A kapilláris elektroforézis (CE) technikái

Átírás

1 A kapilláris elektroforézis (CE) technikái dr. Szakács Zoltán ELTE TTK Kémiai Intézet ( ) vegyész szak (B.Sc.) műszeres analitika - elválasztástechnika

2 2. Elektroforézis, ionvándorlás (migráció) Anód Katód Elektroforézis: különböző ionok eltérő irányú v. sebességű elmozdulása, vándorlása (transzportja) folyadékban (vizes pufferben) elektromos tér hatására. Elektromos erő gyorsítja, U Fe = q E = ze0 l q : az ion töltése [C] z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1, C az elemi töltés E : elektromos térerősség [V cm 1] U : elektr.potenciálkülönbség [V] l: elektródok távolsága [cm] a közegellenállás ( súrlódás ) lassítja az iont: Fs = k η v 0 η : az oldat dinamikai viszkozitása (cp: 10-3 Pa s) v0: ion vándorlási sebessége [cm s 1] Stokes törvény (merev gömb, híg oldatban) Ellentétes irányú erők egyensúlya: Az ion vándorlási sebessége: k = 6π rh rh: az ion hidrodinamikai sugara [cm] q E = 6π η rh v 0 e0 z 1 v = E 6π rh η 0 [cm s 1]

3 3. Ionok abszolút elektroforetikus mozgékonysága Abszolút elektroforetikus mozgékonyság (mobilitás): 0 v e0 z 1 0 µ = = E 6π rh η [cm2 V 1 s 1] Az ionra jellemző, egyedi fizikai állandó (adott oldószerben és hőmérsékleten: η hőmérsékletfüggése: 2-3% / C!!) Arányos az ion fajlagos töltésével (z / rh) Végtelen híg oldatra extrapolált érték diffúziós együtth. (Nernst-Einstein) RT µ D= F z 0 [cm2 s 1] ion moláris fajlagos vezetése: λ0 = z F µ 0 [S cm2 mol 1] Kation H Li Na K NH4 krist. r ion / Å 0,76 1,02 1,38 1,45 Rb Cs (C3H7)4N 1,52 1,67 Mg2 Ca2 Sr2 Ba2 Fe2 Cu2 Ag Pb2 Al3 0,72 1,00 1,18 1,35 0,61 0,73 1,15 1,19 0,54 rh / Å μ / 10 cm V s 3,40 2,76 2,32 1,88 362,5 40,1 51,9 76,2 76,2 80,6 80,1 23,8 3,45 3,08 3,08 2,88 4,39 55,0 61,7 61,6 66,0 56,0 55,6 64,5 72,0 63,2

4 4. Az ion effektív elektroforetikus mozgékonysága A valóságban nem végtelenül híg pufferoldatban dolgozunk elektrosztatikus kcsh. ellenionok felhője (az ionatmoszféra) leárnyékolja az ion töltését, lassítja a migrációját ionatmoszféra sugara δ = κ 1 κ= F 2I ε RT δ = 30 nm pl. I = 0,1 mm r δ = 3 nm I = 10 mm (ld. elektrokémia: Debye, Hückel, nsager elmélete) Effektív elektroforetikus mozgékonyság δ = κ 1 e Q 1 µ = 0 eff 6π reff η [cm V s ] reff r δ : effektív ionsugár [cm] Qeff : az ion effektív töltése z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1, C az elemi töltés E : elektromos térerősség [V cm 1] U : elektr.potenciálkülönbség [V] - az ionra jellemző empirikus adat, az adott pufferoldatban mérhető mennyiség - becslésére léteznek félempirikus összefüggések

5 5. A ph-függő átlagos töltés kiszámítása (disszociáció) Q 0 Q = zha xha z A xa CH -0,5 0 10pK ph 1 Q= 10pK ph 1 pka -1 1 Q ph 11 Q = zh A xh A zh A xh A zha xha z A2 xa2 3 0,5 pk1 pi 0 C pK1 pk2 pk3 3pH 0 10pK2 pk3 2 ph 1 10pK3 ph 2 Q= 10pK1 pk2 pk3 3pH 10pK2 pk3 2 ph 10pK3 ph 1 izoelektromos pont NH3-0,5 3 pk2 H -1 pk3-1,5 H ph 11

6 6. Az elektroforézis története dióhéjban Hittorf, Kohlrausch, Hardy: fizikai-kémiai alapok (elektrolitok vezetése, átviteli szám, mozgó határfelület) Svedberg, Tiselius: moving boundary electrophoresis of proteins Tiselius: Nobel-díj (részben az elektroforézisért) papírelektroforézis, gélelektroforézis makrométerben (fehérjék, nukleinsavak) Jörgenson, Lukacs Hjertén, majd Karger Terabe Hjertén Knox, Grant Watarai kapilláris zóna elektroforézis (CZE) fused silica kapilláris kapilláris gél elektroforézis (CGE) micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) kapilláris elektrokromatográfia (CEC) mikroemulziós elektrokinet.kromatográfia (MEEKC) kereskedelmi CE készülékek & újabb detektorok fejlesztése CE rohamos elterjedése, alkalmazások százai, külön folyóiratok, konferenciák kereskedelmi mikrochip CE készülékek (mikrofluidika, lab-on-a-chip )

