SZENTIRMAI ATTILA Ipari mikrobiológia Frissitve: { }

Átírás

1 Alkalmazásra került FONTOSABB IPARI MIKROBIOLÓGIAI ELJÁRÁSOK <Ipari mikrobiológia II-III.> Il n y a pas des sciences appliquées. Mais il y a des applications de la science Louis Pasteur SZENTIRMAI ATTILA Prof. Emeritus DE-TTK Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék 2000 Biomérnök Tsz Ipari mikrobiológia Piacképes gyógyászati és élelmiszeripari termékek előállítása a mikrovilág választott képviselőinek élettani viszonyait befolyásolva. Frissitve: { } 235 oldal 1

2 The laws of applied microbiology The microorganism is always right The microorganism is your friend The microorganism is a sensitiv partner There are no stupid microorganisms Microorganisms can do anything Microorganisms are smarter, wiser and more energetic than chemists, engineers and biologists If you take care of your microbial friends, they will take care of your future David Perlman 1960 Ki volt Pasteur? Luis Pasteur ( )Strasbourgban kémia tanár. PhD kutató munkája a dl borkősav vizsgálata Ekkor találkozott az optikai aktivitás biológiai vonatkozásaival. Az ipari gyakorlat biológiai problémáival foglalkozott tejsav fermentáció 1864 pasztörözés 1865 selyemhernyóvész 1866 bortermelés 1868 ecetsavgyártás 1876 sörgyártás 1877 a lépfene leküzdhető más mikroorganizmussal Joubert, Pasteur 1880 immunológiai védelem lépfene, baromfi-kolera ellen 2

3 KÜZDELEM A MIKROBIÁLIS KÓROKOZÓK ELLEN 4. A KEMOTERÁPIA TUDATOS ALKALMAZÁSA 9. A PENICILLIN FELFEDEZÉSE 10. AZ ANTIBIOTIKUMOK (SZEKUNDER METABOLITOK) A TERÁPIÁBAN 11. ß-LAKTÁM SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK BIOLÓGIAI-KÉMIÁJA 15. AZETIDINON SZERKEZETŰ VEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA, TÖRZSFEJLESZTÉS 18. ÚJABB β-laktám SZERKEZETÜ BIOLÓGIAILAG AKTÍV METABOLITOK FELFEDEZÉSE 21. PENICILLIN GYÁRTÁS 28. A PENICILLINÁZ 31. P4NICILLIN ALLERGIA 33. A β-laktám SZERKEZETŰ VEGYÜLETEK, A PENICILLIN BIOSZINTÉZISE 42. GYŰRŰ TÁGÍTÁS RING EXPANDÁZ (REX) CEPHEM VÁZ KÉPZŐDÉSE 48. A PENICILLIN KÉMIAI SZINTÉZISE. 48. PENICILLIN ANALÓGOK ELŐÁLLÍTÁSA FÉLSZINTÉZISSEL 57. GLYCOPEPTID ANTIBIOTIKUMOK: VANCOMYCIN, TEICOPLANIN 62. D-CIKLOSZERIN 66. FOSZFONOMYCIN 67. PEPTID JELLEGŰ ANTIBIOTIKUMOK (DEPSZIPEPTIDEK) 68. GRAMICIDIN-S 70. BACITRACIN 72. VIRGINIAMYCIN 75. NISIN 76. BLEOMYCIN 78. ACTINOMYCIN-D 81 CYCLOSPORIN-A; IMMUNSZUPRESSZÍV ANYAG HATÁSMÓDJA 90. NOVOBIOCIN 90. ANSA-LÁNCÚ ANTIBIOTIKUMOK CSOPORTJA 94. RIBOSZÓMÁLIS FEHÉRJESZINTÉZIST GÁTLÓ METABOLITOK 95. CHLORAMPHENICOL 97. AMINOGLIKOZID ANTIBIOTIKUMOK 109. MAKROLID ANTIBIOTIKUMOK 112. THIOSTREPTON 115. POLIKETID KÖZTESTERMÉKBŐL KÉPZŐDŐ METABOLITOK CSOPORTJA 117. TETRACIKLIN TIPUSÚ ANTIBIOTIKUMOK 124. KOLESZTERINSZINT CSÖKKENTŐ FARMAKONOK; SZTATINOK 126. GRIZEOFULVIN 128. POLIÉTERKARBONSAV SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK FUNGISZTATIKUMOK POLIÉNEK, ACTIDION FUMAGILLIN 135. TERPÉNEK - FUSIDINSAV 134. GIBERELLINSAV 140.RÁKOS MEGBETEGEDÉSEK ELLEN HATÁSOS ANTIBIOTIKUMOK CSOPORTJA 143. AZ ANTIBIOTIKUM KÉPZŐDÉS LEHETŐSÉGE ÉS FELTÉTELEI 146. FARMAKOLÓGIAILAG HATÁSOS ANYAGOK 148. MIÉRT ÉPPEN A STREPTOMYCESEK 151. ÚJ ANTIBIOTIKUM ELŐÁLLÍTÁS (KUTATÁS) MŰVELETEI 154. ELJÁRÁS PRIMER METABOLITOK ELŐÁLLÍTÁSÁRA CITROMSAV ELŐÁLLÍTÁSA 165. GLUTAMIN SAV ELŐÁLLÍTÁSA 171. ESSZENCIÁLIS AMINOSAVAK ELŐÁLLÍTÁSA 182. ARÓMÁS AMINOSAVAK ELŐÁLLÍTÁSA 193. ASPARTAM ELŐÁLLÍTÁSA 194. LAKTOBACILLUSOK ENZIMRENDSZEREINEK HASZNOSÍTÁSA 196. CLOSTRIDIUMOK 198. ALKOHOLOS ERJESZTÉS 213. ECETSAVGYÁRTÁS 218. CIANOCOBALAMIN B GLÜKONSAV ELŐÁLLÍTÁS 230. KÖRNYEZETET SZENNYEZŐ ANYAGOK BIOLÓGIAI HASZNOSÍTÁSA 3

4 A KEMOTERÁPIA TUDATOS ALKALMAZÁSA A kemoterápiai kutatások elméletének kialakítása és az első gyakorlati eredmények elérése Paul Ehrlich nevéhez kötődik ( ). Munkatársaival fáradhatatlanul és tudatosan kereste azokat a vegyületeket, amelyek a mikroszervezetek szaporodását olyan koncentrációban gátolják, amelyet még a gazdaszervezet károsodás nélkül elvisel. Felismerte a hatóanyag és a hatáshely közötti fizikai, illetve kémiai kapcsolat szükségességét. Corpora non agunt nisi fixata - A testek nem hatnak, hacsak nem kötődnek. Iskolát teremtve kialakította a gyakorlati gyógyszerkutatás módszertanát, technikáját. A sikereken felbuzdulva a gyógyszerészeti kutatás művelői úgy vélték, hogy kellő ötletgazdagsággal végzett kísérleti munkával megtalálhatók azok a kémiai szintézissel előállítható vegyületek, amelyekkel az élő szervezetet fertőző kórokozók leküzdhetőkké válnak. Kísérleti módszerük szerint a kórokozóval fertőzött állatokba juttatták a hatásosnak vélt vegyület különböző mennyiségét, meghatározva a túlélés százalékát. Egészséges állatokba juttatott hatóanyaggal pedig vizsgálták a vegyület toxicitását. Az eredmények mérhetősége, számszerűsítése a biológiában bevezetett 50%-os hatás meghatározását jelenti. Ez a technika reprodukálható módszerként lehetőséget ad a hatásos (effektív) dózis (ED 50 ) és a gyilkos (letális) dózis (LD 50 ) meghatározására, amely adott időn belül a fertőzött állatok 50%-ának túlélését, illetve az egészséges állatok 50%-ának pusztulását okozza. A kísérleti eredményeket mutató ábra a testsúly kilogrammra vonatkozó hatóanyag mennyiségének az állatok pusztulási görbéjére kifejtett hatását mutatja. A statisztikailag értékelhető számban felhasznált kísérleti állatot olyan mértékben fertőzték, hogy belátható időn belül közel azonos időpontban elpusztuljanak. Ennek érdekében azonos érzékenységű, azonos korú, azonos tömegű állatok kerülnek felhasználásra. Gyógyászati alkalmazásra az a vegyület számíthat, amelynek az ED 50 és az LD 50 értéke közötti érték (távolság) jelentős. A hatásos anyag bevitele történhet a tápcsatornán keresztül (per os) a gyomorban és a vékonybélben, illetve a véráramba juttatva vénába, (i.v.) vagy izomba (i.m.), illetve bőr alá (sub cutan) adva. Felszívódhat az anyag a nyálkahártyán keresztül. Ez esetben elkerüli a máj méregtelenítő hatását. A szervezetbe juttatott anyag a bevitel sebessége és a kiürülés, illetve bomlás függvényében kialakít egy vérszintet amitől a hatás várható. A vese áteresztőképessége és a máj méregtelenítő hatása egyedi illetve faji variációt mutat. Ezért az aktuális vérszint meghatározása feltétlenül indokolt 4

