Bioinspirált kapilláris rendszerek. megvalósítása és vizsgálata

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Holczer Eszter VI. évfolyamos vegyészmérnök hallgató Bioinspirált kapilláris rendszerek megvalósítása és vizsgálata Diplomaterv Témavezető: Dr. Fürjes Péter Tudományos főmunkatárs MTA TTK Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézet MEMS Lab május

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés Folyadéktranszport bioanalitikai rendszerekben Kapillaritás, folyadékáramlás mikrorendszerekben Nedvesítés Folyadéktranszport élő rendszerekben Anyagválaszték A PDMS általános jellemzése A PDMS megmintázása, mikrofluidikai csatornák készítése Lehetőségek a PDMS módosítására Koncepció passzív, PDMS kapilláris pumpa kialakítására Alkalmazott anyagok és kísérletek leírása Felhasznált vegyszerek, fehérjék A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületi összetételének vizsgálata A felületi nedvesíthetőségnek, a minták öregedésének, stabilitásának, és a tenzidek oldatba történő diffúziójának vizsgálata A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületének kölcsönhatása sejtekkel és fehérjékkel Biokompatibilitás vizsgálata Nem-specifikus fehérjebekötődés vizsgálata Kapilláris rendszerek vízszállító képességének vizsgálata Eredmények A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületi összetételének változása A felületi nedvesíthetőségnek, a minták öregedésének, és a tenzidek oldatba történő diffúziójának vizsgálata A felületi nedvesedés változásának vizsgálata A különböző összetételű minták öregedése, hosszú távú stabilitása A minták tenzid tartalmának oldatba történő diffúziója A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületének kölcsönhatása sejtekkel és fehérjékkel Biokompatibilitás vizsgálata Nem-specifikus fehérjebekötődés vizsgálata Kapilláris rendszerek vízszállító képességének vizsgálata Összefoglalás Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék

3 1. Bevezetés Napjainkban a mikro és nanotechnológián alapuló érzékelési elvek új utat nyitnak az olyan extrém kis méretekkel rendelkező érzékelő rendszerek felé melyek képesek az élő szervezet fizikai, kémiai, vagy biológiai paramétereinek gyors és hatékony monitorozására. Ma már számos analitikai teszt célozza meg a vérben megtalálható markerfehérjék vagy más biomolekulák nagy érzékenységgel történő, akár jelölésmentes vagy multi-paraméteres detektálását. A mikroelektronikai technológiákkal előállított érzékelők az ilyen analitikai rendszerek számára is biztosítják a méretcsökkentés lehetőségét: az integrált áramkörök alapanyagaival és technológiájával dolgozva viszonylag olcsón és nagy mennyiségben állíthatóak elő ezek a miniatűr mégia komplex érzékelő rendszerek. A technológia lehetővé teszi, hogy a szenzor és a hozzá tartozó kiértékelő áramkör is egy chipre kerüljön, így biztosítva a gyorsabb információfeldolgozást, a hatékonyabb szabályozást és a jobb ellenőrizhetőséget. A miniatürizáció révén az analitikai rendszerek reagens igénye mikro- vagy nanoliteres nagyságrendre csökkenthető, ez pedig szükségessé teszi a precíz, akár molekuláris szintű folyadékműveleteket végezni képes integrált, úgynevezett mikrofluidikai rendszerek fejlesztését. A mikofluidikai rendszerek révén megnyílik az út az egy chipen minél több (mintapreparációs és analitikai) funkciót megvalósító, automatikus analízisre képes minilaborok, úgynevezettt lab-on-a-chip (vagy másképp Micro Total Analysis System, µtas) rendszerek létrehozása előtt. 1. ábra: Lab-on-a-chip 3

4 Az ilyen eszközök nemcsak gazdaságosabbá teszik a biológiai minták amúgy sokszor igen költséges elemzését, de méreteik miatt a hordozhatóság követelményinek is megfelelnek. A mikrofluidikai csatornákban a folyadékok transzportja már kisebb energia befektetéssel is megvalósítható, nem beszélve arról, hogy a mikrotartomány több makroméretben nem mutatkozó jelenség felhasználást is lehetővé teszi. A hordozható analitikai rendszerek alkalmazhatóságának egyik feltétele, hogy az érzékelő integrálható legyen egy, a funkcionális megbízhatóság mellett megfelelően robosztus, hosszú távon stabil és biokompatibilis mikrofluidikai rendszerbe. A fuidikai rendszernek a mintatranszporton kívül alapvető mintapreparációs feladatokat is el kell látnia, így a megfelelő anyagválasztás, felületmódosítás, geometria és gyártási technológia megtalálása kulcsfontosságú. 2. ábra: A mikrofluidikai rendszer funkciói A Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Kutatóközpontjának Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézetében folyatott munkám célja egy olyan, lehetőleg polimer alapú, külső energia befektetés nélkül, a kapillaritás elvén működő fluidikai rendszer megvalósítása, mely képes akár multi-paraméteres analitikai teszteket végző rendszerek integrálására és biológiai minták hatékony kezelésére. A kutatómunkám során egy lehetséges alapanyag felhasználhatósági és módosítási lehetőségeivel foglalkoztam és megvizsgáltam az ebből létrehozott kapilláris rendszer teljesítményének javítási lehetőségeit. 4

5 1.1. Folyadéktranszport bioanalitikai rendszerekben A mikroanalitikai rendszerek alkalmazásához elengedhetetlen a megfelelő sebességű folyadéktranszport biztosítása, és a mikrorendszerek fejlesztése során erre többféle megoldási lehetőséget találtak. A legtöbb mikrofluidikai alkalmazás esetén a folyadék áramoltatását külső, makroszkópikus pumpák segítségével oldják meg. A MEMS 1 eszközök fejlődésével az áramlást biztosító pumpák és egyéb érzékelők, beavatkozók integrálhatóvá váltak a fluidikai rendszerbe. A MEMS-alapú pumpák működési elve igen sokféle lehet: léteznek a Coulomb kölcsönhatáson, piezoelektromos jelenségen, hőmérséklet különbségen, alakemlékező ötvözeteken alapuló mechanikus pumpák, de vannak az elektroozmózist kihasználó vagy elektrokémiai alapon működő rendszerek is [1]. Az ilyen pumpák megvalósítása szinte mind aktív elemek jelenlétét eredményezi a rendszerben vagy szükségessé teszi valamilyen külső energiaforrás használatát. Az aktív elemek és külső energiaigény kiküszöbölése érdekében elindult az autonóm működést biztosító, kapillaritáson alapuló eszközök fejlesztése. A kapillaritást már régóta használják az immunanalitikai eszközökben: a különböző immunkromatográfiás teszteknél porózus anyagok segítségével oldották meg a folyadékmozgatást. Erre a legjobb példák a régóta kereskedelmi forgalomban lévő terhességi gyorstesztek. Mivel a kapillaritáson alapuló eszközöknél a hordozhatóság könnyen biztosítható, az utóbbi időben rengeteg kutatás foglalkozott autonóm kapilláris rendszereken alapuló immunanalitikai eszközök fejlesztésével. A fejlesztések eredményei alapján ma már rengeteg különféle kapilláris struktúra létezik, melyek képesek különféle folyadékmanipulációs műveletek elvégzésére [2][3]. Az ilyen struktúrák alkalmasak a folyadék hatékony mozgatására, akár szabályozott formában is szelepek segítségével, valamint a minta buborékmentesítésére vagy különböző oldatok keverésére is [4][5][6]. Az eddig elkészült rendszerek hátránya, hogy alapanyaguk vagy szilícium, ami relatíve magas előállítási költséget eredményez, vagy olyan polimer melynek hosszú távú felhasználhatósága nem biztosított. A munkám célja olyan hatékony kapilláris rendszer fejlesztése mely olcsón előállítható, felületi jellege hosszú távú felhasználhatóságot és biokompatibilitást valamint hatékony folyadéktranszportot biztosít. 1 MEMS: Micro-ElektroMechanical Systems 5

6 1.2. Kapillaritás, folyadékáramlás mikrorendszerekben Egymással nem elegyedő fázisok találkozása esetén, a határfelületen lévő molekulákra aszimmetrikus erők hatnak, aminek eredménye képen a határfelület a tömbfázishoz képest többletenergiára tesz szert. Ez a felületi energia annál nagyobb jelentőségű, minél nagyobb a felület aránya a tömbfázis arányához képest. A leghétköznapibb példája ennek a többletenergiának a folyadékcseppek hatására kialakuló gömb alakja. A folyadékfázis belsejében lévő molekulákat minden oldalról azonos molekulák veszik körül, míg a határfelületen lévő molekuláknak a folyadékfázis felől sokkal több szomszédjuk van, mint a gázfázis felőli oldalról, emiatt a folyadékcsepp igyekszik csökkenteni a felszínét. Mivel adott térfogat esetén a gömbalaknak van a legkisebb felülete a csepp összehúzódik, így csökkentve az energiáját. Az ilyen görbült folyadékfelszínek megjelenése nyomáskülönbség kialakulásához vezet a folyadékfelszín két oldalán. A görbült felszín homorú oldalán nagyobb a nyomás, mint a domború oldalon, ez eredményezi az úgynevezett kapilláris emelkedést és kapilláris depresszió jelenségét [7]. 3. ábra: Kapillárisban kialakuló folyadékfelszínek típusai Nedvesítő folyadékok esetén az illeszkedési szög a kapillárisban kisebb, mint 90, a kapillárisban a folyadék addig emelkedik, amíg a belső és külső nyomás közti különbség kiegyenlítődik. A külső és belső nyomás különbsége az úgynevezett kapilláris nyomás. A kapilláris nyomás értéke négyszögletes csatornára az alábbi formában írható fel [8]: (1) ahol γ a folyadék felületi feszültsége a folyadék-gáz határfelületen, α a,f,b,j a folyadék kontaktszöge a csatorna alsó, felső, bal illetve jobb falán, h és w a csatorna mélysége 6