7 7. Joule-hő, konvekció hm-törvény Joule I. törvénye: áramvezetés során hő termelődik: P = I 2 R ( = U 2 / R = UI ) NR: nem redukáló, R: redukáló körülmények között térfogat: ml felület: cm 2 Joule-hő: 150 V * 30 ma = 5 W Elfo idő: 55min 3,5h 3,5h rekombináns heterodimer glikoprotein denaturálódása, bomlása térerősség: V cm 1 A nem megfelelő hőelvezetés hőmérséklet- és sűrűséggradienshez, konvekcióhoz, a szétválasztott zónák elmosódásához, keveredéséhez vezethet

8 8. Elektroforézis kapillárisban: hatékonyabb hődisszipáció Virtanen (1969), Everaerts (1970), Jorgenson & Lukacs (1981) üres olvasztott kvarc (bare fused silica) kapilláris fused silica térfogat: 2 8 µl jóval nagyobb ellenállás felület: 0,4-3 cm2 hatékonyabb hőelvezetés Joule-hő: 30 kv * 50 µa = 1,5 W térerősség: V cm 1 Ltot = cm poliimid bevonat (15 µm) hajlékony, flexibilis µm Inner Diameter µm uter Diameter jobb felület / térfogat arány nagyobb feszültség használata (kis térfogat) nagyobb térerősség gyorsabb, élesebb (nagyobb hatékonyságú) elválasztások

9 9. Töltött kapillárisfal elektroozmotikus áramlás (EF) δ = κ 1 x N Si H Gouy-Chapman réteg (külső határa a zeta-potenciál, ζ) itt még az ellenionok dominálnak Si H Stern réteg (ΨSt): merev, erősen adszorbeált ellenionokból N felületi negatív töltés (Ψ0): diffúz elektrokémiai kettősréteg: elmozdulhat ellenionok konc.gradiense a tömbfázisbeli értékig 1 kettősréteg vastagsága (Debye-length): κ 0,3 / Helmholtz-Smoluchowski egyenlet (1903): N Ψ0 ΨSt ζ potenciál I εζ µeo = 4πη ψ = ψ St e κ x Elektroozmózis: a diffúz réteg ellenionjai magával ragadják az oldat egészét (electroosmotic flow) és makroszkopikus oldatáramlást hoznak létre a kapillárisban (EF) (negatívan töltött szilikafelület esetén katódos irányú az EF) anód veo = µeo E katód

10 10. EF: dugószerű áramlási profil detektorjel HPLC: nyomás hajtotta eluensáramlás HPLC CE: elektrokinetikusan hajtott oldatáramlás CE: szűkebb zónák, éles csúcsok, ez a nagy hatékonyság egyik oka retenciós idő migrációs idő

11 11. Az EF sebességének szabályozása: a puffer ph-ja Si H a zeta-potenciál ph-függő: Si H pka ~ 3-5 µeo [10-5 cm2 V 1 s 1] veo = µeo E 60 fused silica veo = 2 mm s nl min 1 40 pyrex (egy adott kapillárisban) teflon veo = 0,2 mm s 1 50 nl min ph

12 12. Az EF szabályozásának további lehetőségei veo = µeo E = εζ E 4πη Változó Eredmény Megjegyzés Elektr. térerősség EF arányosan változik Joule-hőfejl. megnőhet Puffer ionerőssége (koncentrációja) Növelésével csökken a ζ-pot. és az EF Növelésével nő az áramerősség és a Joule-hő Szerves oldószerkomponens Csökkenti a ζ-potenciált viszkozitást és rel.permett.-t Komplex hatása van, általában EF csökken Tenzid hozzáadása Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób vagy ionos kcsh.-sal Anionos tenzid: EF nő Kationos tenzid: EF csökken szelektivitás! Semleges hidrofil polimer hozzáadása Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób kölcsönhatással Felületi töltés árnyékolásával csökkenti EF-et, növeli η-t Semleges polimer hozzáadása Növeli a viszkozitást a kapillárisfalnál pl. polivinilalkohol Kovalens borítás A kapillárisfal kémiai bevonata Sokféle lehetőség, stabilitás? Hőmérséklet Viszkozitás érzékenyen változik 2-3% / C Könnyű kontrollálni

13 13. A kapilláris elektroforézis (CE) készülék felépítése, működése detektor termosztát egység kapilláris Pt-Ir elektród /- 30 kv minta bemeneti (inlet) puffer nagyfeszültségű tápegység Pt-Ir elektród 0V kimeneti (outlet) puffer

