátló hatással rendelkezô vegyületeket további - a gyógyszerfejlesztés szempontjából elengedhetetlen - validálási vizsgálatoknak vetettük alá. Vizsgáltuk a vegyületek vizes oldhatóságát és kémiai stabilitását, majd ezt követôen kiválasztott vegyületek stabilitását jellemeztük a citokróm P450 enzimek mediálta metabolizmus során mind humán, mind patkány máj mikroszóma preparátumon NADPH jelenlétében. Sikerült megfelelô kémiai és metabolikus stabilitással rendelkezô vegyületeket azonosítanunk, amelyeknek TRPV1 gátló hatása megfelelônek bizonyult mind humán, mind patkány rekombináns TRPV1 receptoron. A vegyületek in vivo validálását a es részfeladat során végeztük. 11

12 1.1.4 részfeladat: HTS hitek antinociceptív hatásának validálása Az részfeladat során kialakított laboratóriumban beállított nociceptív magatartási teszteken tovább vizsgáltuk a as részfeladat teljesítése során talált vegyületeket. A kidolgozott termonocicepciós tesztekben (Füredi et al Eur. J. Pharmacol.) referencia TRPV1 receptor antagonisták (SB705498, BCTC, AMG9810) antihiperalgéziás hatását hasonlítottuk össze patkányokon. Három különbözô modellt vizsgáltunk: (1) A TRPV1 agonista RTX-indukálta akut termális hiperalgézia, (2) enyhe hôtraumával kiváltott termális hiperalgézia (elsôfokú égés-modell) (3) sebészi bemetszéssel kiváltott termális hiperalgézia (posztoperatív fájdalom-modell). A beállított módszerek nagyon érzékenynek bizonyultak a referencia TRPV1 receptor antagonisták in vivo hatásának kvantitatív összehasonlítására, mivel pl. az RTX-indukálta termális hiperalgéziát 1 mg/kg per os dózisban gátolták. A RET részfeladat során a Richter Gedeon gyógyszergyárban szintetizált új struktúrájú vegyületek közül három hatékonyságát vizsgáltuk a fenti in vivo modellekben és kimutattuk, hogy a referenciavegyülethez hasonló dózisban per os adva szignifikáns antihiperalgetikus hatással rendelkeznek. Az elmúlt idôszakban újabb mechanikai hiperalgézia modellt állítottunk be: a talp bemetszésével kiváltott posztoperatív hiperalgézia modellt, amelyet korábban már sikeresen vizsgáltunk a termonocicepciós tesztekben. A dinamikus plantáris eszteziométerrel és von Frey filamentumokkal mért mechanikai küszöbcsökkenés a mûtétet követô 1. órától kezdve mérhetô és akár egy héten keresztül kimutatható. Referencia fájdalomcsillapító gyógyszerként diclofenac-ot illetve tramadolt alkalmaztunk, amelyek 10 illetve 40 mg/kg per os dózisban szignifikánsan mérsékelték a mechanikai hiperalgéziát. Jelenleg a TRPV1 receptor antagonisták vizsgálata folyik ebben az új modellben is. A lehetséges mellékhatás elkerülése céljából, a TRPV1 antagonisták potenciális hipertermiát kiváltó hatásának felderítésére magatartási hôszabályozási tesztet állítottunk be. A környezeti hômérséklet-preferencia (30 C vs 35 C) alapján a melegérzet károsodását bizonyítottuk a hipertermiát kiváltó referencia anyagoknál (AMG9810, BCTC), de az SB elôkezelést követôen az állatok a kontrollokhoz hasonlóan elkerülték a 35 C-os környezetet. Eredményeink igazolják, hogy ez a mellékhatás nem szükséges velejárója a potenciális fájdalomcsillapító hatásnak és az újonnan szintetizált vegyületeknél is elkerülhetô ez a mellékhatás. Az elôzô ciklusban target validálási célból megkezdtük egy RNS interferencián alapuló TRPV1 knock-down patkány modell kifejlesztését. Bár, in vitro izolált TRG idegsejteken sikerült sirns alkalmazásával a TRPV1 receptor expresszióját csökkenteni, azonban in vivo intrathecalis alkalmazás során az sirns hatástalannak bizonyult. Ezért áttértünk egy más megközelítésre és más laboratóriumokkal kollaborációban elkezdtük egy transzgenikus TRPV1 knock-down patkány törzs kifejlesztését. TRPV1 receptor