(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: C12N 1/ (06.01) A61L /36 (06.01) A61K 3/74 (06.01) A23C 9/123 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/DK 03/00019 () Elsõbbségi adatok: DK P US (72) Feltalálók: MURBRAEK, BRÖNDSTAD, Gunnar, N-77 Snasa (NO); BRANDSBORG, Erik, DK- Holbaek (DK) (73) Jogosult: Bifodan A/S, 3390 Hundested (DK) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Lactobacillus törzsek (7) Kivonat A találmány tárgyát képezik új Lactobacillus törzsek, Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs (Lba EB01), Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzs (Lbp PB01), Lactobacillus acidophilus Lba EB02 törzs, Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 törzs, Lactobacillus Lbxx EB03 törzs és Lactobacillus Lbxx PB03 törzs, valamint lényegében azonos elõnyös tulajdonságokat mutató törzsek, amelyek önmagukban vagy kombinációban probiotikumként alkalmazhatók, vagy prebiotikummal együtt alkalmazva szinbiotikumként alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezik továbbá gyógyászati készítmények, tejipari termékek, funkcionális élelmiszerek, gyógyhatású táplálékok és testápoló termékek, amelyek a törzseket önmagukban vagy kombinációban tartalmazzák, valamint a törzsek alkalmazása hüvelyfertõzések, urogenitális fertõzések és gasztrointesztinális betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. HU T2 A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgyát új Lactobacillus törzsek képezik, amelyek önmagukban vagy kombinációban probiotikumként, vagy prebiotikummal együtt alkalmazva szinbiotikumként alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezik továbbá a törzseket önmagukban vagy kombinációban tartalmazó gyógyhatású készítmények, tejipari termékek, funkcionális élelmiszerek, gyógyhatású táplálékok ( nutraceuticals ) és testápoló termékek, valamint a törzsek alkalmazása hüvelyfertõzések, urogenitális fertõzések és gyomor-bél betegségek megelõzésére vagy kezelésére. A találmány háttere A probiotikumok élõ mikroorganizmusok vagy mikrobaelegyek, amelyeket egyének mikrobiális egyensúlyának javítására, elsõsorban a gyomor-bél traktus és a hüvely környezetében alkalmaznak. Lactobacillus törzseket alkalmaznak hüvelyfertõzések kezelésére, hasmenés megelõzésére, valamint urogenitális fertõzések kezelésére [Am. J. Health Syst. Pharm. 8, (12) (01)]. A normál hüvelyflórát Lactobacillus fajok dominálják, amelyek kórokozók szaporodását szabályozni segítõ ágenseket termelnek. A bakteriális vaginózis ( bacterial vaginosis, BV) olyan klinikai állapot, amelyet Lactobacillus fajok csökkenése és anaerob és mikoplazma baktériumok fokozott elszaporodása jellemez. Bakteriális vaginózist összefüggésbe hoztak medencei gyulladásos rendellenességgel és koraszüléssel. Néhány tanulmány arra utalt, hogy bakteriális vaginózisban szenvedõ betegek szexuálisan terjedõ betegségek ( sexually transmitted disease, STD) fokozott kockázatának vannak kitéve, beleértve a humán immundeficiencia vírus ( human immundeficiency virus, HIV) fertõzést [Curr. Infect. Dis. Rep. 2, 2 (01. április 3.); J. Infect. Dis 18, (1) (02. január 1.)]. Probiotikus Lactobacillusok beadásával lehetséges visszatérõ bakteriális epizódokban szenvedõ nõk hüvelyflórájának a helyreállítása. A bakteriális vaginózis egyike a leggyakoribb nõgyógyászati problémáknak. Candida albicans okozta hüvelyfertõzés szintén gyakori nõgyógyászati probléma. Lactobacillusok jelenléte elengedhetetlen az emésztõrendszer mikrobiális ökoszisztémájának a fenntartásához. A Lactobacillusokról kimutatták, hogy gátló aktivitást fejtenek ki olyan kórokozó baktériumok szaporodására, mint például a Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella fajok és mások. Ez a gátlás tulajdonítható lehet olyan gátlóvegyületek termelõdésének, mint például szerves savak, hidrogénperoxid, bakteriocinek vagy reuterin, vagy epitheliumhoz történõ kompetitív adhéziónak [App. Environ. Microbiol. 6, (11) (1999)]. Vizsgálták továbbá Lactobacillusok alkalmazását húgyúti fertõzések kezelésére [Am. J. Health Syst. Pharm. 8, (12) (01)]. Például lactobacillusok behelyezését és a helyi mikroorganizmusok stimulálását alkalmazták húgyúti fertõzések kiújulásának a megelõzésére [Microecol. Ther. 32 4]. Vizsgálták továbbá Lactobacillusok szerepét urogenitális és intesztinális fertõzések megelõzésében [Intl. Dairy J. 8, 62 (1998)]. A technika állásának az ismertetése A Lactobacillusok probiotikumként történõ alkalmazását a szakirodalom kiterjedten ismerteti. Jacobsen és munkatársai [Applied and Environmental Microbiology 6, (1999)] negyvenhét Lactobacillus alfaj probiotikus aktivitásának in vitro eljárásokkal történõ szûrését, valamint öt kiválasztott törzs emberben kifejtett kolonizációs képességét ismertették. A törzseket vizsgálták ph=2, érték és 0,3%¹os oxgall koncentráció iránti rezisztenciára nézve, Caco¹2 sejtekhez való adhézióra nézve, valamint enterális kórokozó baktériumok elleni antimikrobiális aktivitásra nézve. Húsz mikroszkópos látótérben megszámolva, a tapadó Lactobacillusok száma például L. Rhamnosus LGG esetében 6±27, és L. Rhamnosus 19070¹2 esetében 713±188 volt. Az US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás az L. acidophilus terápiásan elõnyös törzseit ismerteti, közelebbrõl egy törzset, amelyet az jellemez, hogy legalább 0 baktérium tapadt egyetlen, humán eredetû vékonybél-nyálkahártyasejthez, a baktérium és a sejt öt percen át tartó együttes inkubálását követõen. A törzset jellemezték továbbá tejsavtermelésre és erõteljes szaporodásra nézve. A WO 99/99 számú nemzetközi közzétételi irat L. plantarum LB 931 nevû, új törzset ismertet. Ez a törzs alkalmas urogenitális fertõzések kezelésére és megelõzésére. A törzs jól tapad a hüvely epitheliális sejtjeihez, és képes megakadályozni különbözõ baktériumtörzsek szaporodását. Az US 64 8 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás Lactobacillust, sovány tejet, Lactobacillus növekedési faktort ( Lactobacillus Growth Factor, LGF) és Lactobacillus készítményeket ismertet, valamint eljárásokat a készítmények alkalmazására urogenitális fertõzések megelõzésére. Közelebbrõl, ez a leírás hidrofób vagy hidrofil lactobacillus törzsek azon tulajdonságait ismerteti, hogy biológiai anyagokhoz, intesztinális, vaginális és uroepitheliális sejtekhez tapadnak, ellenállnak bizonyos antimikrobiális ágenseknek, és dominálják az urogenitális flórát. L. casei var. Rhamnosus GR¹1 esetében azt tapasztalták, hogy egyetlen uroepitheliális sejthez átlagosan legalább 64 baktérium tapadt, míg az L. fermentum B¹4 esetében átlagosan legalább 39 baktérium tapadt egyetlen sejthez. Az US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (WO 98/46261) új törzseket ismertet, például az L. crispatus CTV-0 törzset, amelyet hüvelykenetbõl izoláltak. A törzset vaginális epithelsejtekhez való fokozott tapadásképessége és hidrogén-peroxidtermelés jellemezte. Az L. crispatus CTV-0 törzs esetében azt tapasztalták, hogy 0%-nál magasabb százalékos vaginális epithelsejt ( vaginal epithelial cell, VEC) kohéziós értéket mutatott. A százalékos VEC kohéziós érték kifejezés úgy definiálható, mint egy adott, azonosított csoportba tartozó összes VEC-sejt 2