7 és szélessége. Az egyenlet alapján a kialakuló nyomáskülönbséget a csatorna geometriája és a felületek nedvesíthetősége határozza meg. A kapillárisnyomás alapján a mikrocsatornában kialakuló áramlási sebesség (2) ahol η a folyadék viszkozitása, P a folyadék belsejében és a folyadékfront előtt kialakuló nyomás különbsége, ami csak a kapillaritás elvén működő csatornák esetén megegyezik a kapilláris nyomással, R F pedig az áramlási ellenállás. A csak a kapillaritás által működtetett csatornákban akkor alakulhat ki folyadékáramlás, ha a folyadék nedvesíti a felületet, ekkor az (1) egyenlet alapján kapilláris nyomás értéke negatív, az egyenletbe a kapilláris nyomás abszolút értékét kell behelyettesíteni. Az áramlási ellenállás a hidraulikai sugár (R H ) és a csatorna hosszának (L) ismeretében számítható ki, az alábbi egyenletek segítségével (3). (4) 1.3. Nedvesítés A nedvesítés egy a szilárd-folyadék határfelületen megjelenő jelenség. Ha a szilárd felszínre egy folyadékcseppet helyezünk, akkor a felületi tulajdonságoktól és a folyadék minőségétől függően a csepp szétterül a felszínen vagy valamilyen kontaktszöggel illeszkedik hozzá. A kontaktnedvesedéskor kialakuló peremszög ideálisan sima felszín esetén a kialakuló felületi feszültségek alapján a Young-egyenlet segítségével adható meg, = (5) ahol Θ az egyensúlyi peremszög és γ a megfelelő felületi feszültségek vektorai (S: szilárd, L: folyadék, G: gáz fázis). A peremszög értékek alapján hatféle nedvesítést különböztetünk meg: 7

8 θ = 180 nincs nedvesítés θ < 90 elégséges nedvesítés 180 >θ > 90 minimális nedvesítés θ < 30 jó nedvesítés θ = 90 elégtelen nedvesítés θ 0 tökéletes nedvesítés 1. táblázat: A felületi nedvesítés típusai a peremszög függvényében Ha a folyadék víz, akkor 90 -os peremszög felett hidrofób, 90 -nál kisebb érték esetén hidrofil felületről beszélünk. Nem ideálisan sima felületek esetén a felületi érdesség is befolyásolja a kialakuló peremszöget. A felületi heterogenitások nedvesítésre gyakorolt hatásának leírására általában kétféle modellt alkalmaznak. Cassie-Baxter modell Wenzel modell 4. ábra: A Cassie-Bexter és a Wenzel modell féle nedvesítés A Cassie-Baxter modell szerint a folyadék nem hatol be az érdesség miatt kialakult résekbe, a folyadékcsepp alatt szilárd-folyadék, és folyadék-gáz határfelület is megtalálható [9]. A Wenzel-modell ezzel szemben homogén nedvesítést feltételez, az érdes felületen látszólagos peremszög alakul ki, melynek értékei az alábbi egyenlettel adhatók meg: = (6) ahol θ l a látszólagos peremszög, θ a sima felületen mérhető peremszög, r W a Wenzel féle érdességi faktor [10]. Az egyenletből látszik, hogy 90 -nál nagyobb peremszög esetén a felületi érdesség növeli, 90 -nál kisebb peremszög esetén csökkenti a látszólagos peremszög értékét, így megfelelő felületi heterogenitásokkal a látszólagos peremszög érték csökkenthető, a felület nedvesíthetősége javítható. A nedvesíthetőség 8

9 javítása a kapilláris rendszerek vízszállító képességének növelése érdekében kulcsfontosságú Folyadéktranszport élő rendszerekben A természetben rengeteg hatékony és precíz folyadékszállító rendszer létezik. A leghatékonyabb mikrofluidikát használó élőlények nem meglepő módon a fák, melyeknek vízszállító kapillárisai képesek nagy mennyiségű víz szállítására a fák gyökerétől egészen a levelekig. Az egy fában található transzport elemek teljes hossza akár a néhány száz kilométert is elérheti [11]. A fák vízszállító szövetének, a xilémnek (xylem) az alapanyaga cellulóz, hemicellulóz és lignin keveréke, melynek következménye hogy a kapillárisok belsejét a víz nem tudja tökéletesen nedvesíteni. A nem tökéletes nedvesítés buborékok kialakulását eredményezheti a szöveteken belül, melyek megállítják a víz áramlását. Ennek az ellensúlyozására a fák vízszállító szövetei között van átjárás, így a működésképtelenné vált részek elkerülhetőek. Nedves éghajlaton élő fák esetében, ahol a növény rendszeres folyadék utánpótlásban részesül ez az ellensúlyozás elegendő a megfelelő folyadékellátás biztosításához. Száraz éghajlaton azonban hatékonyabb vízszállító rendszerekre van szükség, hogy a csapadékos időszakokban a fa elegendő vizet tudjon felvenni. 20 m 5. ábra: Példák a fák vízszállító szövetében kialakuló másodlagos struktúrákra. Ennek érdekében a szárazság tűrő fák vízszállító szövete módosult, belső felületükön különböző másodlagos struktúrák figyelhetőek meg. A másodlagos struktúrák 9

10 megnövelik a kapillárisok felületének érdességet, így a kialakuló látszólagos peremszög kisebb lesz, mint a sík felület esetén mérhető peremszög. A látszólagos peremszög kisalakulása miatt a szövet belseje szinte tökéletesen nedvesíthetővé válik [12]. A tökéletesen nedvesíthető felületeken a kavitáció is kisebb mértékű, a folyadéktranszport pedig gyorsabb és hatékonyabb. A felületi érdesség vagy másodlagos struktúrák áramlási sebesség növelő hatását fizikai modellezéssel is bizonyították [13][14]. Az áramlási iránnyal párhuzamosan orientált, meghatározott geometriai paraméterekkel rendelkező struktúrák megnövekedett áramlási sebességet eredményeztek, míg azok a struktúrák, amelyek orientációja merőleges volt az áramlási irányra lelassíthatták vagy megállíthatták az áramlást a csatornákban. Az általam tervezett kapilláris rendszerek hatékonyságának növelése érdekében a csatornákban a fák vízszállító szövetéhez hasonló másodlagos struktúrákat hoztam létre. 10

11 1.4. Anyagválaszték A bioanalitikai rendszerek miniatürizálását a félvezető-megmunkálásban bevetten használt mikrotechnológiai eljárások adaptálása és alkalmazása tette lehetővé. Az elsősorban szilíciumot és annak vegyületeit, például különböző üvegeket alkalmazó technológiák az alapanyagok biokompatibilitása és a kidolgozott technológiai folyamatok miatt kerültek előtérbe. A csatornakészítés ezeknél az alapanyagoknál speciális eszközháttér és körülmények megteremtését igényli, emiatt a mikroanalitikai rendszerek előállítása relatíve magas gyártási költséggel jár. A költséghatékonyságot szem előtt tartva megindult a keresés olyan olcsóbb alapanyagok iránt, amik egyszerűen, de a korábbi µm-es felbontással megmunkálhatók. Kézenfekvő megoldást jelentettek a problémára a félvezetőiparban már régóta jelen lévő polimerek, melyeket elsősorban a litográfiai eljárás során fotorezisztként alkalmaztak. A passzív mikrofluidikai rendszerek kialakítására alkalmas polimer az alábbi követelményeknek kell, hogy megfeleljen: - µm-es felbontással megmintázható legyen, - nagy mélység/szélesség arányú csatornákat lehessen kialakítani benne, - a csatornák szivárgásmentesen lezárhatóak legyenek, - a csatornák felületi érdessége kézben tartható legyen, hogy a csatornában biztosítható legyen a lamináris áramlás, - a felületi tulajdonságok lehetővé tegyék a passzív folyadékáramlás kialakulását, - a felület ne lépjen kölcsönhatásba a minta lehetséges alkotóelemeivel, - az analitikai rendszer és egyéb elemek integrálhatóak legyenek. A fluidikai rendszerek készítésére ma legelterjedtebben alkalmazott polimer a polidimetil-sziloxán (PDMS), mely kiemelkedő megmintázhatóságával és fénytörési tulajdonságaival is illeszkedik a nagy részben optikai alapú bioanalitikai vizsgálatokhoz. Mivel a PDMS a szilícium megmunkálásához használt technológiával könnyen, megfelelő felbontásban megmunkálható, előállítási költsége mégis jóval kevesebb, így a diplomamunkám során ennek az anyagnak a felhasználhatósági és módosítási lehetőségével foglalkoztam, mint lehetséges kapilláris pumpa alapanyag. 11

12 1.5. A PDMS általános jellemzése A PDMS nem véletlenül lett a mikrofluidikai rendszerek egyik leggyakoribb alapanyaga, kedvező tulajdonságai sokféle felhasználást tesznek lehetővé. PDMS fluidikai rendszerekben való alkalmazhatóságát demonstrálták például kapilláris elektroforézis kivitelezésével, de PDMS-üveg mikroreaktorokban sejt-mentes fehérjeszintézis is megvalósítható [15]. PDMS alapanyagú rendszerekben lehetséges biomolekulák, például peptidek, fehérjék, aminosavak, DNS molekulák szeparációja, de akár immunanalitikai tesztek elvégésére is van lehetőség, de emulziók előállítására is alkalmaznak ilyen alapanyagú fluidikai chipeket [16] [17]. 6. ábra: A PDMS lánc összetétele A PDMS egy szilícium bázisú polimer, elállításához a szilikon alapú elasztomer és platina tartalmú térhálósító megfelelő arányú összekeverésére van szükség. Az addíciós reakció során dimetil-sziloxán csoportok hálózata jön létre. A reakció előnye, hogy melléktermékek képződésével nem jár, így az anyag zsugorodása minimális, a térhálósodott polimer geometriai méretei emiatt pontosan megegyeznek a felhasznált öntőforma méreteivel. 7. ábra: A polimer képződését leíró reakció 12