mrns elleni shrns-ek kifejezô vektorokat készítettünk és in vitro sejteken teszteltük ôket hatékonyság szempontjából. A leghatékonyabb shrns szekvenciát lentivirus vektorba építettük és a virus részecskéket patkány zigótába mikroinjektálva transzgenikus patkányokat készítettünk. Bár az eddig vizsgált 17 újszülött patkány egyike sem hordozta még az shrns transzgént, reményeink szerint a továbbiak között lesznek a TRPV1 receptorra kock-down transzgenikus állatok. További lépések A validált vegyületek alapján gyógyszerjelölt molekulacsoport kiválasztása originális gyulladásgátló és fájdalomcsillapító gyógyszer fejlesztése céljából. A bevezetett új módszerek felhasználása a RG által fejlesztésre kerülô egyéb targenteken ható gyógyerjelöltek tesztelésénél altéma: Központi idegrendszeri gyógyszer-targeteken ható endogén és exogén anyagok kutatása (Témavezetô: Dr. Lénárd László) részfeladat: Komplex magatartási-neurokémiai kutatások; integratív vizsgálati protokoll kidolgozása (Témafelelôs: Dr. Lénárd László) részfeladat: Mikroelektrofiziológiai-neurokémiai-magatartási kutatások; KIR-i hatóanyagok vizsgálatára alkalmas tesztrendszer kidolgozása (Témafelelôs: Dr. Karádi Zoltán) Résztvevôk Dr. Lénárd László akadémikus, egyetemi tanár Dr. Karádi Zoltán egyetemi tanár Berta Beáta egyetemi tanársegéd Dr. Gálosi Rita egyetemi adjunktus Dr. László Kristóf egyetemi tanársegéd Dr. Nagy Bernadett állami ösztöndíjas doktorandusz Petykó Zoltán MTA munkatárs Dr. Szalay Csaba egyetemi tanársegéd Takács Gábor egyetemi tanársegéd Tóth Attila egyetemi tanársegéd Dr. Tóth Krisztián egyetemi tanársegéd 12

13 Áttekintés, cél 1.1. É VES J ELENTÉS 2008 Az Élettani Intézet és az MTA- Idegélettani Kutatócsoport munkássága régóta a homeosztázis fôbb mûködésének, központi szabályozásának sokrétû vizsgálatára összpontosul. A jelen kutatási program célja a technikai-módszertani fejlesztésekkel a vonatkozó elméleti ismeretek bôvítése, központilag ható molekulák agyi támadáspontjának azonosítása, lehetséges új gyógyszer-targetek feltárása. Elvégzett tevékenység, eredmények Az alprogram megvalósításának harmadik évében a projekt infrastrukturális és technikai feltételeinek kiteljesítésén túl az elvégzett munka döntô részét a már korábban megkezdett komplex elektrofiziológiai, neurokémiai és magatartási vizsgálatok folytatása, illetve újabb, célirányos rhesus majom funkcionális MRI kísérletek elindítása képezte. Mindezek révén nemcsak tovább vittük a homeosztatikus élettani mûködési sajátosságok központi idegrendszeri szabályozásának, az abban érintett sejtszintû hatásoknak in vivo körülmények közötti feltárását, integratív szemléletû tanulmányozását, hanem egyúttal kitûzött céljaink többségét is sikerült megvalósítanunk. Neuropeptidekkel kapcsolatos kísérleteinkben folytattuk a ghrelin és a neurotenzin hatásának többrétû vizsgálatát. A ghrelin (GHR) i.p., i.c.v. vagy közvetlen intrahipotalamikus injekciója fokozza a táplálékfelvételt és hatással van a vércukorszintre. Jelen ismereteink szerint ezen hatásait növekedési hormon szekretagóg receptorokon (GHSR) keresztül fejti ki. Az elôzô évben megkezdett kísérleteinkben igazoltuk, hogy az amigdala magcsoport bazolaterális magjába (ABL) mikroinjektált GHR a folyékony táplálék felvételének redukcióját eredményezi. Az idei évben kimutattuk, hogy GHSR antagonista megakadályozza a GHR mikroinjekció tápfelvételt csökkentô hatását. Intraamigdaláris GHR kezelésben részesült hím Wistar patkányok metabolikus paramétereit kontrollokkal összehasonlítva mértük a pályázati támogatással beszerzett ARKRAY SPOTCHEM EZSP 4430 készülék ill. Elite 2000, Bayer glukométer segítségével ng GHR kétoldali, ABL-ba irányuló mikroinjekcióját