3 3 4 0 között található olyan VEC-sejtek százalékos aránya, amelyekhez legalább egy Lactobacillus tapadt. Ezen törzsek rekolonizáló képessége a leírásban ismertetett új, prezervációs mátrixnak volt tulajdonítható. Az EP09688 európai szabadalmi leírás különbözõ Lactobacillus törzsek önmagukban vagy kombinációban történõ alkalmazását ismerteti. A törzseket He- La-sejtekhez való tapadásuk és hidrogén-peroxid-termelésük alapján választották ki. A WO 97/29762 számú nemzetközi közzétételi irat olyan készítményeket ismertet, amelyek legalább egy, Ericaceae családba tartozó növényeredetû faj vagy kivonata hatékony mennyiségét, valamint legalább egy, Lactobacillus, Bifidobacterium vagy elegyeik közül választott faj mikrokapszulázott baktériumainak hatékony mennyiségét tartalmazzák. A készítmény alkalmazható urogenitális és intesztinális rendellenességek megelõzésére és/vagy kezelésére. Ocañ[.2]a és munkatársai [Biocell, (3) (01)] Lactobacillusok vaginális epithelsejtekhez (VEC) történõ tapadását vizsgálták. Az L. crispatus CRL 1266, L. salivarius subsp. salivarius CRL 1328, L. acidophilus CRL 19 és L. acidophilus CRL 1294 lactobacillus törzseket hüvelykenetbõl izolálták. McLean, N. W. és munkatársai [J. Med. Microbiol. 49, (6) 43 2 (00)] különbözõ Lactobacillusokat jellemeztek abból a célból, hogy értékeljék probiotikumokként történõ alkalmazhatóságukat azáltal, hogy vizsgálták vaginális epithelsejtekhez (VEC) tapadásukat. A Lactobacillusokat humán eredetû hüvelykenetbõl izolálták. A technika állása szerinti, Lactobacillusokat tartalmazó gyógyhatású készítmények nem elég hatékonyak in vivo, azaz emlõs mikrobiális ökoszisztémában történõ rekolonizációra, ezért igény mutatkozik olyan Lactobacillusok felfedezésére, amelyek gyógyhatású készítmény, gyógyhatású táplálék, tejipari termék, funkcionális táplálék vagy abszorbens termék formájában beadva, belsõ tulajdonságként rekolonizációra képesek. Feltehetõen a humán forrásból izolált Lactobacillusok mutatnak leginkább in vivo rekolonizáló képességet a beadást követõen, mert ezek rendelkeznek azzal a belsõ tulajdonsággal, hogy humán mikrobiális ökoszisztémában túléljenek. Olyan Lactobacillus törzsek azonosítása, amelyek fokozott rekolonizáló tulajdonságot mutatnak a beadást követõen, gyakran munkaigényes folyamat, és ezért fontos a legjobb olyan vizsgálóeljárások kiválasztása, amelyek elõre jelzik az in vivo rekolonizáló képességet. A Lactobacillusok azon tulajdonsága, hogy vaginális epithelsejtekhez (VEC), tenyésztett Caco¹2 sejtekhez vagy más sejtvonalakhoz tapadnak, fontos tényezõ, és eszközül szolgál annak értékelésére, hogy adott probiotikus törzs képes¹e rekolonizálni, valamint részt venni olyan barrier kialakításában, amely megelõzi a kórokozó baktériumok általi kolonizációt. Úgy tûnik, hogy a szakirodalomban nagy eltérés mutatkozik a probiotikus törzsek in vitro tapadásában. Ezek az eltérések valójában törzsek közötti különbségeket tükröznek, de bizonyosan függenek a kísérleti körülményektõl is. Ezen túlmenõen úgy tûnik, hogy különbségek adódnak abból a szempontból is, hogyan mérik a tapadást. Az US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a Lactobacillusok tapadását úgy határozzák meg, hogy kiszámítják a vaginális epithelsejtek (VEC) százalékos kohéziós értékét. A százalékos VEC kohéziós érték kifejezés úgy definiálható, mint egy adott, azonosított csoportba tartozó összes VEC-sejt között található olyan VEC-sejtek százalékos aránya, amelyekhez legalább egy Lactobacillus tapadt. Az in vivo tapadás egy másik mérési módja szerint festett készítményben megszámolják elõre meghatározott számú epitheliális sejthez tapadó mikrobák átlagos számát. A feltalálók szerint az elõbbi eljárás elõnyösebb, mint az utóbbi, amennyiben jobban tükrözi az in vivo tapadást. Vita tárgyát képezheti, hogy egy in vitro kísérlet mindössze eszközül szolgál¹e arra, hogy felbecsüljük epitheliális sejtekhez, vagy például a hüvely falához való tapadás révén történõ kolonizálás képességét. A tapadás kiszámításának a módja ezért nem feltétlenül a legfontosabb tényezõ, inkább az nagyon lényeges, hogy potenciálisan probiotikus törzseket olyan, jól jellemzett probiotikus baktériumtörzsekkel hasonlítsunk össze, amelyekrõl tudjuk, hogy nyálkahártyamembránhoz tapadnak. Az US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan Lactobacillus törzset ismertet, amelyet az jellemez, hogy átlagosan legalább 0 baktérium képes tapadni egyetlen vékonybél-nyálkahártyasejthez, azonban ezt a Lactobacillus törzset nem hasonlították össze egy jól jellemzett probiotikus baktériummal. A Lactobacillus casei GG törzs példa egy kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ, jól jellemzett probiotikus törzsre, amelynek összehasonlításra történõ alkalmazása releváns lehet hatékony probiotikus törzsek keresése során. A Lactobacillusok lehámlott vaginális epithelsejtekhez (VEC), Caco¹2 sejtekhez és más típusú sejtvonalakhoz történõ tapadásának tanulmányozásán kívül fontos továbbá a Lactobacillusok in vitro gátló aktivitásának a jellemzése más, bakteriális vaginózisban szerepet játszó baktériumfajokkal, például anaerob és mikoplazma baktériumokkal szemben, valamint folyékony tápközegben való tenyésztés során mutatott savtermelésük, továbbá hidrogén-proxid- (H 2 O 2 ) termelésük jellemzése. A hidrogén-peroxid-termelés mérése fontos, mert az in vivo hidrogén-peroxid segít a hidrogén-peroxidot nem termelõ baktériumok és mikoplazma baktériumok eradikálásában. Összefoglalva, a probiotikus tulajdonságú Lactobacillus törzseknek képesnek kell lenniük vaginális epithelsejtekhez (VEC) és más megfelelõ sejtekhez, például Caco¹2 sejtekhez való tapadásra. Ezen túlmenõen elvárás továbbá, hogy probiotikus tulajdonságú Lactobacillus törzsek in vitro gátló aktivitást mutassanak más baktériumfajokkal szemben, folyékony tápközegben szaporodva savat termeljenek és/vagy hidrogén-peroxidot termeljenek. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezik a fentebb ismertetett, kívánt tulajdonságokat mutató Lactobacillus törzsek alkal- 3