5 Az antibiotikum kezelés esetén a terápiás vérszint elérésére törekedve a meghatározó paraméterek figyelembe vételével a terápiás hatáshoz szükséges küszöbérték felett kell tartani a hatóanyag koncentrációját. Naponta többször adagolva, vagy pedig olyan származékot használva amelynek kémiai stabilitása akár egy napon keresztül is képes a terápiás szintet biztosítani (lásd például az oxitetraciklin és vibramicin használatát) Nemcsak tudománytörténeti, de szakmai szempontból is tanulságos röviden megismerkedni a kemoterápiai kutatás jelentősebb eredményeivel. Az Ehrlich által vezetett kutatócsoportnak (1909-ben Nobeldíj) az akkor népbetegségnek tekinthető igen súlyos következményekkel járó, Treponema pallidum okozta vérbaj (syphilis, lues) gyógyítására sikerült gyógyszert találni. Az Ehrlich-O. Hata 606 jelzésű, később Salvarsan néven forgalomba került vegyületük aromás arzénszármazék. A kevéssé toxikus készítmény csak in vivo mutat biológiai aktivitást. A gazdaszervezetben végbemenő oxidációval felszabaduló biológiailag aktív aromás arzén származék, a piroszőlősavból induló acetil-coa szintézishez szükséges liponsavval reagál. A liponsav hiánya az egész ciklust blokkolva akadályozza a Treponema életműködését- Liponsav felesleggel egyébként a gátló hatás felfüggeszthető. 5

6 prontosil A kemoterápiás kutatás jelentős eredménye volt a harmincas években a szulfonamidok felfedezése. A Mietzsch és Klarer által szintetizált prontosil biológiai hatását Domagk 1935-ben írta le. Ez a vegyület in vitro ugyancsak inaktív. A gazdaszervezetben alakul olyan hatásos vegyületté (p-aminobenzol-szulfonamid), amely a Streptococcus okozta fertőzések gyors leküzdésére sikerrel használható. A szulfonamidok vérszintjének alakulását, a vérminták hatóanyagtartalmát analitikai méréssel vizsgálják. Kiürülésük a vesén keresztül egyrészt változatlan alakban, másrészt acilezett formában vagy glükuronidként történhet. A metabolitok természetesen a kiürülés szempontjából előnyösebb helyzetben vannak. A képződő p-amino-benzolszulfonamid, mint p-amino-benzoesav (PAB) analóg, a fólsav szintézis gátlásán keresztül zavart okoz a kórokozó anyagcseréjében, reagál a dihidrofólsav egyik alkotórészével, a dihidropteridinnel. A képződő származék dihidropteridin-hiányt okozva végül is fólsav hiányt eredményez. Az emlős szervezetben ez az enzimreakció nem fordul elő. A szulfonamid csak a baktériumok anyagcseréjében okoz zavart, az emlős sejtet nem károsítja. A hazai gyógyszerpiacon a vegyület metiltiazol származéka ultraseptyl néven terjedt el. Az antibiotikumok elterjedése előtt a bakteriális fertőzés elleni küzdelem egyetlen, de igen hatásos fegyvereként tartották számon. A klinikai gyakorlatban szulfonamid készítményt használnak. Ezek két csoportba sorolhatók. Az egyik csoportot alkotják a bélből nehezen felszívódó származékok, amelyeket bélfertőtlenítésre használnak. Ílyen a hazai piacon elterjedt sulfaguanidin. A másik csoportot alkotják a vízben jól oldódó, bélből felszívódó, nyújtott hatású készítmények. Ezek lassú kiürülésük miatt viszonylag tartósan hatásos vérszintet biztosítanak még napi egyszeri per os adagolás esetén is. Ilyen a több hazai szulfonamid készítményben alkalmazásra került 3-szulfa-5- metil-izoxazol származék. A szulfonamidok bakterium spektruma meglehetősen széles. Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokon kívül az Actinomyces, Toxoplasma és Coccidium fajok, valamint a Plasmodium malariae ellen is felhasználhatók, sőt néhány Rickettsia szaporodását is gátolja (Trachoma, Lymphogranuloma psittacosis, Lymphocyticus choriomeningitis). Gyenge hatású viszont az Escherichia, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Brucella, Aerobacter fajokkal szemben. A szulfonamidokkal szemben is kialakulhat rezisztencia egyrészt a p-amino-benzoesav szintézis fokozódása útján, de gyakoribb oka a rezisztenciának a permeabilitási körülmények változása. Ezért nem előnyös alacsony dózisban adagolni a szulfonamid készítményeket. A forgalomba kerülő gyógyszerek hatásmechanizmusának részletes biokémiai vizsgálata, és a céltudatos kemoterápiai kutatás szép eredményeket hozott. Jó példa erre a trimetoprim, a 2,4-diamino-5(3,4,5-trimetoxi-benzil)-pirimidin előállítása és biológiai hatásának a felismerése. Hasonló hatású rokon vegyület a pyrimetamin, a 2,4-diamino-5(p-klórfenil)-6-etilpirimidin. Mindkét pirimidin származék a szulfonamidokkal együtt adva azok hatását jelentősen fokozza (potencirozza). Általában szulfonamidokkal kombinálva alkalmazzák. Ilyen készítmény a sumetrolim. 6