követôen a HDL- és a teljeskoleszterin szint csökkene, valamint a szérum húgysav koncentráció emelkedése jött létre. Sem az 50, sem pedig a 100 ng GHR intraamigdaláris mikroinjekciója nem befolyásolta a szérumban mérhetô összfehérje és triglicerid koncentrációt. Figyelemreméltó, hogy 100 ng GHR bejuttatását követôen: a mikroinjekció utáni 10. és 20. percben a vércukorszint szignifikáns emelkedését tapasztaltuk. A multibarrel mikroelektroforetikus technikával végzett elektrofiziológiai vizsgálatainkban igazoltuk, hogy a GHR közvetlenül befolyásolja az ABL idegsejtjeinek mûködését, s többek között izoláltunk olyan glukóz-monitorozó neuronokat, amelyek mûködését a GHR gátolta. Neurotenzinnel (NT) folytatott magatartási kísérleteinkben az amigdala centrális magjába (AMC) mikroinjektált neuropeptid fokozta a helytanulást Morris-féle úsztatási tesztben. Helypreferencia tesztben a NT pozitív megerôsítô hatásúnak bizonyult, és fokozta a memóriát passzív elhárító szituációban. Ezeket a hatásokat neurotenzin-1 receptor antagonista, és a dopamin D2-receptor antagonista szulpirid is kivédte. Adataink szerint a neurotenzin nem fokozza a motoros aktivitást open field tesztben és nincs szorongás fokozó vagy szorongás gátló hatása emelt keresztpalló tesztben. Multibarrel technikával végzett mikroelektrofiziológiai kísérleteink adatai szerint a NT befolyásolja az AMC idegsejtjeinek aktivitását. Izoláltunk olyan sejteket is, amelyek mind neurotenzinre, mind dopaminra facilitációval válaszoltak, így adataink neuronális szinten igazolják a neurotenzin dopamin interakciók létezését. Korábbi kísérleteinkben bebizonyosodott, hogy a limbikus rendszerben a kettôs katecholamin, dopamin (DA) és noradrenalin (NA) végzôdéseket tartalmazó agyterületek (amygdala, nukleusz akkumbensz, stb.) lézióit követô testtömeg változások és táplálkozási zavarok a lokális DA/NA arány függvényei. Nem volt ismert ugyanakkor, hogy a mediális prefrontális kéreg (mpfc) katekolaminergiás terminálisait érintô neurokémiai léziók befolyásolják-e a testsúlyszabályozást. Ezért Wistar patkányokon a mpfc szelektív katekolamin lézióit követôen mértük az állatok testsúlyát és in vitro HPLC és elektrokémiai detektor segítségével meghatároztuk a DA, NA és metabolitjaik szintjét. Az elmúlt év novemberében izokratikus HPLC rendszerünket a pályázat segítségével kiegészítettük egy automata mintaadagolóval, ami jelentôsen növelte e vizsgálatok hatékonyságát. Eredményeink szerint 1) a NA rostok védelme mellett a DA végzôdések léziója fokozottabb testsúlycsökkenést okoz, mint a NA és DA végzôdéseket együttesen érintô, vagy a DA rostok védelme mellett elvégzett, NA végzôdéseket érintô lézióé; 2) a NA rostok védelme mellett a DA végzôdések léziója tápmegvonást követôen a kontrollokénál jobban fokozza a táplálékfelvételt és növeli a glukóz preferenciát vízzel szemben, illetve a 10 %-os glukóz oldat preferenciáját az 5 %-os oldattal szemben; 3) a fenti táplálkozási zavarok az éhség fokozásakor, megváltozott motivációs szintek esetén is jelentkeznek; 4) a szelektív katekolamin léziók hatékonyságát a neurokémiai mérési adataink egyértelmûen igazolják. A primer citokin interleukin 1beta (IL-1 ) nukleusz akkumbenszbe juttatása nyomán korábban feltárt táplálék- és folyadékfelvételi zavarok, testhômérséklet emelkedés és metabolikus deficitek mellett igazoltuk, hogy e kezelések a táplálkozási magatartásban alapvetô ízérzékelés kóros megváltozását is eredményezik. Hasonló, a ventromediális hipotalamusz magban folytatott vizsgálataink tanúsága szerint a tápláló-kellemes ízekre mutatkozó hedonikus válaszkészség IL-1 mediálta neuronális folyamatok révén valósul meg. Laboratóriumi patkányban és rhesus majomban a multibarrel mikroelektroforetikus technikát felhasználó komplex mikroelektrofiziológiai kísérletek során folytattuk a jutalmazó-motivációs mûködésekben alapvetô szerepet játszó limbikus elôagyi struktúra, a nukleusz akkum- 13

