ONKOGENO-NKFP1a A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel

Átírás

1 ONKOGENO-NKFP1a A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel Országos Onkológiai Intézet, AstraZeneca Kft, Auroscience kft, GlaxoSmithKline kft, Janssen- Cilag Kft, Roche Magyarország kft, Szilak Labor kft, Zenon Bio Kft Alvállalkozók: Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, MTA Enzimológiai Intézete project vezető: dr. Tímár József 1.sz részjelentés szeptember szeptember 30. 1

2 Tartalomjegyzék ONKOGENO-NKFP1a oldal 1.sz beszámoló részfeladatai.3 1.sz beszámolási időszak eredményei...5* 1. programcsomag programcsomag programcsomag programcsomag 42 Publikációk.55 Tervezett és tényleges költségek összehasonlítása 57 Monitoring adatszolgáltatás 59 K+F-ben résztvevő személyek/munkaidő elszámolása..61 *A szakmai jelentés hosszát a dokumentációs anyag bősége (TÁBLÁZATOK, GRAFIKONOK ÉS MIKROSZKÓPOS ÁBRÁK) és a klinikai protokollok synopsisai indokolják 2

3 1.sz Beszámolási időszak feladatai 1. beszámoló A beszámoló időpontja: szeptember 15. Konzorciumi tag neve: Országos Onkológiai Intézet Részfeladatok A részfeladatok szakmai tartalma az adott beszámolási A részfeladat státusza megnevezése Örökletes daganatok Fúziós gének kimutatására alkalmas módszerek kidolgozása (lágyrész tumorokban és non- Hodgkin lymphomákban) Vaszkularizáció sajátosságai különböző típusú tüdőrákokban Keringő Angioblaszt kimutatás különböző típusú tüdőrákokban Előállítjuk a rekombináns PEX fehérjét és származékait, valamint az α v β 3 integrin extracelluláris régióját és vizsgáljuk kölcsönhatásukat Új melanóma markerek expressziójának vizsgálata naevusban és melanómában-rt-pcr segítségével A motilitási szignálútvonal kulcs-elemeinek expressziós mintáza-tának meghatározása Molekuláris terápiás célpontok meghatározása emlő és fej-nyak daganatokban Antraciklin molkuláris imaging A CRC-k adjuváns kezelésének költséghatékony optimalizálása a farmakogenomikai vizsgálatok alapján időszakban A daganatos megbetegedésekre hajlamosító öröklött genetikai változások (mutációk, polimorfizmusok) meghatározása familiaris daganatos betegek vérmintáiból nyert 300DNS mintában Fúziós gén és staging vizsgálatok beállítása (bcl2, MBR/MCR régiókra tervezett próbák tesztelése, Anyaggyűjtés tüdőrák altípusban (laphámrák, adenokarcinóma, kissejtes rák) vizsgáljuk az érellátás sajátosságait immunhisztokémiai módszerrel 50 NSCLC beteg vérének analízise Előállítjuk a rekombináns PEX fehérjét és származékait, valamint az α v β 3 integrin extracelluláris régióját és vizsgáljuk kölcsönhatásukat. A programban a CyclinE, b3endonexin, decorin expressziót határozzuk meg 50 melanoma, 20 naevus, 10 dysplasticus naevus esetében A vizsgálatokhoz általunk tervezett makrochipet fogunk használni, mely segítségével a korábban azonosított motilitási mintázatot elemezzük. A fenti anyagban lézermikrodisszekció, q-pcr segítségével elemezzük a chipen megváltozott gének expresszióját. EGFR és steroid receptorok jelátviteli mechanizmusának felderítése DNS chip módszerrel emlő és fej-nyak daganatokban. Antraciklin sejten belüli lokalizációjának kimutatása humán emlőráksejtekben fibroblasztban és endotélsejtben MTHFR, XPD és UDP-glukuronát TF polimorfizmus vizsgálatok colorectalis rákos szövetekben elkészült elkészült Későbbre halasztott (lsd. Szakmai jelentés) Előre hozott, elkészült elkészült Elkészült, módosítva (lsd. Szakmai jelentés) Elkészült, kibővített elkészült elkészült elkészült 3