14 14. Kereskedelmi CE készülékek

15 15. A CE általános jellemzői miniatürizált ( microscale ) elválasztástechnika, anyagtakarékos! vizes pufferoldatok (környezetbarát), UV átlátszóság ( nm érzékenység!) nincs külön detektorcella, on-column detektálás (kivétel: kapcsolt technikák) HPLC-nél több paraméter, gyorsabb módszerfejlesztés gyors analízis (mikrochipen még gyorsabb), kitűnő elválasztás nagyfokú automatizáltság, sorozatanalízisek lehetősége ugyanazon a készüléken többféle elvű elválasztási módszer megvalósítható: töltettel, hordozóval segített töltetlen kapillárisban CZE CITP ionok elválasztására MEKC CD-EKC CIEF CGE biomakromolekulák, oligomerjeik elválasztására MEEKC CEC semleges molekulák elválasztására

16 16. Kapilláris zóna elektroforézis Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Kationok és anionok elválasztása effektív mozgékonyságuk különbsége alapján (semleges molekulák elválasztására nem alkalmas) a legtöbb ionra: µ < µeo 10 animáció: Agilent CE promóciós anyagból

17 17. detektorjel Kationok és anionok teljes mozgékonysága: elektroforetikus EF szuperpozíciója elektroferogram electroosmotic hold-up time : teo tm : az ion migrációs ideje vtot = vep veo = Leff / tm veo = Leff / teo E = U / Ltot µeo = idő veo Leff Ltot = E teo U µtot = µ µeo = Leff Ltot Leff Ltot Utm Uteo az ion (kísérleti) elektroforetikus mozgékonysága: Leff: kapillárishossz injektálástól a detektorig [cm] Ltot: kapilláris teljes hossza = elektródok távolsága [cm] µ= Leff Ltot U 1 1 tm teo [cm2 V 1 s 1] IUPAC terminológia: Pure Appl. Chem. 2004, 76:

18 18. Mintadugó injektálása a kapillárisba - alapmódszerek Hidrodinamikus injektálás p Vákuum injektálás p vagy minta kimeneti puffer Gravitációs injektálás ( siphoning ) minta h kimeneti puffer Elektrokinetikus injektálás - U minta kimeneti puffer

19 19. Hidrodinamikus injektálás p minta injektált mintatérfogat: p nyomáskülönbség [Pa] t injektálás ideje [s] Hagen-Poiseuille egyenlet: 103 π d 4 Vinj = p t [ml] 128 Ltotη d Ltot η kapilláris belső átmérője [cm] kapilláris teljes hossza [cm] minta viszkozitása [cp = 10 3 Pa s] a leggyakrabban használt injektálási mód, a minta ionjaira nem diszkriminatív kapilláris gélelektroforézisben és mikrochipen nem használható pl. egy d = 75 µm, Ltot = 80 cm kapilláris teljes térfogata: hidrodinamikus injektálás 30 mbar 10 s az injektált mintadugó hossza: 3,5 µl 33 nl 16 mm (2%) 3-4%-nál hosszabb mintadugó injektálása már csúcsdiszperziót okozhat: σinj 33 nl injektálás 1 mm oldatból: 33 pmol ha Mt = 100: 3,3 ng

20 20. Kvantitatív analízis belső standard módszerrel CZE-ben a zónák különböző sebességgel haladnak át a detektoron csúcsterület normálása: A = A / tm a nanoliteres hidrodinamikai injektálás ismételhetősége a kapilláris elektroforézis módszerek validálásának egyik gyenge pontja belső standard (IS) hozzáadásával kiküszöbölhető kalibráló oldatokra mért adatpontok A x / A IS ismeretlen mintára kapott relatív csúcsterület és koncentráció leolvasása koncentrációx

21 21. Elektrokinetikus injektálás injektált x anyagmennyisége: κ d 2πUt nx = ( µeo BGE µ x ) cx 4 Ltot κ minta d: kapilláris belső átmérője [cm] U: injektálási feszültség [V] µeo: EF mozgékonyság a pufferben [cm2/vs] κbge: a puffer vezetőképessége [S/cm] kimeneti puffer [mmol] Ltot: kapilláris teljes hossza [cm] t: injektálás ideje [s] µx: x effektív mozgékonysága [cm2/vs] κminta: a minta vezetőképessége [S/cm] cx : x koncentrációja a mintában [mol/dm3] igen érzékeny injektálási mód (field-amplification, ld. sample stacking) kapilláris gélelektroforézisben vagy chip-en csak ez van mátrix torzítás (függés κminta-tól) diszkriminatív injektálás (csak kation/anion) nehéz a kvantifikálás (speciális külső v. belső standard kell) Külső standard módszer nyomanalízisre híg mintákból: A Gáspár, L Gábor, J. Chromat. A 2005, 1091, Univerzális belső standard kalibrálás: A Gáspár, E Dudás, J. Chromat. A 2006, 1110,