14 bensz glukóz-monitorozó idegsejtjeinek funkcionális jellemzését, melyet kiterjesztettünk a prefrontális-orbitofrontális kéregre is. Ezen utóbbi területeken az idegsejtek jelentôs hányadában rávilágítottunk a dopaminergiás neurotranszmisszió D1- és D2-receptor mediálta folyamataira, továbbá táplálék vagy azonos és ellenkezô nemû konspecifikus egyedek felismeréséhez kötött kategória diszkriminációs tanulási feladat végrehajtásával összefüggô jellemzô aktivitás változásaikra. A fôemlôs neurofiziológiai kutatásokban új távlatokat nyitó modern képalkotó eljárások elônyeit kihasználva, rhesus majomban végzett fmri vizsgálatainkban intravénás cukorterhelést követô vércukorszint változásokkal korreláló szignifikáns aktivációt figyeltünk meg a hipotalamuszban, az amigdalában és a prefrontális-orbitofrontális kéregben. Továbblépés Kutatásaink nyomán a táplálkozás és a metabolizmus, központi idegrendszeri szabályozásának a mediátor hátterérôl, továbbá a gyulladásos citokin (IL-1ß) nyertünk új ismereteket patkányon és rhesus majmon. Mindezek alapján a vizsgálatok folytatása révén elhízás elleni, esetleg idegrendszeri gyulladásos folyamatokat befolyásoló gyógyszer-targetek feltárásához is közelebb kerülhetünk altéma: Szélesspektumú analgetikus és gyulladásgátló gyógyszerjelöltek fejlesztése: TT-232 nem-peptid követô molekulák kötôdési és hatástani vizsgálata (Témavezetô: Dr. Pintér Erika) Résztvevôk Dr. Pintér Erika egyetemi docens Dr. Szolcsányi János akadémikus, egyetemi tanár Dr. Szûts Tamás ügyvezetô igazgató Biostatin Kft. Dr. Helyes Zsuzsanna egyetemi docens Dr. Kéri György tudományos igazgató Biostatin Kft. Dr. Bánvölgyi Ágnes tudományos munkatárs Dr. Ôrfi László vegyész, tanácsadó Biostatin Kft. Dr. Sándor Katalin tudományos munkatárs RET álláson Hegedûs Zoltán projekt menedzser Biostatin Kft. Dr. Elekes Krisztán tudományos munkatárs RET álláson Bagoly Teréz, vegyész RET álláson Dr. Hirné Perkecz Anikó laboratóriumi operátor Dr. Olasz Istvánné asszisztens RET álláson Elôzmények, célok, rövid áttekintés A TT 232 stabil szomatosztatin analóg kiemelkedôen szélesspektumú analgetikus és gyulladásgátló hatással rendelkezik, de p.o nem szívódik fel. (Helyes Zs. et al. Drugs of the Furure (2005) 30:558, Pintér et al. Pharmacol. Ther (200) 112;440) 2008-ban a 3 lehetséges nem-peptid jelölt közül (Biostatin-1403, Biostatin-1404, Biostatin-1408) a BST-1403-mal folytattuk preklinikai vizsgálatainkat, mivel farmakodinámiai és stabilitási paraméterei miatt ez tûnt a legalkalmasabb vezetô molekulának, per os adagolás mellett. Célkitûzések 1. a szükséges anyagmennyiség elôállítása, szintézissel 2. gyártási elôirat elkészítése 3. formulálási problémák megoldása 4. akut toxikológiai vizsgálatok elvégzése 5. farmakokinetikai paraméterek meghatározása patkányban. a farmakológiai hatás bizonyítása akut és krónikus gyulladás-modelleken patkányban és egérben 7. a molekuláris hatásmechanizmus felderítése Elvégzett tevékenység, fontosabb eredmények: A Biostatin Kft. az alábbi vizsgálatokat koordinálta: Elsô lépésben a szükséges alapanyag mennyiség biztosításához a szintézis méretnövelését kellett megoldani. Ez megtörtént, de az alkalmazott eljárás folyamatában keletkezett szennyezés eltávolítása problémát okozott, ami kérdésessé teszi a további méretnövelés lehetôségét, esetleg új szintézis-utat kell keresni. 14

