KROMATOGRÁFIA (elválasztási technika) Történeti áttekintés

Átírás

1 Mózes: KROMATOGRÁFIA (elválasztási technika) Történeti áttekintés kémiai analízisek ~70% iható víz eloállítása keseru vízbol: fa ágak bemerítése (adszorpció) Arisztotelész: édesvíz készítése sós vízbol agyagon (ioncsere) Ferdinánd RUNGE: XIX. sz közepe: muvészi színes alakzatok M??au? Ce?????u?????? (Cvett,Tswett) ( ) Szorbens oszlopok-növényi pigmentek Kromatográfia chromos graphos

2 Összetett minták elemzésénél gyakran szükséges a mérendo anyag komponenseinek elválasztása. Ez rendszerint az analizálandó alkotók egymással nem elegyedo két fázis közötti megoszlásán alapul. KROMATOGRÁFIA többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyujtoneve közös alap: az elválasztandó komponensek egy állófázis és egy azon, meghatározott irányban átáramló mozgófázis (eluens) között megoszlanak Elválasztás alapja: komponensek: eltéro fizikai, kémiai tulajdonság 3 lényeges elem: 1. álló- és mozgófázis 2. fázisok között anyagátmenet játszódik le 3. kölcsönhatás az állófázis és a mintát alkotó komponensek között

3 A mozgófázisban a komponensek eltéro sebességgel haladnak, így egymástól elválnak. Az állófázis egy meghatározott pontján (általában a végén) egy érzékelo (detektor) jelzi a komponenseket, valamilyen fizikai vagy kémiai tulajdonságuk mérésével. A detektor által eloállított jel kiértékelése teszi lehetové az elválasztott komponensek azonosítását (minoségi analízis) és mennyiségük meghatározását (kvantitatív analízis). CSOPORTOSÍTÁS mozgófázis halmazállapota alapján GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) Állófázis: folyadék: GLC szilárd: GSC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (LC) Állófázis: folyadék: LLC szilárd: LSC SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA (SFC) Állófázis: folyadék szilárd technikai kivitelezés alapján oszlop sík (planáris): papír, vékonyréteg

4 megkötodés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint 1. Fizikai kölcsönhatások -szorpciós: adszorpciós abszorpciós (oldódás, megoszlás) kemiszorpció (ioncsere) -méret szerinti kölcsönhatások (gél) 2. Kémiai kölcsönhatások -sav-bázis kölcsönhatás -komplex képzodés -H-hidas kölcsönhatások 3. Biokémiai kölcsönhatások -biokémiai affinitás Kényszeráramot létrehozó ero alapján: nyomáskülönbség elektromos erotér

5 Kényszeráramlást okozó ero Nyomáskülönbség Elektromos erotér Gáz kromatográfia GC Szuperkritikus kromatográfia SFC Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC Mozgó fázis gáz szuperkritikus fluid folyadék folyadék Szilárd GSC SFC TLC IC GPC,SEC CE GEL ELFO Álló fázis Folyadék GLC SFC PC CEC

6 megvalósítás módja alapján: 1. frontális 2. kiszorításos 3. elúciós elválasztás Frontális analízis: a minta folyamatosan áramlik az állófázisra detektorjel Minta: A & B A: kevésbé kötodik B-t megköti az állófázis A + B A 1: B telíti az állófázist 1 ido 2 2: a minta változatlan összetétellel hagyja el az állófázist Csak a legkisebb szorpciójú alkotó (egy részlete) különítheto el! Regenerálni kell az oszlopot!

7 Kiszorításos analízis: a mintának csak egy diszkrét részletét juttatjuk az állófázisra (a kolonna kapacitásának töredékét) 1. minta bevitele: A & B 2. egyensúly beállta 3. kiszorító anyag alkalmazása: K detektorjel B K A a kiszorító anyag telíti a rendszert regenerálni kell a rendszert ido Alkalmazási terület: ionkromatográfia

8 Elúciós analízis leggyakrabban alkalmazott technika jel 1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció Minta: A & B A: kevésbé kötodik A detektort eléro mintakomponens(ek) felgyülemlett mennyiségét méri. A B integrális detektor Analitikai információ: minoségi: t (retenciós ido) mennyiségi: csúcs területe az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny elhanyagolható az eluenséhez képest nincs szükség regenerálásra jel t A t B ido differenciális detektor Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében. ido