13 A kész műanyag kémiailag és biológiailag inert, víztiszta, rugalmas anyag. Nagy előnye még, hogy olcsó, könnyen megmintázható, és oxigén plazmás érzékenyítéssel a fizikai tapadás mellett kovalensen is köthető önmagával és más szilícium bázisú felületekkel. Ez lehetővé teszi, hogy a PDMS-ből szivárgásmentes csatornákkal rendelkező, akár heterogén (PDMS-Si, PDMS-üveg) mikrofluidikai rendszereket hozzunk létre. A PDMS alkalmazását azonban nehezíti, hogy képes kisméretű szerves molekulák (pl: gyógyszermolekulák, kis fluoreszcens molekulák), szerves oldószerek abszorpciójára, ami a polimer duzzadásával is járhat, valamint kiváló gázáteresztő képessége miatt a vízmolekulák evaporációja is lejátszódhat. Legnagyobb hátránya felületének hidrofób jellege. Ez meggátolja, hogy víz bázisú minták kezelésére autonóm rendszereket valósítsunk meg benne, mivel a kapilláris effektus kihasználásának alapvető feltétele, hogy a felületet a vizes minta nedvesítse. Ismeretes az is, hogy a hidrofób felületek - a felület és a fehérjék hidrofób részei között létrejövő hidrofób kölcsönhatás és a kölcsönhatás miatt felszabaduló szolvatált vízmolekulák miatt - kedveznek a nem-specifikus fehérje adszorpciónak [18]. Emiatt előfordulhat, hogy PDMS alapú mikrofluidikai rendszerekben a detektálni kívánt molekula lerakódik a csatorna falán még mielőtt elérné az analitikai rendszer érzékeny területét, így a vizsgálat téves eredményt szolgáltat. Ahhoz, hogy a PDMS valóban hosszútávon alkalmazható legyen, mint analitikai rendszereket kiszolgáló fluidikai platform alapanyaga mindenképpen szükség van felületi jellegének megváltoztatására. A nemspecifikus fehérjebekötődés meggátlásához olyan hidrofil csoportokra van szükség a felületen melyek képesek a folyadékfázis felé orientálódni [19][20]. A fehérjék ilyen csoportokkal való kölcsönhatása az entrópia csökkenését eredményezné, így ennek megfelelően a bekötődésük gátolt. A fehérje bekötődés gátlására alkalmas csoportok hidrofil tulajdonságuk miatt ugyanakkor alkalmasak arra, hogy megfelelő nedvesíthetőséget biztosítsanak a felületen, így passzív mintaszállító rendszerek megvalósítására is lehetőség nyílik. A kísérleti munkám egyik fontos része így az, hogy olyan felületmódosítási eljárást találjak mely képes a PDMS hidrofób felületi jellegét hosszútávon megváltoztatni. 13

14 1.6. A PDMS megmintázása, mikrofluidikai csatornák készítése A PDMS elterjedését többek közt a könnyű és gyors megmintázhatóság tette lehetővé. Mivel ez nem egy fényérzékeny polimer a mikrotechnológiában alkalmazott litográfiás úton közvetlenül nem munkálható meg. A megmintázás az úgynevezett soft litography technikával replika öntés alkalmazásával lehetséges. A technológia lépései az alábbi ábrasoron láthatóak: UV megvilágítás PDMS Maszk Szilícium szubsztrát SU-8 lakk Szilícium szubsztrát PDMS SU-8 lakk SU-8 lakk Szilícium szubsztrát Szilícium szubsztrát 8. ábra: A replika öntéses soft lithography technológia lépései Az ábrakialakításhoz először az öntőforma elkészítésére van szükség. Ehhez a sík szilícium szeletre először fotoreziszt réteget kell felpörgetni, ennek minősége határozza majd meg az öntőforma geometriai tulajdonságait. Nagy mélység-szélesség arányú csatornák kialakításához az SU-8 típusú, negatív fotoreziszt használatára van szükség. Az epoxy bázisú reziszt nagy viszkózussága miatt akár 1mm vastag réteg előállításához is használható. A hordozóra történő felcentrifugálás után egy előzetes hőkezelés következik, melynek hatására a maradék oldószer elpárolog a rétegből, ezután a lakkot a kívánt ábrát tartalmazó maszkon keresztül nagy energiájú UV fénnyel kell megvilágítani. Mivel a lakk fényáteresztő képessége nagy, vastag réteg esetén is szinte derékszögű oldalfalak kialakítása lehetséges. A megvilágítás után a 14

15 lakkábra a megfelelő oldószerben előhívható. A lépések többszöri megismétlésével akár többrétegű mintázatok is kialakíthatóak. A többrétegű ábrák készítése lehetővé teszi, hogy a PDMS-ben bonyolult mintázattal rendelkező csatornákat is létrehozzunk. A PDMS szubsztrát előállításához a megfelelően homogenizált elasztomer és térhálósító elegyét a kívánt minta negatívját tartalmazó szilícium hordozóra öntjük. A homogenizálás során a PDMS-ben buborékok képződnek. Ha a PDMS térhálósítása szobahőmérsékleten történik, a buborékok maguktól eltávoznak a polimerből, de magas hőmérsékletű térhálósítás esetén külön buborékmentesítést kell végezni. A teljes térhálósodás után a PDMS szubsztrát könnyen lefejthető a hordozóról. 9. ábra: PDMS szubsztrát lefejtése az öntőformáról A mikrofluidikai rendszer elkészítéséhez a megmintázott PDMS szubsztrátot a fluidika ellendarabjához kell rögzíteni, lehetőleg úgy, hogy szivárgásmentes csatornák jöjjenek létre. A megfelelően tömített csatornák készítéséhez a két darab között kovalens kötést kell létrehozni, ehhez a felületek oxigénplazmás érzékenyítésére van szükség. A plazma hatására a szilícium bázisú felületeken szilanol csoportok képződnek, így a felületek között Si-O-Si kötések tudnak létrejönni. Ha a felületen egyéb molekulák is jelen vannak és a létrejövő hidroxil csoportok száma kevesebb, akkor a felületek összenyomása után hőkezelésre is szükség van, hogy megfelelő erősségű kötés jöjjön létre a hordozók között. A PDMS felületének módosításához olyan eljárásra van szükség mely lehetővé teszi, hogy a PDMS továbbra is megmintázható legyen a fent leírt módon, valamint oxigén plazmás felületaktiválással lehetséges legyen a szubsztrátok bondolása. 15

16 1.7. Lehetőségek a PDMS módosítására Oxidáció A PDMS felületének oxidációja lehetséges gáz és folyadékfázisú reakcióval is. A gázfázisú reakcióknál, vagy más néven energia-indukált felületmódosításnál a kezelés hatására hidroxid csoportok képződnek a felületen, ez okozza a felületi jelleg megváltozását. A felületmódosításhoz használható oxigén, vagy levegő plazma valamint UV sugárzás [16]. Az UV sugárzással történő kezelés a plazmás kezelésnél jóval több időt vesz igénybe, viszont az oxidáció a polimer mélyebb rétegeiben is lejátszódik a molekulák roncsolódása nélkül. Az oxigén plazma helyett létezik CF 4 plazmás felületkezelés is, ennek során a PDMS felületén fluorozott csoportok képződnek [21]. Folyadék fázisú oxidáció megvalósítható 1M NaOH oldattal, vagy H 2 O/H 2 O 2 /HCL keverékével [22]. A felületi oxidáció hátránya, hogy a PDMS mátrixban szabadon mozgó oligomer láncok miatt a hidrofil felületi jelleget nehéz megőrizni, a hidrofób visszarendeződés néhány órán belül bekövetkezik. A hidrofil jelleg megtartásához többféle módszerrel kísérleteztek. A nem térhálósodott monomerek és oligomerek extrahálása trietilamin, etil-acetát és aceton segítségével jelentősen megnöveli a hidrofil felület élettartamát. A felületi jelleg megőrzéséhez egy másik lehetséges módszer az oxidált felület vizes oldattal való tartós érintkeztetése [16]. Oxigén plazma 10. ábra: A PDMS felületének oxigén plazmás oxidációja 16

17 Grafting - Oltás Az oxidált felületek tovább módosíthatóak, ha kovalens kötéseket alakítunk ki más molekulákkal. Az oxidációs eljárások további kémiai reakciókkal történő kombinálására számos példa található az irodalomban. Gyakran alkalmazott módszer a PDMS felület szilanizálása, mely történhet például aminopropil-trietoxi-szilán (APTES) alkalmazásával [16]. Hidrofil vagy reszponzív polimer rétegek is létrehozhatóak UV kezeléssel kombinált polimerizációval. Ilyen módon polietliénglikol (PEG), poliakrilsav (PAAc), vagy hőmérséklet érzékeny poli(n-izopropilakrilamid) (pnipa) réteg hozható létre a PDMS felületén [16]. Oxigén plazmás felületaktiválás után lehetséges aminanaftol származékok kapcsolása is a felülethez. Az ilyen származékok egyedileg szintetizálhatóak, szerkezetüktől függően segíthetik a felület nedvesíthetőségének növelését, de a biokompatibilitás javítására is szolgálhatnak [23]. 11. ábra: Kovalens kötés kialakításának lépései Vékonyrétegek leválasztása A vékonyrétegek leválasztásához számos módszer található az irodalomban, attól függően, hogy milyen típusú réteget akarunk leválasztani. Folyadákfáziból leválaszthatóak úgynevezett LBL (Layer-by-Layer) filmek. [24] Az egyszerű és hatékony módszer során polianion és polikation molekukák váltakozó adszorpciója történik a felületen. Hátránya, hogy a poliionos vegyületek leválasztása sokszor szerves oldószerekből történik, mely a PDMS duzzadását okozhatják. A felületi fiziszorpciót kihasználva leválaszthatók a PDMS felületre különböző nem ionos molekula rétegek, például poli-dimetil-akrilamid (PDMA), de tenzidek, például Brij 17

18 37, Pluronic család adszorpciója is megvalósítható, akár áramló oldaltból is [24]. Az adszorpció során a molekulák hidrofób része kölcsönhatásba lép PDMS-sel, míg hidrofil részük a vizes fázis felé orientálódik. A nem-specifikus adszorpció meggátlására alkalmaznak szándékos fehérje adszorpciót a felületen, mely során a felületi kötőhelyeket telítik valamilyen az alkalmazás szempontjából indiferens fehérjével, például BSA-val [16]. Cisztein gazdag proteinek, másnéven hidrophobin molekulák felületi önszerveződő folyamtát kiahsználva a nem-spefikus fehérjeadszorpció jelensége minimalizálható. Heparin immomibilizása a felületen nem csak a nedvesíthetőségén javít, de véralvadásgátló hatású is, ami a vérminták kezelését könnyíti meg [25]. A folyadékfázisú rétegleválasztások közé tartoznak a szol-gél típusú módszerek is. Ilyen módon a megfelelő prekurzor oldat alkalmazásával TiO 2, SiO 2, VO 2, ZrO 2 rétegek választhatók le a PDMS-re. TiO 2 és SiO 2 vékonyrétegek leválasztása megvalósulhat kéimai gőzfázisú leválasztással 2 (CVD) vagy porlasztással is. Az így leválasztott fém vagy fémoxid rétegek hátránya, hogy a transzparenciájuk nem mindig megfelelő, illetve a könnyen elrepednek a rugalmas PDMS felületen [16]. 12. ábra: Az LBL filmek kialakításásának sematikus ábrája Embedding Beágyazás Mesterséges amfipatikus molekulák beágyazása a tömbfázisba megváltoztathatja annak felületi jellegét ha az vizes bázisú oldalttal érintkezik. A molekulák beágyazása történhet a tárhálósodási reakció lejátszódása előtt - ilyenkor a prepolimer keverékhez kell adni a beágyazni kívánt molekulákat -, vagy után - ekkor a tenzideket szerves oldószerben oldják fel melyek képesek duzzasztani a PDMS-t [26][27]. A duzzadt 2 CVD Chemical Vapour Deposition 18

