Aktualitások a laboratóriumi és mikrobiológiai diagnosztikában, 2008.szeptember 18.

Átírás

1 GÁZ- és FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS TECHNIKÁK A LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKÁBAN Dr. RÓNA KÁLMÁN Semmelweis Egyetem, Igazságügyi és Biztosítás-orvostani orvostani Intézet, Toxikológiai Laboratórium Aktualitások a laboratóriumi és mikrobiológiai diagnosztikában, 2008.szeptember 18. A kromatográfia felfedezője M. Cvet botanikus, a varsói egyetem tanára volt (1906), aki szemcsés kalciumkarbonáttal töltött üvegcsövön falevél petroléteres extraktumát csurgatta át, s a levélzöld különböz alkotói egy idő után a töltött cső különböző helyein színes gyűrűket képeztek. Az elválasztás az egyes alkotóknak a kalciumkarbonát felületén történő különböző mértékű megkötődésén (adszorpcióján) alapult. Elnevezés: kromatográfia (Chroma = szín, kromatographia = színírás) T. James és A. J. Martin (1952) gázfolyadékkromatográfia-szerves vegyületek analízise. 2 1

2 A kromatográfia dinamikus szorpciósdeszorpciós folyamatokon alapúlú, különböző migrációs tulajdonságokat kihasználó nagy hatású elválasztási módszer. Az egyes komponensek fajlagos kötődése a szorbens réteghez (állófázishoz) nem azonos, ezért az ún. futtatás során az állófázishoz jobban kötődő komponensek lemaradnak. 3 A kromatogram: a kolonnáról eluálódó komponensek detektorjelének idő-függvénye. A kromatográfiás futtatás kezdetétől a komponens eluálódásáig eltelt időt retenciós (visszatartási) időnek nevezzük. A retenciós idő, a komponens anyagi minőségét jellemzi azaz kvalitatív mutató, míg a csúcs alatti terület a mennyiséggel van összefüggésben. 4 2

3 Felhasználhatóság: testidegen anyagok (TDM) endogén anyagok Állófázis geometriája szerint: planáris- (pl.:vékonyréteg) oszlopkromatográfia Mozgófázis halmazállapota szerint: folyadékkromatográfia (HPLC) gázkromatográfia (GC) A megoszlást előidéző folyamat szerint: adszorpciós (szilárd állófázis), megoszlásos (folyékony állófázis), és ioncserés (ioncserélő állófázis) 5 A VILÁGON TÖRZSKÖNYVEZETT LEGJELENTŐSEBB 50 KÉSZÍTMÉNY PLAZMASZINTJÉNEK ALAKULÁSA 100% 80% 60% 40% 20% 0% pg/ml ng/ml mcg/ml Klebovich, I.: Magyar Kémiai Folyóirat, 2005, 111(3):

4 7 HPLC 8 4

5 HPLC-UV 9 HPLC-DAD DIODA-ARRAY ARRAY DETECTOR 10 5

6 7-amino clonazepam (peak 1), 7- amino flunitrazepam (peak 2), demoxepam (peak 4), alphahydroxy triazolam (peak 6), alphahydroxy alprazolam (peak 7), oxazepam (peak 8), lorazepam (peak 9), hydroxy-ethyl flurazepam (peak 10), Internal Standard 1 (triazolam; peak 12), temazepam (peak 13), desmethyl diazepam (peak 14), Internal Standard 2 (ethyl oxazepam; peak 15). Spectral comparison of 7- amino flunitrazepam, alphahydroxy alprazolam and oxazepam. Unknown drug spectra are compared to a library of known candidates for drug identification. 11 zolpidem cinolazepam N.sz.: 0030/08 Gyorsteszt: BZO + cinolazepam UV-spektrum 12 6

7 HPLC-ECD 13 7

8 EXHAUST MECHANICAL PUMP HI VAC PUMP MASS SPECTROMETER HPLC (GC) INTERFACE ION SOURCE MASS FILTER DETECTOR CONTROLLER 15 IONFORRÁS 16 8

9 Electron Multiplier Detector + Incoming Ion X-Ray Lens (0 to -218 V) Signal Out EM Voltage (0 to V) 17 Positive Ions High Energy Dynode Electrons Electron Multiplier Quadrupole Iris Detector Focus Lens Signal Out 18 9

10 19 MINTAELŐKÉSZÍTÉS 20 10

11 AUTOMATIZÁLT ON-LINE MINTAELŐKÉSZÍTÉS

12 HPLC DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSA Katekolaminok és metabolitok Phaeochromocytoma (felnőtt) Magas vérnyomás, fejfájás, tachycardia, látási zavar, hányás, ingerlékenység Neuroblastoma (gyermek) A harmadik gyakoriság szerinti tumor gyermekkorban