9 A KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSE ALAPFOGALMAK A kromatográfiás elválasztások hajtóereje: az egyes komponensek kémiai potenciáljának különbözosége az álló- és a mozgófázisokban A komponensenként eltéro hajtóero azt eredményezi, hogy a minta különbözo összetevoi eltéro ideig tartózkodnak az állófázison. jel KROMATOGRAM retenciós (visszatartási) ido (t R ): a minta mozgófázisba (eluensbe) történo bevitelének pillanatától (adagolásától) a komponens maximális koncentrációban való megjelenéséig eltelt ido Ez az ido minden mintaalkotóra más és más. MINOSÉGI JELLEMZO t A t B ido

10 A t R tartalmazza azt az idot is, amit az eluens a mintaadagolóban, a kolonnaszemcsék közötti térben és a detektorban (a jel képzéséig) eltölt. HOLTIDO: (t M ) a kolonnán nem kötodo komponens áthaladási ideje redukált (nettó) retenciós idot: t R = t R t M A komponens visszatartását (retencióját) kifejezhetjük azzal az retenciós térfogattal (V R ) is, ami az adott komponens kolonnán való átviteléhez szükséges. V R = t R v Holt térfogat: v: áramlási sebesség V M = t M v

11 visszatartási tényezo: k = t R t t M M egy nem visszatartott komponenshez képest mikor eluálódik az adott komponens 1 < k < 10 jel szelektivitási tényezo: α = k k 2 1 két, egymást követo csúcs elválasztását jellemzi α = 1 k 2 = k 1 nincs szeparáció α > 1 szeparáció t 1 t 2 ido

12 Az elválasztás hatékonyságának jellemzése: felbontás (R S ) R s = tr2 tr 1 1 ( w1 + w 2 2 )

13

14 A kromatográfiás elválasztást leíró elméletek Tányérelmélet Sebességi (kinetikus) elmélet n=0 n=1 n=2 n=3 n=4 1 1/2 1/2 Tányérelmélet Martin & Synge, A komponensek megkötodése az állófázison és visszajutása a mozgófázisba dinamikusan ismétlodik. 1/4 1/4 1/4 1/4 1/8 1/8 1/16 1/16 1/32 1/32 1/4 1/4 3/16 3/16 4/32 4/32 1/8 1/8 3/16 3/16 6/32 6/32 1/16 1/16 4/32 4/32 1/32 1/32 D = 1 V á = V m Gauss-eloszlás Edénykék méretének csökkentése kolonna a fázisok térfogatát csökkentve kvázi egyensúly

15 elméleti tányér: a kolonnának az a kis elemi része, amelyben az elválasztandó anyagok a 2 fázis között egyensúlyban vannak elméleti tányérral ekvivalens oszlop-magasság: amelyen kialakul egy egyensúlyi egység (H, vagy HETP = Height Equivalent to Theoretical Plate), elméleti tányérszám: N = L L: a kolonna hosszúsága H (N: )

16 csúcsszélesség: oszlop & rendszer hatékonyság Kromatográfiás csúcs jellemzése csúcs szimmetria: 10 %-nál mért szélesség a b a b a b szimmetrikus: a = b a > b fronting elülso megnyúlás b > a tailing hátsó megnyúlás

17 Sebességi (kinetikus) elmélet a két fázis közötti anyagátadási folyamat dinamikáját veszi figyelembe van Deemter 1956 A töltet inhomogenitásának és a diffúziós folyamatok hatásának vizsgálata. van Deemter-egyenlet: az elméleti tányérral ekvivalens oszlopmagasságnak (H) az eluens lineáris áramlási sebességétol (u) való függését: H = A + B/u + C u A: a töltet geometriájának hatását veszi figyelembe egyes molekulák hosszabb, mások rövidebb utat tesznek meg a kolonnán való áthaladáskor, ami csúcsszélesedést eredményez (eltéro áramlási csatornák, Eddy-diffúzió) B: az elválasztandó komponensnek a mozgófázisban bekövetkezo tengelyirányú (longitudinális) diffúzióját értelmezi a komponens tartózkodási idejével arányos (elsosorban a mozgófázisban, de nem elhanyagolható az állófázisban sem) C: tartalmazza az anyagátadással szembeni gátlás hatását Az állófázisban szorbeált molekuláknak idore van szükségük ahhoz, hogy az állófázisból visszajussanak a mozgófázisba. (Lemaradnak társaiktól.)