19 PDMS mátrixba a tenzidmolekulák hidrofób része behatol, majd a szerves oldószer vízbázisú oldaltra történő cseréje után a molekulák rögzülnek a mátrixban. A térhálósodás elötti adagolás előnye, hogy a technológiai folyamatba egyszerűen beilleszthető, a PDMS felszíne pedig csak akkor változik meg a jelentősen ha a minta vízzel érintkezik, így az oxigénplazmás érzékenyítéssel továbbra is lehetséges a kovalens kötés kialakítása. Az eljárásnak alkalmazására számos irodalmi példa létezik [28][29]. 13. ábra: Amfipatikus molekulák elrendeződése a PDMS felületén 1.8. Koncepció passzív, PDMS kapilláris pumpa kialakítására Ahhoz, hogy a PDMS-ben passzív kapilláris pumpát tudjak készíteni megfelelő felületmódosítási eljárás kiválasztására van szükség. A felületmódosítás lehetővé kell, hogy tegye a PDMS eredendően hidrofób felületén egy stabil hidrofil réteg létrehozását, amí megfelelő nedvesíthetőséget biztosít a folyadékáramlás megindításához, valamint képes meggátolni a fehérjék adszorpcióját a felületen. Fontos szempont ugyanakkor, hogy a módosítás mellett is transzparens, az eredeti mintához hasonló állagú anyagot kapjak, ami megmintázható a replika öntéses technológiával és továbbra is bondolható oxigén plazmás kezelés után. Az eljárás kiválasztásánál szempont volt még, hogy minél több chip módosítását tegye lehetővé egyidejűleg, és a lehető legkevesebb új technológiai lépés beiktatását eredményezze. 19

20 Ez alapján az irodalomban fellelhető módszerek közül a tenzid molekulák beágyazását választottam. A tenzid molekulák mindaddig a mátrixban maradnak míg a minta felülete nem érintkezik vizes oldattal, ekkor a molekulák a felültre diffundálnak és ott hidrofil láncukkal a poláros fázis felé orientálódnak. A tenzidmolekulák beágyazása egyszerűen megtehető a prepolimerhez történő hozzákeveréssel, az irányított diffúzió pedig lehetővé teszi, hogy a PDMS-t továbbra is kovalensen tudjam bondolni más szilícium alapú felületekhez. Az irodalmi hivatkozások alapján kétéféle tenzidet választottam, a Triton X-100 nevű ipari tenzidet és a PDMS-b-PEO kopolimert. Mindkét molekula hidrofil része egy 9-10 egység hosszú poli-etilénoxid (PEO) lánc, méretük megyegyzik a PDMS oligomerek méretével így könnyen tudnak mozogni a mátrixban. A két molekula közti különbséget a hidrofób csoportok eltérő szerkezete adja. PDMS-b-PEO Triton X ábra: A PDMS-b-PEO és a Triton X-100 szerkezeti képlete A kísérletek során felhasznált minták tenzidkoncentrációját úgy határoztam meg, hogy a minta térhálósodása megfelelően lejátszódjon, az állaga és a transzparenciája ne akadályozza a felhasználást és továbbra is bondolható legyen a PDMS. Ez a Triton X- 100 esetében 0,1 és 0,2 V/V% koncentrációjú, a PDMS-b-PEO-nál pedig 0,1, 0,2, 0,5 és 1,25 V/V% koncentrációjú felhasználást tesz lehetővé. Bár irodalmi példák nagyobb mennyiségű tenzid felhasználásról is említést tesznek, az általam készített nagyobb koncentrációjú mintáknál térhálósodási problémák és erős opálosodás lépett 20

21 fel, illetve volt olyan minta, amit sem önmagához, sem szilíciumhoz nem tudtam bondolni még hőkezelés alkalmazásával sem. A módosított összetételű PDMS minták felületének minősítéséhez megvizsgáltam a minták felületét IR spektroszkópia segítségével, ennek alapján a felületi összetételről kaptam információt. A nedvesíthetőség vizsgálatához peremszög mérést végeztem a minták felületén, aminek a segítségvel jól követhető volt a felületi jelleg változása. Szintén peremszög mérés segítségével tanulmányoztam a minták öregedését és a tenzidek mintaoldatba történő diffúzióját is. Munkám során megvizsgáltam a beágyazott tenzidek hatását emberi sejtekre, valamint flureszcens mikroszkóp segítségével összehasonlítottam a különböző minták felületén tesztoldatokból adszorbeálódott fehérjék (fluoreszcensen jelölt HSA 3 ) mennyiségét. A kísérletek alapján kiválasztottam egy olyan összetételű mintát melynek felületi tulajdonságai lehetővé teszik, hogy passzív kapilláris pumpát alakítsak ki benne. A kapilláris pumpák tervezése során olyan csatornaszerkezeteket terveztem melyek a fák vízzsállító szövetéhez hasonló másodlagos struktúrákat tartalmaznak, így a nem tökéletesen nedvestíhető felületeken a látszólagos peremszög csökkenését tudtam elérni. Az elkészített rendszerekben tanulmányoztam a másodlagos szerkezetek hatását a pumpák vízsszállító képességére. 3 HSA: Humán Szérum Albumin 21

22 2. Alkalmazott anyagok és kísérletek leírása 2.1. Felhasznált vegyszerek, fehérjék A PDMS minták készítéséhez Sylgard 184 (Dow Corning) típusú elasztomert és térhálósító szert használtam, melyeket 10:1 térfogatarányban kevertem. A módosított minták előállításához kétféle felületaktív anyagot alkalmaztam, laboratóriumi minőségű Triton X-100-at (Sigma Aldrich) valamint PDMS-b-PEO (Sigma-Aldrich) kopolimert. A tenzidek fontosabb fizikai tulajdonságait az alábbi táblázat tartalmazza: Triton-X-100 PDMS-b-PEO Megjelenés színtelen folyadék színtelen folyadék PEO tartalom 9-10 egység molekulánként 80 m/m% Kritikus micellaképződési koncentráció 0,24 mm nincs adat Sűrűség 1,07 g/ml 1,035 g/ml 2. táblázat: Az alkalmazott tenzidek tulajdonságai A fehérjebekötődés vizsgálatánál a csatornák előzetes és utólagos mosásához foszfát puffer (PBS) oldatot használtam. Az oldat előállításához 1db foszfát sót, káliumkloridot (KCl) és nátrium- kloridot (NaCl) tartalmazó tablettát (Sigma-Aldrich) oldottam fel 200 ml ioncserélt vízben. Az így készített puffer foszfát sóra 0,01M, kálium-kloridra 0,0027M, nátrium-kloridra 0,137M koncentrációjú, 25 C-on ph értéke 7,2. A mérés során még fluoreszcens izotiocianáttal jelölt humán szérum albumin (FITC-HSA, Sigma-Aldrich) oldatot alkalmaztam. Az albumin molekula súlya 66kDA, a FITC molekula tömege 389,4g/mol. A FITC kioltási tényezője (E mm ) 495nm hullámhossznál, 7,5pH érték mellett 84, gerjesztési/emisszós hullámhossza 418nm/518nm. A FITC-HSA 10mM koncentrációban feloldható 7pH-jú pufferoldatban. A mérésekhez 1mg FITC-HSA kristályt oldottunk fel 1ml 7,2 ph-jú foszfát puffer oldatban, majd az oldatot 0,01mg/ml koncentrációjúra hígítottuk szintén pufferoldattal. A biokompatibilitás vizsgálatához U 937 emberi monocita sejteket használtam fel, melyeket RPMI mM glutamin, penicillin/kanamycin (50IU/ml/, 50 g/ml) és 10% magzati borjú szérum (FCS) médiumban tenyésztettek. A halott sejtek festéséhez tripánkék (Sigma-Aldrich) festék került felhasználásra. 22

23 2.2. A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületi összetételének vizsgálata A PDMS réteg felületi vizsgálata infravörös (IR) spektroszkópiai módszerrel történt. Az FT-IR spektroszkópiával elvileg bármilyen anyag összetétele jellemezhető minőségi és mennyiségi szempontból is. Az IR spektroszkópia a vegyületek rezgéseinek gerjesztésén alapul. A minőségi analízis alapja, hogy az egyes funkciós csoportoknak jellemző elnyelési sávjaik vannak, míg a mennyiség analízis a Lambert- Beer törvényen alapul, amely az áteső fényintenzitás és az anyag abszorpciós tényezője, valamint az anyagban megtett úthossz között teremt kapcsolatot. Az IR spektroszkópia a megfelelő méréstechnika megválasztásával alkalmas arra, hogy a minta kívánt mélységéből szolgáltasson információkat. A felületi réteg vizsgálatához úgynevezett belső reflexiós (ATR) feltétre van szükség. A mérés során a minta és a feltét szorosan illeszkedik egymáshoz, az IR fény a feltéten sokszori belső visszaverődéssel jut át, miközben minden visszaverődéskor 1-2µm mélységig behatol a mintába, mely elnyeli a rá jellemző frekvenciájú komponenseket. Szilárd minta Detektorhoz Infravörös sugár ATR kristály 15. ábra: Az ATR feltét működése A mérésekhez hat különböző összetételű PDMS mintát készítettem, 0,1V/V%,- 0,2V/V% Triton X-100 tartalmút, valamint 0,1V/V%-0,2V/V%-0,5V/V%-1,25V/V% PDMS-PEO tartalmút. A mintákat sík, polírozott szilícium szeleten térhálósítottam, majd 1x1 cm-es darabokra vágtam. A spektrumok felvételét Varian Scimitar 2000 FTIR spektrométerrel végeztük, Pike Golden Gate gyémánt ATR feltét segítségével. A felvett spektrumok 4cm -1 felbontásban készültek. A mérések során a minták sík felülete érintkezett az ATR kristállyal. 23