15 1.2. É VES J ELENTÉS 2008 Elkészült az anyag gyártási elôirata és meghatároztuk a fiziko-kémiai jellemzôket. A formulálás megoldásához az oldhatósági problémát kellett leküzdeni. A metilcellulózos szuszpenzió bizonyult alkalmasnak. Megtörtént az anyag akut toxikológiai vizsgálata. E szerint a jelenleg érvényes nemzetközi norma szerinti vizsgálat során a legmagasabb 2000 mg/ts kg dózis esetén sem történt elhullás, sem a kezeléssel kapcsolatos patológiai vagy viselkedési elváltozás. Vérszint mérésekkel vizsgáltuk az anyag dózisfüggését, és a vérbôl történô gyors 12 órán belüli eltûnését. Nem várt módon a nôstény patkányokban azonos dózis adagolásával kétszeres vérszintet találtunk. Meghatároztuk a fô metabolitot, ami dezacetilezéssel keletkezô primer amin. Dóziskeresô vizsgálat patkányokon: A patkányok a 14 napon át per os adagolt 10, 50, 250 mg/kg/nap tesztanyagot jól tolerálták, nem volt észlelhetô toxicitás. Irwin teszt patkányokon: Nem tapasztalható biológiai jelentôségû viselkedési változás. Micronucleus teszt egéren: A tesztanyag nem váltott ki biológiailag jelentôs változást a hím egerek polikromatikus vörösvérsejtszámában 500, 1000 és 2000 mg/kg p.o. dózisok esetén. Croton olajjal kiváltott fülduzzadás egéren: A tesztanyag p.o. adagolva 0,2, 1,0 and 5,0 mg/kg dózisban, dózisfüggôen csökkentette a croton olaj kiváltotta fülduzzadást, a diclofenac-kal (3,0 mg/kg p.o.) hasonló mértékben. Hot plate teszt egéren: Sem a tesztanyag (0,2, 1,0 and 5,0 mg/kg p.o.), sem a diclofenac (3,0 mg/kg p.o.) nem volt hatással a latencia idôre, egyik sem váltott ki antinociceptív hatást az alkalmazott dózisokban, hím egereknél. Kollagén által kiváltott krónikus artritisz egéren, terápiás vizsgálat: A tesztanyag 1,0-5,0 mg/kg p.o. dózisai mérsékelten gátolták a lábduzzanatot (40 %, p<0,05), de összességében nem gátolták a kollagén kiváltotta artritisz kialakulását hím egerekben. A diclofenac 3,0 mg/kg p.o. dózisban gátolta az artritisz kialakulását (total score: 0 %), de a hatás nem szignifikáns. A laboratóriumaiban az alábbi munkákra került sor: Carrageninnel kiváltott gyulladás, hyperalgesia és allodynia: A BST-1403 (100 µg/kg i.p.) nem befolyásolta számottevôen a CD1 egerekben a carrageeninnel kiváltott lábduzzadást, mechanonocicepciót és a gyulladásos fájdalom okozta nehézkedési eltérést. Mustárolajjal indukált fülödéma egérben: A BST-1403 (100 µg/kg p.o.) jelentôsen csökkentette az 1% mustárolajjal kiváltott fülduzzadást a C57BL/ típusú vad egerekben, míg szomatostatin 4 receptorgén (sst4) hiányos knockout egerekben nem hatott. Traumás mononeuropathia model (Seltzer) patkányban: A BST µg/kg dózisban nem dózisfüggô módon, de szignifikánsan csökkentette traumás mononeuropathia modellben az ideglekötés következtében kialakuló mechanonociceptív küszöbcsökkenést (hiperalgézia) és az érintési érzékenység csökkenését (allodynia) Wistar patkányokban. LPS- és PMA-indukálta interleukin termelés izolált pertoneális makrofágokból: A BST-1403 nem gátolta számottevô módon a lipopoliszachariddal (LPS) illetve forbol-myristat-13-acetáttal (PMA) kiváltott interleukin termelést CD1 egerek izolált peritoneális makrofágjaiból. 15

16 Freund-adjuvánssal kiváltott krónikus gyulladás patkányban: A BST-1403 Freund adjuvánssal kiváltott krónikus artritisz modellben szignifikánsan csökkentette a mechanikai hiperalgéziát és a lábduzzadás mértékét Lewis patkányokban. G-protein-aktivációs vizsgálat: a leszorításos kötôdési vizsgálatokkal nem tudtuk igazolni a BST-1403 kötôdését az sst4 receptort expresszáló validált CHO sejtvonalhoz, alloszterikus aktivációt feltételeztünk. Mivel az sst4 receptor a Gi-protein-függô családba tartozik, elvégeztük a G-protein-aktivációs vizsgálatot. A BST-1403 minden vizsgált koncentrációban aktiválta a G-proteint, teljesen