18 H [mm] H = A + B/u + C * u A van Deemter egyenlet általános ábrázolása C * u H min B/u A u szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlotlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlotlenségek u [cm/s] (WCOT: A tag elhanyagolható: Golay egyenlet)

19 Minoségi analízis Alapja: a retenciós ido a minta komponenseinek minoségétol függ A legegyszerubb módszer: a retenciós idok (pontosabban a redukált retenciós idok) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével jel relatív retenció (r x,r ): a kísérleti körülmények különbözoségébol származó eltéréseket kompenzálja egy kiválasztott (r) anyagra vonatkoztatott redukált retenciós ido hányadosaként adnak meg: ' r x, r = t t R ' R x r t x ido jel t r t x ido

20 Mennyiségi értékelés a kromatogramon levo csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával. Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak mérése 1. kalibrációs módszer 2. addíciós módszer 3. belso standard módszer

21 A kalibrációs módszer T = mc jel c 1 T 1 T: csúcs területe c: koncentráció (anyagmennyiség) m: arányossági tényezo (érzékenység) ido 1. független standard (kalibráló) oldatok jel T ismeretlen oldat: T x c 2 T 2 T 3 T x ido T 2 jel c 3 T 3 T 1 m c 1 c 2 c x c 3 c ido

22 Standard addíció jel c x T x T 1,x = T x +T 1 T 1 =T 1,x -T x ido T T 2,x = T x +T 2 T 2 =T 2,x -T x jel c x + c 1 T 1,x T 2 T 1 T x jel ido c 2 + c x T 2,x c x c 1 c 2 c ido

23 Belso standard: relatív terület meghatározása a mintán belüli referencia rögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához hozzáadjuk a referencia anyagot a referencia anyag csúcsára vonatkoztatjuk a meghatározni kívánt csúcsok területét Elonyök: az analízis során fellépo hibák egy részét küszöböli ki: adagolás érzékenység változása

24 A KROMATOGRÁFOK FELÉPÍTÉSE eluens tároló eluens továbbító (pumpa) mintaadagoló oszlop detektor jelfeldolgozó KROMATOGRAM MINOSÉGI & MENNYISÉGI INFORMÁCIÓ

25 1956: van Deemter: sebességi elmélet M. Golay: kapilláris oszlopok Schay Géza: 1961: GC elmélete Szepesy László GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) 1952: A.T. James & A.J.P. Martin nagyhatékonyságú analitikai módszer kvalitatív & kvantitatív információk összetett minták analízise a mintát alkotó komponensek szétválasztása Mozgófázisa: gáz Állófázisa: felületen kötött folyadék, vagy szilárd anyag (GLC, GSC) technikai kivitelezés: oszlop elúciós analízis Elválasztás alapja: 1. illékonyság (forráspont) 2. szerkezet A gázkromatográfia bomlás nélkül gozzé, ill. gázzá alakítható vegyületek elválasztására és analízisére szolgáló módszer. ~12 millió szerves vegyület: jelentos részük hoérzékeny nagyobb jelentoséggel ~ 50 ezer bír: jelentos része gázkromatografálható Illékonyság: molekula tömege molekula polaritása hostabilitás

26 GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) Minta: be kell juttatni a mozgófázisba gázzá/gozzé kell alakítani Minta halmazállapota: 1. Gáz 2. Folyadék: el kell párologtatni (pillanatszeruen) 3. Szilárd: el kellene párologtatni (pillanatszeruen): oldat formában gáztartály nagynyomású palack nyomásszabályozó egységek reduktorok, szelepek tisztító egység Gázkromatográf (GC)

27 GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) tisztító patron injektor detektor PC oszlop termosztát nyomásméro áramlás-szabályozók gázpalack

28

29 Vivogáz elnevezés tiszta nagy tisztaságú jelölés % 99, ,95 99,99 ppm az alkalmazott detektortól függoen: H 2 Ar N 2 He , , , ultra , ,1 Reduktor: a gáz anyagi minoségének és a nyomásnak megfelelot választani készüléken belül: szelepek áramlási sebesség

30 Mintaadagolás 1. A mintát pillanatszeruen kell bejuttatni az eluensbe 2. Goz/gáz halmazállapot létrehozása 3. Keveredjen el a vivogázzal mikroliterfecskendo: speciális tu gáz & folyadék halmazállapotú minta viszonylag kicsiny térfogat 0,1 µl-1 ml folyadék elpárologtatva: X térfogatnövekedés hatutas beméro szelep