4 mazásával elõállított gyógyhatású készítmények vagy abszorbens termékek. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi Lactobacillus paracasei Lbp PB01 PB01 törzs önmagában vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 EB01 törzzsel kombinálva, amelyek lényegében azonos elõnyös tulajdonságokat mutatnak, azaz nyálkahártyához tapadva képesek kolonizálni, és amelyek ennek megfelelõen alkalmasak hüvelyfertõzések, húgyúti fertõzések és gyomor-bél betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány tárgyát képezik továbbá nyálkás, tapadó vivõanyag alkalmazásával elõállított gyógyhatású készítmények, amelyek nyálkahártyához való tapadás révén fokozott kolonizáló tulajdonságot mutatnak. A találmány tárgyát képezik továbbá vaginális készítmények, amelyek fokozottan képesek Candida albicans és Gram-negatív kórokozó baktériumok szaporodásának a szuppresszálására. A találmány tárgyát képezik továbbá tejipari termékek, gyógyhatású táplálékok és funkcionális élelmiszerek, amelyek Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset, önmagában vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva tartalmaznak, amely törzsek lényegében azonos tulajdonságokat mutatnak, képesek nyálkahártyamembránokat kolonizálni, és ennek megfelelõen alkalmazhatók hüvelyfertõzések, húgyúti fertõzések és gyomor-bél betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére. Ábrák 1. ábra. Lactobacillus acidophilus EB01, Lactobacillus paracasei PB01 és Lactobacillus casei GG törzsek tapadása Caco¹2 sejtekhez. Meghatároztuk a kötõdött baktériumok számát, és az adatokat átlagos százalékos tapadás ± SD formában fejeztük ki. 2. ábra. Lactobacillus acidophilus EB01, Lactobacillus paracasei PB01 és Lactobacillus casei GG törzsek tapadása izolált vaginális epithelsejtekhez. Meghatároztuk a kötõdött baktériumok számát, és az adatokat az egyes VEC-sejtekhez kötõdött baktériumok számával ± SD fejeztük ki. 3. ábra. VEC és Caco¹2 sejtekhez történõ tapadás korrelációja. Az ábra az 1. és 2. ábra alapján készült. Definíciók Vivõanyag kifejezés alatt bármely, nem aktív összetevõt értünk, amely hozzáadva a végsõ készítmény részét képezi. Probiotikum kifejezés alatt élõ, mikrobiális kiegészítõt értünk, amely elõnyös befolyást gyakorol a betegre az emésztõtraktusban, húgyúti traktusban vagy a hüvelyben kifejtett hatása révén. Prebiotikum kifejezés alatt a leírásban szubsztrátot értünk, amely elõnyös hatást gyakorol a probiotikumra, és ezáltal a probiotikumot szedõ egyénre A beteg kifejezés alatt a leírásban olyan egyént értünk, aki mikrobiális egyensúly hiányával összefüggõ bármely klinikai állapotban szenved, valamint olyan egyént, aki megelõzés céljából bakteriális készítményt alkalmaz. Szinbiotikus termék alatt probiotikum és prebiotikum kombinációját értjük, amelyek szinergizmus révén elõnyös hatással vannak a betegre. Erõteljes szaporodás alatt azt értjük, hogy adott baktérium kitûnõ növekedést mutat. A cfu rövidítés a telepképzõ egységet ( colony forming unit, cfu) jelöli. A találmány részletes ismertetése Emberben az in vivo flóra regenerálására alkalmas Lactobacillus törzsekre vonatkozó találmányunk nyilvánvalóvá válik az alábbi részletes ismertetés nyomán. Egy elsõ szempont szerint a találmány tárgyát képezi Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzs önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel, valamint lényegében azonos tulajdonságokat mutató, probiotikus Lactobacillus törzsekkel kombinálva. A Lactobacillus acidophilus Lba EB01 és Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzsek megfelelõ mintáit letétbe helyeztük a DSMZ gyûjteményben ( Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg 1b, D¹38124 Braunschweig, Németország), ahol az alábbi nyilvántartási számot kapták: Lactobacillus acidophilus Lba EB01; DSM és Lactobacillus paracasei Lpb PB01; DSM A Lactobacillus acidophilus Lba EB01 és Lactobacillus paracasei Lpb PB01 törzsek letétbe helyezésének dátuma 02. március 18. volt. A Lactobacillus acidophilusi Lba EB01, Lactobacillus plantarum Lbp1 PB02, Lactobacillus Lbxx EB03 és Lactobacillus Lbxx PB03 törzsek megfelelõ mintáit letétbe helyeztük a DSMZ gyûjteményben ( Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg 1b, D¹38124 Braunschweig, Németország). A Lactobacillus acidophilus Lba EB01, Lactobacillus plantarum Lbp1 PB02, Lactobacillus Lbxx EB03 és Lactobacillus Lbxx PB03 törzsek letétbe helyezésének dátuma 03. március. volt. A Lactobacillus törzsek az alábbi tulajdonságokat mutatták. Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs Egy órán át tartó inkubáció alatt a hozzáadott baktériumok legalább %¹a tapadt tenyésztett Caco¹2 sejtekhez. A vaginális epithelsejtekhez (VEC) való tapadás sejtenként legalább baktérium. A törzs hidrogén-peroxidot termel. A törzs in vitro tejsavat termel, és in vitro erõs növekedést mutat. A törzs epestabilitást mutat. A törzs savstabilitást mutat. A törzs bakteriocin formájában természetes antibiotikumot termel. 4

5 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 Egy órán át tartó inkubáció alatt a hozzáadott baktériumok legalább %¹a tapadt tenyészetett Caco¹2 sejtekhez. A vaginális epithelsejtekhez (VEC) való tapadás sejtenként legalább baktérium. A törzs in vitro tejsavat termel, és in vitro erõs növekedést mutat. A törzs epestabilitást mutat. A törzs savstabilitást mutat. A törzs bakteriocin formájában természetes antibiotikumot termel. A törzs erõs gátló aktivitást mutat Gardnerella organizmusok ellen Lactobacillus acidophilus Lba EB02 törzs Egy órán át tartó inkubáció alatt a hozzáadott baktériumok tenyésztett Caco¹2 sejtekhez tapadnak. A baktériumok vaginális epithelsejtekhez (VEC) tapadnak. A törzs hidrogén-peroxidot termel. A törzs in vitro tejsavat termel, és in vitro erõs növekedést mutat. A törzs epestabilitást mutat. A törzs savstabilitást mutat. A törzs bakteriocin formájában természetes antibiotikumot termel. Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 törzs Egy órán át tartó inkubáció alatt a hozzáadott baktériumok tenyésztett Caco¹2 sejtekhez tapadnak. A baktériumok vaginális epithelsejtekhez (VEC) tapadnak. A törzs hidrogén-peroxidot termel. A törzs in vitro tejsavat termel, és in vitro erõs növekedést mutat. A törzs epestabilitást mutat. A törzs savstabilitást mutat. A törzs bakteriocin formájában természetes antibiotikumot termel. Lactobacillus Lbxx EB03 törzs Egy órán át tartó inkubáció alatt a hozzáadott baktériumok legalább 12%¹a tapadt tenyészetett Caco¹2 sejtekhez. A baktériumok vaginális epithelsejtekhez (VEC) tapadnak. A törzs in vitro tejsavat termel, és in vitro erõs növekedést mutat. A törzs epestabilitást mutat. A törzs savstabilitást mutat. A törzs bakteriocin formájában természetes antibiotikumot termel. Lactobacillus Lbxx PB03 törzs Egy órán át tartó inkubáció alatt a hozzáadott baktériumok legalább 11%¹a tapadt tenyészetett Caco¹2 sejtekhez. A baktériumok vaginális epithelsejtekhez (VEC) tapadnak A törzs in vitro tejsavat termel, és in vitro erõs növekedést mutat. A törzs epestabilitást mutat. A törzs savstabilitást mutat. A törzs bakteriocin formájában természetes antibiotikumot termel. Lényegében azonos tulajdonságokat mutató probiotikus Lactobacillus kifejezés alatt minden olyan törzset értünk, amelyeknek a tapadási tulajdonsága megegyezik a fentebb felsorolt Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs, Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzs, Lactobacillus acidophilus Lba EB02 törzs, Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 törzs, Lactobacillus Lbxx EB03 törzs és Lactobacillus Lbxx PB03 törzs tapadási tulajdonságaival, elõnyösen a Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs, Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzs, Lactobacillus Lbxx EB03 törzs és Lactobacillus Lbxx PB03 törzs tapadási tulajdonságaival, és még elõnyösebben a Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs és a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzs tapadási tulajdonságaival. Abból a célból, hogy meghatározzuk a leírásban ismertetett törzsek nemzetségét és faját, Riboprinter Microbial Characterization rendszert alkalmaztunk. A törzsek mennyiségét és összetételét gázkromatográfiás eljárással azonosítottuk és határoztuk meg. Ezen túlmenõen a törzsek API azonosítását is elvégeztük. Az izolált törzsek tapadási tulajdonságát a jól jellemzett Lactobacillus casei GG törzséhez hasonlítottuk. A hozzáadott Lactobacillus paracasei PB01 törzsbeli baktériumok közel %¹a tapadt tenyésztett Caco¹2 sejtekhez 1 órán át tartó inkubálás alatt, szemben a Lactobacillus acidophilus EB01 esetében mért %¹os és a Lactobacillus casei GG esetében mért körülbelül %¹os értékkel. A Lactobacillus paracasei PB01 törzs tapad a legerõsebben VEC-sejtekhez, körülbelül sejtenként baktérium, 1 órán át tartó inkubálást követõen. Lactobacillus casei GG mutatta a legalacsonyabb számú tapadó baktériumot, míg az EBO 1 törzs közbeesõ értéket mutatott. A három baktériumtörzs tapadása tenyésztett Caco¹2 sejtekhez jól korrelált a VEC-sejtekhez való kötõdéssel. Azt tapasztaltuk, hogy a Lactobacillus acidophilus Lba EB02 és Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 törzsek tapadnak Caco¹2 sejtekhez egy órán át tartó inkubálás alatt. A hozzáadott Lactobacillus Lbxx EB03 baktériumok legalább 12%¹a, míg a Lactobacillus Lbxx PB03[.4] baktériumok legalább 11%¹a tapadt tenyésztett Caco¹2 sejtekhez egy órán át tartó inkubálás alatt. Ennek megfelelõen a törzsek mindegyike képes volt Caco¹2 sejtekhez tapadni. Az EB03 és PB03 törzsek jobb tapadási tulajdonságot mutattak, mint a Lactobacillus casei GG törzs. Azt tapasztaltuk, hogy a törzsek in vitro tejsavat termeltek, erõs növekedést mutattak in vitro, valamint stabilitást mutattak epe és sav iránt, továbbá mindkét törzs képes volt bakteriocin természetes antibiotikumot termelni. Az EB02 és PB02 törzsek nagyon erõs H 2 O 2 ¹és tejsavtermelést mutattak, a Lactobacillus paracasei

6 3 4 0 PB01 törzs erõs gátló aktivitást mutatott Gardnerella vaginalis ellen, amely egy BV¹asszociált baktériumfaj. Az EB01 törzs H 2 O 2 ¹ot termel. Egymást kiegészítõ hatásaiknak tulajdoníthatóan a két törzs kombinációja nagyon elõnyös vaginális probiotikus készítmény elõállítására. Ezt alátámasztja továbbá az a megfigyelés, hogy folyékony tápközegben tenyésztve mindkét izolátum erõsen savas környezetet állított elõ, valamint hogy mindkét törzs erõsen tapad VEC-sejtekhez és tenyésztett Caco¹2 sejtekhez. Az eredmények arra is utalnak, hogy Lactobacillus paracasei Lbp PB01 vagy az EB01 törzs önmagában, kombinációban vagy együtt alkalmazva a Lactobacillus acidophilus Lba EB02, Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, Lactobacillus Lbxx EB03 és/vagy Lactobacillus Lbxx PB02 törzsekkel, alkalmasak más beadási utak céljára. Egy második szempont szerint a találmány szerinti Lactobacillus törzsek alkalmasak orvosi alkalmazásra, hüvelyfertõzések, urogenitális fertõzések vagy gasztrointesztinális fertõzések megelõzésére vagy kezelésére. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint hüvelyfertõzések kezelésére alkalmazott probiotikus Lactobacillus törzsek gyógyító hatását úgy értékeljük, hogy Riboprinter Microbial Characterization system alkalmazásával meghatározzuk a hüvelyflórát. A Riboprinter Microbial Characterization system mikroorganizmusok nemzetségének és fajának a meghatározására alkalmas. A beteget akkor tekintjük gyógyultnak, amikor a hüvelyflórát Riboprinter Microbial Characterization system alkalmazásával normálisnak ítéljük. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezi gyógyhatású készítmény, amely Lactobacillus paracasei Lpb PB01 törzset tartalmaz önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva, amelyet a találmány szerint gyógyászatban elfogadható hordozóval és/vagy hígítóval együtt alkalmazunk. A baktériumtörzseket olyan gyógyászati készítmény formájában szereljük ki, amely lehetõvé teszi a probiotikus törzsek egyszerû, és szakember számára ismert módon történõ beadását. Elõnyösen a találmány szerinti gyógyhatású készítmény egy grammjában a probiotikus baktériumokat legalább vagy 13 cfu Lactobacillus koncentrációban, vagy elõnyösebben 6 12 cfu koncentrációban alkalmazzuk, ahol a cfu rövidítés telepképzõ egységet ( colony forming unit, cfu) jelöl. Ez lehet a törzsek egyike vagy azok kombinációja. Elõnyösen a találmány szerinti probiotikus baktériumokat alkalmazhatjuk közvetlenül, vagy még elõnyösebben liofilezett formában. Gyakorlati alkalmazás céljára a találmány szerinti gyógyhatású készítményeket szuszpenzió, spray, krém, por, kapszula, öblítõoldat, hüvelykúp, pesszárium, tabletta vagy mikrokapszulázott termék formájában szereljük ki, szakember számára ismert vivõanyagok és kiszerelési eljárások alkalmazásával. Abból a célból, hogy fokozzuk a gyógyhatású készítmény tapadását a nyálkahártyamemránhoz, nyálkás adhezív vivõanyagot adhatunk hozzá, amely a készítmény körülbelül %¹át teszi ki. Az elõnyös adhezív vivõanyag hidrokolloid, elõnyösebben a hidrokolloid lehet xantángumi[.6], szentjánoskenyér-gumi, alginát és még elõnyösebben a hidrokolloid xantángumi. A Candida albicans nem képes laktitol