hasonló mértékben, mint az sst4 superagonista referencia szer a J-215. További lépések: A Biostatin-1403 hatásosnak bizonyult különbözô akut és krónikus gyulladásos és fájdalom modellekben. Szignifikánsan gátolta a gyulladásos folyamatok neurogén komponensét is. Bár hatékonysága általában nem haladta meg a referens anyagét, kedvezô mellékhatás profilja szempontjából javasolható a klinikai fázis megkezdése. Nem optimális farmakokinetikai és gyártási tulajdonságai miatt azonban folyamatban van új potenciális vezetô molekulák szintézise és tesztelése is. Ezek alapján történik döntés a legmegfelelôbb vegyület kiválasztására és a preklinikai dosszié összeállítására altéma: -PannonPharma együttmûködés új gyógyszerkészítmények bevezetése, iparjogvédelem megszerzésére részfeladat: Kis- és normál dózisú COX-1-gátló- és capsaicin-tartalmú orális készítmény/készítmények kifejlesztése kardiológiai és mozgásszervi betegek kezelésében, a COX-1-gátlók gyomorkárosító mellékhatásának kivédése céljából PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Résztvevôk Dr. Mózsik Gyula egyetemi tanár Dr. Past Tibor ny. tud. fômunkatárs Dr. Dömötör András Ph.D rezidens Dr. Perjési Pál egyetemi docens Pallos J. Péter igazgató PannonPharma Dr. Szabó Leventéné vegyésztechnikus Kuzma Mónika gyógyszerész Ph.D Fodor Krisztina egyetemi tanársegéd Vas Viktória humánszervezô I. Capsaicin Célok: Capsaicin tartalmú orális készítmények kifejlesztése, engedélyeztetése cardiológiai és mozgásszervi betegek részére. A 2008-as évben elvégzendô munka célja az volt, hogy az új termékeket emberben való alkalmazásának hatóság általi engedélyezéséhez a szükséges kiegészítô 1

17 1.4. É VES J ELENTÉS 2008 vizsgálatokat elvégezzük és a dokumentációt az Országos Gyógyszerészeti Intézethez beadjuk. Végsô cél az, hogy a korábbi humán vizsgálatokban bizonyított hatást a forgalomba hozandó új formulációval elôállított készítménnyel is elvégezzük és a termékek fejlesztését befejezzük. 1. Négy gyógyszer készítmény kifejlesztése: Capsaicin tabletta, Capsaicin+ ASA tabletta, Capsaicin+ Diclofenac tabletta, Capsaicin+ Naproxen tabletta, 2. Kifejlesztett és validált módszerek a gyógyszerhatóanyagok mérésére, valamint biológiai mintákból való mérésére: 1. GC-MS gázkromatográfiás módszerek kidolgozása capsaicinoidok kémiai meghatározására a módszer validálása ( Gyógyszerész Kémiai Intézet) 2. HPLC-DAD diódasoros detektálással kapcsolt nagynyomású kromatográfiás módszer capsaicin meghatározására és a módszer validálása ( Gyógyszerész Kémiai Intézet) 3. HPLC-FLD fluoreszcencia detektálással kapcsolt nagynyomású folyadék kromatográfiás módszer kialakítása és a módszer validálása ( Gyógyszerész Kémiai Intézet) 4. az 1-3 módszerek alkalmazása kémiai analízisre valamint biológiai mintákból történô mérésre plasmából ( Gyógyszerész Kémiai Intézet) 5. LC-MS Liquid kromatográfiás és tömegspektrográfiás módszer beállítása és validálása capsaicin biológiai mintákból (kutya plasma) való meghatározására ( TTK Analitikai és Környezeti Kémiai Tanszék, Központi Kémiai Kutató Intézet Budapest). TLC Vékonyréteg-kromatográfiás módszer beállítása és validálása a capsaicin hatóanyag azonossági vizsgálata (USP 29) és gyógyszerformából történô capsaicin hatóanyag meghatározása nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel ( Gyógyszerész Kémiai Intézet) 7. Itraconazole meghatározás különbözô kémiai módszerek beállítása és validálása (HPLC-s módszerek) ( Gyógyszerész Kémiai Intézet) 3. A Beagle kutyák krónikus capsaicin kezelése során a capsicin, illetve capsaicinoidok kinetikai vizsgálatát elvégezte a Gyógyszerész Kémiai Intézet. A Gyógyszerész Kémiai Intézetben végzett (GC, HPLC) mérési