22 22. A kapilláris elektroforézis legfontosabb detektorai Detektálási módszer UV-látható fényelnyelés Fluoreszcencia Lézer-indukált fluorszcencia (LIF) Kimutatási határ Kimutatási határ 3 koncentráció (mol / dm ) -5-8 abszolút (mol) Előnyök / hátrányok ! kromofór csoport kell (>190 nm) vagy származékképzés DAD: korlátozott szerkezeti info! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés - drága Amperometria ! elektroaktív csoport kell! speciális hardver, kapilláris kell Vezetőképesség univerzális! speciális hardver, kapilláris kell Indirekt UV, fluoreszcencia, amperometria x rosszabb, mint a direkt Kapcsolt technikák (hyphenated techniques) Tömegspektrometria (ESI-MS) Mágneses magrez. spektroszkópia (NMR) kb univerzális univerzális szerkezeti információt nyújt (MSn ) - drága, problematikus legrészletesebb szerkezeti info - csak CH csoportokról - drága, keresked.nem elérhető

23 23. Megoldások az UV-érzékenység növelésére UV-detektor érzékenységi korlátja: optikai úthossz = kapilláris átmérője = µm megnövelt úthosszú kapillárisok (Agilent), minimális csúcsdiszperzió buborékcella 3-5 érzékenység Z-cella 10 érzékenység képek forrása: Agilent CE brosúrák

24 24. A CE nagy felbontása nagy hatékonyságán alapul Ürescső CE (Free Solution CE, pen Tubular CE) esetén a van Deemter egyenletben: B HETP = A Cu u A=0 mert nincs töltet, amelyben többféle útvonalon (multiple path) vándorolna az elválasztandó komponens C=0 mert nincs állófázis, amelybe fázistranszfer történhetne B>0 elvileg a hosszirányú (longitudinális) diffúzió a csúcsszélesedés (diszperzió) egyetlen forrása az EF éles, dugószerű profilja is alig szélesíti a csúcsokat a gyakorlatban számos tényező ronthatja a hatékonyságot: σ tot = σ long.diff σ inj σ temp σ wall σ σ -ads det EMD... EMD: electromigration dispersion (puffer ko-ion vezetőképessége...) σ tot

25 25. detektorjel Az elválasztás analitikai paraméterei σ w1/2 wa wb ta tb a (Gauss) csúcs std.deviációja: σ = longitudinális diffúzió dominál: idő w σ tot σ long.diff = 2 Dt = 2 D Leff Ltot ( µeo µ )U elméleti tányérszám: L2eff ( µ µeo )ULeff t2 N= 2 = = σ tot 2 DLtot w1 / 2 felbontás: 2 ( t B t A ) Δμ N Δμ R s= = w A wb 4 ( μ μeo ) μ μ eo > 10 5 is lehet!

26 26.A puffer ph megválasztására pk ismeretében (fford-görbék) a H3N pka HS H becsült µ eff = Q / M 2 / 3 fford-képlet a mozgékonyság becslésére 1,94 8,60 10,28 0,04 Cys 0,02 0 4,19 H BzH -0,02-0,04 H S <0 H NH2-0,06-0,08 1 H H Elektromigrációs diszperzió EMD!! ph PTS Cys 15 mm HCl BzH PTS Cys ph 8,3 puffer: 40 mm TRIS és 15 mm sav mm MES S N H becsült µ eff, Cl - 11 BzH H3C becsült µ eff, MES- PTS

27 Az elektromigrációs diszperzió (EMD) zónatorzítása a minta a puffernél: (jobban vezet) (azonos vezetőképességű) kisebb vezetőképességű zóna áramlási iránya koncentr.profil a mintadugóban (elektroferogramon ellentétes irányú torzulás) EF EF EF fronting tailing katód(-) detektor 27. kapilláris injektálás idő az elektroferogramon A puffer ko-ionjának effektív mozgékonysága legyen kb. azonos a mérendő ionokéval, különben azok csúcsalakja háromszög alakú torzulást szenved (minél jobban összemérhető a minta koncentrációja a pufferével, annál inkább jelentkezik ez a torzulás)

28 A CE-ben leggyakrabban használt pufferkomponensek NH2 - S H β-ala: 10,24 H3B3: 9,23 NH4: 9,25 H CHES: 9,55 H2N TRIS: 8,08 HEPES: 7,50 MES: 6,10 β-ala: 3,43 H3P4: 2,16 Ecetsav: 4,76 pka H2P4-: 7, N H NH H H H S N NH2 - S - Good típusú (biológiai) pufferek: kisebb vezetőképesség, de UV-elnyelés 210 nm-ig! ph

