Élelmiszer-allergének mennyiségi meghatározása immunanalitikai módszerekkel- lehetőségek és korlátok

Átírás

1 Élelmiszer-allergének mennyiségi meghatározása immunanalitikai módszerekkel- lehetőségek és korlátok Bugyi Zsuzsanna, Török Kitti, Hajas Lívia, Tömösközi Sándor BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék Hungalimentaria Kockázatbecslés, önellenőrzés, élelmiszerbiztonság április 17. Budapest

2 Bevezetés ÉLELMISZERBIZTONSÁG Külső veszélyforrások ÉLELMISZEREKEL SZEMBEN JELENTKEZŐ KÁROS REAKCIÓK TOXIKUS (mindenkit érinthet) NEM TOXIKUS (csak az érzékeny egyéneket érinti) ELSŐDLEGES TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK MÁSODLAGOS TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK Immunmediált reakciók (ALLERGIÁK) Nem -immunmediált reakciók (INTOLERANCIÁK) Ortolani et al. 2001, Taylor et al. 2001, Jackson

3 Immunmediált reakciók összevetése IgE-mediált reakciók (klasszikus allergia) Sejt-mediált reakciók (pl. cöliákia) Glutén + Szöveti transzglutamináz Deamidált glutén/szöveti transzglutamináz + Antigénprezentáló sejtek Anti-glutén és antiszöveti transzglutamináz ellenanyagok és IgA + Aktivált T-sejtek Nyálkahártyakárosodás (Taylor et al. 2001) (Gendel et al. 2008) Tünetek Tej: pl. kazein, β-laktoglobulin, α- laktalbumin Tojás: pl. ovalbumin, ovomukoid, lizozim Búza: pl. glutén, albuminok, globulinok Búza: gliadinok KEZELÉS: DIÉTA 3

4 Az egyéni túlérzékenységi reakciókból fakadó kockázat kezelése KLINIKAI KUTATÁSOK FEHÉRJEKÉMIAI KUTATÁSOK Hatásmechanizmusok feltárása Kiváltó molekulák azonosítása Küszöbdózisok meghatározása Kiváltó fehérjék és epitópok jellemzése Fehérjék viselkedése feldolgozás során ANALITIKA SZABÁLYOZÁS 4

5 Szabályozási környezet 2000/13/EC, 2003/89/EC, 2006/142/EC, 2007/68/EC, R1169/ /2009 (Codex Stan rev. 2008) Glutént tartalmazó gabonák Rákfélék Tojás Hal Földimogyoró Szójabab Tej Diófélék + Zeller Mustár Szezámmag Csillagfürt Puhatestűek Kén-dioxid Gluténmentes: <20 ppm glutén Alacsony gluténszintű: ppm glutén Cöliákia Allergének Határérték nincs 5

6 Analitikai módszertan ELISA Meghatározandó molekula Validált és robosztus analitikai módszertan hiánya Kiváltó molekula, epitóp Egyéb fehérje Referencia anyagok és referencia módszerek hiánya Kiváltó fehérjék genetikaikörnyezeti variabilitása Módszerek közötti eltérések (célmolekula, ellenanyag, extrakció, stb.) Élelmiszer-mátrix és feldolgozás hatása AZ ANALITIKAI FELTÉTELRENDSZER FEJLESZTÉSE SZÜKSÉGES Képek: 6

7 Célkitűzések Referencia anyagok fejlesztése (tej, tojás, gliadin) A referencia anyagok és előállítási folyamatuk jellemzése Az ELISA módszerek teljesítményjellemzőinek meghatározása, összevetése és értelmezése A feldolgozási folyamat analitikai eredményekre gyakorolt hatásának vizsgálata és értelmezése Genetikai-környezeti variabilitás hatásainak vizsgálata és értelmezése Harmonizáció (szabályozás, módszerfejlesztés) A mérési bizonytalanság becslése 7

8 Anyagok és módszerek 1. Tej és tojás Recept kiválasztása Recept optimalizálása Homogenizálási módszer kidolgozása Glutén Összetevő Mogyoró-vaj keverék Búzaliszt Tiszta vaj Porcukor Sovány tejpor Só Szódabikarbóna Ammónium-hidrogén-szulfát Víz Összesen (Scaravelli et al. 2008) Tejpor (INSTANTPACK Kft.) Teljes tojáspor (Capriovus) Referencia tejpor (IRMM 380R) Referencia tojáspor (NIST SRM 8415) Modelltermékek (referencia anyag) előállítása Gliadin izolátum (Sigma G3375) Gliadin izolátum (PWG gliadin) (van Eckert et al. 2006) 8