módszerekkel, az irodalom alapján várhatóan, egyetlen capsaicin dózis alkalmazása után sem tudtunk a kutya plazmából capsaicint illetve capsaicinoidot kimutatni. (2008) 4. A capsaicin illetve capsaicinoidok GC és HPLC mérési módszerek eredményei alapján végeztünk LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) vizsgálatokat, amelyek a kutyákból a legnagyobb dózisban alkalmazott capasicin után sem sikerült a kutyák plazmájából mérhetô capsaicin illetve capsaicinoid szintet meghatározni. Ugyanakkor a teszt oldatokba alkalmazott capsaicin mennyiségeket nagyon jól lehetett detektálni a fg-os tartományban is. (2008) 5. Humán fázis I és II vizsgálatok elôkészítése az OGYI-val történt elôzetes egyeztetések alapján A capsaicin toxikológiai vizsgálatok eredményeirôl illetôleg az idôközben a capsicin + nonsteroid gyulladáscsökkentôk és az itraconazole humán fázis I és II vizsgálatok végleges protokolljainak elkészítésére a Gooodwill Research LTD-vel együttmûködve került sor. A humán fázis I és II vizsgálatok engedélyezéséhez a dokumentációt 2008 decemberében a KEOB-hoz és az OGYI-nak leadtuk.. A Gyógyszerész Kémiai Intézet GLP (GMP) akkreditációs kérvénye a hatósághoz beadva 2008 október 18-án. (ikt sz.: 14/2008) Résztvevô kutatóhelyek 1. Gyógyszerész Kémiai Intézet 2. TTK Analitikai és Környezeti Kémiai Tanszék 3. TTK Szervetlen Kémiai és Technológiai Tanszék 4 Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet 5. I. sz. Belgyógyászati Klinika. PannonPharma Kft, Pécsvárad 7. Központi Kémiai Kutató Intézet, Budapest 17

18 Validált kémiai protokollok: Boros B., Dörnyei Á., Felinger A.: Determination of kapszaicin and dihydrokapszaicin in dog plasma by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (Analytical method report) TTK Analitikai Kémiai Tanszék, Pécs (2008) Kuzma M., Boros B., Perjési P.: Determination of capsaicin and dihydrocapsaicin content of Capsaicin Natural USP 27 by HPLC-DAD method (Modification of the USP30-NF25 Method) Vizsgálati protokoll. ÁOK Gyógyszerészi Kémiai Intézet, Pécs (2008) Kuzma M., Fodor K., Boros B., Past T., Perjési P.: Determination of capsaicinoid content of solutions of Capsaicin USP 27 by HPLC- DAD method (Modification of the USP30-NF25 Method). ÁOK Gyógyszerészi Kémiai Intézet, Pécs (2008) Kuzma M., Fodor K., Boros B., Perjési P.: Determination of capsaicinoid content of Capsaicin Natural USP 27 by HPLC-FLD method. Vizsgálati protokoll. ÁOK Gyógyszerészi Kémiai Intézet, Pécs (2008) Kuzma M., Fodor K., Boros B., Past T., Perjési P.: Determination of capsaicin and dihydrocapsaicin content of dog s plasma by HPLC- FLD method. Vizsgálati protokoll. ÁOK Gyógyszerészi Kémiai Intézet, Pécs (2008) Mózsik Gy., Past T., Perjési P., Szolcsányi J.: Determination of kapszaicin and dihydrokapszaicin content of dog s plasma by HPLC- FLD method. In.: Mózsik Gy., Past T., Perjési P., Szolcsányi J.: Original Reports on Toxicology of Kapszaicin VII. 8-Day Oral Toxicity Study of Test Item Kapszaicin Natural USP 27 in Beagle Dogs (Final Report). LAB International Research Centre Hungary Ltd. Veszprém by the date of final report 13 June Study Code: 07/49-100K pp in text and 190 pages in Appendices. (Appendix 2.11) pp.1-37 (2008) PANNONPHARMA KFT. Résztvevôk Pallos József Péter ügyvezetô igazgató Dr. Sárospataky Ilona orvos igazgató Lahner Marianna törzskönyvezési és fejlesztési vezetô Dr. Blazics Gyula minôségbiztosítási igazgató Máté Márta termelési vezetô Csaba János MEO laboratórium vezetô Feiszt Péter minôségbiztosító biológus Dr. Füredi Réka fejlesztô orvos Horváth Eszter analitikus Kiss Katalin törzskönyvezési munkatárs, fejlesztô biomérnök Pénzes Ágota fejlesztô biológus Seffer