29 29. Mozgékony anionok elválasztása: az EF szerepe bemeneti puffer (inlet) anód µe µ app injektálás helye kimeneti puffer (outlet) katód µ µ EF detektor szokásos polaritás: a kapillárisfal negatív töltésű (disszociált SiH-csoportok), az elektroozmózist (EF) pozitív ionok hajtják (katódos EF) EF sebessége (mozgékonysága, µ): vef = µ EF E > 0 anion saját (elektroforetikus) sebessége: ve = µe E < 0 anion bruttó (látszólagos, apparent) sebessége: vapp = vef ve = ( µ EF µe ) E probléma kisméretű, mozgékony anionoknál µe > µ EF ha az anion nem a detektor felé vándorol, nem is halad át a detektoron! grafika: HP CE Partner

30 30. Mozgékony anionok elválasztása: az EF megfordítása bemeneti puffer (inlet) anód µe µ app kimeneti puffer (outlet) katód µ µ EF injektálás helye detektor a megoldás: az EF-et el kell nyomni (kapillárisfal borítása, coating) és polaritáscsere bemeneti puffer (inlet) katód kimeneti puffer (outlet) anód µ eff = µ app injektálás helye detektor vagy az EF-et meg kell fordítani (kapillárisfal borítása kationos tenziddel, CMC alatt!), ekkor az EF és az anion sebessége összeadódik, így az anion áthalad a detektoron: bemeneti puffer (inlet) katód grafika: HP CE Partner µ EF injektálás helye µ eff µ app detektor kimeneti puffer (outlet) anód

31 31. Növényi karbonsavak elválasztása oxálsav borkősav almasav citromsav borostyánkősav UV [mau] 75 µm fused silica 32 nl injektálás fordított polaritás -20 kv a negatív EF-et megelőzve jönnek a savanionok EF: kb. 5,3 perc Br - H3C H3C N CH3 CH3 indirekt detektálás UV, 210 nm koncentrációtart. 0,01-1 mm sav futtató puffer: 5 mm KHftalát (állandó UV elnyelés a pufferben) 20 mm N-morfolino-etánszulfonsav (MES), ph 5,3-ra titrálva NaH-dal 0,5 mm cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB, az EF megfordítására)

32 32. Enzimek CZE elválasztása borított falú kapillárisban bare (uncoated) fused silica = borítatlan falú szilika kapillárisban: borított falú kapillárisban: dinamikus: ikerionos puffer H-alkil-cellulóz... statikus: teflon

33 atenolol Nemvizes kapilláris elektroforézis (NACE): β-blokkolók elválasztása metanolban metabolitja 33. 0,5 ml szűrt humán vizeletminta, SPE (asis HLB) dúsítás, MeH lemosás, bepárlás BGE: 40 mm AcH/NaAc (pk 9,7); ph 8,9 58,5 (Ld=50) cm FS kapilláris (50 µm) std.minta: 10 µg/ml β-blokkolók MeH-ban minta: 0,5 ml metanolban elfo: 30 kv (10 µa), UV detektálás 200 nm spike: 20 µg/ml atenolol standard H Sirén, R Kuldvee, T Karla, T Ekström, ML Riekkola, J Chromat A 2005, 1068,

34 34. Izoproterenol enantiomerek elválasztása (CZE ciklodextrin királis szelektorral) * H H natív CD H H H RS H H H H hidroxipropil- H H H H H H H H H H H H béta-ciklodextrin dimetil- trimetilkét CD keveréke ( duál CD rendszer ) 50 mm foszfát/tea puffer, ph = 3,0; 30 kv H Godel, R Weinberger, HP Application Note, 1995, E.

35 35. A CZE összefoglalása: a pufferoldat (BGE) szerepe Megfelelő pufferkapacitás (>10 mm / ph) biztosítása: pka 1,5 < ph < pka 1,5 megfelelő koncentráció Koncentráció (tipikusan 5-50 mm): megfelelő vezetőképesség, de még nem túl nagy Joule-hő ionerősség: mm forrás: Gerd Vanhoenacker, Direkt UV detektálás esetén a puffer lehetőleg ne abszorbeáljon (akár nm!) Indirekt UV detektálás esetén abszorbeáló komponens is kell CE-MS esetén illékony puffer kell (ecetsav, hangyasav, ammóniumsók...) Szelektivitás növelése: EF elnyomás: szerves módosító (oldószer: MeH, ACN, iprh...) szelektív komplexképző királis szelektor... hidrofil polimer (pl. hidroxietil-cellulóz) vagy kationos tenzid (konc.<cmc) 0,05% polivinil-alkohol: viszkozitást növeli

36 36. Kapilláris izoelektromos fókuszálás Capillary Isoelectric focusing (CIEF) Makromolekulák (fehérjék, huminsavak...) elválasztása izoelektromos pontjuk (pi) szerint (S. Hjertén, 1985) Q 1 0,5 pi 0-0,5-1 -1, ph

37 37. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve I. Amfolit: több, különböző pka-jú csoportot tartalmazó molekula ( ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) ph A B C C A C A B borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) NaH kapilláris az EF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kv): ph-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás anód() H3P ph