13 SEROTONIN HPLC/ECD 25 Vizelet serotonin metabolitok mérése LC/MS/MS v.hplc/ed 5-hidroxi-triptofol (5-HTOL)/ 5-hidroxi-indolecetsav (5-HIAA) arány < 15 pmol/nmol Alkohol FOGYASZTÁS esetén az arány > 15 pmol/nmol 5-HTOL normál érték: < 35 ng/ml, alkohol fogyasztás után néhány órával ng/ml 5-HTOL/5-HIAA HIAA 15pmol/nmol, krónikus alkohol fogyasztás hatására eléri 1000 pmol/nmol szintet. ETANOL EREDMÉNYEK INTERPRETÁLÁSA Pragst, F., et al.: Forensic Sci. Int. 107 (2000) Johnson, RD. et al.: J. Chromatography B. 805 (2004)

14 HOMOCYSTEIN 27 Ludányi,

15 TDM Volunteer 23 Test drug Reference drug time (h) Mean (Volunteer 1-30) Test drug Reference drug time (h) 30 15

16 SIROLIMUS (A) (rapamycin) BELSŐ STANDARD (B) (32-dezmetoxi- rapamycin) 31 SIROLIMUS BIOANALITIKA (1.) MINTAELŐKÉSZÍTÉS (fehérjementesítés) 1. PP csőbe 1 ml 0,2 M ZnSO ml aceton, mix µl (20 ng) belső standard (I.St.), mix 3. 1 ml minta (teljes vér) sec vortex, centrifuga (3500 rpm, 18 ºC, 5 perc) 5. Felülúszó másik PP csőbe + 1,5 ml bideszt.víz 32 16

17 SIROLIMUS BIOANALITIKA (2.) MINTAKINYERÉS (SPE Baker-Speedisk/Phenyl-50mg/3ml) 1. Kondicionálás: - 2 ml metanol - 2 ml metanol : bideszt.víz (1:1) 2. Mintafelvitel 3. Mosás: - 2 ml metanol : bideszt.víz (1:1), 15 levegő - 2 ml Cl-bután, 5 levegő átszívás - 2 ml heptán, 5 levegő átszívás 4. Leoldás: 500 µl aceton 5. Bepárlás: szárazra N 2 alatt, 35 ºC-on 33 SIROLIMUS BIOANALITIKA (3.) MINTAKINYERÉS (folytatás előkészítés) 6. A száraz maradék feloldása 300 µl mozgó fázisban 7. Kifagyasztás -20 ºC-n, 15 percig perc szobahőn állás 9. Centrifugálás, szűrés: (Millipore - Amicon Ultrafree-MC 0,22 µm), rpm, szobahőn 10. Felülúszó átöntés az autosampler vial-ba

18 SIROLIMUS BIOANALITIKA (4.) FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA 1. Oszlop: SPHERISORB ODS-2, 250X4.6 mm, 5 µ (Thermo Hypersil-Keystone) 2. Előtétoszlop: SPHERISORB ODS-2 cartridge, 4 X 4.6 mm (Thermo Hypersil-Keystone) 3. Mozgófázis: metanol acetonitril - bideszt.víz = (30:45:25, v/v) 4. Detektálás: UV, 278 nm (SPD-10A, Shimadzu LC-10) 5. Injektált minta térfogat: 100 µl 6. Áramlási sebesség: 1 ml/perc 7. Oszloptermosztát: 65 ºC 8. Automata injektor mosófolyadék: i-propilalkohol 35 BLANK No.# Sirolimus vérkoncentráció: 19,4 ng/ml 36 18

19 3 nap, 5 párhuzamos K o n c e n t r á c i ó (ng/ml) r a b 2,5 5,0 10,0 20,0 50,0 átlag 0, ,5116-0,185 2,68 5,24 9,34 20,5 48,15 ±S.D. 0,0019 2,7214 0,081 0,19 0,23 0,41 0,78 2,12 R.S.D. (%) 6,72 7,09 4,38 4,1 3,8 4,4 Torzítás(%) 7,2 4,8-6,6 2,5-3,7 Napon belüli (n=6) Napok közötti (n=18) QC Mért koncentráció Mért koncentráció (ng/ml) (ng/ml) RSD(%) (ng/ml) RSD(%) 3,75 3,84 ± 0,30 7,81 3,52 ± 0,25 7,10 11,25 11,05 ± 0,79 7,14 12,12 ± 0,89 7,34 37,5 36,17 ±1,60 4,42 38,59 ± 1,80 4,66 % QC n SIR I.St. 3, ,9 ± 3,6 60,4 ± 2,8 11, ,5 ± 1,6 64,3 ± 2,1 37,5 5 80,3 ± 7,6 63,3 ± 5,8 átlag±s.d. 81,5 ± 4,3 62,7 ± 3,6 37 NEMZETKÖZI KÖRKISÉRLET Bioanalytical R&D, Analytical Unit, St. George s Hospital Medical School, London 5+12 International Sirolimus Proficiency Testing Scheme (ISPTS): 72 centrum (ca 50% HPLC/UV, 50% HPLC/MS) Belépő : 3+78 sikeres meghatározás (5 batch) Havonta 9 mérés: 3 koncentrációban 3 párhuzamos 38 19