Dénes külsô gyártás vezetô, fejlesztô biomérnök Sefferné Szalai Mária fejlesztô biomérnök Cél Orális, hatóanyagként capsaicint tartalmazó készítmény kidolgozása, iparjogvédelmi oltalom nyerése a készítmény(ek)re, a készítmények törzskönyvezésének elôkészítése Elvégzett tevékenységek, fontosabb eredmények A capsacin készítmény elôállítása a PannonPharma feladata. A protokollok alapján a capsaicin filmtabletta mellett acetilszalicilsav, naproxen és diclofenac hatóanyagú vizsgálati készítmények gyártásának a kidolgozása is megkezdôdött. A PannonPharma a forgalomba hozatali engedély jogosultja a naproxen hatóanyagú Napmel 500 mg tablettának, valamint a diclofenac hatóanyagú Diclomel SR 100 retard tablettának, így ezen készítmények esetében egyedül a gyártások pécsváradi telephelyen történô megvalósítását végeztük el. A capsaicin és acetilszalicilsav tartalmú készítmények elôállítása azonban a teljes gyógyszerfejlesztési folyamat véghezvitelét igényelte. 18

19 Capsaicin 0,4 mg filmtabletta 1.4. É VES J ELENTÉS Hatóanyag ben a capsaicin natural USP hatóanyag analitikai ellenôrzô vizsgálatait a ÁOK Gyógyszerészi Kémiai Intézettel a PannonPharma (PPh) Minôségellenôrzési Laboratóriuma végezte. A dokumentumok azonosítószáma: PPD32SP3 és PPD32AE3, a beszerzett hatóanyag (Ashian Herbex Ltd.) kiegészítô stabilitás vizsgálatai az ICH követelmények alapján (Stabilitásvizsgálati terv azonosítója: PPD_ST_3_2_08). 2. Gyógyszerkészítmény elôállítása 2.1 A 2007-ben kidolgoztuk a capsaicin tartalmú tabletta elôállítási technológiáját. A capsaicin rendkívül irritáló tulajdonsága miatt a tablettát filmbevonattal kell ellátni ban beindítottuk a kísérleti bevonóüzemet, ahol elvégeztük a filmbevonás technológiai fejlesztését és elôállítottuk a capsaicin 0,4 mg filmtablettát. Az üzemi gyártás során a hatóanyag irritatív tulajdonsága miatt rendkívül nagy gondot kell fordítani a munkavédelemre. 2.2 A filmtablettákból 10 db-os bliszteres (bubrékfóliás), valamint barna üvegfiolás kiszerelési egységeket készítettünk. 3. Gyógyszerkészítmény analitikai vizsgálata Kidolgoztuk a gyártási folyamat köztitermékére (tabletta mag) és a késztermékre vonatkozó specifikációkat (PPD31SP137, PPD30SP137), valamint az analitikai ellenôrzô vizsgálatokat tartalmazó elôiratokat (PPD31AE137, PPD30AE137). A hatóanyag tartalom meghatározására validálási tervet dolgoztunk ki (PPD34VTM032). 4. Stabilitásvizsgálatok A filmtabletta mindkét kiszerelési egységébôl a stabilitásvizsgálat a ( hónapos tárolás 25 C-on), a bevont tabletta esetében az eddig eltelt (1 hónap) idô alatt stabilnak bizonyult. Acidum acetylsalicylicum 500 mg tabletta 1. Hatóanyag A készítmény elôállításához direkt préselhetô acetilszalicilsav hatóanyagot választottunk, melyet a PannonPharma által minôsített beszállítótól vásárolunk. Kidolgoztuk a hatóanyag PannonPharmánál történô minôsítô vizsgálatait (PPD32SP370, PPD32AE370). 2. Készítmény gyártása 2.1 Kidolgoztuk a tabletta gyártási technológiáját, mely egy nagyon egyszerû és költséghatékony direktpréseléses elven alapszik, nem igényli környezetkárosító szerves oldószerek felhasználását. 2.2 A tablettákból 10 db-os bliszteres (bubrékfóliás) kiszerelési egységeket készítettünk. 3. Késztermék ellenôrzése 3.1 A készítmény elfogadási paramétereit meghatároztuk (PPD30SP139), az ellenôrzésükre szolgáló analitikai eljárásokat kidolgoztuk (PPD30AE139). 3.2 ICH irányelveknek megfelelô módon összehasonlító kioldódás vizsgálatot végeztünk, mellyel igazoltuk, hogy a PannonPharma által gyártott Acidum acetylsalicylicum 500 mg tabletta és a Bayer gyártmányú Aspirin 500 tabletta kioldódási profilja hasonló, így in vitro vizsgálat alapján bioekvivalensnek tekinthetôk. 19