38 38. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve II. Amfolit: több, különböző pk-jú csoportot tartalmazó molekula ( ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) ph borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) NaH kapilláris az EF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kv): ph-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás anód() H3P4 A 3 4 B 5 C ph kialakul a ph-gradiens ( steady state ), az áram minimális értékre csökken, a mintakomponensek izoelektromos pontjuk (pi) szerint fókuszálódnak

39 39. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve III. 3. A ph-gradiens mobilizálása: a fókuszált mintazónák áthajtása a detektoron A anód() H3P4 4 3 A B B 5 C ph 6 katód(-) H3P4NaCl C ph 3 elektroforetikus mobilizálás: pl. katód-elektrolitot ellentétes ph-jú pufferre cseréljük [H ] cnh3 = [H ] cc [H ] cnh3 = [H ] cc ccl-

40 40. Hemoglobin-rendellenességek klinikai szűrése 25 µm id borított kapilláris 2% amfolitkev. ph 3-10 fókuszálás 10 kv, 5 min mobilizálás 10 kv A0: normál humán Hb C, G, G2: mutáns hemoglobinok

41 41. Kapilláris gélelektroforézis Capillary Gel Electrophoresis (CGE) Nagymolekulák (biopolimerek) méret szerinti elválasztása Fehérjék analízise: pl. SDS-PA-CGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél gélelektroforézis) ligonukleotidok, DNS: pl. agaróz gélen és lineáris poliakrilamidon teljes Human Genome szekvenálása Capillary Array Electrophoresis

42 42. Kapilláris gélelektroforézis (CGE) Gél töltet a kapillárisban kusza, térhálós szerkezet, pórusokkal - kis méretű ionok (pl. pufferalkotók) zavartalanul átmennek a pórusokon - nagyobb ionok hidrodinamikai sugara összemérhető a pórusok méretével: a pórusok molekulaszűrőként viselkednek (gston-modell) méret szerinti elválasztás (oligonukleotidok) - nagyobb biopolimerek (denaturált DNS vagy fehérje) kígyózó, hüllőszerű mozgással (reptation) préselik át magukat a pórusokon méret (molekulatömeg) szerinti elválasztás - gél: antikonvektív közeg (diffúzió lecsökken) - kapillárisfal borítása (coating) EF is minimális kémiai gélek (térhálós polimerek, kémiai keresztkötésekkel, cross-links) - bele vannak polimerizálva a kapillárisba, jól definiált méretű pórusok - hőérzékeny, buborékképződés veszélye! pl. térhálósított poliakrilamid fizikai gélek (lineáris polimerek hálózata, polymer networks) - kisebb viszkozitás, bepumpálható a kapillárisba, majd eltávolítható, megújítható - pórusméret változtatható pl. a hőmérséklettel, nem hőérzékeny pl. lineáris poliakrilamid, alkilezett cellulóz, agarózgél, dextrán, polietilén-oxid, PEG

43 43. Kémiai gél: poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) H2C CH H2C C NH2 AA (akrilamid) CH C NH H2C CH C BIS Gél összetételének jellemzése (AA = akrilamid) T% = (AA bis) / 100 teljes gélképző anyag tömeg%-a, 3-10 % C% = bis / (AA bis) 100% bifunkciós akrilamid %-a, 0-5 % C% határozza meg a térhálósodás fokát, a gél keménységét C% = 0 fizikai, lineáris gél (kapillárisba pumpálható, megújítható) gyakori az elektrokinetikus injektálás kereskedelemben kapható kész, géllel töltött kapillárisok: Beckman, ABI, Bio-Rad, J&W, Supelco,... ligonukleotidok, DNS szakaszok szekvenálása: PAGE kétszálú DNS (dsdna) denaturálása: 7 M karbamid vagy formamid, hő, Hg-vegy. töltés/méret arány azonos, elválasztás méret szerint! nagyobb DNS-re jobb a lineáris poliakrilamid-gél vagy agarózgél (nagyobb pórusok) Fehérjék, glikoproteinek elválasztása: SDS-PAGE a (globuláris) fehérjéket denaturálni kell pl. a következő anyagokkal: nátrium-dodecil-szulfát (SDS): be is burkolja a fehérjét, mozgékonys. arányos log Mt béta-merkaptoetanol, DTT = ditiotreitol (diszulfidhidak hasítása)

44 44. Humán fehérjék méret szerinti elválasztása: SDS-PAGE (A) cerebrospinális folyadék minta (B) szérumminta minta puffer, hevítés (feh. denatur.) 120 mm Tris, ph 6.6, 1% SDS, merkaptoetanol lineáris PAG kapilláris, inj. 3.4 kpa 60 sec elfo 14 kv, UV detektálás 254 nm marker fehérjék (ismert Mt): Ferguson plot G: range G (front marker, elsőként jut át) a: transthyretin c: β-trace protein Alb: albumin f: α2-makroglobulin b: IgG könnyű lánc d: IgG nehéz lánc e: transzferrin A. Hiraoka et al. J. Chromatogr. A 895 (2000)