31 Az injektor felépítése (üveg) betétcsovel ellátott fémcso szeptum vivogáz bevezetés INJEKTOR 1. minta befogadása 2. elpárologtatása 3. oszlopba történo bejuttatása futoblokk ( o C) liner (betétcso) kolonna Töltetes oszlopok: nagyobb átméro: nagyobb mintatérfogat Kapilláris oszlopok: kisebb mintatérfogat

32 Injektor muködése Injektálás Elpárologtatás 1. fecskendovel átszúrjuk a szeptumot 2. minta bevitele mikroliterfecskendovel 3. eltávolítjuk a fecskendot 1. elpárolog a minta 2. kitölti az injektor teljes térfogatát ( X térfogatnövekedés) 1. elkeveredik a vivogázzal

33 gyors injektálás oldószer lassú A vivogáz a beadagolt (és elpárologtatott) mintát bejuttatja az oszlopra.

34 vivogáz Az injektorok típusai Split-injektor SPLIT SPLITLESS ON-COLUMN PTV Szeptum öblítés split-gáz Splittelési arány: meghatározza a kolonnára jutó anyag mennyiségét

35 5:1 200:1

36 SPLITLESS INJEKTOR Purge Off Purge On

37 On-column PTV (Programmed Temperature Vaporizer) közvetlenül az oszlopba fecskendezzük a mintát

38 Töltetes: fém vagy üveg Kolonnák (kromatográfiás oszlopok) szerep: ELVÁLASZTÁS töltetes kapilláris Fémcso: nemkívánatos katalitikus folyamatok Kapilláris: üveg, (fém) Hossz (m) Belso átméro (mm) Áramlási sebesség (ml/perc) Tányérszám Kapacitás (µg/csúcs) Film vastagság (µm) töltetes 0, kapilláris ,1 0,7 0, ,1 0,1-10

39 védoréteg (poliimid, 350 o C) kvarc d állófázis mikrokapilláris (microbore): d < 150 µm standard kapilláris: 150 µm < d < 500 µm makrokapilláris (widebore): d > 500 µm Kapilláris oszlopok: Adszorpciós: PLOT (porózus rétegu nyitott végu oszlop) (Porous Layer Open Tubular) Megoszlásos: WCOT (falborítású nyitott végu oszlop) (Wall Coated OT) SCOT (hordozóval borított nyitott végu oszlop) (Support Coated OT)

40 SiOH SiOH SiOH SiOH SiOH SiOH Kölcsönhatás: CSAK AZ ÁLLÓFÁZISSAL üvegfelelület dezaktiválása Aktivitás: szilanol csoportok tailing nem szimmetrikus jelalak dezaktiválás: szililezo reagens üvegfelület Si-O-Si(CH 3 ) 3 Si-O-Si(CH 3 ) 3 SiOH Si-O-Si(CH 3 ) 3

41 Állófázisok Követelmények: hostabilitás nincs számottevo bleeding jól definiált kémiai szerkezet kémiai inertség mérsékelt ár Adszorbensek (GSC) porózus, nagy fajlagos felületu anyagok szerves eredetuek: aktív szén gyöngypolimerek szervetlen adszorbensek: szilikagél alumínium-oxid zeolitok (molekulasziták) módosított adszorbensek: szén vagy szilikagél alapúak kicsiny molekulatömegu szénhidrogének, nemesgázok (PLOT) (adszorpció: gázok/folyadékok szilárd felületen történo megkötodése)

42 Állófázisok (GLC) megosztó folyadékok Különféle polimerek: egyenletes bevonat a kapilláris belso felületén (WCOT) viszonylag kevés állófázis: szubsztituált polisziloxánok (szilikonok): kedvezo tulajdonság: hosszú élettartam (abszorpció: gázok/folyadékok folyadékban történo oldódása) R R S i O S i O R: polisziloxánvázhoz kapcsolható szubsztituensek Feltétel: termikus stabilitást ne befolyásolja R R Fontosabb szubsztituensek: Metil Fenil Cianopropil Trifluoropropil n Metil: -CH 3 Fenil: Cianopropil: -CH 2 CH 2 CH 2 CN Trifluoropropil: -CH 2 CH 2 CF 3

43 O CH 3 Si CH 3 O O Si CH 3 Si CH 3 O Si CH 3 CH 3 metil-fenil cianopropil-fenil stb. helyettesítés: Si atomok hány %-át 100 % metil 5 % fenil & 95 % metil