fermentálására, csakúgy, mint az E. coli és más Gram-negatív baktériumok. Ennek megfelelõen találmány szerinti, probiotikus Lactobacillus törzseket tartalmazó hüvelykészítményekben olyan prebiotikus szubsztrátot alkalmazunk, amelyet a Candia albicans vagy kórokozó baktériumok nem fermentálnak, abból a célból, hogy szuppresszáljuk a Candida albicans szaporodását. A prebiotikus szubsztrát elõnyösen oligoszacharid, elõnyösebben laktitol, oligofruktóz vagy laktulóz, még elõnyösebben a szubsztrát laktitol. szerint a találmány tárgyát képezi abszorbens termék, amely egy vagy több probiotikus Lactobacillus törzset tartalmaz. A baktériumtörzseket azért elegyítjük az abszorbens termékbe, hogy lehetõvé váljon a probiotikus baktériumtörzsek kényelmes adagolása az abszorbens termék alkalmazása során. Gyakorlati alkalmazás céljából a találmány szerinti abszorbens termék nõi higiéniai pelenka, egészségügyi betét, impregnált tampon, tisztasági betét vagy inkontinenciabetét, amely Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset tartalmaz önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva. Elõnyösen az abszorbens termékben alkalmazott probiotikus baktériumok mennyisége legalább vagy 13 cfu Lactobacillus, elõnyösebben 6 12 Lactobacillus. szerint a találmány tárgyát képezik tejipari termékek, amelyek Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset tartalmaznak önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva, a baktériumtörzsek tejipari termékben vannak elegyítve, ami lehetõvé teszi a probiotikus törzsek orális beadását gasztroenterális betegségek megelõzése és/vagy kezelése céljából. Ilyen tejipari termékek például, a korlátozás szándéka nélkül, a kímélõ joghurt, amely különösen elõnyös minden új probiotikus törzzsel való együttes alkalmazásra, az aludttej és a teljes tej. szerint a találmány tárgyát képezik gyógyhatású táplálék termékek, amelyek Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset tartalmaznak önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva, a baktériumtörzsek gyógyhatású táplálékban vannak elegyítve, ami lehetõvé teszi a probiotikus törzsek orális beadását gasztroenterális betegségek megelõzése és/vagy kezelése céljából. A korlátozás szándéka nélkül ilyen gyógyhatású táplálékok például olyan termékek, amelyeket étrend kiegészítésére alkalmaznak, és amelyek elõnyös hatást gyakorolnak az egészségre. szerint a találmány tárgyát képezik funkcionális élelmiszerek, amelyek Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset tartalmaznak önmagában, vagy Lactobacillus aci- 6

7 3 4 0 dophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva, a baktériumtörzsek funkcionális táplálékban vannak elegyítve, ami lehetõvé teszi a probiotikus törzsek orális beadását gasztroenterális betegségek megelõzése és/vagy kezelése céljából. A korlátozás szándéka nélkül ilyen funkcionális táplálékok például a fagyasztva szárított vagy mikrokapszulázott termékek, amelyek élelmiszertermékeken könnyen szétterjednek. szerint a Lactobacillus törzseket gyógyászati készítmények elõállítására alkalmazzuk, hüvelyfertõzések, gasztrointesztinális betegségek vagy húgyúti fertõzések megelõzése és/vagy kezelése céljára. szerint a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva abszorbens termék elõállítására, például nõi higiéniai pelenka, egészségügyi betét, tisztasági betét vagy inkontinenciabetét elõállítására alkalmazzuk, hüvelyfertõzések, gasztroenterális betegségek vagy urogenitális fertõzések megelõzése és/vagy kezelése céljából. A találmány további elõnyös megvalósítási módja szerint a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva tejipari termékek elõállítására alkalmazzuk, gasztroenterális betegség megelõzése és/vagy kezelése céljából. szerint a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva funkcionális élelmiszerek elõállítására alkalmazzuk, gasztroenterális betegség megelõzése és/vagy kezelése céljából. szerint a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzset önmagában, vagy Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzzsel kombinálva gyógyhatású táplálékok elõállítására alkalmazzuk, gasztroenterális betegség megelõzése és/vagy kezelése céljából. A különbözõ termékekre vonatkozó kezelési rendek az adott terméktõl és a betegtõl függenek, amelyeket szakember jól ismer. A korlátozás szándéka nélkül hüvelykapszulák esetében elõnyös beadási rend egy kapszula, naponta kétszer, egy héten át. Abból a célból, hogy biztosítsuk a baktériumok kezdeti optimális szaporodási körülményeit, és in vivo tapadás révén rekolonizálódjanak, elõnyös szubsztrát, azaz a baktériumok számára specifikus táplálóközeg hozzáadása a készítményhez. A szubsztrát funkcionális prebiotikumként szolgál, amely szinergista elõnyös hatást gyakorol a betegre, azaz a prebiotikum és a probiotikum szinbiotikumként hat. Ilyen szubsztrátra példa a laktóz; a laktóz azonban szubsztrátként szolgál a kórokozó Candida albicans és Gram-negatív baktériumok számára is. Elõnyös tehát a baktériumkészítményt olyan szubsztráttal kiegészíteni, amely nem szubsztrátja a Candida albicans gombának. A találmány harmadik szempontja szerint a találmány tárgyát képezik olyan hüvelykészítmények, amelyek a hüvelyt kolonizálni képes baktériumtörzseket, valamint olyan szubsztrátot tartalmaznak, amelyet a Candida albicans nem fermentál. A szubsztrát oligoszacharid, elõnyösen a szubsztrát laktitol, oligofruktóz és/vagy laktulóz, elõnyösebben a szubsztrát laktitol. Vizsgáltuk a laktitol Lactobacillus acidophilus Lba EB01 és Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzsek HEp¹2 és WEHI sejtvonalakhoz in vitro történõ tapadására kifejtett hatását. Azt tapasztaltuk, hogy a laktitol nem befolyásolja a baktériumtörzsek sejtekhez történõ tapadási képességét, és ezért az in vivo tapadást sem fogja befolyásolni. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint baktériumot tartalmazó hüvelykészítmény elõállításához olyan szubsztrátot alkalmazunk, amelyet Candida albicans és Gram-negatív baktériumok nehezen fermentálnak, abból a célból, hogy szuppresszáljuk a Candida albicans szaporodását, és amely szubsztrát elõnyösen oligoszacharid, elõnyösebben a szubsztrát laktitol, oligofruktóz és/vagy laktulóz, legelõnyösebben a szubsztrát laktitol. szerint a baktériumtörzseket, például kapszula formában, orvosi eszközökként alkalmazzuk, hogy stabil emlõs mikrobiális ökoszisztémát kapjunk in vivo. Példák 1. példa Baktériumtörzsek izolálása Két Lactobacillus törzset, amelyeket Lactobacillus acidophilus Lba EB01 és Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzsekként tipizáltunk, egészséges humán donorokból nyert vaginális epithelsejtekbõl izoláltunk, és letétbe helyeztük a DSMZ gyûjteménybe. A Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs a DSM 14869, a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzs a DSM nyilvántartási számot kapta. A letétbe helyezés dátuma 02. március 18. Négy Lactobacillus törzset, amelyeket Lactobacillus acidophilus Lba EB02, Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, Lactobacillus Lbxx EB03 és Lactobacillus Lbxx PB03 törzsekként tipizáltunk, egészséges humán donorokból nyert vaginális epithelsejtekbõl izoláltunk, és letétbe helyeztük a DSMZ gyûjteménybe. A letétbe helyezés dátuma 03. március. A Lactobacillus casei GG törzset, egy kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ probiotikumot Valióból (Finnország) szereztük be. A törzseket anaerob körülmények mellett tenyészettük Man, Rogosa és Sharpe tápközegekben (Merck), 37 C¹on. Izotópos jelölés céljából l 3 H-adenint adtunk ml tápközeghez, amelyet órán át inkubáltunk, majd a fölös izotópot a baktériumok kétszeri mosásával és centrifugálásával távolítottuk el. A VEC-vizsgálatban alkalmazott baktériumokat nem jelöltük izotóppal, azonban ettõl eltekintve ugyanúgy kezeltük azokat. A baktériumkoncentrációk beállításához a tenyészetek 0 nm¹en mért optikai denzitását alkalmaztuk, amint azt máshol ismertettük. 7

8 2. példa Probiotikus törzsek tapadása VEC-sejtekhez Ezzel a teszttel probiotikus Lactobacillus törzsek VEC-sejtekhez való tapadását vizsgáltuk. Nõgyógyászati vizsgálat során VEC-sejteket gyûjtöttünk steril, foszfáttal pufferezett fiziológiás konyhasóoldatba (PBS, ph=7,2). Körülbelül óra elteltével a sejtekhez gentamicint és magzati borjúszérumot adtunk. A végsõ koncentráció 0 mg/ml gentamicin és 2% szérum volt. Ezt követõen a sejteket további 24 órán át tároltuk, 4 C¹on. A tapadási vizsgálat elõtt a sejteket kétszer mostuk 2% szérumot tartalmazó PBSpufferben. A mosott probiotikus baktériumokat mmol/l laktátot és 0 mmol/l NaCl¹ot tartalmazó pufferben szuszpendáltuk, és az optikai denzitást 1,00±0,03 értékre állítottuk. A baktériumszuszpenziót 1:1 arányban elegyítettük VEC-szuszpenzióval, majd 2 órán át inkubáltuk 37 C¹on. Az inkubálást követõen a sejteket négyszer mostuk 2% magzati borjúszérumot tartalmazó PBS-pufferrel, majd egyszer sima PBS-sel. Az utolsó centrifugálást követõen a sejtüledéket néhány l pufferben szuszpendáltuk és mikroszkóplemezekre vittük. Ezt követõen a sejteket 90 C¹on szárítottuk. A megszáradt foltot metanollal fixáltuk és 0,1%¹os kristályibolya festékkel festettük. A festett készítményt fénymikroszkóppal vizsgáltuk, olajimmerzió alatt, százszoros nagyítás mellett. Donoronként 70, véletlenszerûen kiválasztott sejten meghatároztuk a baktériumok számát. A 2. ábrán bemutatott eredmények három törzs tapadását mutatják VEC-sejtekhez. Az értékek donorból származó átlagot ± SD jelölnek. A PB01 törzs tapadt a legerõsebben, sejtenként körülbelül baktériummal, 1 órán át tartó inkubálást követõen. A Lactobacillus GG törzs mutatta a letapadt baktériumok legalacsonyabb számát, míg az EB01 törzs közbeesõ értéket adott példa Probiotikus törzsek tapadása tenyésztett Caco¹2 sejtekhez Ezzel a teszttel probiotikus Lactobacillus törzsek Caco¹2 sejtekhez való tapadását vizsgáltuk. A Caco¹2 sejtvonalat (CRL-22, ATCC, USA) 4 mmol/l L¹glutamint tartalmazó Dulbecco s modified Eagle s tápközegben (Sigma-Aldrich) tenyésztettük, amelyet úgy állítottunk be, hogy 4, g/l glükózt, 1, g/l nátrium-bikarbonátot, 1,0 mmol/l nátrium-piruvátot (Sigma-Aldrich), % magzati borjúszérumot (FBS) (Merck) és 1% penicillin/streptomicint (Merck) tartalmazzon, és a tenyésztést % parciális CO 2 -nyomás mellett végeztük, 37 C¹on. A tapadási vizsgálathoz a Caco¹2 sejteket 96 vályulatú mikrotitrálólemezekre helyeztük, 1, koncentrációban. Felhasználás elõtt a sejteket 2 héten át tartottuk fenn. A sejttenyésztõ tápközeget minden másnap cseréltük, és azt 2 órával a tapadási vizsgálat elõtt lecseréltük. A baktériumtörzsek Caco¹2 sejtekhez történõ tapadását úgy vizsgáltuk, hogy a vályulatokba 0 l, izotóppal jelölt baktériumszuszpenziót mértünk be. A baktériumok hozzáadása elõtt a vályulatokat kétszer mostuk 0,% FBS-sel, 1% glutaminnal és 0,1% nem esszenciális aminosavakkal kiegészített MEM-Eagle tápközeggel (Sigma-Aldrich). Egy órán át tartó inkubálást követõen a sejttenyészetet négyszer mostuk 0 l pufferezett fiziológiás konyhasóoldattal Multiwash Plus AR (Labsystems) berendezéssel, majd 0 l, 2% SDS¹t tartalmazó NaOH-dal kezeltük percen át, hogy lizáljuk a baktériumokat, és az eredményt folyadékszcintillációs eljárással olvastuk le. A tapadási arányt (%) úgy számítottuk ki, hogy a radioaktivitást az eredeti baktériumszuszpenzió értékeihez hasonlítottuk. Az 1. ábrán mutatott adatok három probiotikus törzs tapadását mutatják tenyésztett Caco¹2 sejtekhez. A hozzáadott Lactobacillus paracasei Lbp PB01 baktériumok csaknem %¹a tapadt a tenyésztett sejtekhez az egy órán át tartó inkubálás alatt, a Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs körülbelül %¹os, és a Lactobacillus GG törzs körülbelül %¹os értékeivel összehasonlítva. 4. példa Tenyésztett Caco¹2 sejtekhez és VEC-sejtekhez történõ tapadás közötti korreláció Amint azt a 3. ábra mutatja, a tenyésztett Caco¹2 sejtekhez és VEC-sejtekhez történt tapadás jó korrelációt adott.. példa Készítmény hüvelykapszula céljára Összetevõk mg/kapszula Laktitol 328,00 Glükóz,00 Xantángumi,00 Lactobacillus acidophilus Lba EB01 12,0 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 12,0 Magnézium-sztearát 2,00 Az alkalmazásig a fagyasztva szárított tejsavas kultúrát minden idegen kontaminációtól védve kezeltük. Azt tapasztaltuk, hogy a baktériumok számára vízmentes glükózt, vízmentes laktitolt és xantángumit tartalmazó tápközeg volt optimális. A magnézium-sztearát hidrofób, tapadást gátló kenõanyag, amely biztosítja a por áramlását a kapszulák töltésekor. Minden vivõanyagot Frewitt szitán rostáltunk, és Cubus keverõ alkalmazásával elegyítettünk. A homogén porelegyet azután kapszulákba töltöttük. Minden folyamatot a helyes gyógyszergyártó gyakorlat szerint végeztünk. A tenyésztési nyersanyagot, a vivõanyagokat és a készterméket validált analitikai eljárásokkal alaposan ellenõriztük azonosításra, tisztaságra és kontaminációra nézve. 8