24 A vizsgálat során először a száraz minták spektrumát vettük fel, majd a mintákat 15 percre desztillált vízbe áztattuk és újra felvettük a színképüket. A méréseket módosítatlan PDMS mintán is elvégeztük, ez szolgált referenciaként A felületi nedvesíthetőségnek, a minták öregedésének, stabilitásának, és a tenzidek oldatba történő diffúziójának vizsgálata A módosított PDMS minták felületi jellegének megváltozását statikus peremszög mérés segítségével vizsgáltam, ülőcsepp módszerrel. A mérés során a szilárd felületre helyezett csepp illeszkedési szöge határozható meg, ami felvilágosítást ad a nedvesítés fokáról, mely egyértelmű függvénye a megfelelő felületi feszültségnek. A mérésekhez itt is hat különböző összetételű PDMS mintát készítettem, 0,1V/V%,-0,2V/V% Triton X-100 tartalmút, valamint 0,1V/V%-0,2V/V%-0,5V/V%-1,25V/V% PDMS-PEO tartalmút. A mintákat közvetlenül a térhálósodás után vizsgáltam meg, a mérést 95 Con, 60 percig hőkezelt mintákon is elvégeztem, mivel a PDMS minták felhasználásuk alkalmával a bondolási lépés után hőkezelésnek lehetnek kitéve. A méréshez egy oldalon polírozott, sík szilícium szeleteken készített mintákból vágtam ki 1x1cm-es darabokat. A minták felszínére Hamilton fecskendő segítségével 5µl-es ioncserélt vízcseppet helyeztem, miközben a minta körül a relatív páratartalom végig 80% felett volt, így a vízcsepp térfogata közel állandó volt a mérés során. A goniométerre szerelt Leutron vision gyártmányú PicSight P38B-GigE kamerával 15 percen keresztül percenként képeket készítettem, majd a felvételek alapján ImageJ 4 (NIH National Institute of Health) program segítségével határoztam meg az egyes összetételekhez tartozó peremszög változást az idő függvényében

25 Kontakszög Vizsgált felület Csepp 16. ábra: Statikus kontakszög meghatározása A minták öregedésének, eltarthatóságának vizsgálatához az előző méréshez készített hőkezelt, majd 1, 5, 14, 30, valamint 60 napig pihentetett darabokon is kontaktszög mérést végeztem. A mérés során a különböző 1x1 cm-es PDMS darabokra szintén 5µles ioncserélt vízcseppet helyeztem, és 15 perc után meghatároztam a kialakuló kontaktszöget. A tenzidek oldatba történő diffúziójának meghatározásához az eltérő összetételű PDMS mintákból közvetlenül a térhálósodás után 1x1 cm-es darabokat 50ml ioncserélt vízbe áztattam 1, 2, 4, 24 valamint 78 órára, majd ezután az előző méréshez hasonlóan végeztem el a peremszög mérést. 17. ábra: A kontaktszögmérő berendezés 25

26 2.4. A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületének kölcsönhatása sejtekkel és fehérjékkel Biokompatibilitás vizsgálata Mivel több felületaktív anyagról, így a Triton X-100-ról is ismert, hogy jelenlétükben a sejtek sejtfala sérül, és ez nagyobb tenzid-koncentráció estén lízishez vezet, ezért megvizsgáltam a módosított PDMS minták hatását emberi monocita sejtekre. A méréshez egy ELISA plate celláinak aljára az adalékolt mintákból 400µl-t pipettáztam, majd a térhálósodás után vizsgáltam a sejtek és a minták kölcsönhatását. Az U937 sejtvonalból származó emberi monociták RPMI médiumban, 10% FCS tartalmú sejt szuszpenzió formájában kerültek felhasználásra. A szuszpenzióból a módosított PDMS-t tartalmazó cellák aljára 250µl-t pipettáztam, majd a plate 37 C-os, 5% CO 2 tartalmú atmoszférába került. A módosított minták mellett egy üres cella és egy adalékmentes PDMS-t tartalmazó cella is készült, melyekbe hasonló mennyiségű sejt szuszpenzió került. Az inkubálási idő minden esetben 1 óra volt, mivel egy mikrofluidikai rendszerben a vizsgálat során a mintaoldat és a felület érintkezése ennél nem tarthat tovább. Az inkubálás után a cellákban található leülepedett szuszpenziót egy pipetta segítségével felszuszpendáltam, majd minden cellából 10µl mintát vettem. Az így vett mintákat 10µl tripánkék festékkel kevertem össze. A tripánkék festék jellemzője, hogy az élő sejtekbe nem tud behatolni, míg az elpusztult sejteket kékre festi. Ezután a keveréket egy Bürker kamrába pipettáztam, majd egy Invitrogen Countess automata sejtszámláló készülékbe helyeztem. A készülék a mintában található élő sejtek százalékos arányát adja meg. 18. ábra: Bürker kamra és az Invitrogen Countess automata sejtszámláló készülék 26

27 Nem-specifikus fehérjebekötődés vizsgálata A nem-specifikus protein adszorpciót fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltam. A vizsgálati módszer lehetővé teszi, hogy a felületre irreverzibilisen adszorbeálódott fluoreszcensen jelölt fehérjék jelenlétét és relatív mennyiségét meghatározzam. A mérések célja az volt, hogy meghatározzam az alkalmazott tenzidek hatását a felületi adszorpciós jelenségre. A vizsgálatokhoz különböző módokon adalékolt és módosítatlan PDMS-ből egyszerű mikrfoluidikai rendszereket készítettem az alábbi maszkterv alapján: 19. ábra: A mikrofluidikai csatornák maszkterve SU-8 lakk segítségével fotolitográfiás úton szilícium hordozón készült az öntőforma. Az öntőforma segítségével a módosítatlan PDMS-ben 1,9/2,3 cm hosszú, 200µm széles és 50µm magas csatornákat készítettem. A térhálósodott PDMS-t lefejtettem a hordozóról, majd a csatornák végénél lévő beömlő nyílásokat lyukasztó segítségével szabaddá tettem. Ezután a mintákat ioncserélt vízben ultrahangos rázatóban 2 percig mostam, majd nitrogén áramban megszárítottam. A PDMS csatornák ellendarabjaként az adalékolt mintákból készített, sík szilíciumon térhálósodott szubsztrátok kerültek felhasználásra, melyeket az adalékolatlan PDMS-hez hasonló módon tisztítottam meg. A két szubsztrátot ezután a felületek oxigénplazmás érzékenyítése nélkül, befogó segítségével nyomtam össze, annak érdekében, hogy a mintaoldatokkal történő átmosás után a darabok szétválaszthatóak legyenek, ezáltal az adalékolt minták felülete önállóan vizsgálható legyen mikroszkóp alatt. 27

28 20. ábra: A mérési elrendezés Az így elkészült fluidikai rendszerbe MicroFluid számítógép vezérelt fecskendőpumpa rendszerrel jutattam be az oldatokat, így biztosítva az ellenőrizhető áramlási sebességet a csatornákban. A mérések során az első és az utolsó lépésben PBS oldattal mostam át a csatornákat a nedvesítés növelése, illetve a reverzibilisen kötött fehérjék lemosásának érdekében. Az első lépésnél minden esetben 100 másodpercen keresztül áramlott át a puffer oldat a rendszeren. A PBS oldat után közvetlenül a mintaoldat injektálása következett, ez tartalmazta a FITC-HSA-t. A mérések során a vizsgálatot több, különböző mennyiségű mintaoldattal elvégeztem annak érdekében, hogy lássam, hogy a mikrofluidikai szempontból releváns térfogatú és koncentrációjú minták esetén telítődik-e a felület. A mintaoldat után újra 100 másodperces pufferes átmosást alkalmaztam. Áramoltatott oldat Átáramlott térfogat Áramlási sebesség PBS 200 µl 2 µl/s FITC-HSA 50/100/150/200 µl 2 µl/s PBS 200 µl 2 µl/s 3. táblázat: A vizsgálat pontos paraméterei Miután az oldatok átjutottak a csatornákon a két szubsztrátot elválasztottam egymástól, majd a módosított PDMS hordozók felületéről Axio Vert A1 invertált fluoreszcens mikroszkóp segítségével felvételeket készítettem. A felvételek készítése AxioCam ICm1 monokróm kamerával, Zeiss A-Plan 10X nagyítású objektívvel történt, 4096 ms expozíciós idővel, maximális gerjesztési intenzitás mellett a ZEN 2012 Blue edition program segítségével. A képéket szintén ezzel a programmal értékeltem ki, segítségével a felvételekre illesztett egyenesek mentén megkaptam az 28

29 adott intenzitás értékeket a hely függvényében. Az egyenesek illesztése a csatornára merőlegesen történt a kép teljes magasságában, így meghatározható volt a háttér intenzitása is, mely ezután levonásra került a csatornákra meghatározott intenzitásértékekből. Az így meghatározott fluoreszcens intenzitások alapján összehasonlítottam a különböző tenzid tartalmú minták esetén a nem-specifikus fehérje adszorpció mértékét Kapilláris rendszerek vízszállító képességének vizsgálata A különböző, biológiai rendszerekből adaptált másodlagos struktúrák kapilláris rendszerek vízszállító képességére gyakorolt hatását módosított PDMS-ből készült eszközök segítségével vizsgáltam. A polimer kapilláris rendszerek ebben az esetben is az soft litography technológiával készültek. A másodlagos struktúrák vizsgálatához kétrétegű öntőformára van szükség, aminek előállításához két maszkot terveztem. 21. ábra: Az alapstruktúrákat tartalmazó maszkterv a kapilláris rendszerek készítéséhez 29

30 22. ábra: A másodlagos struktúrákat tartalmazó maszkterv Ahhoz, hogy az elkészíteni kívánt csatornák negatívja kerüljön az öntőformára először 50µm magas SU-8 lakkréteget centrifugáztam fel a szilícium szubsztrátra, majd a rétegre az alapstruktúráknak megfelelő maszkábra lett rávilágítva. A megvilágítás után az ábra nem került előhívásra, hanem a második rétegnek megfelelő 10µm-es SU-8 réteg lett felpörgetve. Ezután a második maszkábra került levilágításra az első ábrájához illesztve. A két réteg megvilágítása után került előhívásra a lakkábra, ami így az alapstruktúrához illesztve a másodlagos struktúrákat is tartalmazta. Az így készült öntőformára az előző kísérletek eredményei alapján 1,25 V/V% PEO-b-PDMS tartalmú PDMS-t öntöttem, majd miután a minta szobahőmérsékleten 2 napig térhálósodott lefejtettem a szeletről. A lefejtett mintákat szike segítségével chipekre vágtam, beömlő nyílásaikat lyukasztóval szabaddá tettem, majd a hasonló összetételű, sík szilíciumon térhálósított PDMS szubsztárhoz bondoltam őket. A bondolás során mindkét minta felületét oxigén plazma segítségével aktiváltam, 200W RF teljesítmény mellett az oxigén nyomása 1,4bar volt, térfogatárama 4 SCFH (normál köbláb/óra). A felületaktiválás után mintákat páronként összenyomtam és 95 C-on, 60 percen 30