44 Polietilénglikolok (PEG) HO CH 2 O CH 2 O H n Carbowax speciális szeparációs karakterisztika Hátrány: kisebb hostabilitás oxigén-érzékenység

45 Állófázis polaritása: állófázis szerkezete funkciós csoportok minosége az egyes funkciós csoportok száma Apoláris állófázisok: 100 % metil 5 % fenil Közepes polaritás: 35 % fenil 50 % fenil Poláris állófázis: PEG Szelektivitás: kölcsönhatás létrejötte az állófázis és a mintát alkotó komponensek között Kölcsönhatás: adott komponens minosége állófázis szerkezete

46 Kölcsönhatások 1. diszperziós 2. dipólusos 3. H-híd Diszperziós kölcsönhatás: apoláris-apoláris kh. (átmenetileg keletkezo dipólusok) mindegyik állófázisra jellemzo Molekula polarizálhatósága: méret függés Forráspont helyett inkább goznyomás Kisebb goznyomással bíró komponensek: erosebb visszatartás (sok esetben nem fellelheto) Oldhatóság: nagyobb oldhatóság: hatékonyabb visszatartás (nehéz becsülni) ÁLLÓFÁZIS metil fenil cianopropil trifluoropropil PEG KÖLCSÖNHATÁS eros nagyon eros eros eros eros

47 Dipólusos kölcsönhatás mind az állófázis mind a molekula rendelkezzen dipólus momentum PEG & cianopropil szubsztituált állófázisok Dipólus momentummal rendelkezo molekulák: egyenetlen töltéseloszlás O, N, S, P, Cl, F, Br, I -tartalmú molekulák: általában rendelkeznek dipólus momentummal -OH,-NH csoportok: nagy dipólus momentum Szimmetrikus a molekula: kicsiny dipólus momentum Elválasztás: eltéro dipólus momentumok (a dipólus momentumok különbsége számít) Kicsi a dipólus momentum különbség az elválasztandó komponensek között: nagy dipólus momentumú állófázis alkalmazása szükséges

48 Dipólusos kölcsönhatás ÁLLÓFÁZIS metil fenil cianopropil trifluoropropil PEG KÖLCSÖNHATÁS nincs nincs nagyon eros közepes eros OH, NH csoport jelenléte Hidrogén-híd kölcsönhatás az állófázis és a molekula között kialakuló H-híd (a H-híd erosségének különbsége számít) Kicsi a H-híd erosségek különbség az elválasztandó komponensek között: eros H-híd kialakítására képes állófázis alkalmazása szükséges

49 Hidrogén-híd kölcsönhatás ÁLLÓFÁZIS metil fenil cianopropil trifluoropropil PEG KÖLCSÖNHATÁS nincs gyenge közepes gyenge közepes 1. tudomány 2. tapasztalat 3. (tipp) Az állófázis kiválasztása: publikációk applikációs adatbázisok (internet) hasonló a hasonlóval választható el: apoláris molekula apoláris állófázis poláris molekula poláris állófázis

50 Elvárások: Szelektivitás: az elválasztó rendszer azon tulajdonsága, hogy különbséget tud tenni: az állófázis és a mintaalkotói között kialakuló kölcsönhatások révén jön létre Hatékonyság: minél rövidebb ido alatt minél több komponenst lehessen meghatározni kicsiny szélességu elúciós csúcsok

51 oszlop Termosztát homérséklet retenciós ido elválasztás hatékonysága kevésbé illékony komponensek goznyomásának növelése Kétféle üzemmód: izotermikus programozott felfutés T ( o C) termosztát szabályozható homérséklet változtatható felfutési sebesség: 0-40 o C/perc visszahutés: szelloztetés elemzési ido csökkentése megfelelo jelalak t (perc) jelentos eltérés a mintát alkotó komponensek fizikai, kémiai tulajdonságaiban

52 Detektorok Kolonna: idoben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel (vivogázzal) együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által eloállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idoegység alatt bejutott mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet destruktív nem destruktív dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %) érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkezo jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelmuen megkülönböztetheto a háttértol (LOD) meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelo precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ)

53 Detektorok hovezetoképesség-méro detektor (Thermal Conductivity D) (katarométer) ellenállás megváltozása hídkapcsolás W-szálak: ma futoáram nem destruktív univerzális dinamikus tartomány: 10 5 LOD: 5-50 ng Vivogáz: H 2, He N 2