7 Szerkezete bizonyos mértékig hasonlít a pteridin szerkezetéhez, így nem meglepő, hogy a szulfonamid fólsav szintézist zavaró hatását fokozni tudja a szintézist végző enzimek működésének gátlásával. A dihidrofólsav reduktázt gátolva megakadályozza a tetrahidrofólsav képződését. Ez az enzim nem csak a baktériumokban, de az emlős szervezetben is fontos szerepet tölt be. A trimetoprim tehát a gazdaszervezetet is károsítja. Századunk közepén két kemoterápiás szer vált népszerűvé hazánkban. Mindkettő a tuberkulózis elleni küzdelemben került felhasználásra. Az egyik az 1946-ban felfedezett p-amino-szalicilsav (PAS) mint PAB analóg. A másik pedig az 1951-ben felfedezett baktericid tulajdonságú izonikotinsav-hidrazid (INH), amelynek szerkezete hasonlít a piridoxaminhoz, illetve a nikotinsavamidhoz. Feltételezhetően mindkét vitaminjellegű vegyület élettani hatását zavarja. Széles spektrumú kinolon származékok közül emlitésre érdemes a vízben jól oldódó pefloxacin (1-etil-6-fluoro- 7-/4-metil-1-piperazinil/4-oxo-1,4-dihidro-3-kinolinkarbonsav moltömege: 465.5), amely tabletta és injekciós formában adagolható. Jellemző rá a posztantibiotikus hatás.az antibiotikum /400 mg hatóanyagot tartalmazó tabletta/ 8-10 óra alatt bekövetkező kiürülése után még néhány órán keresztül a kezelést esetleg túlélt baktériumok sem képesek növekedni. A hatóanyag az RNS magra feltekeredett DNS fellazítását végző giráz működését gátolva fejti ki baktericid hatását. Szepszis, szívbelhártya és agyhártya gyulladás esetén is hatásos. A hatóanyagnak a szervekben illetve a szövetekben kialakuló koncentrációját a következő oldalon található ábra szemlélteti. Pefloxacin Nem felejtendő el, hogy a kemoterápia eredményei nem függetleníthetők a gazdaszervezet védekező mechanizmusának állapotától. A gyógyszerként felhasznált hatóanyagok csak csökkentik a korokozók életképességét. A végső eredményt az ellenanyagképző mechanizmus, az immunológiai védelem teljesítménye határozza meg. A gondolkodó ember a mikroszkóppal sem látható természeti Nalidix sav képződmények élettani hatásával, kórokozó tulajdonságaival jóval azelőtt találkozott, mintsem ezen lények vizsgálatára alkalmas eszközöket megalkotta volna a műszaki tudomány. A gyógyítani akaró orvosi hivatástudat több-kevesebb sikerrel felvette ezekkel az ismeretlen lényekkel a küzdelmet. A szervezet védekező mechanizmusát kihasználva, Edward Jenner az aktív immunizálást alkalmazta az orvoslás gyakorlatába, amikor 1796-ban elsőként a tehénhimlővel vakcinálva (vacca~tehén) védelmet tudott biztosítani az akkor még ismeretlen himlő (Pox) vírus ellen. Luis Pasteur pedig 1880-ban az immunológiai védelem hatásos alkalmazását demonstrálta a lépfene korokozója, az Anthrax bacillus okozta fertőzés leküzdésére. 7

8 8 A piperazinil-kinolin-karbonsav hatóanyagnak a szervekben illetve a szövetekben kialakuló koncentrációja

9 AZ ANTIBIOTIKUMOK BIOLÓGIAI-KÉMIÁJA A PENICILLIN FELFEDEZÉSE A penicillint felfedező orvos - Alexander Fleming ( ) - doktori disszertációját a magasabb rendűek által védekező anyagként termelt lizozim tulajdonságait vizsgálva készítette. Ez az enzim folytonosan termelődve az élőlény felületére került baktériumok sejtfalát feloldja, a sejtfal szénhidrát építőelemei közötti β- glikozidos kötést hidrolizálja. A baktériumtenyészet penész hatására bekövetkező feloldódását látva, valamint a hatásos anyag hő és ph érzékenységét tapasztalva, Fleming valami lizozimhoz hasonló anyagra gondolt. A munkába kapcsolódó Dr. C. Thom mikológus rendszertanilag Penicillium notatum-mal, egy ritkán előforduló fajjal azonosítja az antibakteriális hatást mutató anyagot termelő fonalas gombát. Az antibakteriális tulajdonságú hatásos anyag kinyerése céljából végzett eredménytelen kísérleti munka után, 1932-ben Clutterbuck csak annyit közölhetett, hogy a penicillinnek elnevezett hatásos anyag labilis, ph és hő érzékeny gyenge sav. Az anyag hatásossága és elhanyagolhatóan csekély toxicitása azonban nem hagyta feledésbe merülni Fleming felfedezését, bár a nehézségeket látva maga sem bízott a sikerben. Az 1930-as évek végén csupán a tenyészet szűrletét javasolhatta külsődleges alkalmazásra. Az Oxfordban összekovácsolódott munkacsoport kitartó munkája, Chain és Florey erőfeszítései végül eredményre vezettek. Felületi tenyészetből elkülönített tenyészléből fagyasztva szárítva sikerült kielégítő stabilitású barna port nyerni, amellyel Abraham és munkatársai már bizonyíthatták az anyagnak a szeptikus folyamatok leküzdésében elért fantasztikusnak tűnő gyógyító hatását. Tiszta anyaggal nem rendelkezve, biológiai egységet használtak összehasonlítási alapként. Oxford-egységnek (NE) tekintették azt a legkisebb penicillin mennyiséget, amely egy bizonyos Staphylococcus törzs növekedését 50 ml táptalajban képes gátolni. Ez ma o.6 mg kristályos benzilpenicillin Na-sónak felel meg. Fleming 1940 november 14.-én a Gyógyszerészeti Társaság tudományos űlésén számolt be az eredményekről. Ezekkel az eredményekkel indult 1941 júliusában Florey és Heatley az Egyesült Államokba a kormány anyagi támogatását kérni az eredmények továbbfejlesztéséhez. A kormányszervek felismerték a téma katonai jelentőségét.(az első világháborúban megsebesült katonák több mint 50%-a szepszisben halt meg!) A Pentagon a Northern Regional Research Laboratory (Peoria Illinois) fermentációs osztályán R. D. Coghill és A. N. Richards mikrobiológusokat bízta meg a téma vitelével. A termelő törzsek kiválasztásában az USA lakosságának a segítségét is igénybe vették. Közhasznú hazafias tevékenységgé vált a különböző helyekről származó gombatenyészetek eljuttatása a Mezőgazdasági Minisztérium által fenntartott NRRL törzsgyűjteményébe, ahol szorgalmas munkával minden tenyészet biológiai aktivitását megvizsgálták. Az összegyűjtött törzsek közül egy háziasszony által beküldött grép fruitról származó Penicillium notatum chrysogenum néven leírt tenyészet - a Fleming által izoláltnál 10-szer nagyobb biológiai aktivitást mutatott. Később (feltehetőleg szabadalmi okokból) a notatum előnév lemaradt. Ebből az izolátumból fejlesztették ki a gyógyszeripar fermentációs üzemeiben felhasználásra kerülő törzseket. Kezdetben négy gyógyszergyártó vállalat (Pfizer, Lederle, Merck, Squibb) és több kutató laboratórium, (Carnegie Institute, University of Minnesota, University of Wisconsin) kapcsolódott a munkába. A katonai titoktartás szabályait betartó együttműködés a különböző kutatóhelyek között tökéletes volt, A hadügyminisztérium szakemberei ezt az életmentőnek tűnő anyagot minél előbb a szövetséges hatalmak katonakórházaiba kívánták juttatni. Az anyagi és a szellemi erőfeszítés hamarosan eredményt hozott májusában az új gyógyszert már 300 sebesült esetében alkalmazhatták teljes sikerrel a szepszis kialakulásának akadályozására, illetve gyógyítására. A katonai költségvetés a háború utolsó éveiben 30 millió dollárral támogatta a program sikerét. A munkában résztvevő kutatóhelyek száma közben 20-ra növekedett. A heti penicillin termelés 1943 végére elérte a 100 grammot (100 ezer NE penicillin akkor 20 dollárba került, ez ma 1 milliárd NE ára). A fejlődés ütemét jól mutatja, hogy 1944 végére a havi termelés meghaladta a 200 kg-ot, amely 1946-ban évi 32 tonnára emelkedett ben már indokolt esetben a polgári kórházak számára is engedélyezték a hatásos anyag, a G-penicillin alkalmazását júliusában a király a V-bombák rendszertelen érkezése miatt a királyi palota alagsorában rendezett ceremonia keretében tudományos érdemeit elismerve a neves tudóst lovaggá ütötte (Sir Alexander Fleming). Az első felhasználásra került termék mindössze 1% hatóanyagot tartalmazott. A tisztításban való előrehaladás a kémiai szerkezet felderítésének lehetőségét jelentette. Abban reménykedtek, hogy a kémiai szerkezet ismeretében a hatóanyag kémiai szintézisére lehetőséget találnak. A szerkezetkutatásban l944-ben már 59 kutatóhely vett részt teljes katonai titoktartás mellett. Ma már köztudott, hogy kutató munkát az zavarta, hogy a különböző laboratóriumokban előállított gombatenyészetek szűrletei több mint 20 különféle penicillin keverékét tartalmazták, amelyeket az angol alphabet betüivel jelöltek.. Az USA laboratóriumaiban előállított penicillin készítményeknek a fizikai-kémiai adatai jelentős mértékben eltértek az Angliában, szeszgyártási maradékon előállított készítmények vizsgálatakor nyert adatoktól. Az egyik esetben G-penicillin (benzilpenicillin), a másik esetben F-penicillin (pentenil-penicillin) volt a főtermék. Angliában a szeszgyártás maradékát (distillers solubl) használták táptalajként, az US kutatói viszont a fenilecetsavat is tartalmazó kukorica áztató lé tejsavas erjesztéssel dúsított koncentrátumát alkalmazták a táptalaj nitrogén forrásaként. A tenyésztő táptalaj kémiai összetételének meghatározó jelentőségét felismerve javasolták a prekurzorok alkalmazását. A tápközeghez adott fenilecetsav jelenlétében a kutató laboratóriumokban főleg benzil-penicillin képződött a tenyésztési ciklus második fázisában. 9