4 Részfeladatok megnevezése A részfeladatok szakmai tartalma az adott beszámolási időszakban A részfeladat státusza Konzorciumi tag Zenon Bio Örökletes daganatok A daganatos megbetegedésekre hajlamosító öröklött genetikai változások (mutációk, polimorfizmusok) meghatározása familiaris daganatos betegek vérmintáiból nyert 300DNS elkészült mintában Konzorciumi tag Auroscience Fúziós gének kimutatására alkalmas módszerek Fúziós gén és staging vizsgálatok beállítása (bcl2, MBR/MCR régiókra tervezett próbák tesztelése, elkészült kidolgozása (lágyrész tumorokban és non- Hodgkin lymphomákban) Anyaggyűjtés Konzorciumi tag Janssen-Cilag EPO kezelés hatása fejnyaki, tüdő- Klinikai protokoll kidolgozása, engedélyeztetése elkészült és rectumrák ereződésére Konzorciumi tag AstraZeneca ZD6474 kezelés Klinikai protokoll kidolgozása, engedélyeztetése elkészült GSK Melanóma Protokoll kidolgozása, engedélyeztetése progresszió gátlása elkészült LMWH segítségével Konzorciumi tag Szilak Labor LMWH Syndecan4 knockout human melanoma sejetek biológiai viselkedésének tesztelése in vitro, heparin+dtic kezelés szignalizációjuk meghatározása St-III melanómás elkészült betegek esetében Konzorciumi tag Molekuláris terápiás célpontok meghatározása emlő és fej-nyak daganatokban. Konzorciumi tag ER+ fejnyaki laphámrákok kiegészítő hormonterápiája Roche Diagnosztika Csont-markerek kimutatásának infrastrukturális alapjainak megteremtése, a diagnosztikus kitek tesztelése, validálása AsztraZeneca Protokoll kidolgozása és engedélyeztetése elkészült elkészült 4

5 1. Programcsomag: Molekuláris Diagnosztikai szolgáltatások fejlesztése 1.1. Örökletes daganatok predikciója és detektálása Magyarországon (dr. Oláh Edit, dr. Forrai Gábor, Zenon Bio kft) Rákra hajlamosító gének daganatos családokban Összefoglalás Új ismereteket szereztünk a genetikailag determinált daganatokról, hazai előfordulásukról és a rák iránti genetikai fogékonyság molekuláris alapjairól. Az emlő-, petefészek-, méh-, vastagbél- és hererák familiáris eseteiben jellemeztük az ismert rákra hajlamosító géneket, leírtuk azok betegségre hajlamosító mutációit és a hererákos családok vonatkozásában nemzetközi együttműködés keretében új hajlamosító gént sikerült megismerni. A rák iránti genetikai hajlam meghatározása révén olyan célpopuláció azonosítására nyílt lehetőség, amely legtöbbet profitál a rákkockázat és a halálozás csökkentését célzó beavatkozásokból. Ezért az eredmények hozzájárulnak az örökletes daganatok diagnózisához, megelőzéséhez, késleltetéséhez és a kezelési modalitások megválasztásához a hazai familiáris megbetegedésekben. Betegek és módszerek A mutáció hordozói státuszt határoztuk meg familiáris daganatos megbetegedésekben abból a célból, hogy a populáció szintjén ritka előfordulású örökletes rákszindrómák újabb eseteit azonosíthassuk. Minden esetben EDTAval konzervált vérből nyert DNS-ben vizsgáltuk a BRCA1/2, CHECK-2 örökölt mutációit emlő- és petefészekrákban; az APC, STK-11, MYH, MADH4 mutációkat polipózisban és az MLH1, MSH2 gének örökölt mutációinak jelenlétét nem polipózis talaján kifejlődő vastagbélrákos családokban. Összesen 340 daganatos családot vizsgáltunk: 218 emlő- és petefészekrákos családban, 52 polipózisos szindrómában, 57 nem polipózis talaján kialakuló vastagbélrákos családban és 13 hererákos családban fejeztük be a hajlamosító gének elemzését. A gének valamennyi kódoló szekvenciájára kiterjedő mutációvizsgálatot a hagyományos SSCP, HDA és közvetlen DNS szekvenálási módszerekkel végeztük. A konzorcium 6.sz. kisvállalkozó partnerével (Zenon Bio Kft.) szoros együttműködésben sikerült bevezetni két új mutáció elemző módszert, a DHPLC és a nagy genomi deléciók azonosítására szolgáló MPLA módszert, abból a célból, hogy javítsuk az öröklött génmutációk költséghatékony kimutatását a BRCA1/2, APC, MLH1 és MSH2 génekre. Ez úgy volt lehetséges, hogy a kisvállalkozó partner alkalmazásában álló Kovács András biológust franciaországi továbbképzésre küldte és a hazahozott módszereket alkalmaztuk a Wave3500 Mutáció Detektáló készülékre. A készülék folyamatos működését, szervizelését szintén az ipari partner biztosította. Eredmények Emlő- és petefészekrákos családok genetikai elemzése (BRCA1/2 és CHEK2 gének vizsgálata) Az örökletes emlő- és petefészekrákos családok kialakulásáért leggyakrabban a BRCA1 és a BRCA2 gének öröklött meghibásodása felelős. 