45 45. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia Micellar Elektrokinetic Chromatography (MEKC) Micellar Elektrokinetic Capillary Chromatography (MECC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő micella / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján Ionok esetén vegyes mechanizmus, mert egyidejűleg mozgékonyság szerinti elválasztás is történik (Terabe, 1984)

46 Micelláris elektrokinetikai kromatográfia (MEKC, MECC) µ tot = µ eo 1 k' µ ep µ mc 1 k' 1 k' ez a tag csak ionokra! elválasztás: injektálás: k : kapacitás faktor (micella oldatfázis megoszlás) detektor 46. EF teo detektorjel MEKC elúciós ablak tmc MEKC retenciós idő

47 47. A MEKC-ben leggyakrabban alkalmazott anionos tenzidek tenzid CMC [mm] aggr. szám anionos: Na dodecil-szulfát, SDS: CH3(CH2)11S3 8,2 62 nátrium tetradecil-szulfát 2,1 62 N-lauroil-N-metil-β-alaninát (ALE) 9,8 lítium-perfluorooktánszulfonát (LIPFS) 6,7 epesavsók: R1 nátrium-kolát (SC) R2 R H H H CH2CH2C -dezoxikolát (SDC) H H -taurokolát (TC) -taurodezoxikolát R3 H CH2CH2C H H H H H H CH2CH2CNHCH2CH2S3 CH2CH2CNHCH2CH2S

48 48. A MEKC-ben gyakran használt további pszeudofázisok tenzid CMC [mm] aggr. szám kationos: dodecil-trimetil-ammónium-bromid (DTAB) nemionos: tetradecil-trimetil-ammónium-bromid (TTAB) 3,6 hexadecil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB) ,1 40 polioxoetilén(23)-dodecil éter (Brij 35) polioxoetilén(20)-szorbinát monooleát (Tween 80) 0,01 polioxoetilén(20)-szorbinát monolaurát (Tween 20) 0,059 oktilglükozid dodecil-β-d-maltozid 0,16 TRITN X-100 0,24 140

49 49. A legfontosabb micella-markerek teljesen szolubilizált festékmolekula a micellákkal együtt vándorol tmc meghatározására

50 50. A felbontás optimálásának lehetőségei a MEKC-ban 1 teo / t mc N α 1 k ' Rs = 4 α 1 k ' 1 (teo / t mc )k ' ha tmc, szelektivitás: k '1 α= 1 k '2 visszakapjuk a HPLC-re érvényes felbontás képletet ptimálási lehetőségek: Micellák típusa és koncentrációja (MEKC elúciós ablak) Puffer típusa, koncentrációja és ph-ja Szerves módosító használata (MeH, ACN, iprh) Vegyes micellák használata Micellák királis szelektorok (pl. ciklodextrinek) használata Kapillárisfal borítása, más hőmérséklet vagy feszültség használata

51 51. Anabolikus szteroidok MEKC elválasztása H3C CH3 1 H H 5 H H H CH3 3 CH3 H 6 CH3 H H3C 7 CH3 H CH3 H H CH3 H H H CH3 H H H CH3 2 H H CH3H CH3 CH3 H CH3 H H 50 µm ID kapilláris, 65 (50) cm BGE: 60 mm borát, 30 mm foszforsav, 20 mm SDS, 10% 1-propanol referencia minta: 50 µg ml-1 (0,2 mm) szteroid BGE-ben feloldva EK injektálás 11 kv, 4 s elfo: 27 kv, 25 C, UV detektálás 245 nm WC Lin, CC Sue, CH Kuei, Chromatographia 1999, 49,

52 52. Doxorubicin & metabolitjai egyetlen sejtből: MEKC LIF A: egyetlen sejtből, B: sejtszuszpenzió extraktumból NS-1 sejtek inkubációja: 25 µm DX, 8 h, majd mosás HEPES/mannitol pufferrel 20 µm ID 39,5 cm kapillárisba mikroszkóp alatt az 5 ml sejtszuszpenzióból egyetlen sejtet felszippantunk (gravitációs injektálás, 114 cm, 1 sec, <0,1 nl), pufferben sejt lízis 30 BGE: 10 mm borát, 10 mm SDS (ph 9,3) elfo: 400 V cm-1, detektálás: LIF Ar-ion lézer 488 nm gerj, 635 ± 28 nm bandpass detektálás DX kalibráció: 0,1 10 nm lineáris, LD: 61 ± 13 zmol (36600 molekula) átlagosan 9,5 fmol DX / sejt, metabolit: 0,03-1 amol/sejt AB Anderson, J Gergen, EA Arriaga, J Chromatogr. B 2002, 769,