10 A második világháború után a penicillin előállításával a gyógyítás történetében új korszak kezdődött. Az orvosi gyakorlatban, a fertőző betegségek elleni küzdelemben addig nem tapasztalt forradalmi fejlődést jelentett az antibiotikumok megjelenése. Széleskörű gyógyászati alkalmazásuk az átlagéletkor meghosszabbodását jelentette. A genetikailag megalapozott egyéni különbségek, az öröklött ellenálló képesség szintjében jelentkező eltérés szelekciós hatása csökkent. Addig ritkábban előforduló halált okozó megbetegedések ennek következtében előtérbe kerültek (rák, keringési problémák). A gyermekhalandóság csökkenése, a szeptikus folyamatok kialakulásának megakadályozása, a fertőző betegségek leküzdése a lakosság életkori összetételét jelentősen megváltoztatta. Nem csekély mértékben az antibiotikumok használatának terjedése is hozzájárul a Föld népességének ugrásszerű növekedéséhez. Áttételesen a társadalmi átalakulásokra is hatással van. Hagyománytiszteletből antibiotikumnak nevezzük azokat a mikro-organizmusok életműködését gátló vegyületeket, amelyeket mikroorganizmusok termelnek. E vegyületek utáni kutatás és a kiválasztott vegyületek nagyipari előállítása a gyógyszeripar legdinamikusabban fejlődő ágát teremtette meg. Az antibiózis fogalma a biológiában régóta ismert, mint a szimbiózis ellentéte. A kifejezést először Vuillemin használta 1889-ben megjelent dolgozatában. Évezredes hagyomány és gyakorlati tapasztalat a tejsavas erjedés tartósító szerepének használata. A tejsav azonban nem tekinthető antibiotikumnak, mert elsősorban a közeg hidrogén ion koncentrációjának megváltozása a kialakított savanyú élettér akadályozza más mikroorganizmusok elszaporodását. Időszámításunk előtt évvel készült kínai feljegyzések említik, hogy szójababon nőtt gombák nedvével furunkulusok, gennyes fertőzések leküzdhetők. A tudománytörténet Roberts 1870-ben közzétett dolgozatát tekinti az első antibiózisra utaló híradásnak, melyben leírja, hogy Penicillium glaucum tenyészetében nem növekednek a baktériumok. Később Tyndall közli, hogy bizonyos zöld színanyagot termelő baktériumok más idegen mikroorganizmusok szaporodását gátolva, képesek leküzdeni azokat. Joubert és Pasteur 1877-ben bejelenti, hogy apatogén mikroorganizmusokkal le tudják küzdeni a lépfene fertőzést. Pasteur dolgozatában a jövőt sejtve megállapítja, hogy ez a jelenség nagy reményekre jogosítja a gyógyászat művelőit. A szorgalmas kutatómunka ellenére több mint 50 év telik el Alexander Fleming ( ) a St. Mary kórház bakterológusának 1929-ben megjelent dolgozatáig, amelyben leírja, hogy a Staphylococcus növekedését gátolva a tenyészet lízisét okozza egy levegőből származó penész által kiválasztott ismeretlen vegyület. Ilyen jelenséget valószínűleg több klinikai laboratóriumban észleltek már ezt megelőzőleg is, sőt közlésre is került több esetben mint figyelemreméltó tapasztalat, mégsem lett belőle piacképes termék. AZ ANTIBIOTIKUMOK MEGJELENÉSE A TERÁPIÁBAN Közel tíz év telik el a penész által termelt vegyület a penicillin első parenterális gyógyászati alkalmazásáig. Ettől az időponttól ugrásszerű a fejlődés. Mi volt vajon a kezdeti sikertelenség oka? Nem más, mint az, hogy a kémiai tevékenység modern módszerei, a kis mennyiségű anyagok ma már megoldott tisztítási eljárásai az időben ismeretlenek voltak, illetve még gyermekcipőben jártak. Nem utolsó sorban éppen a biológiailag aktív anyagok tisztítására való törekvés volt a serkentője e mikrokémiai módszerek fejlesztésének. Ezen időszakban a kutató kapacitás jelentős részét világszerte a szép eredményekkel dicsekvő (salvarzán, prontozil stb.) kemoterápia gyógyszeripar által támogatott fejlesztése vonta el. Ezek az évtizedek az antibiotikum kutatás szempontjából is haszonnal jártak, amennyiben ebben az időszakban a kemoterápiai módszerek tökéletesedésével egy új gondolkodásmód terjedt el a fertőzéses megbetegedések leküzdése területén. Tüneti kezelés helyett a kórokozó elpusztítására törekedtek a gazdaszervezet károsítása nélkül. Az elmúlt félszázadban felfedezett hatásos vegyületek száma meghaladja a tízezret, a gyógyászati alkalmazásra került antibiotikumok száma azonban alig éri el a százat. Biológiai szempontból a rendszertani csoportokra kifejtett hatásuk szerint oszthatjuk be őket baktérium ellenes, gomba ellenes, antivirális és citosztatikus hatású anyagokra. Hatásmód szerint megkülönböztethetünk: baktérium sejtfalszintézist gátló, membránkárosító, fehérjeszintézist gátló, DNS képződést gátló, RNS szintézist akadályozó vegyületeket. Kémiai szerkezet szerint megkülönböztethetők az azetidinon ( β-laktám) szerkezetű antibiotikumok, aminoglikozidok, tetraciklinek, makrolidok, ansa-láncúak, oligopeptidek, antraciklinek, poliéterek, spirolaktonok, ciklopentano-perhidrofenantrén vázúak, poliének, poliketid vázból épülők, antimetabolitok (anyagcsere köztestermékek, nukleotidok és aminosavak analógjai), poliének, stb. A kémiailag jelentős mértékben különböző vegyületek hatásmechanizmusa, de felhasználási módjuk is eltérő. Az antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok rendszertani helye sem segít a csoportosításban. Képződésüket nem tekinthetjük faji jellegzetességnek, inkább anyagcseretípustól függő lehetőségnek. Így például ß-laktám csoportot tartalmazó antibiotikumokat termelnek a prokariota törzsek és az eukariota tömlős gombák. A kemoterápia eredményei nem függetleníthetők a gazdaszervezet védekező mechanizmusának állapotától. A gyógyszerként felhasznált hatóanyagok csak csökkentik a korokozók életképességét. A végső eredményt az ellenanyagképző mechanizmus, az immunológiai védelem teljesítménye határozza meg. 10