198 női- és 20 férfi emlőrákos családban végeztünk genetikai vizsgálatot a BRCA1 és BRCA2 gének öröklött mutációinak kimutatására. Eddig 20 családban sikerült mutációt azonosítani, további 21 DNS szekvencia eltérés funkcionális szerepét még tanulmányozzuk. Az egyes mutációk előfordulási gyakoriságát az alábbiakban ismertetjük: BRCA1 gén: 5382insC (6 család), 185delAG (3 család), 300T>G (2 család), 2415delAG (1 család) BRCA2 gén: 9326insA (2 család), 6174delT (2 család), 3303GA>TT (1 család) a világon először azonosított elváltozás., 6884C>G (1 család), 8141del5 (1 család), C39R (1 család) Az utóbbi évben végzett mutáció elemzések eredményei megerősítik korábbi megfigyeléseinket, amelyek szerint a BRCA1 gén meghibásodása gyakran a gén azonos szekvenciáját érinti, aminek következtében több családban is ugyanaz a mutáció fordul elő. Ezzel szemben ezt az úgynevezett alapító hatást a BRCA2 génben kizárólag a magyarokban előforduló 9326insA mutáció és a zsidó származásúakra jellemző 6174delT mutáció esetében észleltük. A CHEK2 gén allélvariánsainak feltérképezése magyar emlőrákos családokban A CHEK2 egy, a sejtciklus ellenőrző mechanizmusában részt vevő "checkpoint" fehérje, mely fontos szerepet játszik a DNS-ben kódolt genetikai tartalom megóvásában. A CHEK2 csíravonalas mutációit számos, különféle rákos megbetegedéssel hozták összefüggésbe. Az emlőrákra nézve legjelentősebb mutációja a 10. exonban elhelyezkedő 1100delC, mely a fő hajlamosító génekhez (BRCA1, BRCA2) képest kis penetranciájú ugyan, de a skandináv térségben populációs szinten is viszonylag gyakori (1,5-2%), familiáris emlőrákos esetekben pedig 4-5%. Célunk volt, hogy feltérképezzük a magyarországi emlőrákos populációban a CHEK2 csíravonalas mutációit különös tekintettel az 1100delC allélre. 147 olyan emlőrákos családot vizsgáltunk, ahol a betegség 60 éves kor előtt jelentkezett és ennek ellenére nem találtunk BRCA1/2 csíravonalas mutációt. Az eredményeink azt mutatják, hogy egyetlen esetben sem fordult elő az 1100delC allél. Hat betegnél azonosítottunk T470C mutációt. Egy esetben figyeltünk meg G>A splice site mutációt, további egy esetben észleltünk A252G neutrális hatású elváltozást és néhány, már leírt polimorfizmust. Azt a következtetést vonjuk le, hogy az 1100delC mutáció előfordulási gyakorisága Magyarországon 5

6 nem jelentős, szűrése nem indokolt. A T470C elváltozás azonban más országokban mért adathoz (1-2%) képest gyakoribb (4%). Vizsgálatát érdemes kiterjeszteni más típusú rákszindrómákra is. Örökletes vastagbélrák polipózis szindrómák genetikai háttere Magyarországon A vastag- végbélrák daganatok egyik legfontosabb kockázati faktorát a pozitív családtörténet jelenti, amely több tünetcsoportban is megnyilvánulhat. Ezek közé tartozik a familiáris adenomatosus polipózis, az MYH-asszociált polipózis, a Peutz-Jeghers, valamint a juvenilis polipózis szindróma. Vizsgálataink arra irányultak, hogy hazai családokban meghatározzuk a fenti szindrómák hajlamosító génjeinek (APC, MYH, STK11, SMAD4) magyarországi mutációs spektrumát, valamint értékeljük a genotípus és fenotípus esetleges összefüggéseit. A vizsgálatba beleegyező és genetikai tanácsadáson megjelent több, mint 50 család tagjainak vérmintáiból DNS-t izoláltunk, majd a fenti gének teljes kódoló régióját kombinált mutációvizsgálatnak vetettük alá. A variánsokat direkt szekvenálással azonosítottuk. A vizsgált családok mintegy kétharmada esetében mutattuk ki valamely gén inaktiváló, a daganatos fenotípushoz egyértelműen kapcsolható mutációját, emellett több bizonytalan hatású variánst, illetve polimorfizmust is azonosítottunk. Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a polipózis talaján kialakuló vastagbélrákos szindrómák kialakulásának hátterében hazánkban az esetek mintegy kétharmadában volt kimutatható az ezt okozó tumorszuppresszor gének mutációja. A kimutatott szekvenciavariánsok legnagyobb része visszatérő jellegű volt. A mutációs spektrum további értékelése nagyobb esetszámú vizsgálat elvégzését teszi szükségessé. Nem polipózis talaján kialakuló örökletes vastagbélrák (HNPCC) hajlamosító génjeinek elemzése 57 család kombinált mutációvizsgálata (HDA/SSCP/MLPA/szekvenálás) alapján ezek 31,6%-a (18/57) hordozott patogén mutációt. Az azonosított 18 mutáció fele az MLH1, másik fele az MSH2 génben volt. A vizsgált populációban minden mutáció csak egyszer fordult elő, azaz alapító hatással nem találkoztunk. A detektált mutációk fele új, azaz eddig még egyetlen populációból sem írták le. A mutációk jelentős része (4/18, 22%) genomi aberráció (nagy deléció vagy duplikáció), ezekből 1 az MLH1 génben, 3 pedig az MSH2-ben volt kimutatható. A betegség kialakulásával biztosan kapcsolatba hozható mutációkon kívül 7-féle besorolatlan variánst is találtunk (10 családnál, azaz a családok 17,5%-ban), ezek közül 2 (1 az MLH1-ben, egy az MSH2-ben) előzetes vizsgálataink szerint erősen valószínűsíthetően patogén. A többi besorolatlan variáns karakterizálása folyamatban van. A fentieken túl 6-féle, változó gyakoriságú (5-50% heterozigóta) polimorfizmust is azonosítottunk (3 az MLH1-ben, 3 az MSH2-ben). A mutációk és a patogénnek tartott besorolatlan variánsok túlnyomó többségét a szigorú nemzetközi Amsterdam I-II klinikai kritériumoknak megfelelő családokban detektáltuk (>80%). Hererákos családok A Hererák Konzorciummal végzett genom-elemzés után megállapítottuk, hogy az emlőrákok esetében megismert nagy penetranciájú genetikai változások nem játszanak szerepet a familiáris hererákos megbetegedések kialakulásában (Crockford és mtsai., 2006). Ugyanakkor a nemzetközi szakirodalomban az első olyan genetikai változást írtuk le, amely mérsékelten fokozza a hererák kialakulásának kockázatát (Nathanson és mtsai., 2005). 6

7 1.2.Molekuláris diagnosztikai szolgáltatások fejlesztése (dr. Szentirmay Z, Soós Miklós, Auroscience kft, dr. Józsa Adrienne, Roche Diagnoasztika kft) Fúziós gének kimutatására alkalmas módszerek kidolgozása (lágyrész tumorokban és non-hodgkin lymphomákban) 1. Bcl-2/IgH génátrendeződés és molekuláris staging meghatározás tüsző eredetű lymphomákban. A follikuláris lymphomák (FL) az összes non-hodgkin lymphoma mintegy 30%-át teszik ki. Ez országosan évi 380 új megbetegedést jelent, ebből az Országos Onkológiai Intézetben kb új beteget kezelnek. FL-ban a daganatos klón t(14;18) kromoszómális translocatioval jellemezhető. Az ilyen esetek több mint 90%-ban a Bcl-2 gén áthelyeződik az immunglobulin nehéz lánc (IgH) gén promoter régiójába. Follikuláris (és más alacsony malignitású) B-sejtes non- Hodgkin lymphomáknál különösen előrehaladott stádiumban a kezelés után gyakran relapsus következik be, amit jelenlegi ismereteink szerint a vérben és csontvelőben jelenlévő residualis daganatsejtek (minimális residualis betegség) okoznak. A klinikai vizsgálatok eredménye azt mutatja, hogy betegkövetés során a Bcl-2/IgH génátrendeződést hordozó daganatsejtek hiánya a csontvelőben vagy a perifériás vérben szignifikánsan hosszabb remisszióhoz vezet. A betegség molekuláris módszerekkel történő követésekor a PCR-rel kimutatott Bcl-2/IgH génátrendeződés szekvenciája a kiújulások során mindig azonos az eredeti FL klónban talált génátrendeződéssel. Ritkábban az is előfordul, hogy a kimutatott génátrendeződés nem azonos az eredeti MBR/JH fúziós szekvenciával. Ez a meglepő lelet abból adódik, hogy hasonló típusú génátrendeződés a perifériás vérben tumoros folyamat fennállása nélkül is kialakulhat. Ezért alapvető fontosságú annak meghatározása, hogy azok a sejtek, amelyekben a Bcl-2/IgH transzlokációt a perifériás vérben kimutattuk, azonosak vagy különböznek az eredeti daganatos klóntól. A PCR-rel amplifikált termék szekvencia analízise széles körben elfogadott, de egyúttal időigényes és drága módszere a probléma megoldásának. Ezért fluorescens olvadáspont analízisre alapozott valós idejű PCR módszert dolgoztunk ki a kérdéses DNS fragmentek analízisére. A módszer azon alapszik, hogy az olvadáspont értéke az adott szekvencia GC tartalmától, és a szekvencia hosszától függ. Az általunk kifejlesztett fluorescencia rezonancia energia transzfer (FRET) próba kombinálva a SYBER Green I. festéssel alkalmas az olvadáspont analízisére. 115 különböző klinikai stádiumú FL-ben szenvedő beteg alábbi klinikai adatait táblázatba foglaltuk: (a) a beteg azonosítója, neve, életkora; (b) a kórszövettani diagnózis; (c) a primer tumorból végzett molekuláris vizsgálat eredménye; (d) a perifériás vérből vagy csontvelőből végzett molekuláris vizsgálatok eredményei. A betegek vérmintáiból a lymphocytákat Biocoll szeparáló oldattal feldúsítottuk, a DNS izolálás Roche izoláló kittel történt. A major breakpoint (MBR)- és minor cluster régióra (MCR) specifikus PCR primereket az NCBI GenBank adatbázis alapján terveztük. A töréspont régió szekvenciájának megsokszorozását valós idejű PCR módszerrel LightCycler (Roche) segítségével végeztük. 20 µl reakcióelegybe 2 µl FastStart mastermixet (Roche), 5 µm MgCl 2 -t, 0,5 µm primert és próbát, 2 µl templátot mértünk. Az amplifikáció után minden egyes kapillárisba további 2 µl mastermix-et adtunk és elvégeztük az olvadáspont analízist. Tizenegy esetben a PCR termékek szekvencia analízise is megtörtént. 1. ábra. Bcl2-IgH fúziós gén kimutatása NHL-ben 7

8 Az 1. ábrán két betegnél a primer tumorból származó daganatsejtek és a vérben keringő daganatsejtek töréspont régió szekvenciáit és olvadáspontjait hasonlítottuk össze. Az ábra felső részén a primer tumorban lévő és a vérben keringő daganatsejtek töréspont régiója azonos, a szekvenciák olvadáspontja is azonos, és ez daganatos relapsus jele. Az ábra alsó részén a primer tumor és a vérben keringő daganatsejtek töréspont régiója eltér, a két szekvencia olvadáspontja is eltér, ez pedig a Bcl-2 génátrendeződés ellenére sem utal daganatos kiújulásra. 2. ábra. FL betegek adatai. A 2. ábrán tizenegy beteg kezelésének és kórlefolyásának adatai láthatók. A vizsgált vér- és csontvelő minták időrendi sorrendben vannak feltüntetve (0-56 hónap). Nyilak jelzik a kezelések időpontját, és a betegkövetések végén található a jelenlegi klinikai állapot. Három esetben (9, 10, 11) volt kimutatható az eredeti nyirokcsomóban található génátrendeződéstől eltérő t(14,18) transzlokáció. Az általunk kidolgozott módszernek az a jelentősége, hogy a relapsus előre jelzése a klinikai tüneteknél sokkal korábban megtörténhet, a vizsgálat olcsó, gyors, más esetben pedig szükségtelenné válhat drága kezelés, ami nem csak költséghatékony, hanem a beteg életminőségét is nagy mértékben javítja. 2. Fúziós gének és génamplifikációk kimutatása lágyrész tumorokban A lágyrész tumorok szövettani diagnosztikája az egyes elváltozásokban meglévő szöveti mintázaton, jellegzetes sejttípuson és a stroma eltérésein alapszik. A szöveti szerkezet segítségével kialakított daganat csoportok között nincs éles határvonal, a csoporton belül pedig egyedül a morfológiai kép nem ad elegendő támpontot az egyes daganatféleségek további elkülönítéséhez. Az immunhisztokémia a diagnosztikus patológia elfogadott módszere. Rendszerint olyan antigéneket mutatunk ki, amelyek normális körülmények között csak egy-két meghatározott ép szövetben fordulnak elő. Lágyrész tumorokban ezen antigének aberrans expressioja gyakori. Tovább nehezíti a diagnosztikát, hogy rutin szövettani metszetekben egy-egy tumorra egyébként jellemző fehérje marker immunhisztokémiával az ép szövetnél sokkal kisebb mennyiségben, és rendszerint csak 50%-80% gyakorisággal mutatható ki. Ezért mondhatjuk, hogy az immunhisztokémia sokszor szintén nem elég specifikus a hisztogenetikai diagnosztikához. A kromoszómális génátrendeződések gyakoriak lágyrész tumorokban. Ezekre jellemző, hogy két, egyébként nem daganatkeltő gén egy-egy jól körülhatárolt szakaszon eltörik és egymással összekapcsolódva egyetlen új daganatkeltő fúziós génné alakul át. A különböző fúziós gének más-más daganatokban találhatók, tehát kimutatásuk diagnosztikus jelentőségű. A vizsgálatokat a tumorszövetből történő RNS izolálás után RT-PCR technikával végezzük. A PCR primereket az 1. táblázatban feltüntetett tumor típusokban meglévő specifikus génelváltozások kimutatására terveztük. 1. táblázat. Fúziós gének lágyrész sarcomakban Tumor-specifikus Tumor típusok hybrid gének FUS CHOP EWS Fli1 EWS AFT1 EWS WT1 EWS CHN SYT SSXT FKHR PAX3 NTRK3 ETV6 COL1A1 PDGFB Jól differenciált és myxoid liposarcoma Ewing sc./ PNET / Askin tu. / Esthesioneuroblastoma Világossejtes sarcoma Desmoplasticus kis kereksejtes tumor Extraseletalis myxoid chondrosarcoma Synoviális sarcoma Alveoláris rhabdomyosarcoma Congenitalis fibrosarcoma Dermatofibrosarcoma protuberans Tapasztalatok szerint a génvizsgálatok szükségessége gyakorlatilag mindig a rutin szövettani diagnosztika során merül fel, amikor legtöbbször már csak formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetek állnak rendelkezésre. Az ilyen mintákban az RNS gyakran degradálódik és ezért a fúziós gén kimutatása sokszor sikertelen. Ezért jelenleg új, rövidebb RNS szakaszokat igénylő primer készlet kidolgozását végezzük, ami jobban használható formalin-fixált 8

9 szövetmintán.számos olyan génelváltozás található lágyrész sarcomákban, amelyek nem kötődnek szorosan valamely daganat-típushoz, ezért kimutatásuk inkább prognosztikai mint diagnosztikai jelentőségű. Ezek közül vizsgáltuk az MYCN onkogén amplifikáció mértékének meghatározását neuroblastomában. A neuroblastomák rizikó csoportokba sorolása a klinikai stádium, a szövettani kép, a MYCN státus és a sejtenkénti DNS tartalom (DNS ploidia) alapján történik. A neuroblastomák prognózisának fentiek szerinti meghatározása a korszerű kezelés elengedhetetlen feltétele, mert alacsony rizikójú tumoroknál elegendő a műtéti eltávolítás, átmeneti rizikójú daganatok esetén a műtét után mérsékelt dózisú kemoterápia, míg magas rizikójú tumoroknál nagy dózisú csontvelő ablatív terápia is szükséges és között összesen 32 műtéttel eltávolított neuroblastomában valósidejű kvantitatív PCR (LightCycler) és kvantitatív dual-color-fish módszerrel (Q-BIOgene) meghatároztuk a MYCN gén amplifikációjának mértékét. A műtéti preparátumok fixálatlanul érkeztek molekuláris patológiai diagnosztikára. A tumorszövetből félre tettünk DNS izolálás és mélyfagyasztásos tárolás céljára, továbbá lenyomati keneteket készítettünk DNS cytometria és FISH vizsgálatokra, végül a daganatot formalinban fixáltuk és paraffinba ágyaztuk szövettani analízisre. A sejtenkénti FISH szignál szám vizsgálata a Központi Fizikai Kutatóintézet Anyagtudományi Intézetében Eördögh Imre és munkatársai által kifejlesztett színes kvantitatív képfeldolgozó rendszer (IMAN) segítségével történt. Jelenleg a kétféle módszerrel (PCR, FISH) meghatározott MYCN kópiaszámot hasonlítottuk össze. Előzetes eredményeinket a 3. ábrán mutatjuk. A FISH képeken (3 éves kislány III. stádiumú magas rizikójú tumora) a 2. kromoszóma centromer (α-satellita) régiója zöld szignál, az MYCN gén vörös szignál formájában látható. A képfeldolgozó rendszer külön kijelöli, elkülöníti és megszámolja a vörös és zöld szignált. Egy szignál egy kromoszómának illetve gén-kópiának felel meg. Nagyon jó lineáris pozitív korrelációt találtunk a FISH és LightCycler segítségével meghatározott MYCN kópiaszám között (a képen a bal alsó ábra, a koordinátákon a MYCN kópiaszám van ábrázolva). Kvantitatív PCR nem ad felvilágosítást a 2. kromoszóma számbeli eltéréseiről, átlagos sejtenkénti MYCN kópiaszámot ad meg, de akár 200-szoros amplifikáció is meghatározható. Kvantitatív FISH jól tükrözi a sejtek heterogenitását, mutatja a 2. kromoszóma esetleges polysomiáját (3. ábra) de 25- szörös amplifikáció fölött a MYCN kópiaszámot nem tudja megadni. 3. ábra N-myc gén státusz meghatározása NBL-ben IMAN program segítségével 3. A vastagbélrákok molekuláris diadnosztikája és prognosztikája Előzetes vizsgálataink arra utalnak, hogy a vastagbélrákok prognózisát a lokalizáció és a TNM-re alapozott klinikai stádium mellett leginkább a Braf gén V600E mutációja és microsatellita státusa határozza meg. A sejtek növekedését és proliferációját többféle mechanizmus is kontrollálja. Ezek egy része külső szignál, ami az un. mitogén-aktiválta protein kináz (MAPK) úton keresztül jut el a sejtmagba. Ha e szignálút kulcs-génjeiben mutációk alakulnak ki, azok többféle emberi daganat kialakulását is elősegítik. A 7q34 kromoszóma régióra lokalizálódó Braf is ilyen kulcs-gén, amit a növekedési faktorok a receptor tyrozin kinázokon és a G-proteinhez kapcsolt receptorokon, majd a ras fehérjén keresztül aktiválnak. A Braf specifikus mutációi önmagukban előidézik a génaktivációt, így növekedési faktor szignál nélkül is beindítják a sejtproliferációt és gátolják a differenciációt. Microsatellitáknak nevezzük a genomban előforduló nagyszámú ismétlődő szekvenciákat, amelyek hossza genetikailag meghatározott és állandó. Microsatellita instabilitásról akkor beszélünk ha ezen repetitív szekvenciák hossza változik a mismatch repair gének valamelyikének mutációja vagy az MLH1 gén promoter metilációja okozta inaktivitás következtében. Ezen az alapon a colorectalis rákok mikrosatellita instabil (MSI-H) illetve mikrosatellita stabil (MSS) csoportba sorolhatók. Az Országos Onkológiai Intézetből, a Debreceni Egyetem Sebészeti Klinikájáról és a zentai (Szerbia) Dr. Gerő István Egészségügyi Centrum kórházából származó összesen 206 beteg klinikai pathologiai és genetikai adatait dolgoztuk fel. A DNS mintákat fixálatlan vagy paraffinba ágyazott tumorszövetből izoláltuk. A microsatellita instabilitást valós idejű kvantitatív PCR (LightCycler) módszerrel, olvadáspont analízis segítségével vizsgáltuk és standard microsatellita 9

10 markereket használtunk. A BRAF mutációt a laboratóriumban kifejlesztett LightCycler teszt és olvadáspont analízis segítségével mutattuk ki. Az eredményt DNS szekvencia analízissel is igazoltuk. Eredmények és diszkusszió: (1) Azt találtuk, hogy a colorectalis carcinomák (CrC) prognózisa leginkább az alábbi 4 paramétertől függ: klinikai stádium, lokalizáció, microsatellita- és BRAF státusz. (2) Az MSI-H CrC-k szignifikánsan jobb prognózisúak, mint az MSS tumorok. (3) Mutáns BRAF gén nem fordult elő 14 HNPCC-s beteg daganatában. (4) A BRAF V600E mutáció 7-szer gyakoribb MSI-H tumorokban (9/23), mint MSS rákokban. (10/169). (5) A BRAF V600E mutációt hordozó vastagbélrákok sokkal kedvezőtlenebb biológiai viselkedést mutatnak, mint a BRAF negatív tumorok. Az ilyen betegeknél tanácsos agresszívebb daganatellenes gyógykezelést alkalmazni már II. stádiumú tumorok esetén is, mert korai tumor stádiumban a betegek jelenleg nem kapnak kemoterápiát, ráadásul a mutáns BRAF ellenes célzott kemoterápia is rövidesen rendelkezésre fog állni. A vizsgálatoktól azt várjuk, elősegíti a vastagbélrákok hisztogenetikai osztályozását és segít megítélni a várható kórlefolyását. Számítunk arra, hogy esetleg optimalizált terápiás javaslattal szolgálhatunk, vagy elősegítjük új terápiás eljárás kifejlesztését. 4. ÚJ alkalmazás: A humán papillomavírus (HPV) kimutatás jelentősége az anogenitális daganatok szűrésében és megelőzésében. A világon az összes emberi daganat 6.1%-a HPV eredetű. Egyértelmű bizonyítékok szólna a mellett, hogy az anogenitális régió rákmegelőző állapotait és carcinomáit valamint számos, a fej-nyaki régióból kiinduló laphámrák HPV fertőzéssel függ össze. Magyarországon a női lakosság mintegy 25%-a genitálisan HPV-vel fertőzött, és az ilyen anyák újszülöttjeinek száj-nyálkahártyájában sok esetben a vírus évek múlva is kimutatható. Több mint 100-féle HPV típust azonosítottak, de ennek csak a fele okozza a nyálkahártya sejtek malignus átalakulását. A HPV fertőzés kimutatásának népegészségügyi jelentőségét az alábbi kérdések világítják meg: 1.) Nagy anyagon nemzetközi együttműködéssel végzett összehasonlító vizsgálatokban kimutatták, hogy a rákszűrésre alkalmazott cervix cytologiai vizsgálatok önmagukban a rákmegelőző közepes-és súlyosfokú hámelváltozást (CIN 2/3) csak 53%-ban deríti fel, HPV kimutatással kombinálva ez az arány 90-98%. 2.) Magyarországon év elején kerül bevezetésre a leggyakoribb HPV fertőzések (HPV 6, 11, 16, 18) megelőzésére szolgáló oltóanyag. Kérdés, hogy cytologiai elváltozást nem, vagy csak enyhe elváltozást mutató fertőzések esetén a vakcina hatásos vagy nem? 3.) Hatásos-e a védőoltás a fenti négy típushoz genetikailag nagyon hasonló ezért azonos filogenetikai csoportokba tartozó további 15-féle papillomavírus fertőzés vagy többszörös vírusfertőzés esetén is? 4.) Csökkenti-e a HPV vakcináció a fej-nyaki régió juvenilis papillomatosisának és bizonyos laphámrák-típusainak előfordulási gyakoriságát? 5.) A HPV pozitív nők férfi partnereinek HPV fertőzöttségi gyakorisága indokolja-e a férfiak vakcinációba történő bevonását? A Roche cég nagyon érzékeny un. Linear Array HPV Genotyping Test -et fejlesztett ki, amellyel eddig összesen 59 vizsgálatot végeztünk és az eredményeket a saját korábban kifejlesztett PCR-alapú HPV tesztünkkel összevetettük. Az array-hpv teszt sajátunknál sokkal érzékenyebbnek és megbízhatóbbnak mutatkozik a HPV fertőzések, különösen a többes vírus fertőzések kimutatásában (5. ábra). Tervezzük az array-hpv tesztnél sokkal olcsóbb és gyorsabb, de ugyanannyira megbízható valósidejű PCR alapú eljárás kidolgozását. Saját HPV tesztünket rutinszerűen kívánjuk alkalmazni a cervix cytologiai minták vizsgálata során a méhnyakrák szűrés hatékonyságának növelésére és a HPV vakcináció hatásosságának monitorizálására. Az array-hpv tesztet pedig rendszeres minőségi kontrollként továbbra is alkalmazzuk. 5. ábra. HPV pattern citológiai mintákban 10

11 2. Programcsomag: Daganatereződés diagnosztikus, prognosztikus jelentősége és terápiás kiaknázása 2.1. A daganat-ereződés sajátosságainak meghatározása az egyes tüdőrák-altípusokban. Témavezető: dr. Döme Balázs (Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet) Keringő angioblaszt kimutatás különböző típusú tüdőrákokban Miután a program keretében az angiogenezis gátló ZD6474 klinikai vizsgálata is meg fog indulni tüdőrákos betegeken, úgy gondoltuk, hogy a 3. évre tervezett programpontot előre hozzuk, mert szükség van egy olyan érzékeny diagnosztikus-monitorozásra alkalmas gyors módszerre, amely a betegek ilyen szerekkel történő kezelése során a terápiás választ a daganaton mérhető válasz előtt a célponton (angiogenezis) már jelzi. Napjainkig általánosan elfogadott volt, hogy a daganatok ereződése a már meglévő erek endotheliális sejtjei proliferációjának és a daganatba történő benövésének eredménye. Azonban egyre több adat áll rendelkezésünkre, amelyek ettől eltérő, a daganatok által indukált angiogenesis mechanizmusokat írnak le. Ezen mechanizmusok egyike a vasculogenezis, a csontvelői eredetű endoteliális prekurzor sejtek (EPC-k) beépülése a daganatos erek endotheliális borításába. Ezek az őssejtek jól jellemezhetőek a sejtfelszínen megjelenő antigénjeikkel: CD34, CD133, VEGFR2 és VE-cadherin. Azonban a daganatok angiogenezisében betöltött szerepük mértéke ma még nem egyértelműen tisztázott, a legtöbb daganatféleség esetében ismeretlen. Munkánkban nem-kissejtes tüdőrákos (NSCLC) betegek (53 páciens) perifériás vérében határoztuk meg a CD34+/VEGFR2+ EPC-k számát flow-citométerrel a kezelések előtt és azt követően. Ezen felül quantitativ PCR segítségével meghatároztuk a VEGFR2, CD34, CD133 és a VE-cadherin mrns expressziót is a perifériás vérmintákban. Eredményeink azt mutatják, hogy a keringő EPC-k száma emelkedett a daganatos betegekben az egészséges kontrollokhoz képest (1.ábra), és a magas EPC szint szorosan korrelált a rosszabb átlagos túléléssel (2. ábra). A terápia előtt nem volt semmilyen összefüggés az EPC szint és a vizsgált standard prognosztikus paraméterek között (1. táblázat), azonban a terápia utáni EPC szint szignifikánsan alacsonyabb volt a terápiára reagálók mintáiban a rezisztens esetekhez képest (1. ábra). A molekuláris diagnosztikai módszerrel végzett vizsgálat eredménye azt mutatta, hogy csak a VEGFR2 receptor mrns expressziója emelkedett szignifikánsan a daganatos betegekben és ennek szintje is párhuzamosan alakult a terápiás válasszal (3. ábra) 1. ábra. A keringő EPC-k száma NSCLC betegek perfériás keringésében. Circulating EPC number 7000 ** EPCs / ml of blood * Control Tumor Responder Non-responder 2. ábra. Keringő EPC-k száma és a túlélés összefüggése. Kaplan-Meier analízis. Magas EPC: több mint 1000 sejt/ml vér. EPC low EPC high 11