9 Anyagok és módszerek 2. Tej és tojás Recept kiválasztása Recept optimalizálása Homogenizálási módszer kidolgozása Modelltermékek (referencia anyag) előállítása Analitikai vizsgálat (ELISA) Glutén ELISA összehasonlító vizsgálat Eredmények értékelése Kit Gyártó Ellenanyag BIOKITS Casein Assay Kit RIDASCREEN Fast Ei/Egg Protein RIDASCREEN Fast Ei/Egg Protein (módosított) Tepnel R-Biopharm R-Biopharm N.A. Poliklonális Poliklonális Meghatározási tartomány 1,6-25,6 ppm kazein 1-27 ppm tojásfehérje fehérje 0,5-13,5 ppm teljes tojáspor Kalibráló anyag NIST SRM8435 teljes tejpor N.A. NIST SRM8445 teljes tojáspor AgraQuant Gluten Assay Romer Labs N.A ppm glutén N.A. BIOKITS Gluten Assay Kit Tepnel monoklonális ellenanyag (401/21) Gliadin ELISA ELISA Systems N.A. HAVen Gluten-Check ELISA kit RIDASCREEN Gliadin Veratox Quantitative Gliadin Test Wheat protein ELISA kit (Gliadin) II Tej: Tepnel BIOKITS Casein Assay Tojás: R-Biopharm Fast Ei/Egg Protein ELISA Gliadin: R-Biopharm RIDASCREEN Gliadin ELISA Diagnostic Innovations R-Biopharm Skerritt&Hill R5 monoklonális 3-50 ppm glutén 2,5-25 ppm gliadin 7,5-120 ppm glutén Búzasikérextraktum N.A. N.A ppb gliadin PWG gliadin Neogen N.A ppm gliadin N.A. Morinaga N.A. 0,78-25 ng/ml búzafehérje NIST SRM- 1567a búzaliszt 9

10 Anyagok és módszerek 3. GLIADIN FORRÁSOK liszt egy búzafajtából lisztkeverék öt különböző búzafajtából kereskedelmi forgalomban kapható standard liszt PWG gliadin izolátum (van Eckert et al. 2006) 2 koncentrációszint: 10 és 50 ppm gliadin 3 ELISA kit: RIDASCREEN Gliadin (R-Biopharm) AgraQuant Gluten G12 Assay (Romer Labs) AgraQuant Gluten Assay (Romer Labs) GENETIKAI- KÖRNYEZETI VARIABILITÁS 10

11 Eredmények Referencia anyagok előállítása Glutén ELISA összehasonlító vizsgálat A feldolgozási folyamat hatásainak vizsgálata Genetikai-környezeti variabilitás hatásainak vizsgálata 11

12 Referencia anyagok előállítása, kísérletterv Hígító keverék TEJ és TOJÁS REFERENCIA ANYAG * Alapkeverék * * ELISA vizsgálat GLIADIN REFERENCIA ANYAG Száraz alapanyagok keveréke * * ELISA vizsgálat Gliadin oldat Hígított alapkeverék * Gliadinos porkeverék * Margarin, víz Margarin, víz Tészta Tészta Sütött modelltermék (3 koncentráció-szint, 3 sütés/koncentráció * Fagyasztva szárítás * Sütött modelltermék (3 koncentráció-szint, 3 sütés/koncentráció * Fagyasztva szárítás * 12

13 Glutén ELISA összehasonlító vizsgálat Ellenanyagok Extrakciós módszerek Kalibráló anyagok Gliadin izolátumok Élelmiszerminták 13

14 A feldolgozás hatásai TEJ TOJÁS Hődenaturáció Szerkezetmódosulás Kölcsönhatás mátrixkomponensekkel GLIADIN- 10 ppm GLIADIN- 50 ppm Oldhatóság Immunaffinitás 14

15 Fehérje-tartalom (%) Genetikai-környezeti variabilitás vizsgálatagliadin 1 Egy búzafajta Több fajta keveréke Standard liszt Szárazsikér-tartalom (%) Egy búzafajta Több fajta keveréke Standard liszt

16 Mért gliadin-koncentráció (ppm) Mért gliadin-koncentráció (ppm) Mért gliadin-koncentráció (ppm) Genetikai-környezeti variabilitás vizsgálatagliadin "A" ELISA kit Sütött termék "B" ELISA kit "C" ELISA kit Sütött termék 0 Sütött termék 16

17 Összegzés 1 IMMUNANALITIKA Lehetőségek Korlátokhibaforrások Valódi élelmiszerminták modellezése Határértékek pontosítása HARMONIZÁCIÓ 17

18 Összegzés 2 Meghatározandó molekula Ellenanyag Extrakciós módszer Gyártók Határértékek Új módszertan (pl. proteomika) Kutatás FOGYASZTÓ Hatóságok Küszöbdózisok Kiváltó molekula/epitóp GxE variabilitás Feldolgozás hatásai Klinikum 18

19 Köszönetnyilvánítás Tömösközi Sándor Török Kitti Hajas Lívia Allergén csoport Dr. Gelencsér Éva és Valentin Éva (KÉKI) MoniQA Allergén Munkacsoport Dr. Emmerich Berghofer (BOKU) MTA Agrártudományi Kutatóközpont Diagnostic Innovations, ELISA Systems, Morinaga, Neogen, Romer Labs, Tepnel MoniQA Kiválósághálózat (FOOD- CT ) "Minőségorientált, összehangolt oktatási és K+F+I stratégia, valamint működési modell kidolgozása a Műegyetemen" c. projekt (TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR ) Varga József Alapítvány, állami doktori ösztöndíj 19

20 Köszönöm a figyelmet! 20