11 A ß-LAKTÁM SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK BIOLÓGIAI-KÉMIÁJA A penicillin molekula krisztallográfiás analízissel igazolt szerkezete 1945-ben vált ismertté Crowfoot és Low munkáiból. A benzil-penicillin, - más néven G-penicillin - D-valinból és L-ciszteinből álló penám alapvázát fenilecetsav acilezi. A tiazolidin gyűrűvel anellált négytagú, igen labilis β-laktám szerkezet sav, lúg és oxigén érzékenysége jelentette a szerkezet felderítés fő nehézségét..a három királis szénatom (vastagítva) pedig a gazdaságos totálszintézis reménytelenségét. A PENICILLIN KÉMIAI SZERKEZETE ÉS BOMLÁSI FOLYAMATAI VIZES KÖZEGBEN = R H H CH 3 : : R-CH 2 -CO-NH-C----C S C-CH 3 O=C----N C-H : COOH H 2O H 2O OH -- H + H H CH 3 : : CH 3 R-CH 2-CO-NH-C C S C CH 3 R-CH 2-CO-NH-CH-CHO HS-C-CH 3 COOH H-C-NH 2 HOOC HN C-H COOH : COOH Penicillo-sav Penald-sav Penicillamin CO 2 CO 2 R-CH 2-CO-NH-CH 2---C S C-CH 3 H CH 3 : R-CH 2-CO-NH-CH 2-CHO Penilloaldehid H-N C-H : COOH CH 3 HOOC CH CH S C--CH 3 penill-sav N N C-H \\ / : C COOH R CH 2 Savanyú kémiai kezeléssel a penaldsav mellett az úgynevezett penicillamin (dimetil-cisztein) különíthető el mint hidrolízis termék. Lúgos körülmények között penicillosav képződik. A penicillosav dekarboxilezésével penillosavhoz, a penaldsav dekarboxilezésével pedig penilloaldehidhez jutunk. Savanyú körülmények között egy intramolekuláris átrendeződéssel penillsav képződik. A laktám gyűrű felnyílása a biológiai hatás elvesztésével jár. A molekulában található három királis (vastagítva) szénatom azidőtájt reménytelenné tette a gazdaságos kémiai szintézist. A fejlesztési igény kielégítése elsősorban a mikológusok eredményes genetikai tevékenységétől volt várható A penicillin szerkezetének felderítése után a biológusok az acilező sav (prekurzor) változtatásával igyekeztek a G-penicillinnél előnyösebb tulajdonságú származékot nyerni. Itt azonban a bioszintézist végző Penicillium törzs enzimrendszerének specifitása behatárolta lehetőségeiket. A kipróbálásra került több mint ezer acilező sav közül alig száz esetben igazolták a prekurzor beépülését. Az előállított új származékok baktériumspektruma és penicillinázzal szembeni érzékenysége nem különbözött a gyógyszerként ma is forgalomban levő fenilecetsav származéktól, a G-penicillintől. Kiemelkedő savstabilitására való tekintettel csupán egyetlen új termék aratott sikert, a fenoxiecetsav származék, amely szabad savként a gyomorsav hatásának ellenállva tabletta formájában tartósan adagolható gyógyszerként növelte a penicillin népszerűségét. 11

12 A fermentlében talált, addig betüvel jelölt Gram-pozitív mikroszervezetek ellen eltérő mértékben hatásos fontosabb penicillinek kémiai szerkezete is közlésre került. Penicillin BT penám-co-ch 2 -S-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 Penicillin O penám-co-ch 2 -S-CH 2 -CH=CH 2 Penicillin F penám-co-ch 2 -CH=CH-CH 2 -CH 3 Flavicidin penám-co-ch 2 -CH 2 -CH=CH-CH 3 Penicillin K penám-co-ch 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 Dihidro-penicillin F penám-co-ch 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 Penicillin N penám-co-ch 2 -CH 2 -CH 2 -CHNH 2 -COOH Penicillin G H penám-co-c--- H H Penicillin X penám-co-c OH H H Penicillin V penám-co-c O H penám = 6-aminopenicillansav CH 3 H H : : H 3 C-C S C C NH 2 H-C N C=O : COOH A penicillin kémiai analitikai meghatározása is a laktám gyűrű labilitását hasznosítja. A jodometriás módszer alapja az, hogy az ép penicillin molekula nem köt jódot, a lúgos hidrolízis termék, a penicillosav viszont 7-8 atom jódot köt. Ez lehetőséget adott a penicillin jodometriás meghatározására. A hidrolízis nélkül mért aspecifikus jód kötés és a lúgos kezeléssel hidrolizált minta jódkötése közötti érték arányos a β-laktám szerkezetű vegyület mennyiségével. A másik eljárás azt a tényt hasznosítja, hogy a penám váz jól reagál hidroxilaminnal. A képződő hidroxamát vaskomplexe kolorimetriás meghatározásra ad lehetőséget. H H CH 3 : : R CO HN--- C C----S-----C---CH 3 Penicillin + HO-NH 2. HCl HO---HN----C=O HN C---H : COOH ÚJABB β-laktám SZERKEZETŰ BIOLÓGIAILAG AKTÍV METABOLITOK FELFEDEZÉSE Hamarosan új vegyületcsoportot a carbapenemeket fedezték fel egymástól függetlenül a Merck és a Beecham kutatói, a Streptomyces fajok által termelt thienamycineket. Ez esetben a kén atom nem az anellált gyűrűben, hanem tioetanolamin származékként tioéter kötésben található. (Streptomyces clavuligerus, S olivaceus, Erwinia carotovora, Serratia sp.). CH 3 Tienamicinek szerkezeti képlete HO-C-H H O CH 3 H H : : : : H C C CH 2 HO S O C C C CH 2 H H O=C N---C== C S CH 2--CH 2--NH 2 O H O=C N C==C S C=C---N---C---CH 3 COOH COOH H O 12