31 keresztül hotplaten hőkezeltem. A hőkezelés után egy napot pihentettem a mintákat annak érdekében, hogy a plazmás felületaktiválás hatása ne befolyásolja a méréseket. Az így készített minták segítségével 6 különböző csatornarendszer vízszállító képességét tudtam vizsgálni. Egy referencia struktúráét, mely sima felszínű csatornákat tartalmazott, és 5 olyan struktúrát ahol különböző másodlagos struktúrák kerültek kialakításra. A struktúrák - ahogy a 23. ábrán látható - 4 részből állnak, minden rész egyenként 75 db 40µm széles és 50µm magas, 3mm hosszú csatornát tartalmaz. A másodlagos struktúrákat is tartalmazó rendszereknél a másodlagos struktúrák mélysége 10µm, az egységeket összekötő csatornák szélessége 60µm. Az öntőformákat pásztázó elektronsugaras mikroszkóp (SEM), a kész PDMS darabokat fénymikroszkóp segítéségével minősítettem. A vízszállító képesség meghatározásához a kész chipek beömlő nyílásához pipetta segítségével 5µl vizet helyeztem, majd megmértem mennyi idő szükséges a szerkezet feltöltődéséhez. Mivel a szerkezetek térfogata ismert, a mért idő alapján meghatároztam a struktúrákra jellemző térfogatáramot. 23. ábra: Egy kapilláris rendszer maszkábrája 31

32 3. Eredmények 3.1. A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületi összetételének változása A PDMS referencia minta színképe a fontosabb csúcsok megjelölésével az alábbi diagramon látható. as Si-O-Si CH as Si-C as CH 3 CH s CH Abszorbancia /Hullámszám (cm -1 ) Absorbance / Wavenumber (cm-1) gyémánt ATR elnyelés 24. ábra: Módosítatlan PDMS minta infravörös spektruma A tenzid molekulák beágyazása csekély spektrális változást eredményezett mind a száraz, mind a hidratált minták esetében is. A cm -1 tartományban kis intenzitás-növekedés észlelhető, az intenzitás a tenzid mennyiségével arányosan nő, a hidratált minták esetében valamivel nagyobb. Ez a tartomány az OH csoportok vegyértékrezgési tartománya, így a változás a felületi hidroxid csoportok számának növekedésével hozható kapcsolatba. A hidratált minták esetén az adalékolt és a referencia minták különbség spektrumának vizsgálatakor is tapasztalható ez a kismértékű intenzitásváltozás ebben a tartományban, ahogy az a 25. ábrán is látható. A különbség spektrumok alapján a metil csoportokra jellemző sávok intenzitás értékei csökkenek, ez a változás negatív sávok formájában jelenik meg a 2964, 2902, 1249 cm -1 hullámszám értékeknél. A spektrumban 1067 és 892 cm -1 hullámszámnál megjelenő új sávok a C-O vegyértékrezgésekhez rendelhetők, ami a tenzidek hidrofil 32

33 PEO láncának jelenlétét bizonyítja. A tenzid tartalom növekedésével ezeknek a csúcsoknak az intenzitása csekély mértékben nő. A derivált jellegű sávok megjelenése 1009 és 785 cm -1 -nél a Si-ra jellemző rezgési hullámszámok eltolódásával hozható kapcsolatba. Mivel a gyémánt ATR elnyelése miatt a cm -1 közötti hullámszám tartomány nem értékelhető a referencia és a legnagyobb tenzid tartalmú mintán ZnSe horizontális ATR feltéttel is felvettük a spektrumokat, de nem tapasztaltunk változást a kérdéses hullámszám tartomány körül. Abszorbancia /Hullámszám (cm -1 ) 25. ábra: Különböző tenzid tartalmú hidratált minták és a referencia minta különbség spektrumai A mérési eredmények alapján elmondható, hogy a tenzid tartalom növekedése és a hidratálás a nagyon kismértékű koncentrációváltozások miatt alig detektálható intenzitásváltozást okoz, így a diffúziós és orientációs folyamat nyomon követésére ez a mérési módszer nem alkalmas teljes mértékben. A tenzid molekulák hidrofil láncának jelenléte azonban egyértelműen kimutatható a minta felületének közelében, valamint a hidroxid csoporthoz tartozó csúcs intenzitásnövekedése és a metil csoporthoz tartozó csúcsok intenzitáscsökkenése alapján megállapítható, hogy a felület közelében a hidratálás hatására átrendeződik a tömbfázis szerkezete. 33

34 3.2. A felületi nedvesíthetőségnek, a minták öregedésének, és a tenzidek oldatba történő diffúziójának vizsgálata A felületi nedvesedés változásának vizsgálata A mérés során a különböző tenzid tartalmú minták felületi nedvesíthetőségének változását tanulmányoztam, és megvizsgáltam a hőkezelés hatását is az elérhető peremszögekre nézve. A 26. ábrán a TX-100 tartalmú, nem hőkezelt PDMS minták kontaktszögének változása látható az idő függvényében Kontaktszög( ) Triton X-100 0,1V/V% Triton X-100 0,2V/V% PDMS Idő(min) 26. ábra: A különböző Triton X-100 tartalmú PDMS minták kontaktszögének változása az idő függvényében 34

35 27. ábra: Triton X-100 tartalmú PDMS minták peremszöge 15 perc után A módosítatlan PDMS kontaktszöge az eltelt idő alatt alig változott, 106 -ról 92 -ra csökkent, melyet a csepp lassú párolgása is eredményezhet, tehát itt a felület nedvesíthetősége nem változik az idővel. A beágyazott Triton X-100-at tartalmazó PDMS-nél a kezdeti kontaktszögek mindkét minta esetén magasabbak, mint a PDMS esetén mért értékek. A peremszög változás a csepp felületre helyezése után 2-3 perccel később válik jelentőssé. Ezután a változás felgyorsul, majd perc eltelte után ismét lelassul, a minták itt érik a legalacsonyabb kontaktszöget. A 0,1V/V% Triton X- 100 tartalmú mintánál a végső érték 61, a 0,2V/V% tartalmúnál pedig 52 volt. A diagram alapján megállapítható, hogy a Triton X-100 beágyazása a polimer mátrixba jelentősen javítja a PDMS felületének nedvesíthetőségét. A 0,2V/V% tenzid tartalmú minta nedvesíthetőségének változása több mint 3,9-szerese a módosítatlan PDMS változásának, így megállapítható, hogy a peremszög változását nem csak a vízcsepp párolgása okozza. A diagramból az is látható, hogy a változás megindulásához percekre van szükség. A minta felületén valószínűleg kezdetben nincsenek, vagy nagyon kis mennyiségben találhatóak PEO láncok, a molekulák diffúziója és orientációja a folyadékfázis irányába pedig időbe telik. Miután a molekulák a minta felszín közeli rétegébe diffundáltak hidrofil láncukkal fokozatosan a vizes fázis felé orientálódnak, ez eredményezheti a peremszög változásának felgyorsulását. Miután ez a folyamat lejátszódott a peremszög csökkenés ismét lelassul, majd peremszög állandó értéket vesz fel. 35

36 Kontaktszög( ) PDMS-PEO 0,1 V/V% PDMS-PEO 0,2 V/V% PDMS-PEO 0,5 V/V% PDMS-PEO 1,25 V/V% PDMS Idő(min) 28. ábra: A különböző PDMS-bPEO tartalmú PDMS minták kontaktszögének változása az idő függvényében 29. ábra: PDMS-b-PEO tartalmú PDMS minták peremszöge 15 perc után A PDMS-b-PEO kopolimer beágyazása a Triton X-100-hoz hasonlóan előnyösen befolyásolja a PDMS felületi tulajdonságait, a különböző tenzid koncentrációjú minták peremszögének időbeni változása a 28. ábrán látható. A diagram alapján elmondható, hogy már a 0,1V/V% tartalmú minták esetén is jelentős a változás, a koncentráció növelésével pedig egyre csökken az elérhető kontaktszög érték. Ezen minták esetében már a kezdetben mért peremszög értékek is alacsonyabbak voltak, mint a PDMS-nél mérhető érték. A nedvesíthetőség változása a PDMS-b-PEO-val módosított mintáknál már a csepp felületre helyezése után azonnal megindul. Ez arra utalhat, hogy ebben az esetben a molekulák diffúziója a tömbfázisban és orientációja a felületen gyorsabb, mint a Triton X-100 esetében, a különbséget a két molekula eltérő hidrofób csoportja 36

37 okozhatja. A peremszög értékek csökkenése 10 perc után lelassul, vagyis ezután a felületre kijutó PEO láncok mennyisége már nem változik jelentősen. A elérhető legalacsonyabb kontaktszög 0,1V/V% esetén 63, 0,2V/V% esetén 55, 0,5V/V%-nál 47, 1,25V/V%-nál pedig 41 volt. A mérést megismételtem 95 C-on, 60 percig hőkezelt mintákkal is, a 15 perc után mért peremszög értékeket az alábbi táblázat tartalmazza. Kontaktszög ( ) Minta típusa TX 100 0,1 TX 100 0,2 Tenzid tartalom (V/V%) PDMS-PEO 0,2 PDMS-PEO 0,1 PDMS-PEO 0,5 PDMS-PEO 1,25 Nem hőkezelt Hőkezelt táblázat: A hőkezelés hatása a 15 perc után mérhető peremszög értékekre A mért értékek nem mutatnak jelentős különbséget a kezeletlen és hőkezelt minták esetén, mivel semmilyen tendencia nem fedezhető fel, kijelenthető, hogy a bondolás közben hőkezelésen átesett minták nedvesíthetőségi tulajdonságai megegyeznek a friss minták tulajdonságaival Kontaktszög ( ) TX100 0,1 TX100 0,2 PEO 0,1 PEO 0,2 PEO 0,5 PEO 1,25 Tenzid tartalom (V/V%) 30. ábra: A különböző PDMS-b-PEO és Triton X-100 tartalmú PDMS minták kezdeti és végső kontaktszögének összehasonlítása 37