20 ANYAGCSERE BETEGSÉGEK SZŰRÉSE Vékey, K.: Magyar Kémiai Folyóirat, 2006, 112(1): HEADSPACE-GC HS-GC/FID Oszlop: Rtx -BAC2 (RESTEK, Blood Alcohol Column), 30 m x 0,54 mm x 2 µm HS paraméterek: 15 min rázatás 80 º C-on Injektálás: 220 ºC, FID: 240 ºC 40 Hőfokprogram: 35 ºC (2 perc) 10 ºC/min 80 ºC (2,5 min) 20

21 Mintaelőkészítés: 20 ml HS vial 4 ml víz, 2 g NaCl, 200 µl minta Készülék: Agilent 6890N GC, Agilent 5973 inert quadrupole MS, EI, Scan: amu Mintaadagoló: Gerstel MPS2 Oszlop: Supelco SPB-624, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm HS paraméterek: 10 min rázatás 80 º C-on, 250 µl inj. Injektálás: T inj: 220 ºC Split: 1:20 Hőfokprogram: 40 ºC (4 min) 10 ºC/min 120 ºC (5 min) ESET #1. (N.sz.: 0492/07) TOLUOL 41 ESET #6. (N.sz.: 0487/07) Több napos hulla vérének GC/MS, vér: 2,708 Halál ok: Májzsugor, kivérzés, légzési elégtelenség etanol 1-propanol etil-acetát 3-metil-butanal 1-butanol dimetil-diszulfid aceton 2-propanol 42 21

22 GYÓGYSZEREK ÉS ABÚZUSSZEREK HAJBÓL TÖRTÉNŐ IGAZSÁGÜGYI TOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA A haj olyan egyedülálló biológiai mátrix, mely lehetőséget ad az abúzus retrospektív vizsgálatára Casper : Praktisches Handbuch der Gerichtlichen Medizin 11 év után exhumált személy hajából As Keats hajából 170 évvel a halála után ópiátok éves chilei és perui múmiák: benzoilekgonin Szegmentanalízis: abúzustörténet felderítése a haj hosszától függően hónapokra visszamenőleg Igazságügyi toxikológiai szempontból fontos szerek alkohol fogyasztás markerei gyógyszerek (club drugs, drug-facilitated sexual assault) ópiátok, kokain amfetamin származékok kannabinoidok 43 Auwärter V. et al: Forensic Science International 145 (2004)

23 45 DRUG FACILITATED SEXUAL ASSAULT Gyógyszer hatással elkövetett szexuális bűncselekmények /2001 FBI date rape drug pl: flunitrazepam: bódultság, csökkent ellenállás, amnesia kromatográfiás módszer - csak a 90 -es évek végén * 46 *Goullé J-P., Anger J-P.: Ther Drug Monit 26(2) (2004) **Chéze M. et al.: Forensic Science International 153 (2005) ** 23

24 NESCAFE 4 in 1 ESET #10: GC/MS, SIM 219, 235 és 307 m/z HP5-MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm Injektálás: T inj: 290 ºC Splitless: 1 µl inj. Hőfokprogram: 280 ºC (6,5 min) 20 ºC/min 320 ºC (1,5 min) éves lány, kávé kórházban, DFSA, 6 nappal később rendőrség, 4 héttel később hajanalízis LC-MS/MS = 4,4 pg/mg éves nő, DFSA a barátjától, vér 9 órával az esemény után LC-MS/MS=390 ng/ml vér (terápiás szint ng/ml) 4 héttel később 8 cm haj segment analízis: (22, 47, 67 és 9 pg/mg...) 47 Villain M. et al.: Forensic Science International 143 (2004) GHB GC/MS/MS HP5-MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm Injektálás: T inj: 270 ºC Splitless: 1 µl inj. Hőfokprogram: 100 ºC (1 min) 30 ºC/min 295 ºC (5 min) ESET #11.: 19 éves lány, soft drink, DFSA, 5 nappal késöbb rendőrség Kintz P. et al.: J Forensic Sci. 48 (2003)

25 TOXIKOGENOMIKA Farmakogenetika: egyes gyógyszerek azonos dózisú adása után bizonyos örökletes faktorok következtében, jelentős eltérés az egyének terápiás és vérszint válaszában. 49 ESET #12. ESET #12. (N.sz.: 0068/08) SPME-GC/MS metamfetamin MDMA amfetamin PMMA (4- metoximetamf etamin 50 25