9 6. példa Készítmények rágható tabletták céljára Összetevõk mg/kapszula Laktitol 3,0 Xilitol 90,00 Mandarinaroma 3,0 Tejsav 9,00 Kétszer bevont Lactobacillus paracasei 6, Lbp PB01 Kétszer bevont Lactobacillus acidophilus Lba EB01 6, Magnézium-sztearát 4,0 Az alkalmazásig a fagyasztva szárított tejsavas kultúrát minden idegen kontaminációtól védve kezeltük. Azt tapasztaltuk, hogy a baktériumok számára laktitolt tartalmazó tápközeg volt optimális. A magnézium-sztearát hidrofób, tapadást gátló kenõanyag, amely biztosítja a por áramlását a tabletták préselésekor. Mandarinport és tejsavport ízesítés céljából adtunk a készítményhez. Minden vivõanyagot Frewitt szitán rostáltunk, és Cubus keverõ alkalmazásával elegyítettünk. A homogén porelegyet azután mg tömegû tablettává préseltük. Minden folyamatot a helyes gyógyszergyártó gyakorlat szerint végeztünk. A tenyésztési nyersanyagot, a vivõanyagokat és a készterméket validált analitikai eljárásokkal alaposan ellenõriztük azonosításra, tisztaságra és kontaminációra nézve. 7. példa Készítmény tejipari termék céljára Probiotikus Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs és joghurt tenyészetek elõállítása A sovány tejet magas, körülbelül 98 C¹on pasztõröztük, legalább 3 percen át. A folyamat alatt az elegy porított sovány tejjel vagy porított savóval egészíthetõ ki, a szárazanyag-tartalom növelése céljából. A magas hõmérsékleten pasztõrözött sovány tejet ezt követõen 3, 4,0% zsírtartalomra és 3,8 4,0% proteintartalomra standardizáltuk. A standardizált tejet ezt követõen 70 C¹on, 0 2 bar ( 22 Mpa) nyomáson homogenizáltuk. A standardizált és homogenizált tejet ezt követõen C¹on pasztõröztük. A tejet ezt követõen lehûtöttük, majd fermentorba pumpáltuk, ahol a hõmérsékletet a fermentációs eljárás alatt mindvégig állandó 3 C¹on tartottuk. Joghurt egyedüli ( sole )[.9] indítókultúrát, valamint probiotikus Lactobacillus acidophilus Lba EB01 törzs egyedüli indítókultúrát közvetlenül a tejbe adagoltunk, erõteljes keverés mellett. Az egyedüli fermentálókultúrák lehetnek például fagyasztott (alkalmazás elõtt C¹on tárolt) tenyészetek, amelyeket közvetlenül a fermentorba töltünk A fermentálási folyamatot addig végezzük, amíg a ph=4,6 4,4 értéket elérjük. Ezt követõen a joghurtot megkeverjük, majd C¹ra hûtjük. A joghurtot ezt követõen körülbelül 24 C¹ra hûtjük, majd közvetlenül puffertartályba pumpáljuk, ahol C¹on tartjuk, amíg csomagolóanyagba töltjük (gyümölcslekvárral vagy anélkül) és 2 C¹on tároljuk. 8. példa Hüvelykapszulák elõzetes vizsgálata Klinikai vizsgálat: Hatás és a betegek megelégedettségi szintje Az elõzetes vizsgálat célja: 1. Hüvelykapszulák klinikai hatásának vizsgálata bakteriális vaginózissal (BV) diagnosztizált nõkben. 2. Annak vizsgálata, hogy a hüvelykapszulák betegorientáltak. A betegek csoportja: Huszonegy nõ, BV diagnózissal. A BV¹t az orvos az alábbi kritériumok alapján diagnosztizálta. Kellemetlen szagú hüvelyfolyást mutató nõk: túlzott szürke és fehéres folyás 4, értéknél magasabb ph pozitív szag teszt Kiszerelési forma Az. példa szerint elõállított hüvelykapszulák humán eredetû tejsavbaktériumokat (Lba EB01 és Lbp PB01) tartalmaztak. Kezelés A diagnózist követõen a betegeket egy héten át kezeltük hüvelykapszulákkal. Két-három héttel a betegek kezelését követõen megvizsgáltuk õket, és felkértük egy beteg kérdõív kitöltésére. Vizsgálati hely A vizsgálatot egy nõgyógyászati klinikán végeztük, Drammenben (Norvégia). Eredmények A betegek mindegyike kellemetlen szagú hüvelyfolyásban szenvedett, ezen túlmenõen 12 beteg túlzott mennyiségû hüvelyfolyásban szenvedett, beteg enyhe vérzést mutatott, és 3 beteg számolt be viszketés okozta kellemetlenségrõl. Tizenhárom beteg próbálta gyógykezelni magát: 8 beteg alkalmazott Canesten kenõcsöt gombák ellen, 3 beteg alkalmazott tejsavas kúpot, és egy próbált antibiotikus kezelést. Tizenkét beteg ment orvoshoz, és BV ellen 0%¹uk fungicid ágenst, %¹uk Dalacint kapott, míg %¹uk egyáltalán nem kapott kezelést. A nõk 90%¹a (21-bõl 19) tapasztalta, hogy a tünetek elmúltak a kezelés alatt, többségük néhány nap alatt: két nap alatt: 6 beteg öt nap alatt: 9 beteg nyolc nap alatt: 4 beteg 9

10 Egyetlen beteg találta úgy, hogy a hüvelykapszulát nehéz alkalmazni, míg a többiek nagyon meg voltak elégedve. Egy beteg kivételével (azon két beteg egyike, akik nem találták a kezelést hatásosnak) mindegyik beteg újra ki akarta próbálni a kapszulákat betegsége kiújulása esetén. Mellékhatásokról nem számoltak be. Következtetések Úgy tûnik, hogy a találmány szerinti baktériumtörzseket tartalmazó hüvelykapszulák pozitív klinikai hatást gyakorolnak BV¹vel összefüggõ tünetekben szenvedõ betegekre, és ¹bõl 9 beteg meggyógyult. A betegek többsége kipróbált öngyógyítást, és felkereste orvosát. Többségük fungicid ágenst próbált alkalmazni állapota javítására. A hüvelykapszulák nagyon felhasználóbarátnak bizonyultak. 9. példa Abból a célból, hogy vizsgáljuk a laktitol in vivo szerepét a találmány szerinti prebiotikus készítményben, különbözõ hüvelykészítményeket állítottunk elõ. Hüvelykapszulák összetétele (laktitollal) Összetevõk mg/kapszula Laktitol 328,00 Glükóz,00 Xantángumi,00 Lactobacillus acidophilus Lba EB01 12,0 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 12,0 Magnézium-sztearát 2,00 Hüvelykapszulák összetétele (laktózzal) Összetevõk mg/kapszula Laktitol 328,00 Laktóz,00 Xantángumi,00 Lactobacillus acidophilus Lba EB01 12,0 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 12,0 Magnézium-sztearát 2, Hüvelykapszulák összetétele (baktériumtörzsek nélkül) Összetevõk mg/kapszula Laktitol 328,00 Glükóz,00 Xantángumi,00 Magnézium-sztearát 2,00 Baktériumtörzseket és laktitolt tartalmazó hüvelykapszulák elõnyös kiszerelési forma nõgyógyászati problémákat mutató betegek kezelésére.. példa Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (=1702 BBB Lactobacillus acidophilus) és Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (=1704 BBB Lactobacillus paracasei) RiboPrint lenyomata RiboPrint (R) lenyomat Jelölés/feltételezett ID (azonosság) Lactobacillus paracasei ss. paracasei <Jelöletlen><nincs> Lactobacillus paracasei ss. paracasei <Jelöletlen><nincs> 1704 BBB Lactobacillus paracasei Lactobacillus rhamnosus <Jelöletlen><nincs> Lactobacillus rhamnosus <Jelöletlen><nincs> Lactobacillus acidophilus <Jelöletlen><nincs> Lactobacillus acidophilus <Jelöletlen><nincs> 1702 BBB Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri <Jelöletlen><nincs> Lactobacillus johnsonii <Jelöletlen><nincs> 11. példa Lactobacillus acidophilus Lba EB01 és Lactobacillus paracasei Lbp PB01 zsírsavösszetétele Referencia-adatbázis Lb. acidophilus Referencia-adatbázis Lb. paracasei Vizsgált Lb. Acidophilus Lba EB01 Vizsgált Lb. Paracasei Lbp PB01 Zsírsav Százalék Zsírsav Százalék Zsírsav Százalék Zsírsav Százalék 14:0 4,09 14:0, 14:0 9,79 14:0 6,22 16:0 7,91 16:0 16,17 16:0 34,64 16:0 37,32