54 lángionizációs detektor (FID) hidrogén/levego eleggyel táplált mikroégo, amely fölé elektródpárt helyeznek el nem ionizálható eluens: N 2, Ar, He, H 2 A kolonnát elhagyó szerves komponensek a lángba jutva többlépéses reakcióban, oxigén közremuködésével ionizálódnak. a képzodött ionok hatására áram folyik, ami erosítés után mérheto C-detektor: minden égheto anyagra ad jelet destruktív dinamikus tartomány: LOD: 0,05-0,5 ng

55 β-sugárzó radioaktív forrás (pl. 63 Ni) elektronbefogási detektor (ECD) Az elektron áramlás kicsiny (10-12 A) állandó elektromos áramot hoz létre a megfelelo feszültségre kapcsolt elektródok között nagy elektronegativitású elemet tartalmazó komponensek az elektromos térben az elektronokat befogják és így jelentosen csökkentik az áramot trikloridok vegyületcsoport szénhidrogének éterek, észterek alkoholok, ketonok, aminok monobromidok, dikloridok poliklórozott vegyületek (peszticidek) relatív válaszjel F, O, Cl, Br öblítogáz bevezetés öblítogáz kivezetés anód (+) 63 Ni fólia (-): 1-10 V polarizációs feszültség make up gáz dinamikus tartomány: <10 3 LOD: 0,1-10 pg Vivogáz: He (nagytisztaságú) kolonna

56 Alkalmazások Roppant széles kör: egyszeru hatékony szelektív kicsiny mintaigény sorozatelemzésre alkalmas automatizálható az elválasztás során a minta nem roncsolódik, így kapcsolt módszerekkel (MS, IR) az analízis tovább folytatható Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari KÖRNYEZETVÉDELMI 1. illékony 2. hostabilis SZÁRMAZÉKKÉPZÉS

57 NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: felületen kötött folyadék, vagy szilárd anyag (LLC, LSC) technikai kivitelezés: oszlop elúciós analízis Minta halmazállapota: folyadék nagyhatékonyságú analitikai módszer kvalitatív & kvantitatív információk összetett minták analízise a mintát alkotó komponensek szétválasztása eluens tároló gázmentesíto pumpa adagoló kolonna termosztát detektor PC

58 gázmentesíto HPLC moduláris felépítés pumpa adagoló detektor (termosztát)

59 Eluens Választási szempontok: viszkozitás: kisebb = kedvezobb (nyomás & anyagtranszport) inert: ne lépjen reakcióba a mintát alkotó komponensekkel kémiai stabilitás ne legyen korrozív ne legyen mérgezo megfelelo forráspont (buborékképzodés elkerülése) ne legyen nagyon illékony megfizetheto legyen megfelelo tisztaságban rendelkezésre álljon ne legyen detektor-aktív (kivétel: indirekt detektálás) UV-elnyelés: minél kisebb Tisztaság: HPLC grade víz & adalékok is!!!

60 Eluens két fázis közti megoszlás: komponens kölcsönhatása a két fázissal molekula & mozgófázis & állófázis polaritása hexán kloroform tetrahidrofurán acetonitril izopropanol etanol metanol víz P O L A R I T Á S polaritás változtatása: anyagi minoség változtatása különbözo oldószerek elegyítése oldószer elegyek/keverékek (2-3 féle oldószerbol): elegyedjenek egymással (homérséklet függo) oldószer erosség: szilikagélen meghatározott erosségi sorrend: eluotróp sorozat izoeluotróp elegy: oldószererosség megegyezik: k, R s : változik!!! Izokratikus elúció: állandó oldószerösszetétel Gradiens elúció: változó oldószerösszetétel Pufferek: ph beállítása: ionizálható komponensek esetén

61 Pumpák eluens áramoltatása Elvárások: nyomás (400 bar) (kisméretu részecskékkel töltött oszlop) stabil áramlási sebesség biztosítása kompatibilis legyen a különféle oldószerekkel (korrózió állóság) kis holttérfogata legyen pulzálás mentes szállítási karakterisztika klasszikus analitikai HPLC: 0,1-1,5 ml/perc (0-5 ml/perc) injekciós tu típusú pumpa