38 A 30. ábrán a különböző minőségű és mennyiségű tenzidet tartalmazó minták kezdeti és végső peremszögének érékeit tüntettem fel. Az ábra alapján elmondható, hogy a kezdeti peremszög értékek a Triton X-100 tartalmú mintáknál minden esetben magasabbak voltak, mint az azonos koncentrációjú PDMS-b-PEO tartalmúaknál, az utóbbiaknál tehát magasabb a PEO láncok felületi koncentrációja száraz állapotban. Ha a végső kontaktszög értékeket nézzük az azonos tenzid koncentrációjú mintáknál, akkor látható, hogy az elérhető kontaktszög közel azonos, a Triton X-100 tartalmú mintáknál néhány fokkal alacsonyabb. Mivel a két molekula hidrofil láncában azonos a lehetséges PEO egységek száma így azonos koncentrációknál a felületi PEO koncentráció is megegyezik, ha tömbfázisból a molekulák már a felületre diffundáltak és az orientációs folyamat is lejátszódott. A minimális különbség abból adódhat, hogy a PDMS-b-PEO molekulák PDMS csoportja a térhálósodási reakció során rögzülhet a tömbfázis belsejében, így az ilyen molekulák nem tudnak a felületre jutni. A legalacsonyabb kezdeti és végső peremszög érték a legnagyobb, 1,25V/V% PDMS-b- PEO tartalmú mintánál érhető el, és ennél a mintánál a felületi tulajdonságok megváltozása azonnal elindul, ha a minta vízzel érintkezik, ezért ez az összetétel lehet a legalkalmasabb passzív mikrofluidikai rendszerek készítésére. Itt kell megjegyezni, hogy ilyen koncentrációjú Triton X-100 beágyazást a PDMS bondolási és optikai tulajdonságainak degradációja miatt nem tudtunk létrehozni. Ezt a következtetést támasztja alá az is, ha a különböző minták esetén 50µm széles 50µm magas valamint 5cm hosszú csatornákban kialakuló kapilláris nyomás kerül összehasonlításra. A 31. ábrán a kezdeti, a 32. ábrán pedig a végső peremszög mértékek alapján számolt kapilláris nyomás értékek láthatóak. Az adatok alapján látszik, hogy a legalacsonyabb peremszöggel, tehát a legjobb nedvesíthetőséggel rendelkező minta esetén a kialakuló kapilláris nyomás már a kezdeti kontaktszög értékeknél is negatív, míg a többi minta esetén pozitív. Pozitív kapilláris nyomás esetén a csatornában nincs folyadékáramlás, míg negatív értékek esetén külső nyomás alkalmazása nélkül is létrejön. 38

39 2500 Kapilláris nyomás (Pa) Triton X-100 0,1 Triton X-100 0,2 PDMS-PEO 0,1 PDMS-PEO 0,2 PDMS-PEO 0,5 PDMS-PEO 1,25 Tenzid tartalom (V/V%) 31. ábra: A kezdeti kontaktszög értékek alapján meghatározott kapilláris nyomás értékek különböző tenzid tartalmú PDMS-ből készült csatornákban 0 Triton X-100 0,1 Triton X-100 0,2 PDMS-PEO 0,1 PDMS-PEO 0,2 PDMS-PEO 0,5 PDMS-PEO 1,25 Kapilláris nyomás (Pa) Tenzid tartalom (V/V%) 32. Ábra: A végső kontaktszög értékek alapján meghatározott kapilláris nyomás értékek különböző tenzid tartalmú PDMS-ből készült csatornákban A végső peremszög értékeknél számolt nyomás értékek közül szintén a 1,25V/V% PDMS-b-PEO tartalmú mintánál a legkisebb (abszolút értékben a legnagyobb) a csatornában kialakuló kapilláris nyomás, így itt lesz a legnagyobb a csatornában 39

40 elérhető áramlási sebesség is, ahogy az a 33. ábrán is látszik. A mérési eredmények alapján elmondható, hogy megfelelő minőségű és mennyiségű tenzid beágyazásával a PDMS eredendően hidrofób felületi jellege módosítható, létrehozható rajta egy olyan stabil hidrofil réteg, mely nem gátolja meg a módosított PDMS feldolgozását az eddig alkalmazott módszerek szerint, mégis lehetővé teszi, hogy a kapillaritás elvén működő csatornarendszerek kialakíthatók legyenek benne. 0,25 0,2 0,15 Q (ul/s) 0,1 0,05 0 Triton X-100 0,1 Triton X-100 PDMS-PEO PDMS-PEO 0,2 0,1 0,2 Tenzid tartalom (V/V%) PDMS-PEO 0,5 PDMS-PEO 1, ábra: A végső peremszög értékeknél számolt áramlási sebesség értékék különböző PDMS-ből készült csatornákban 40

41 A különböző összetételű minták öregedése, hosszú távú stabilitása A 34. és 35. ábrán a hőkezelt, majd félretett mintákon 15 perc után mért peremszögek láthatóak Komtaltszög ( ) Triton X-100 0,1 V/V% Triton X-100 0,2 V/V% Idő(nap) 34. ábra: Pihentetett Triton X-100 tartalmú minták felületén mérhető peremszögek a pihentetés idejének függvényében Kontaktszög( ) PEO-PDMS 0,1 V/V% PEO-PDMS 0,2 V/V% PEO-PDMS 0,5 V/V% PEO-PDMS 1,25 V/V% Idő(nap) 35. ábra: Pihentetett Triton X-100 tartalmú minták felületén mérhető peremszögek a pihentetés idejének függvényében 41

42 A diagramok alapján a Triton X-100 tartalmú mintáknál az elérhető kontaktszög a minták öregedésével minimális mértékben növekszik, 0,1V/V% esetén egy hónap alatt 3 -kal, 0,2V/V% esetén 4 -kal növekedett a mért érték. A PDMS-b-PEO tartalmú mintáknál nem figyelhető meg egyértelmű tendencia, a mért kontaktszög értékek itt sem változnak jelentősen. A mérések alapján megállapítható, hogy a minták öregedése a vizsgált időtartamban nem szignifikáns, ez alapján a beágyazott tenzid molekulákkal módosított PDMS rendszerek alkalmasak lehetnek hosszú távú tárolás utáni felhasználásara is A minták tenzid tartalmának oldatba történő diffúziója Az alábbi táblázatokban a különböző ideig vízben áztatott, eltérő összetételű minták esetén 15 perc után elérhető kontaktszög értékek láthatóak. Kontaktszög ( ) Áztatás ideje (h) TX 100 0,1 TX 100 0,2 Tenzid tartalom (V/V%) PDMS-PEO 0,2 PDMS-PEO 0,1 PDMS-PEO 0,5 PDMS-PEO 1, táblázat: Különböző idejű áztatás után mért peremszög értékek különböző összetételű PDMS minták esetén A mérési eredmények alapján 1 órás áztatás után a kontaktszög értékek nem változtak jelentősen a kontrol mintákhoz képest. Az áztatási idő növekedésével minden minta esetén növekvő peremszög értékeket mértem, tehát a mintákban csökkent a beágyazott molekulák mennyisége. A táblázatban feltüntetett értékek alapján látható, hogy a minták vízben való áztatása csökkenti a felület nedvesíthetőségét, mivel a beágyazott tenzid molekulák képesek átdiffundálni a vízbe. A vizsgálat alapján a módosított PDMS mintákból a tenzidek diffúziója a felülettel érintkező oldattal több órát vesz igénybe, a mikrofluidikai szempontból releváns időtartamon belül (kb. 1 óra) a diffúzió mértéke nem jelentős, a felület nedvesíthetősége érdemben nem változik meg. 42

43 3.3. A különböző tenzid tartalmú PDMS minták felületének kölcsönhatása sejtekkel és fehérjékkel Biokompatibilitás vizsgálata A kísérlet során a módosított PDMS minták és emberi monociták kölcsönhatását vizsgáltam. A mérés során kapott eredményeket összehasonlítottam egy módosítatlan, az irodalmi hivatkozások szerint biokompatibilis PDMS mintán és egy vak mintán mért eredményekkel. 36. ábra: A módosítatlan PDMS-re helyezett sejtpopuláció mérési eredménye A biokompatibilitás szempontjából a készülék által meghatározott adatokból az élősejtek %-os aránya volt a legfontosabb, a mintákat ez alapján hasonlítottam össze. Életben maradt sejtek (%) minta1 minta 2 Triton X-100 0,1 V/V% Triton X-100 0,2 V/V% PDMS-PEO 0,1 V/V% PDMS-PEO 0,2 V/V% PDMS-PEO 0,5 V/V% PDMS-PEO 1,25 V/V% PDMS kontrol táblázat: Élő sejtek %-os aránya a PDMS-be ágyazott tenzid típusa és mennyisége szerint 43

44 Holczer Eszter: Bioinspirált kapilláris rendszerek megvalósítása és vizsgálata Az elvégzett tesztek alapján a beágyazott tenzid molekulák, minőségüktől függetlenül nem befolyásolták szignifikánsan a velük kölcsönhatásba kerülő sejtek élettartamát a kísérlet ideje alatt, a sejtek lízise nem következett be. Ebből arra lehet következtetni, hogy a PEO láncokból képződött hidrofil réteg a PDMS felületén nem tesz kárt a sejtfalban, az esetleg oldatba diffundált tenzidek mennyisége pedig szintén kevés ahhoz, hogy érdemben megváltoztassa a szuszpenziók élő sejt tartalmát. Ez összhangban van azzal, hogy a tenzid molekulák oldatba történő diffúziójának vizsgálatakor sem tapasztaltam jelentős eltérést a nedvesíthetőségben 1 óra áztatás után. A kísérlet alapján az általam felhasznált anyagok alkalmasak arra, hogy sejteket tartalmazó minták vizsgálatához készült eszközök alapanyaga legyen, mivel a beágyazott molekulák nem okozzák a sejtek idő előtti pusztulását. Elpusztult sejtek 37. ábra: Élő és elpusztlt sejtekről készített fénymikroszkpos felvétel 75X nagyításban Nem-specifikus fehérjebekötődés vizsgálata A nem-specifikus fehérjebekötődés vizsgálata során a 6 különböző, tenziddel adalékolt PDMS minta esetében meghatároztam a tenzid tartalom hatását a jelenség minimalizálásának szempontjából, illetve azt, hogy a mikrofluidikai szempontból érdekes térfogatú és koncentrációjú fehérjeoldat esetében telítődik-e a minták felszíne irreverzibilisen kötött fehérjékkel. A Triton X-100 tartalmú minták esetében mindkét mintánál megállapítható, hogy a tenzid beágyazása a mátrixba az adott mérési körülmények között nem elég a nemspecifikus adszorpció megakadályozására, bár a tenzid tartalom növekedése csökkenti a felületen irreverzibilisen kötött fehérje mennyiségét. 44