13 Ugyancsak Streptomyces törzsek termelik a. Merck és az Eli Lilly kutatói által felfedezett cefamicineket. A Streptomyces clavuligerus, törzsek által termelt cefamicin származékok különlegessége a 7-α-metoxi csoport megjelenése és az oximetil csoport hiánya, illetve karbamoilezettsége. CH 3 NH 2 H H H O H O H : : HOOC----C----C----C----C----C----N-----C------C-----S-----CH 2 O H H H H O= C------N-----C===C---CH 2 --O--C---NH 2 Cephamycin szerkezete O=C OH A Beecham Laboratórium kutatói által vizsgált Streptomyces clavuligerus tenyészlevében egy clavulansavnak elnevezett vegyületet izoláltak. Ez a vegyület a tiazolidin gyűrű helyett oxazolidin gyűrűt tartalmaz. A kén helyett oxigént tartalmazó alapváz acilező aktivitása fokozott mértékű. A C 6 szubsztituens hiánya miatt antibakteriális hatást ugyan nem mutat, de a penicillináz enzimet képes inaktíválni. A β-laktam bontásáért felelős -SH csoportot a felnyíló laktám gyürű acilezi. Ezt követőleg az oxazol gyürű felnyílása után a reaktív oldallánc stabil tioéter kötésbe lép az enzim másik SH csoportjával. Széles spektrumú félszintetikus penicillin származékokkal együtt adagolva penicillin rezisztens fertőzések leküzdésére használják..a β-laktám szerkezetű vegyületek sikere fokozta a kutató csoportok új hatásos anyagokat kereső tevékenységét. Azetidinon gyűrűt tartalmaznak a monolactamok. Első képviselőjüket a nocardicint Fujisava laboratóriumának a kutatói izolálták Nocardia uniformis tsuyamanensis tenyészlevéből. A molekula p-hidroxi-fenilglicinből, annak oximino származékából, ciszteinből és homo-szerinből ill. cisztathioninból épül fel. A hetvenes évek végén végzett kutatómunka N-szulfonil azetidinon gyürűt tartalmazó Gram-negatív törzsekre ható β-laktám vegyületek felfedezéséhez vezetett. Az irodalom monobaktám gyűjtőnéven tárgyalja őket, mert baktériumok (Pseudomonas acidophila, Gluconobacter, Acetobacter, Agrobacterium radiobacter) tenyészlevéből izolálták őket. A 3-amino-baktámsav alapváz savanyú természetét az N-szulfonsav csoport okozza. A β-helyzetű amino-csoportot különféle savak, illetve savszármazékok acilezik. Több esetben a 3-αhelyzetű hidrogént metoxi csoport helyettesíti. CH 3 H H H O H H : : O=C N C------CH 2 --CH C-----C-----N------C-----CH 2 O=C N NH O=C---- N SO 3 K + O=C CH 3 SO 3 K + 13

14 Az Agrobacterium radiobacter törzs termékében az acilező sav aromás gyűrűt tartalmaz. Ezek az utóbbi azetidinon szerkezetű antibiotikumok gyógyászati felhasználásra nem kerültek, de a megszerzett biokémiai ismeretek termékenyítőleg hatottak az új hatóanyagok előállítását célzó kutató munkában. 14

15 AZETIDINON SZERKEZETÚ VEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA TÖRZSFEJLESZTÉS A penicillin kémiai szerkezetének felderítése után a tématerületen dolgozó kutató csoportok számára nyilvánvalóvá vált, hogy a totálszintézis gazdaságos megoldására nem számíthatnak. Minden erejüket a biológiai eljárás technológiájának fejlesztésére fordították. Minden mikrobiális eljárás alapja a kitűzött feladat megoldására (sejt-tömeg termelés, enzim termelés, primer vagy szekunder metabolit termelés) kiválasztott illetve genetikai munkával fejlesztett olyan baktérium vagy gomba törzs amely biokémiai tulajdonságát hosszabb időn át képes megőrizni. Az eljárás kivitelezéséhez szükséges a környezettől elválasztott olyan aszeptikus körülményeket biztosító reakciótér, amely hatékony hűtő és fűtő rendszerrel rendelkezve a sterilezés és a hőmérséklet tartás feladatát biztonsággal megoldja. Változtatható hatékonysággal működő keverő elemei az anyagátadást elősegítik. Műszerezettség szempontjából a belső nyomás a ph, az oldott oxigén és széndioxid koncentráció beállított értéken való tartására alkalmas. A reakció elegy összetételében bekövetkező változások mérése és az adatok rögzítése alapvető jelentőségű. A magas színvonalú technológia kialakítása igényli a mikroszervezet anyagcsere rendszerének ismeretét, a mikrobiális feladat megoldásában szerepet játszó enzimek közötti élettani, funkcionális kapcsolat felderítését. A természeti környezetünk kialakulásának evolúciós szemlélete szerint a rendszer fennmaradásában a természetes kiválogatódás érvényesül. A gazdaságosabb anyagcseréjű egyed győzedelmeskedik. Ennek szellemében nem várható, hogy természetes élőhelyén bármely organizmus fölös mennyiségben állítson elő valamilyen számunkra hasznos terméket. Nyilvánvaló, hogy a létért folytatott küzdelemben ez az improduktív tevékenység hátrányos helyzetbe juttatná a kiválasztott törzset. Természetes élőhelyén az anyagcsere szabályozott volta biztosítja a leggazdaságosabb életvitelt a mikroszervezet számára. Az ipari alkalmazáskor kialakított technológia valójában az évmilliók alatt kialakult szabályozási mechanizmus félrevezetésével, adott esetben kikapcsolásával éri el a gazdaságos termelés körülményeit. A negyvenes évek elején a fonalas gombák által termelt anyagok nagyipari előállítása közismert volt a biomérnökök előtt. Az Aspergillus niger tenyészlevéből elkülöníthető citromsav nagyipari méretben folyó előállítása évtizedek óta évi több ezer tonnás tételt jelentett. Formalinnal és gőzzel sterilizálható helységekben elhelyezett 2x5 méteres saválló acélból készített tálcákban töltött cm-es folyékony táptalaj felszínén növekedett a gomba micélium tömege. Aszeptikus körülmények között a tápközeg felületén fejlődő micélium tömeg a táptalaj glükóz tartalmát 25-30%-os hatásfokkal alakította át citromsavvá. Ez a primer metabolit a micéliumtömeg (réteg) alól elválasztott tenyészléből könnyen kinyerhető volt. Kezdetben a penicillin termelésre is ezt a technológiát alkalmazták. Különbség volt a hasznos termék koncentrációjában. A citromsav 100 g/l koncentrációban képződött savanyú körülmények között, a penicillin viszont alig haladta meg a 0,1 g/l értéket semleges körüli környezetben. Ez lényeges különbséget jelentett. A citromsavat termelő felületi tenyészetet bakteriális fertőzés ellen jól védte a savanyú kémhatás. A semleges körüli ph tartományban termelődő penicillin viszont nem volt képes megvédeni a gombatenyészetet a gyakran jelentkező bakteriális eredetű fertőzésektől. A megjelenő baktériumok a penicillint általában elbontották. Nyilvánvaló volt mindenki számára, hogy a technológiai folyamatban alkalmazható döntő áttörés nélkül a termék nem számíthat piaci sikerre. A fejlesztési munkákat a technológia jellegéből adódóan genetikai és technológiai tevékenységre csoportosíthatjuk. A két irány egymással állandó kapcsolatban levő kutató-fejlesztő munkát jelentett és jelent ma is. Egy-egy új jobban termelő mutáns fermentációs körülményeinek optimalizálása az előállítási technológia módosítását igényelte. A felületi tenyésztést hamarosan felváltotta a sűlyesztett körülmények között végzett eljárás. A keverővel ellátott sterilizálható edényekben elhelyezett tenyészet oxigénellátását sterilre szűrt levegő befúvásával oldották meg. Ez nem csekély feladatot jelentett a habzás miatt, amit habgátló anyagok adagolásával lehetett mérsékelni. Az oxigénellátást javító keverést a fonalas szerkezetű micélium tömeg növekedésével járó viszkozitásváltozás nehezítette. A genetikai munkákban a szelekciós tevékenység mellett a mutagén kezelés is korán alkalmazásra került. A törzsfejlesztéshez felhasznált mutagének (diepoxibután, etilmetánszulfonát, etilénimin, metil-bis-(β-kloretil)amin, N-metil-N -nitro-n-nitroso-guanidin, UV-, X-, γ-sugárzás.) hatására a törzs termelőképessége több százszorosra növekedett. A felületi kultúrában 200 E penicillint termelő törzs röntgen sugárral kezelt túlélői, amilyen például a Carnegie Intézetben előállított X jelű mutáns már 450E penicillin termelésére volt képes. A Wisconsin egyetemen előállított Q 176 jelű mutáns termelése elérte a 780 E értéket ban a Wis mutáns 1520 E termeléssel került az élre. Egyébként ez a törzs került ipari felhasználásra hazánkban is az ötvenes évek elején. A táblázat néhány fejlesztéssel foglalkozó laboratóriumban végzett tevékenység vázlatát mutatja megjelölve az alkalmazott klasszikusnak tekinthető genetikai eljárást. A legjobb mutánsok termelési értéke ma meghaladja az E/ml értéket. Ez a mennyiség a tenyészet száraz micélium tömegének többszöröse. Nyilvánvaló, hogy ez a gomba számára haszontalan többlettermelés csak szigorúan meghatározott körülmények között valósul meg és ahhoz sem férhet kétség, hogy ezzel a túltermeléssel terhelt mutáns a létért való küzdelemben alul marad a környezet energiaforrásait gazdaságosabban hasznosító, penicillint alig termelő vad törzzsel szemben. Ezért nem kis feladat a jól termelő törzs termelőképességét meghatározó biokémiai tulajdonságok megőrzése. Nagyipari termelésre csak olyan mutáns alkalmas, amelyik változatlan körülmények között hosszú ideig képes termelőképességét megőrizni. Az üzemek mikrobiológusainak fő feladata a magas termelőképességű oltóanyag előállítása. 15

16 A legjobban termelő törzs kiválasztása egyspóra tenyészet (klon) termelőképességének meghatározásával kezdődik. A vizsgálandó, mutagén kezelést túlélő higitott spóra-szuszpenziót szélesztik agar táptalajra, hogy a kifejlődő telepek egymástól elkülönülve növekedjenek. A kifejlett telepekről nyert spóra szuszpenzióval rázó lombikban elkészített termelő táptalajt oltanak, illetve törzsfenntartásra szolgáló szaporító felületet, például köles szemeket. Rázott tenyészetben vizsgálják az izolátumokra jellemző antibiotikum képződés sebességét. A legjobban termelő változat biokémiai tulajdonságának stabilitását ismételt szélesztéssel és termelőképesség vizsgálattal igazolják. A kísérleti eredmények a törzs specifikus termelőképességére jellemző adatokat szolgáltatnajk a sejttömeg és az idő függvényében. Négy fejlesztő laboratórium törzsnemesítő tevékenysége a törzsjelzés feltüntetésével. Penicillium chrysogenum NRRL 1951 Peoria Illinois S NRRL 1951-B-25 Carnegie Institute Univ.Minnesota X X 1612 U Wis Q 176 UV-1 Wis BL 3DIO S S S S S S S S S UV-1 NM S UV-1 NM S UV-1 NM S UV-1 NM S UV-1 NM S UV-1 U S S M-5 E S UV-1 U X NG S S S 52-8 M-30 E-2 E F UV-1 U NG S S M-58 E F-3-64 UV-1 U NG S M-73 E-5 E UV-1 UV-1 DEB NG M-88 E-7 E-8 (AS-P-78 v. P-2) UV-1 NG E-9 V-116 NG E-10 C (P-6) NG NG E-12 4E-184 E-11 SA NG 1639 E E-119 NG NG E-14 6E-369 (P-9) NG NG 29/ E-15 7E-408 S E E-10 (P-11) 9E-10 (P-14) Wyeth Lab. Eli Lilly Indianapolis Panlabs Seattle Univ.Wisconsin Madison West Chester Alkalmazott módszerek: S= szelekció, X = röntgenbesugárzás, UV= ultraibolya kezelés, M= metil-bis(β-kloretil)amin, NG = nitrozo-guanidin, NM = nitrogénmustár Az egymást követő mutagén kezelés természetesen nem csak a termelőképesség megváltozásával jár. A kezdetben fonalasan növekedő micélium tömegből célszerűségi okokból azokat a jól termelő variánsokat választották ki, amelyek rövid lekerekedő formában - pelletet képezve - növekedtek. Ezek az alakok sűlyesztett körülmények között 1-2 mm átmérőjű kompakt gömbszerű telepecskéket alkotnak. Ez a növekedési forma a 16

17 specifikus termelőképesség szempontjából is előnyös, mert a térfogategységben megjelenő micélium tömeg mennyisége nagyobb. A golyócskákból álló tenyészet jól keverhető és levegőztethető. (A fonalas sűrű micéliumtömeg oxigén-ellátása technikai okok miatt nem oldható meg.) Az ipari szempontból kinemesített variánsok csak a növekedés kezdetén, a spórából csírázva jelennek meg laza, fonalas formában, de ez a növekedési szakasz sem emlékeztet a vad törzs hosszú sima, enyhén elágazó micéliumára, hanem hajlott göcsörtös, artrospóraszerű, néha elágazó formát mutat. Fleming felfedezését követően hosszabb ideig úgy vélték, hogy a penám váz szintézisére csak a Penicillium nemzetség néhány faja jöhet számításba. A század második felében végzett kiterjedt vizsgálatok megerősítették, hogy a bioszintetizáló rendszer számos nemzetségben előfordul, sőt a molekuláris biológiai vizsgálatok a gén prokariota eredetére utalnak Közel húsz év telik el Fleming emlékezetes bejelentése után a második β-laktám típusú antibiotikum felfedezéséig. Brotzu 1948-ban közli, hogy egy Cephalosporium acremonium törzs tenyészlevében igen erős széles spektrumú antibakteriális hatás észlelhető (J. Gen. Microbiol. 47:1952). A fermentlé több biológiailag aktív terméket tartalmaz. A Cepalosporin-C hatóanyagon és a 6- aminopenicillansav D-α-aminoadipinsavval acilezett Gram-pozitív és Gram-negatív kórokozók ellen hatásos származékán, a penicillin-n antibiotikumon kívül egy savanyú természetű szteroid vázat tartalmazó kefalosporin-p-nek nevezett helvolinsav származék jelenlétét is bizonyították. A főtermékként megjelenő Cephalosporin-C-nek elnevezett azetidinon származékot Abraham és Newton izolálta 1961-ben. Később a törzs rendszertani hovatartozását végző mikológusok az antibiotikumot termelő törzset helyesen Acremonium chrysogenum névvel különítették el a Cephalosporium fajoktól A termelő törzs nevének változása nem befolyásolta az antibiotikum elnevezését. NH 2 H H H O H H H : : HOOC----C----C----C----C----C---N----C C-----S-----CH 2 O H H H H O=C N----C===C---CH 2 ---O---C---CH 3 Cephalosporin-C szerkezeti képlete O=C OH A kefém váz 7-amino csoportját D-α-aminoadipinsav acilezi. A hattagú tiazin gyűrűvel anellált β- laktám gyűrű kémiai stabilitását a kvázi-delokalizált elektroneloszlás mezomer rendszere okozza. Ez a rendszer a penicillináz rezisztencia magyarázata. A kémia szerkezet D-alaninhoz való hasonlósága miatt hatásmódja a penicillinéhez hasonlóan a peptidoglükán sejtfal felépülését gátolja. A szélesebb baktérium spektrumát az acilező sav aminocsoportja hozza. Kémiai stabilitása alkalmassá teszi különböző O-acil és 7 amino-acil származékainak előállítására. Félszintetikus származékainak gyógyászati jelentősége az antibiotikum illetve kemoterápia sikeres korszakát indította el. A penicillin képződéséhez szükséges három enzim; az ACV tripeptid szintetáz (ACVS), az izopenicillin N szintetáz (IPNS) és az izopenicillin aciltranszferáz, (IAT) jelenlétét igazolták a felsorolt gombanemzetségekben: ASCOMYCETES (perfekt alak) DEUTEROMYCETES (imperfekt alak) Emericella nidulans Aspergillus nidulans Eurotium Penicillium notatum chrysogenum Sartorya Epidermophyton Eupenicillium Trichophyton Talaromyces Microsporum Carpenteles Malbranchea Thermoascus Polypaecilum Gymnoascus Arthroderma Nanizza Az N penicillin képződéséhez szűkséges enzimek; ACV tripeptid szintetáz (ACVS), az izopenicillin N szintetáz (IPNS), az izopenicillin epimeráz továbbá a gyűrűtágító rendszer, az expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz valamint a befejező lépéseket katalizáló hidroxiláz, aciláz karbamoil transzferáz, és a metiltranszferáz Jelenlétét a következő gomba törzsekben sikerült igazolni: 17

18 ASCOMYCETES Emericellopsis Byssochlamys Arachnomyces Anixiopsis DEUTEROMYCETES Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum) Paecilomyces persicinus Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium További vizsgálatokban több azetidinon származékot termelő pokariotát sikerült izolálni: Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans, Lysobacter lochenigenus, Flavobacterium A ß-laktám antibiotikumot termelő Penicillium chrysogenum törzs rendszertanilag az Ascomycota tagozat Euascomycia ágazat Eurotiales rend Eurotiaceae család Talaromyces nemzetség Asymetrica csoport Velutina alcsoport Chrysogenum sorozatba illeszthető faj olyan nemesített Penicillium notatum Penicillium chrysogenum variánsa, melynek szexuális folyamata ismeretlen. (Önmegtermékenyítő is lehet). Ugyanez vonatkozik a Penicillium csoportokra óta több mint 150 új Penicillium faj került leírásra, amelyek valójában valószinűleg az Eupenicillium és a Talaromyces fajok imperfekt alakjaiként tárgyalhatók. A taxonómiai szempontok változását szemlélteti az Acremonium strictum esete amely a Cephalosporium nemzetségből 1971-ben került át Gams W munkája eredményeként az Acremonium nemzetségbe. A konidiumok (c) csoportosan a vékony fialidok csúcsán helyezkednek el. Az egyesével álló fialidok harántfallal különülnek el a.konidiofórumokon (b). A konidiumok általában egy a gomba által kiválasztott nyálkás anyag hatásaként összetapadva maradnak. A fialidok átmérője a konídiumnál 0,5 µm-re szűkül. Talajban, növények maradványain gyakran előfordul. Acremonium strictum A penám és cephem szerkezetű antibiotikumot termelő fajuk Acremonium chrysogenum-ként ismert, holott a Botzu által cephalosporin-c termelésre alkalmas szervezetként izolált gombát a XX. század közepén Cephalosporium acremonium-ként azonosították. Innen ered az antibiotikum elnevezése. A PENÁM ÉS KEFÉM SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK FELDÚSULÁSA A TENYÉSZETBEN Az azetidinon szerkezetű antibiotikumok képződésének előfeltétele egyrészt, hogy a bioszintézisben résztvevő enzimek aktív formában kellő mennyiségben jelen legyenek, másrészt, hogy az építőelemek, az L-α- Aminoadipinsav, L-Cisztein és L-Valin az ACV-tripeptid szintetáz működéséhez szükséges koncentrációban jelen legyenek. Ez nem elhanyagolható igény, mert egyetlen ml fermentlében felhalmozódó 100 mmol antibiotikum (6x10 17 molekula) tömege meghaladja az őt termelő mikroszervezet száraz tömegét. A sejtben normál esetben előforduló aminosavak mennyiségének 100-szorosa található a termelt antibiotikumban. Ezért van jelentősége az eljárás szempontjából olyan optimális technológia kimunkálásának, amely a termelő törzs 18

19 igényeit szelektíven kielégítve, a genetikailag meghatározott potenciális lehetőséget maximális mértékben kihasználja. (Lásd a három aminosav (A,C,V) képződését bemutató vázlatot a következő oldalon ACV tripeptid építőelemeinek (L-α-aminoadipinsav, L-cisztein, L-valin) képződése 19

20 A három aminosav közül az L-cisztein központi szerepet ellátva közvetlenül nem jelenthet limitáló faktort az azetidinon képzésben. A glikolitikus út köztes termékéből (3-foszfoglicerát) NAD-függő redukcióval képződő 2-keto-3-foszfoglicerát transzamináz segítségével alakul szerin foszfáttá. Ebből acetil-coa felhasználásával képződik az acetil-szerin, amely kénhidrogénnel reagálva alakul ciszteinné a szükséges mennyiségben. Hiánya áttételesen jelentkezhet, ha a szulfát redukcióhoz szükséges NADPH formában megjelenő redukáló aktivitás nem áll rendelkezésre. Az L-valin képződése ugyan feedback kontrol alatt áll, de képződése ugyancsak központi szerepet betöltő piroszőlősavból kielégítő aktivitással folyik. Különlegességként említhető a bioszintézis NADPH-t igénylő reduktoizomeráz reakciója. A vízkilépést követően glutaminsavból származó amino csoportot hasznosít a transzamináz a ketovalin valinná alakításához. A harmadik építőelem az L-α-aminoadipinsav, a lizin szintézis köztes terméke. A Krebs-ciklusban képződő α-ketoglutársav acetil-coa-val reagálva alakul homocitráttá. Nem véletlen, hogy a reakciót a végtermék, a lizin szabályozza. Ezt a lizinhez vezető reakció utat csapolja meg az izo-penicillin-n szintézis. A homocitrátból képződő homoakonitin-sav dehidrogénezésével és egy transzamináz reakcióval jutunk az L-αaminoadipinsavhoz, amelynek δ-karboxil csoportja ATP-vel reagálva adenilsav vegyes anhidridként hasznosul a tiotempláton folyó ACV-tripeptid képződéséhez. Ez a vegyes anhidrid a lizin szintézis irányában lehetővé teszi a karboxil csoport redukcióját, amely feltétele az ε-aminocsoport kialakulásának. Mindent összevetve végeredményben négy acetil-coa felhasználásával képződik egy-egy aminoadipinsav, amely nélkülözhetetlen építőeleme a cephalosporin-c antibiotikum képződésének is. (A prokariotákban a szacharopinen és a- aminoadipinsav félaldehiden keresztül vezető lizin lebontási út szolgáltatja a kefém váz szintéziséhez szűkséges köztes terméket.) A bioszintézis egyes lépésének közvetlen energia és kofaktor igényét szemlélve, nyílvánvaló, hogy a sejten belüli redukáló környezet szempontjából optimális NADPH szint fenntartása meghatározó jelentőségű. A felhasználásra kerülő aminosavak előállítása a vázlaton bemutatott anyagcsere rendszert terheli. Az ammonia felvételt katalizáló glutaminsav dehidrogenáz NADPH-t igényel. A valin szintézis redukciós lépése ugyancsak NADPH-t igényel. Négy NADPH segíti a szulfátból származó kén redukcióját. Végül a NADPH poolt terheli a tripeptidet redukált formában tartó specifikus tioredoxin rendszerhez hasonló széles spektrumú diszulfid-reduktáz, amely felszámolja az átmenetileg esetleg megjelenő biszulfid alakot, amely nem azonos a glutationt redukált formában tartó, NADPH igényes reduktázzal. A bioszintézis szempontjából tehát meghatározó jelentőséget nyer a G-6-P dehidrogenáz és a 6-PG dehidrogenáz működésétől függő NADPH ellátottság.. Hexóz szénforrásból a G-6-P szint természetesen kielégítené a szénváz felépítés igényét, ha a hexóz monofoszfát (HMP) úton hasznosul. Ezt az irányítást hatásosan a fruktóz-2,6-biszfoszfát szint végzi. Fruktóz-2,6-biszfoszfát szabályozó szerepének a vázlata 20