62 alternáló mozgást végzo, kis dugattyú-térfogatú pumpa (reciprocating pump) pulzálás: jelentosen csökkentheto: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás) V térfogat: µl továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása: löket hossz dugattyú sebessége ido

63 Gázmentesítok folyadékok: különbözo mennyiségben oldott gázokat tartalmaznak gázbuborékok hatásai: Pumpa: ingadozó nyomás egyenetlen szállítási térfogat mechanikai igénybevétel Detektor: ingadozó detektorjel Ultrahang: olcsó egyszeru legkevésbé hatékony Vákuum: drágább egyszeru hatékony He-purge: egyszeru hatékony megfizetheto

64 Mintaadagolás 1. a mintát pillanatszeruen kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG) minta térfogata: µl (nincs térfogatváltozás) mikroliterfecskendo: A bevitt minta térfogatát az adagolón elhelyezett hurok ( loop ) térfogata határozza meg. hatutas beméro szelep

65 Kolonnák (kromatográfiás oszlopok) szerep: ELVÁLASZTÁS LC: NP LC: normál fázisú LC (Normal Phase) RP LC: fordított fázisú LC (Reversed Phase) NPLC: állófázis polaritása > mozgó fázis polaritása (poláris állófázis & apoláris mozgófázis) RPLC: állófázis polaritása < mozgó fázis polaritása (apoláris állófázis & poláris mozgófázis) Oszlop anyaga: saválló acél üveg PEEK (poli(éter-éter-keton) Oszlop méretei: átméro: 2-5 mm hossz: 5-25 cm Töltet: reguláris szférikus Töltet: kisebb átméro nagyobb N, de nagyobb nyomás is

66 Töltetek porózus részecskék (szivacs-szeru szerkezet) átméro: 3-10 µm pórusok belsejében: diffúzió nem-porózus részecskék nincs belso felület: nincs (elhanyagolható) diffúzió: C-tag kicsi lesz átméro: 1-2 µm kicsiny retenciós térfogat: gyors kromatográfia nagy nyomás kicsiny mintakapacitás H [mm] H = A + B/u + C * u C * u H min u u [cm/s] C: anyagátadással szembeni gátlás Az állófázisban szorbeált molekuláknak idore van szükségük ahhoz, hogy az állófázisból visszajussanak a mozgófázisba.

67 Töltetek átjárható részecskék: átjárható pórusok: nm diffúziós pórusok: nm 20 µm-es részecskék kicsiny ellenállás, kedvezo tulajdonságok monolit töltet: pórusos rúd kicsiny ellenállás kedvezo tulajdonságok pellikuláris töltet: az állófázis porózus külso héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén szilikagél: (Si & O atomok háromdimenziós rácsa) legszélesebb körben alkalmazott állófázis kémiai inertség mechanikai ellenállóképesség: p max 250 bar ph stabilitás: 2< ph < 9 szerves polimer-alapú töltetek: sztirol-divinilbenzol kopolimer kevésbé nyomásturo (keresztkötések számával javítható) duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható ph stabilitás: 1< ph < 14

68 Módosított szilikagél SiO 2 OH OH OH OH OH fontosabb módosító csoportok: C18: oktadecil: C 18 H 37 C8: oktil: C 8 H 17 C4: butil: C 4 H 9 Amino: CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 Ciano: CH 2 CH 2 CH 2 CN Fenil: C 6 H 5 RPLC: C18 állófázis & metanol/víz mozgófázis NPLC: szilikagél & hexán elotét oszlop (guard column): szennyezésektol védi az analitikai oszlopot

69 Termosztát homérséklet Egyensúlyi folyamatok homérséklet függok! retenciós ido elválasztás hatékonysága eluens viszkozitása csökken: nagyobb áramlási sebesség alkalmazható: gyorsabb analízis, kisebb diffúzió elválasztás: jobb/rosszabb anyagátadás javul szabályozható homérséklet: izotermikus Homérséklet növelése: no az eluensgoznyomása (buborékképzodés) minta elbomolhat állófázis oldhatósága 5 o C- 80 o C

70 Detektorok Kolonna: idoben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által eloállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idoegység alatt bejutott mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet (destruktív) nem destruktív dinamikus tartomány lineáris tartomány érzékenység kimutatási határ meghatározási határ