45 Az 38. és 39. ábrán a Triton X-100 típusú tenziddel adalékolt minták esetében mért fluoreszcens intenzitás értékek láthatók az átáramlott mintaoldat mennyiségének függvényében (1024 árnyalatú skálán reprezentált értékek). Mivel az oldatok átpumpálása után a fluidikai rendszer fedődarabját eltávolítottam, az erre lerakódott fehérje mennyisége nem befolyásolta a mérési eredményt. Intenzitás TX100 0,1 V/V% Minta térfogat ( l) 38. ábra: A fluroeszcens intezitás az átáramlott mintaoldat térfogatának függvényében 0,1V/V% Triton X-100 tartalmú PDMS minta esetén Intenzitás TX100 0,2 V/V% Minta térfogat ( l) 39. ábra: A fluroeszcens intezitás az átáramlott mintaoldat térfogatának függvényében 0,2V/V% Triton X-100 tartalmú PDMS minta esetén 45

46 A mérési eredmények alapján elmondható, hogy az adszorbeálódott fehérje mennyisége az átáramoltatott minta térfogatával arányosan nő, a szubsztrátok mintaoldattal érintkező felületén irreverzibilisen kötött molekulák maradtak, melyeket az utólagos puffer oldatos mosás sem távolított el. A kisebb tenzid koncentrációjú mintánál a mért intenzitás értékek minden esetben magasabbak, a mintaoldat térfogatának függvényében az intenzitás változás kisebb, mint a nagyobb tenzid koncentrációnál. Ha a különböző Triton X-100 koncentrációk esetén azonos mintatérfogatnál mért intenzitás értékek különbségét vizsgáljuk megfigyelhető, hogy különbség a fluoreszcens oldalt térfogatának növekedésével egyre csökken, ahogy az az alábbi táblázatban is látható. Mintaoldat térfogata 50 µl 100 µl 150 µl 200 µl ΔI 142,63 74,15 23,38 24,89 7. táblázat: A 0,1 illetve 0,2 V/V% Triton X-100 tartalmú minták esetén mért intenzitásértékeinek különbségei A mintaoldat mennyiségének növekedésével együtt jár a mérési idő megnövekedése is, vagyis a minta felülete és a vizes bázisú oldat érintkezésének ideje megnő, így a felületre diffundáló molekulák száma is nagyobb. A kontaktszög mérés eredményei alapján a Triton X-100-zal módosított mintáknál a diffúzió lassabb, nem indul meg azonnal, és a mérés kezdetén a nagyobb koncentrációjú minta peremszög változása lassabb, mint a kisebb koncentrációjú esetén. A nagyobb koncentrációjú mintánál a felület közelében tartózkodó PEO láncok száma nagyobb, itt a kezdetben mérhető kontaktszög is valamivel alacsonyabb, a mérés során valószínűleg ezeknek a láncoknak az orientációja határozza meg az adszorpció mértékét. Az alacsonyabb koncentrációjú mintánál a felület közelében lévő molekulák száma nagyon kevés. Nagyobb térfogat, vagyis hosszabb mérés esetén az alacsonyabb Triton X-100 koncentrációjú minta esetén is megindul a diffúzió a tömbfázisból a vizes fázissal érintkező felület felé, a felületre diffundált molekulák pedig már képesek csökkenteni az adszorpció mértékét. A PDMS-PEO molekulákat tartalmazó keverékek vizsgálata során mért értékek a 40. valamint 41. ábrákon láthatóak. A kísérletek alapján csak a két alacsonyabb, 0,1 46

47 valamint 0,2V/V%, koncentráció esetén volt meghatározható a fluoreszcens intenzitás, a magasabb értékek esetén - 0,5, valamint 1,25V/V% - nem volt detektálható jel PEO 0,1 V/V% 250 Intenzitás Minta térfogat (ul) 40. ábra: A fluroeszcens intezitás az átáramlott mintaoldat térfogatának függvényében 0,1V/V% PDMS-PEO tartalmú PDMS minta esetén PEO 0,2 V/V% 200 Intenziáts Minta térfogat (ul) 41. ábra: A fluroeszcens intezitás az átáramlott mintaoldat térfogatának függvényében 0,2V/V% PDMS-PEO tartalmú PDMS minta esetén 47

48 A Triton X-100 tartalmú mintákhoz hasonlóan itt is elmondható, hogy felületen mérhető fluoreszcens intenzitás értéke a térfogattal arányosan növekszik, a nemspecifikusan adszorbeálódott FITC-HSA mennyisége nő, a kötőhelyek nem telítődnek ezeknél a minta térfogatoknál. A 0,2V/V% PDMS-PEO koncentráció mintánál a meghatározott értékek itt is alacsonyabbak, a molekula koncentrációjának növelése mérsékli az irreverzibilisen kötött fehérje mennyiségét. A Triton X-100-as mintáktól eltérően azonban a mért értékek különbségeiben nincsenek nagyságrendi eltérések. Mintaoldat térfogata 50 µl 100 µl 150 µl 200 µl ΔI 27,75 48,02 44,86 52,77 8. táblázat: A 0,1 illetve 0,2V/V% PDMS-PEO tartalmú minták esetén mért intenzitásértékek különbségei A PEO-PDMS esetében, ahogy az a kontaktszög mérésnél is megfigyelhető volt, a molekulák diffúziója a mátrixban gyorsabb, ezért a PEO molekulák kezdeti felületi koncentráció különbsége a mérés során közel állandó marad. A nagyobb tenzid koncentrációjú minta esetén a felületen vagy a felület közelében lévő PEO láncok mennyisége több, a gyorsabb és azonnal meginduló diffúzió miatt a két minta közötti eltérés a kezdeti koncentráció különbség végig megmarad és ez határozza meg a mért értékeket. 0,1 V/V% TX100 0,2 V/V% TX100 0,1 V/V% PDMS-PEO 0,2 V/V% PDMS-PEO 42. ábra: A különböző tenzid tartalmú minták felületének fluoreszcens mikroszkóppal készített képe 50µl átáramoltatott mintatérfogat (FITC-HSA oldat) esetén. 48

49 TX100 0,1 V/V% TX100 0,2 V/V% PEO 0,1 V/V% PEO 0,2 V/V% 350 Intenzitás Minta térfogat ( l) 43. ábra: A módosított PDMS mintákon mért fluoreszcens intenzitás értékek a mintaoldat térfogatának függvényében A 43. ábrán látható a FITC-HSA oldat térfogatának függvényében a 0,1 és 0,2V/V% tenzid koncentrációjú mintákon mért fluoreszcens intenzitás értékek. A diagram alapján elmondható, hogy adott koncentráció mellett a PDMS-PEO beágyazása a PDMS mátrixba az adott mérési körülmények között hatásosabb. Ennek oka, hogy a mérés ideje alatt a minták nem érik el a maximálisan elérhető legjobb nedvesítési értékeket. Habár a Triton X-100 tartalmú minták esetén az elérhető kontaktszög valamivel kisebb, a PDMS-PEO minták eltérő diffúziós sebessége miatt hamarabb érik el a végső kontaktszög értéket. Mivel a mérések a leghosszabb esetben is 5 percig tartottak, a kontaktszög mérés alapján ekkor még a PDMS-PEO mintákon mérhető nedvesítés kedvezőbb. A 0,5 és 1,25V/V% PEO-PDMS tartalmú minták esetében a kísérleti leírásban alkalmazott vizsgálat során nem volt mérhető fluoreszcens intenzitású adszorbeálódott réteg a minta felszínén. 49

50 Holczer Eszter: Bioinspirált kapilláris rendszerek megvalósítása és vizsgálata a, b, 44. ábra: 0,5V/V% PDMS-PEO tartalmú minta PDMS fedőcsatornával (a), valamint anélkül (b) 200µl átáramoltatott FITC-HSA oldat térfogat esetén. A 44. ábra fluoreszcens mikroszkóppal készített képein látszik, hogy a módosítatlan PDMS-ből készített fedőcsatornával készített képen a csatorna fluoreszcens intenzitása jelentősen eltér a környezetétől, míg a felső szubsztrát eltávolítása után készített képen nem látható a csatornából érkező jel. Ez alapján tehát a módosítatlan PDMS-sel ellentétben a 0,5V/V% PDMS-PEO tartalmú mintán nem, vagy elenyésző mértékben található irreverzibilisen kötött fehérje, ha a mintaoldat injektálása előtt és után PBS oldattal mossuk át a csatornát. A méréseket megismételtem 0,5V/V% PDMS-PEO koncentrációjú mintán úgy, hogy a PBS utólagos injektálását elhagytam, valamint úgy is, hogy a PBS oldalt alkalmazását teljesen elhagytam. a, b, 45. ábra:1,25v/v% PDMS-PEO tartalmú minta felülete fluoreszcens mikroszkóp alatt a PBS oldalt utólagos injektálásnak elhagyása (a), valamint PBS alkalmazásának teljes elhagyása esetén (b) 50

51 Holczer Eszter: Bioinspirált kapilláris rendszerek megvalósítása és vizsgálata Mindkét esetben megfigyelhető volt, hogy módosított PDMS-en nem volt mérhető intenzitás jel, irreverzibilisen kötött fehérje nem volt jelen a felületen. Ez alapján elmondható, hogy 0,5V/V% illetve nagyobb PDMS-PEO tartalom esetén a mikrofluidikai csatornában a nem-specifikus fehérjebekötődés teljesen megakadályozható. A mérési eredmények szerint megfelelő minőségű és mennyiségű tenzid beágyazásával megfelelő nedvesíthetőségű felület hozható létre, melyen a nemspecifikus fehérjebekötődés jelensége sem tapasztalható Kapilláris rendszerek vízszállító képességének vizsgálata A mérések során különböző másodlagos struktúrákkal rendelkező kapilláris szerkezeteket vizsgáltam, és meghatároztam a másodlagos szerkezetek hatását a pumpák vízszállító képességére. A kísérleti részben leírt módon készített öntőformákat és az azokról készített ellendarabokat SEM valamint fénymikroszkóp segítségével minősítettem. A hatféle struktúráról készített felvételek alább láthatóak. 51

52 Holczer Eszter: Bioinspirált kapilláris rendszerek megvalósítása és vizsgálata 46. ábra: A megvalósított, különböző másodlagos szerkezettel rendelkező kapilláris rendszerek öntőformáinak SEM képei (balra), illetve a csatornáiról készült fénymikroszkópos felvételek (jobbra). 52