53 53. Kapilláris elektrokromatográfia Capillary Elektrochromatography (CEC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő állófázis / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján (mint az RP-HPLC-ben) Ionok esetén vegyes mechanizmus, mert mozgékonyság szerinti elválasztás is történik ( HPLC CZE ) Jorgenson, Lukacs: 10 µm DS fázis 170 µm kapillárisban Tsuda: coated open tubular cap Knox, Grant: CEC gyakorlati megvalósítása Smith, Evans: gyógyszermolekulák CEC elválasztása (DS tölteten)

54 54. Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) HPLC hatékonyságának növelése: részecskeméret csökkentése µm alá egyre nagyobb oszlopellenállás, egyre nagyobb nyomás kell! hidraulikus áramlási profil: parabolikus, csúcsdiszperzióhoz vezet nyomás helyett EF hajtsa a folyadékot: - elérhető a HPLC-ben megszokott sebesség (0.5-3 mm/s) - dugószerű áramlási profil: nagyobb hatékonyság - részecskeméret elvileg µm alá is csökkenthető Elválasztás elve: semleges molekulák álló/mozgófázis közti megoszlása Az EF szerepe a töltet részecskéinek felületén is kialakul elektromos kettősréteg elég közeli részecskék kettősrétegei átfednek, EF megszűnhet! Stern-Gouy-Chapman modell: egyre kisebb részecskék esetén egyre nagyobb pufferkoncentráció kell (10 mm-ig), hogy vékonyabb kettősréteg legyen, az elmélet szerint 0,4 um-ig le lehet menni a részecskeátmérővel pressurized CEC (pcec) = PEC (pszeudo-elektrokromatográfia): EF mellett nyomáskülönbség (pumpa) is hajtja az eluenst (inletben túlnyomást alkalmazunk; Verheij, Hugener; Tsuda, 1987)

55 55. CEC oszlop készítése a részecskék felületén is kialakul elektromos kettősréteg töltöttek frit kell a kapilláris végére a töltet kiáramlásának megakadályozására: - szilikakapilláris végének szinterelésével (huzalon áramot átvezetve, 450 C) - kálium-szilikát és formamid in situ polimerizálása - a töltet anyagának szinterelésével oszlop töltése állófázissal: - zagy (slurry) : állófázis szuszpendálva a mozgófázisban, kapillárisba töltés, majd a mozgófázis kimosása vízzel mm vastag kapillárist száraz állófázissal töltenek, majd géppel kihúzzák - szilikagél töltött, elektrokinetikusan be lehet vinni - újabban: monolith column (continuous bed column) kémiailag belepolimerizálják az állófázist, nem kell frit (kb től) buborékképződés megakadályozása: kis túlnyomás a pufferedényekben grafika: HP CE Partner

56 56. Használt állófázisok C18 oktadecilszilán (DS), 3 µm - erősen bázisos anyagok esetén szilika hatás (csúcsalak-torzulás) - mixed-mode: pl. C6/SCX (kationcserélő szulfonátcsoport ugyanazon a szemcsén) szilikafalhoz kémiailag kötött C8 szilikafalhoz kémiailag kötött alfa-savas glikoprotein (AGP) királis elválasztásra Mozgófázis választása adott ph-jú puffer víz/acetonitril (vagy víz/metanol) oldószerelegyben %ACN-el nő (!) az EF ikerionos (Good-típusú) puffer előnyös 1-5 mm (hő- és buborékfejlődés kivédésére) pl. 5 mm SDS: ionpárképző és hatékony buborék-gátló (felületi feszültséget csökkenti a szilárd/folyadék fázishatáron)

57 57. Gyógyszeralapanyag (API) gyártás példa: Ibuprofen szennyezésprofilja pcec-val fused silica kapilláris (33 cm, 24.5 cm, i.d. 100 um), töltet: Lichrosphre 100 RP-18 (5 um) mobil fázis: 10 : 40 : 50 arányban: mm hangyasav/ammónia, ph 2,5 - víz - acetonitril 0,5 mg/ml metanolos minta, injektálás 12 bar 24 sec elektrokromatográfia: 25 kv és 12 bar túlnyomás lineáris tartomány: 0,05-0,15 mg/ml, 1% szennyezők kvantitatív mérése Quaglia, et al. Il Farmaco 55 (2003)

58 58. Mikrochip elfo, lab-on-a-chip, micro-tas, mikrofluidika fotolitográfiásan gyártott lapkák - üveg, fused silica - poli(dimetil)sziloxán, PMMA EK injektálás, detektálás: LIF, MS, amperometria néhány cm migrációs úthossz sec-időskálára rövidült analízis előkoncentrálás, reakció is lehetséges lab-on-a-chip 1-puffer, 2-minta, 3-minta waste, 5-elválasztás, 4-waste biokémiai, orvosdiagnosztikai alkalmazások!