11 Táblázat (folytatás) Referencia-adatbázis Lb. acidophilus Referencia-adatbázis Lb. paracasei Vizsgált Lb. Acidophilus Lba EB01 Vizsgált Lb. Paracasei Lbp PB01 Zsírsav Százalék Zsírsav Százalék Zsírsav Százalék Zsírsav Százalék 17:1 w8c 1,24 17:1 w8c 0,6 17:1 w8c 0 17:1 w8c 0 18:1 w9c 63,03 18:1 w9c 44,07 18:1 w9c 32,79 18:1 w9c 37,4 18:1 w7c 6,17 18:1 w7c 13,18 18:1 w7c 0 18:1 w7c,6 18:0 0,9 18:0 1,0 18:0 8,17 18:0 7,04,71 9, ,16 0,6 14,6 6,41 7,09 8,3 0 0 % összesen 98,3 98,6 99, példa Lactobacillus acidophilus Lba EB01 és Lactobacillus paracasei Lbp PB01 törzsek API vizsgálata, amely mutatja a törzsek különbözõ cukrokat fermentáló tulajdonságát 1¹es szám=lactobacillus acidophilus Lba EB01 (DSM 14869) 2¹es szám=lactobacillus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870) Végsõ következtetés: 1¹es szám= Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (DSM 14869) Az API 0 CHL vizsgálat a nemzetség tekintetében jó eredményt adott, amelyet helyesnek találtunk (Lactobacillus ssp.), míg a faj szerinti meghatározás (L. acidophilus) kevésbé volt bizonyos. Eredmények Glicerin Eritritol D-Arabinóz L-Arabinóz Ribóz D-Xilóz L-Xilóz Adonitol -Metil-D-xilozid Galaktóz Glukóz Fruktóz Mannóz Szorbóz Ramnóz Dulcitol Inozitol API 0 CHL API 0 CHL 1 Mannitol Szorbitol -Metil-D-mannozid -Metil-D-glukozid N-Acetil-glukozamin Amigdalin Arbutin Eszkulin Szalicin Cellobióz Maltóz Laktóz Melibióz Szacharóz Trehalóz Inulin Melezitóz D-Raffinóz Keményítõ[.] Glikogén Xilitol Gentiobióz D-Turanóz D-Lixóz D-Tagatóz D-Fukóz L-Fukóz D-Arabitol L-Arabitol Glukonát 11

12 2-Keto-glukonát -Keto-glukonát API 0 CHL 1 Következtetés ID% T-érték (teljes egyezés a típustörzzsel=1,00) Lacto. acidophilus,7 0,74 Lacto. delb. delb. 36, 0,69 Lacto. acidophilus 2, 0,9 Végsõ következtetés: 2¹es szám= Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870) Az API 0 CHL nagyon jó eredményt adott a nemzetség és species vonatkozásában egyaránt, megállapítást nyert tehát, hogy a törzs Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Glicerin Eritritol D-Arabinóz L-Arabinóz Ribóz D-Xilóz L-Xilóz Adonitol -Metil-D-xilozid Galaktóz Glukóz Fruktóz Mannóz Szorbóz Ramnóz Dulcitol Inozitol Mannitol Szorbitol -Metil-D-mannozid -Metil-D-glukozid N-Acetil-glukozamin Amigdalin Arbutin Eszkulin Szalicin Cellobióz Maltóz Táblázat (folytatás) API 0 CHL 2.~ Laktóz Melibióz Szacharóz Trehalóz Inulin Melezitóz D-Raffinóz Keményítõ[.11] Glikogén Xilitol Gentiobióz D-Turanóz D-Lixóz D-Tagatóz D-Fukóz L-Fukóz D-Arabitol L-Arabitol Glukonát 2-Keto-glukonát -Keto-glukonát API 0 CHL 2.~ Következtetés Lacto. para. paracasei (Teljes egyezés a típustörzzsel (teljes=1,00): 0,2 ID%=97,8 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Gyógyászati készítmény, amely Lactobacillus paracasei Lbp PB01 DSM törzset és gyógyászatban elfogadott hordozót és/vagy hígítót együtt tartalmaz. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely további Lactobacillus törzset tartalmaz. 3. A 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a további Lactobacillus törzs Lactobacillus acidophilus Lba EB01 DSM Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amely egy grammjában 13 cfu (telepképzõ egység) Lactobacillust tartalmaz.. A 4. igénypont szerinti készítmény, amely grammonként 6 12 cfu Lactobacillust tartalmaz. 6. A 4. igénypont szerinti készítmény, amely a fenti Lactobacillus törzsek bármelyikébõl grammonként legalább cfu mennyiséget tartalmaz. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelynek formája szuszpenzió, spray, gél, krém, por, kapszula, öblítõoldat, hüvelykúp, pesszárium, tabletta vagy mikrokapszulázott termék. 12

13 8. Az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amely körülbelül % nyálkás adhezív vivõanyagot tartalmaz. 9. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a nyálkás adhezív vivõanyag hidrokolloid.. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a hidrokolloid xantángumi, szentjánoskenyér vagy alginát közül választott. 11. A. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a hidrokolloid xantángumi. 12. Lactobacillus paracasei Lbp PB01 DSM törzs. 13. Lactobacillus paracasei Lbp PB01 DSM törzs, Lactobacillus acidophilus Lba EB01 DSM törzzsel kombinálva. 14. Az igénypontok bármelyike szerinti készítmény, hüvelykészítmény formában, amely tartalmaz továbbá szubsztrátot a Lactobacillus törzsek számára.. A 14. igénypont szerinti hüvelykészítmény, ahol a szubsztrát patogén Candida albicans vagy Gram-negatív baktériumok által nem fermentálható. 16. A. igénypont szerinti hüvelykészítmény, ahol a szubsztrát oligoszacharid. 17. A 16. igénypont szerinti hüvelykészítmény, ahol a szubsztrát laktitol és/vagy oligofruktóz és/vagy laktulóz. 18. A 17. igénypont szerinti hüvelykészítmény, ahol a szubsztrát laktitol. 19. Abszorbens termék, például nõi higiéniai pelenka, egészségügyi betét, impregnált tampon, tisztasági betét vagy inkontinenciabetét, amely az igénypontok bármelyike szerinti készítményt tartalmazza.. Tejipari termék, amely tartalmazza a 12. igénypont szerinti törzset vagy a 13. igénypont szerinti két törzset. 21. Gyógyhatású táplálék termék, amely tartalmazza a 12. igénypont szerinti törzset vagy a 13. igénypont szerinti két törzset. 22. Funkcionális élelmiszer, amely tartalmazza a 12. igénypont szerinti törzset vagy a 13. igénypont szerinti két törzset. 23. A 12. igénypont szerinti törzs vagy a 13. igénypont szerinti két törzs alkalmazása gyógyászati készítmény elõállítására hüvelyfertõzés, gasztrointesztinális betegség vagy húgyúti fertõzések megelõzésére és/vagy kezelésére. 24. A 12. igénypont szerinti törzs vagy a 13. igénypont szerinti két törzs alkalmazása hüvelyfertõzések megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló abszorbens termék, például nõi higiéniai pelenka, egészségügyi betét, impregnált tampon, tisztasági betét vagy inkontinenciabetét elõállítására.. A 12. igénypont szerinti törzs vagy a 13. igénypont szerinti két törzs alkalmazása gasztrointesztinális betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas tejipari termék elõállítására. 26. A 12. igénypont szerinti törzs vagy a 13. igénypont szerinti két törzs alkalmazása gasztrointesztinális betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas funkcionális élelmiszer elõállítására. 27. A 12. igénypont szerinti törzs vagy a 13. igénypont szerinti két törzs alkalmazása gasztrointesztinális betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyhatású élelmiszer elõállítására. 13

14 HU T2 Int. Cl.: C12N 1/ 14

15 HU T2 Int. Cl.: C12N 1/

16 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest