Biotechnológia a kémiában

Átírás

1 Biotechnológia a kémik miában Dr. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz Biológiai rendszerek alkalmazása a kémiában és a mindennapokban

2 Biotechnológia Mi is az? Bármilyen technológia, amely biológiai rendszereket élő szervezeteket, vagy azok bármilyen származékát alkalmaz termékek vagy gyártási eljárások kifejlesztésére vagy módosítására elött: elsősorban az élelmiszeripar és az agrárgazdaság termékei és eljárásai 1970 után: elsősorban a biológiai kutatásokban felhasznált laboratóriumi eljárásokon- alapuló új technológiák, mint rekombináns DNS technikák, szövetkultúra alapú eljárások, növényi rendszerekben végzett horizontális gén-transzfer vagy élő akár emlős szervezetek klónozása

3 Biotechnológia Milyen módszereket m alkalmaz? A biotechnológia változatos módszereket és tudományterüleket alkalmaz: Genetika Molekuláris biológia Biokémia Sejtbiológia és embriológia (őssejt kutatás) Bioinformatika Vegyész és biomérnöki módszerek Robotika Nano-biotechnológia

4 Biotechnológia Főbb alkalmazási területei rvosi és gyógyászati alkalmazások Agrár és élelmiszeripari alkalmazások Biomérnöki alkalmazások Bioremediáció és biodegradáció

5 Biotechnológia Gyógy gyászati alkalmazások Farmakogenomika Gyógyszeripari termékek Gén tesztek Génterápia Human Genom Project Klónozás

6 Biotechnológia Agrár és élelmiszeripar Termő növények hozamának növelése Termő növények ellenállóképességének növelése Élelmiszerkomponensek hozamának és minőségének növelése Élelmiszerek ízének, megjelenésének és állagának javítása Csökkentett peszticid, műtrágya és egyéb agrokemikália felhasználás Termő növények felhasználása új anyagok előállítására

7 Biotechnológia Biomérn rnöki alkalmazások Hagyományos mérnöki tudományok ötvözése biológiai módszerekkel, termékekkel Új termékek megújuló forrásokból (non-food applications) Biotranszformációkkal kapcsolatos biomérnöki fejlesztések rvosbiológiai mérnökség

8 Biotechnológia Biodegradáci ció,, bioremediáci ció Biodegradáció anyagok, elsősorban szerves vegyületek lebontása élő szervezetek illetve az általuk termelt enzimek segítségével. A biodegradáció szoros kapcsolatban áll a környezeti ökölógiával, hulladékkezeléssel és a biodegradáción alapuló remediációval. A szerves anyagok lebontása alapvetően lejászódhat anaerob módon (oxigén nélkül) ill. aerob (oxigént felhasználó) eljárásokkal. Bioremediáció: olyan eljárás, melynek során mikroorganizmusokat, gombákat vagy zöld növényeket ill. az általuk termelt enzimeket használjuk fel a természetes környezet eredeti állapotának helyreállítására, elsősorban a szennyező anyagok lebontásával. Bakteriális bioremediáció használható fel például talaj klórozott szénhidrogénmentesítése során. Másik példa lehet az olajszennyezések mikrobiális degradációjának gyorsítása nitrát és szulfát műtrágyák alkalmazásával

9 A fermentáci ció és s a biotranszformáci ció összehasonlításasa FERMENT Nem definiált olcsó szénforrás, ERMENTÁCIÓ Egyszerű N, P, S, nyomelem forrás Definiált szerkezetű termék BITRANSZFRMÁCIÓ Definiált szerkezetű szubsztrát Definiált szerkezetű termék Előnyök, hátrányok + Bonyolult, többlépéses folyamat "egyszerű" kivitelezése - Összetett elegy (tápanyagok, melléktermékek, stb.), nehezebb kinyerés - Összetett mikrobiológiai ismeretek, több tapasztalat szükségeltetik Biokatalizátor tor Előnyök, hátrányok + Egyszerűbb közeg, "tisztább" reakció - Izolált, tisztított biokatalizátor "drágább", előállítása bonyolultabb lehet - "Kevesebb" ismeret, egyszerűbb megvalósíthatóság

10 A biokatalizátorok torok és s alkalmazási területeik A biokatalízis különféle célokra többféle biokatalizátor felhasználásával alkalmazható Többsejtes rendszerek Mikroorganizmusok Enzimek Gyógyszer Finomvegyszer Kozmetikum - Üzemanyag A biob iokatalizátorok legtöbbsz bbször enzime mek

11 A biokatalizb iokatalizátorok torok megjelenési formái Mikroorganizmusok, egész-sejtes rendszerek Enzimek Élő egész-sejtes rendszerek Homogén enzim Holt sejtek Részlegesen tisztított enzim Feltárt sejt, nyers enzimkészítmény

12 Biotranszformáci ció - Korai előzm zmények MIKRBILÓGIAI ENZIMATIKUS I. e. 2000: Ecetgyártás első emlékei biokatalizátor H biokatalizátor H H + H + H 2 H : (Schwann) A gyomornedv aktív komponense (pepszin) in vitro emészti a húst 1876: (Kühne) Az "enzim" fogalom XIX. sz: Az első "rögzített sejtes bioreaktor" (ágakon megkötött sejteken átfolyó alkoholtartalmú oldat) 1858: (Pasteur) Borkősav mikrobiológiai reszolválása 1930: (Knoll AG) L-Efedrin gyártás CH S. cerevisiae H H kémiai H NHMe 1894: (E. Fischer) α-me-glc maltáz α-glc β-me-glc emulzin β-glc 1914: (Zemplén G.) Kb. 150 oldalas magyar nyelvű összefoglaló az enzimek kémiai alkalmazásáról (pl. ricinusmag izolátum használata zsír-bontásra több tonnás tételben)

13 Enzimkatalízis zis Történelmi mérfm rföldkövek 1836: 1836: (Schwann (Schwann) Hús Hús in in vitro vitroemésztése pepszinnel pepszinnel 1876: 1876: (Kühne (Kühne) Az Az "enzim" "enzim" név név és és fogalom fogalom 1890: 1890: (Takamine (Takamine Co.) Co.) Takadisztáz Takadisztáz --az az első elsőiparilag alkalmazott alkalmazottenzimkészítmény 1897: 1897: (Hill (Hill) Az Az enzimműködés enzimműködés reverzibilis reverzibilis (hidrolázok) (hidrolázok) 1906: 1906: (Pottevin (Pottevin) Metil Metil oleát oleát szintézise szintézise gyakorlatilag gyakorlatilag szerves szerves közegben közegben (MeH (MeH + olajsav) olajsav) 1913: 1913: (Michaelis, (Michaelis, Menten) Menten) Az Az enzimkatalízis enzimkatalízis kinetikai kinetikai alapjai alapjai 1926: 1926: (Summer (Summer) Ureáz: Ureáz: az az első elsőkristályos fehérje. fehérje. Az Az enzim fehérje enzim fehérje kapcsolat kapcsolatfelismerése 1950-es 1950-es évek évek (Watson, (Watson, Crick Crick és és s többent többen) A DNS, DNS, RNS RNS szerkezete, szerkezete, a a genetikai genetikai kód kód 1967: 1967: (Phillips (Phillips) Lizozim Lizozim --Röntgen Röntgen krisztallográfia: krisztallográfia: az az első elsőfehérje harmadlagos harmadlagos szerkezet szerkezet 1969: 1969: (Gutte, (Gutte, Merrifield) Merrifield) A Ribonukleáz Ribonukleáz A enzim enzim kémiai kémiai totálszintézise totálszintézise 11'931 11'931 műveletben műveletben 1969: 1969: (Tanabe (Tanabe Co) Co) Az Az első elsőiparilag alkalmazott alkalmazott rögzített rögzített enzim enzim (Aminoaciláz L-metionin) 1983: 1983: (Ensley (Ensley) Az Az első elsőiparilag alkalmazott alkalmazott rekombináns rekombináns mikroorganizmus mikroorganizmus (Pseudomonas (Pseudomonas putida putidagének Esherichia Esherichia coli coli indigó indigóelőállítás) 1986: 1986: (Klibanov (Klibanov) Az Az enzimek enzimek többsége többsége működőképes működőképes "vízmentes" "vízmentes" szerves szerves közegben közegben 1992: 1992: (többen (többen) HIV-1 HIV-1 proteáz proteáz (99 (99 aminosav) aminosav) enantiomer enantiomer formájának formájának szintézise szintézise D-aminosavakból D-aminosavakból (az (az enzimek enzimek sztereoszelektivitásának forrása forrása kiralitásuk) kiralitásuk) HIV-1 HIV-1 proteáz proteáz L-aminosavból L-aminosavból álló állópeptideket hasítja hasítja ent-hiv-1 ent-hiv-1 proteáz proteáz D-aminosavakból D-aminosavakból álló állópeptideket hasítja hasítja

14 A biokatalízis fejlődése, megtorpanása és reneszánsza nsza Kémiai tömegtermelés Fosszilis források - kõolaj - kõszén Környezetvédelem, Megújuló nyersanyag és energiaforrások jelentõsége nõ Világválság II. Világháború lajválság Mindennapi 1990 KémiaK

15 A szintetikus biológia hierarchiája Szekvenálás, génexpresszió, promoter tervezés, in silico tervezés, DNS szintézis, irányított evolúció, aptamerek in silico tervezés, irányított evolúció 1970 után Szintetikus szabályzási hálózat módosítás Genetikai szabályzókörök, genom redukció, genom szintézis

16 Enzimek szerkezete Enzim < = > Egy adott funkciót t katalizáló fehérje Elsődleges szerkezet > Aminosavak kapcsolódási sorrendje Másodlagos szerkezet > Aminosavak láncbeli relativ helyzete (hélix, redő, rendezetlen hurok, stb.) Harmadlagos szerkezet > Peptidláncok teljes térszerkezete Negyedleges szerkezet > Egy vagy több peptidláncból és további prosztetikus csoportokból álló enzim teljes térszerkezete Szerkezet hatékonyság, szelektivitás

17 Enzimek elsődleges és s másodlagos m szerkezete Elsődleges szerkezet Másodlagos szerkezet MNKKEWEEKYVKPLLERSPERKKEFKTSSGIVVDRLYTPEDVEIDYENKL GYPGVYPFTRGVYPTMYRGRLWTMRQYAGFGTAEETNRRYRYLLEQGQTG LSVAFDLPTQIGYDSDHPMALGEVGKVGVAIDTIEDMEILFNGIPLGKVS TSMTINSTCAQILSMYVAVAEKQGVERANLRGTVQNDMLKEYIARGTYIF PPEPSLRLATDIIMFCAKEMPKWNSISISGYHMEEAGATPVQEVAFTLAD GITYVEKVIERGMDVDSFAPRLSFFFAAGNNFLEEIAKFRAARRLWARIM KERFNAKNPRSMMLRFHVQTAGCTLTAQQPENNIVRVALQALAAVLGGCQ SLHTNSFDEALCLPTEKAVRIALRTQQIIAEESGVADVVDPLGGSYYIEW LTDRIEEEAMKYIEKIDEMGGMIKAIESGYVQREIQKSAYEKQKAIDEGE ITVVGVNKYQIEEEIQIELLRVDKAVVEKQIRRLQEFRKNRDAKKVEEAL RLRKAAEKEDENLMPYVLDAVKARATLGEMTDALRDVFGEFRAPEIF DNS aminosav sorrend tekeredés folding

18 Enzimek harmadlagos és s negyedleges szerkezete Harmadlagos szerkezet Negyedleges szerkezet Harmadlagos és negyedleges szerkezet aktív konformáció aktív konformáció (szubsztrátum illeszkedése reakció lejátszódása) denaturálódás (az aktív szerkezet irreve5rzibilis változása biológiai inaktiváció)

19 Enzimek szerkezete Az aktív v centrum A karboxipeptidáz A enzim aktív v centruma: (a) az aktív centrum sematikus ábrája; (b) a fehérje aktív centruma a Cbz-Gly-Phe szubsztrátummal (feltételezhető elhelyezkedés). A piros vonalak a fontos aminosavoldalláncokat, a kék vonalak a szubsztrátum hidrogén-hidas kötési helyeit jelzik. pozitív katalízis (szubsztrátum és az aktív hely katalitikus részeinek illeszkedése) negatív katalízis (szubsztrátum védelme, biológiai védőcsoport )

20 Enzimkatalízis zis koenzimekkel és s nélkn lkülük a) koenzim nélküli enzim b) szorosan kötött koenzimmel működő enzim c) nem szorosan kötött koenzimmel működő enzim Koenzimek (coe) (pl. B 12 koenzim) a) vagy b) típusú enzimek (pl. hidrolázok) alkalmazás szempontjából előnyösek kapcsolt regenerációs rendszer Vitaminok (pl B 12 vitamin) gyakran a koenzimek prekurzorai Enzim koenzim kölcsönhatások típusai

21 Enzimek Szerkezet / hatás összefüggések A metilmalonil-coa mutáz (MCM) reakció és az MCM - szubsztrát komplex Metilmalonil-CoA mutáz szerkezet, PDB: 4REQ, [Evans, et al.] Szukcinil-CoA Metilmalonil-CoA B 12 -koenzim ( Ado-Cbl )

22 ? Valóság - Kísérlet Modell l??

23 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása HTP kristályos lyosítás

24 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása HTP kristályos lyosítási si eredmények

25 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása Röntgen krisztallográfia

26 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása NMR spektroszkópia pia Az NMR mérések során a magok mágneses perdületének változásai követhetőek a magok környezetétől függően. Értkető módon a magok érzékenyen reagálnak a kémiai környezet változásaira így a módszer erről ad információt. Az NMR spektroszkópusok alapvetóen a proteinek oldatfázis zisú szerkezetét képesek vizsgálni. Fontos információk nyerhetőek a fehérjék dinamikus viselkedéséről is

27 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása NMR módszer m lépéseil

28 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása NMR spektroszkópia pia

29

30 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása és biomolekulák 3D szerkezeti adatbázisa Röntgenkrisztallográfia NMR módszerekm Elektron mikroszk kroszkópia Elektron diffrakc kció Kísérleti szerkezetek: Protein data bank (PDB) As of Tuesday Nov 11, 2008 there are Structures PDB Statistics M. J. Foster: Micron 2002, 33,

31 Protein homológia modellez ezés Homológia modellezési ezési módszerekm M. J. Foster: Micron 2002, 33, Homológia modellezés ezés kísérleti szerkezettel nem rendelkező de de ismert genetikai szekvenciájú protein - 3D proteomika egyik eszköze ze Szekvenálás (SwissProt, TrEMBL) jóval egyszerűbb mint a 3D 3D szerkezet meghatározás A 3D 3D szerkezetek felhasználása funkció molekuláris szintű megértése Lehetséges alkalmazás -- szerkezet alapú gyógyszertervezés Fragmens alapú módszerek (CMPSER/SYBYL; HMLGY // InsightII) Távolság alapú módszerek (MDELLER // InsightII) Automata homológia modell szerverek (Swiss-Model: Critical Assessment of of Structure Prediction (CASP) Folyamatos ellenőrzés

32 Protein homológia modellez ezés M. J. Foster: Micron 2002, 33, A szekvencia azonosság g foka <30 <30 %: %: megbízhatatlan modellek %: %: megbízható modellek kevésbé megbízható régiókkal >60 >60 %: %: jó jóminőségű modellek (C (C α RMSD < 1 Å) Å) A fibroblaszt növekedési faktor modell (alap (alap--patkány keratinocyta GF: GF: ~ % azonosság) összevetve a kísérleti szerkezettel (röntgenkrisztallográfia)

33 PAL modell PAL röntgen r szerkezet Homológia modell összehasonlítása két röntgenszerkezettel PAL (R. toruloides) röntgen PAL (petrezs.) modell PAL (petrezs.) röntgen Homológi modellezés: bonyolultabb fehérjék (pl. (pl. fenilalanin ammónia-liáz, PAL) PAL) modellezése

34 Ligandumok dokkolása fehérj rjék k szerkezetéhez Modell ligandum dokkolása Modell fehérjéhez Heparinnal komplexált kísérleti szerkezet

35 Virtuális szűrés Ligandumok automatizált dokkolása

36 Biokatalízis általános jellemzői Enyhe körülmk lmények + Hatékonys konyság (a kémiai reakciók akár szoros gyorsítása) + Szubsztrátspecifit tspecifitás + - ("Pont az én szubsztrátom nem?") Szelektivitás Jellemző Előny Hátrány + (Eredendő sztereoszelektivitás) Majdnem minden kémiai k reakciónak létezik l enzimatikus megfelelője Környezetbarát, könnyen lebomlik + - (Egész sejtes ill. nyers készítményeknél több enzim ellentétes irányban működhet) + - (Instabilitás) Ár + (Könnyen megújuló) - (Tisztítás drága)

37 Biokatalízis Szelektivitások típusait SZUBSZTRÁT SZELEKTIVITÁS TERMÉK SZELEKTIVITÁS S 1 T 1 T 1 k 1 reagens k 1 = k 2 k 2 S k 1 reagens k 1 = k 2 k 2 S 2 T 2 T 2 KEMSZELEKTIVITÁS Konstitúciójukban különböző, de kémiailag hasonlóan viselkedő csoportok között REGISZELEKTIVITÁS Konstitúciós izomerek között Eltérő konstitúciójú helyre kapcsolódó csoportok DIASZTEREMER SZELEKTIVITÁS DIASZTERETÓP SZELEKTIVITÁS Diasztereomerek között Diasztereotóp csoportok / felületek között ENANTIMER SZELEKTIVITÁS ENANTITÓP SZELEKTIVITÁS Enantiomerek között Enantiotóp csoportok / felületek között Poppe, L., Novák, L.: Selective Biocatalysis: A Synthetic Approach, Verlag Chemie: Weinheim-New York,

38 Enyhe, hatékony katalízis (akrilamid) CN nitriláz H 2 NH 2 Az akrilamid amely nagy tömegben felhasznált polimeripari alapanyag, jelenlegi felhasználása kb t/év előállítására a Nitto Co (Japán) nitriláz enzimmel, enyhe körülmények közt végzett hidrolízisen alapuló eljárást dolgozott ki. E technológia segítségével 1985-ben például már ~ 6000 t akrilamidot gyártottak

39 Regioszelektív v izomerizáci ció (inverz cukor) H H H H α-d-glükopiranóz H glükóz izomeráz H H H H H α-d-fruktofuranóz H H H H H β-d-fruktopiranóz A világszerte több helyen több 100'000 t/év mennyiségben előállított termék gazdaságos termelése kifinomult eljárásokat igényel. Jellemző adatként megemlíthető, hogy mára 18'000 kg termék állítható elő egyetlen kg rögzített biokatalizátor felhasználásával

40 Akirális vegyület letekek világa Alíz csodaországban

41 Belépés s a királis vegyület letekek világába Hát persze, hiszen ez tükörország!

42 Királis vegyületek élettani hatások A DNS, az élet alapvető információhordozója is monokirális How would you like to live in Looking-glass House, Kitty? I wonder if they'd give you milk, there? Perhaps Looking-glass glass milk isn't good to drink... Az aminosavak, a fehérjék építőkövei és a fehérjék szintén királisak

43 Eltérő enantiomerek eltérő biológiai hatása Íz, aroma, illat H H HC NH 2 NH H L,L-(-)-aszpartám (R)-(+)-limonén (1R,3R,4S)-(-)-mentol (R)-(+)-szulkatol (édes/keserű) (narancs/citrom illat) (mentol íz/íztelen) (feromon/hatástalan) Gyógyszer, hatóanyag H H NH 2 CH N H N N H H H N NH L-DPA (S)-(-)-nikotin (-)-atropin (S)-(-)-talidomid (anti-parkinson/mellékh.) (méreg/gyengébb) (hatásos/inaktív) (nyugtató/teratogén)

44 Levéltetvekt ltetvektől l az oroszlánig A nepetalactone több levéltetű szex-feromon komponense: Macskamenta (Nepeta cataria) H H az egyik enantiomer hatásos H (5S,8S,9R)-Nepetalactone H H A nepetalactone a házi macskák és az oroszlán viselkedésére hat: az egyik vagy másik enantiomer hatásos, a racemát t nem hat

45 Az enantiomerek megkülönb nböztetése királis szelektor Királis reagens, katalizátor vagy rezolválószer preferált enantiomer királis szelektor nem preferált enantiomer Enzimek: királis biokatalizátorok

46 Királis kulcsvegyület let korszerű fejlesztési si stratégi giája Cél: egy adott enantiomer tiszta formájának elõállítása Biokatalízis Kémiai katalízis Mikrobiológia: (klasszikus és rekombináns egész sejtes technológiák) Biokatalízis: (enzimatikus módszerek) Homogén katalízis: (aszimmetrikus katalízis) Heterogén katalízis: (aszimmetrikus katalízis) 1. Technológia 2. Technológia 3. Technológia 4. Technológia Gazdaságossági elemzés (a környezetvédelmi szempontokat is beleértve) Kiválasztott + tartalék technológia ipari léptékû termelésre Magas enantiomer tisztaságú termék

47 Enantiomer szelektív v hidrolízis (Taxol intermedier előáll llítása) HN imm. lipáz (Ps. cepacia) H 2 HN (3R,4S)-Ac + HN H Taxol > 96 % (az enantiomerre) > 99.5 %ee A Bristol-Myers cég által 150 l-es reaktorban, 1,2 kg/sarzs-nagyságban, rögzített (tehát többször felhasználható) enzim segítségével végrehajtott folyamatában a nem hidrolizáló acetát enantiomer hűtés hatására kiválik, így könnyen kinyerhető

48 Enantiomer szelektív v hidrolízis racemizáci cióval (L-lizin előáll llítása) Az enantiomer szelektív folyamatok gazdaságossága nagymértékben megnövelhető, ha a racém elegyból az egyik enantiomer forma nem csupán kinyerhető, hanem a racemát teljes mennyisége a kívánt enantiomer formává alakítható. HN rac-akl NH 2 L-lizin laktamáz (C. laurentii) H 2 AKL racemáz (Achromobacter obae) D-AKL HN NH 2 NH 2 + H 2 N CH L-lizin > 99 % (a racemátra) > 99,5 %ee A Toray Industries (Japán) 4000 t/év kapacitású tankreaktorokban egész sejtek felhasználásával állít(ott) elő L-lizint. Az enantiomer szelektív hidrolízist a Cryptococcus laurentii sejtekben található L-lizin laktamáz enzim, míg az in situ racemizációt az Achromobacter obae sejtekben meglévő α-amino-ε-kaprolaktám racemáz enzim végzi.

49 Prokirális diol enantiotóp p szelektív v acilezése (fungicid intermedier előáll llítása) F H F F H lipáz F (C. antarctica) H > 74 % (az enantiomerre) > 99 %ee F F gombaölõszerek N N N X A Schering-Plough (USA) cégnél a diolból Candida antarctica lipáz enzime által katalizált reakció segítségével több kg-os léptékben állították elő a kívánt királis monoacetátot

50 Keton enantiotóp p szelektív v reduktív v aminálása (kofaktor enzimes regenerálása L-terleucin) CH + NH 3 - H 2 leucin dehidrogenáz NH 2 CH L-terleucin 74 % >99 %ee Az enzimek sok esetben külön hozzáadott kofaktorokat igényelhetnek a katalízis során. Ekkor komoly problémát jelenthet a kofaktorok folyamatos, hatékony regenerálása, mivel e nélkül az igen drága kofaktorokból sztöchiometrikus mennyiségre lenne szükség. NADH NAD + formiát dehidrogenáz C 2 HCH A Degussa-Hüls AG (Németország) a rák- és HIV-ellenes szerek szintézisében intermedierként felhasználható L-terleucin tonnás léptékben történő előállítása során használt fel L-leucin dehidrogenáz/formiát dehidrogenáz enzimeket az enantiotóp szelektív reduktív aminálás/nadh regenerálás megvalósítására

51 KÖSZÖNÖM FIGYELMÜKET