71 UV-Vis spektrofotométer Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens Lambeert-Beer: A l = e l c l fényforrás rés Fényforrás: UV: deutérium lámpa Vis: volfrám lámpa monokromátor fényosztó (splitter) Detektor: fotodióda méro ág cella (küvetta) referencia ág (eluens tisztasága: UV cutoff: az a λ, ahol a tiszta oldószerre A=1, T=10 % (l=1 cm)) I 0 I I 0 I 0 leggyakrabban használt HPLC detektor 190 nm < λ < 800 nm D E T E K T O R Cella: kvarc küvetta l=5-10 mm A = lg I 0 /I

72 Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector) polikromátor fényforrás lencse cella (küvetta) diódasor Elony: különbözo hullámhosszúságon mért elnyelések egyideju mérése spektrum felvétele: minoségi információ

73 Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor fluoreszkáló anyagok detektálása rés monokromátor cella (küvetta) fényforrás monokromátor Detektor: a kibocsátott fényt méri

74 Törésmutató mérésen alapuló detektor univerzális detektor a minta és az eluens törésmutatója közti különbséget méri Diffrakciós detektor: fényelhajlás mérésen alapul rés fényforrás méro ág referencia ág detektor tükör lencse Törésmutató: homérséklet függo: TERMOSZTÁLT detektor

75 Elektrokémiai detektorok vezetoképesség mérésen alapuló detektor (IC) potenciometriás: potenciál mérésen alapul amperometriás: oxidáción/redukción alapul

76 Alkalmazások Roppant széles kör: egyszeru hatékony szelektív kicsiny mintaigény sorozatelemzésre alkalmas automatizálható az elválasztás során a minta nem roncsolódik, így kapcsolt módszerekkel (MS) az analízis tovább folytatható korlát: OLDHATÓSÁG Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari KÖRNYEZETVÉDELMI SZÁRMAZÉKKÉPZÉS: detektor-aktívvá tenni a mérendo komponenseket kromatográfiás tulajdonságok befolyásolása

77 Szuperkritikus folyadékkromatográfia Olyan elválasztási módszer, melynél a mozgófázisként használt folyadék kritikus homérséklete és nyomása fölött, de annak közvetlen közelében van. mozgófázis: szuperkritikus fluidum tulajdonságai: gáz - folyadék - 2 között nagy diffúziós együttható: gyorsabb, hatékonyabb elválasztás, mint a HPLC-nél kis viszkozitás: hosszú oszlop készítheto Technikai kivitelezés: hasonló, mint a HPLC Állófázis: HPLC Analitikai jelentosége: mérsékelt Alkalmazás: (szemi)preparatív kromatográfia

78 sík elrendezés (planáris) Papírkromatográfia hordozó: speciális papír (nagytisztaságú cellulóz) állófázis: papír vagy a felületén rögzített film Kivitelezés lépései: mintát tartalmazó oldatot felcseppentjük a papírcsík egyik végére elpárologtatjuk a minta oldószerét alkalmasan megválasztott eluensbe merítjük (futtató kád) futtatás: kapilláris hatáson alapul kifejlodik a kromatogram: a minta alkotói (térben) elválnak egymástól elohívás: alkotók megjelenítés: festés, kémiai reakciók, UV-megvilágítás mozgófázis megválasztása: HPLC minoségi értékelés: retenciós adatok (távolság mérés) mennyiségi értékelés: foltok kivágását követoen Elonyei: egyszeru olcsó

79 Vékonyrétegkromatográfia üveg- vagy muanyaglemezen, vékony rétegben elterített adszorbenst használunk szilikagél alumínium-oxid diatomaföld módosítás: felületen rögzített film Kivitelezés lépései: hasonló, mint a papírkromatográfiánál elonyei a papírkromatográfiával szemben: jobb felbontás (kevésbé terülnek el a foltok) reprodukálhatóbb analízis

80 Gélkromatográfia Gélszurés: méretkizárásos kromatográfia (size-exclusion chramotography) térhálós polimer gélek: jól definiált méretu, belso járatokkal, pórusokkal rendelkeznek nagyobb molekulák: nem férnek bele az üregekbe/járatokba: nincs visszatartás kisebb molekulák: behatolnak a járatokba: mérettol függo visszatartás a gél megfelelo megválasztása: a vizsgálható molekula méret-tartomány változtatható állófázis: agar-agar gél akril-amid alapú gélek Technikai kivitelezés: oszlop Detektor: UV-Vis, RI mozgófázis: víz THF kloroform

81 Affinitás kromatográfia az elválasztandó vegyület és a ligandum közötti specifikus biológiai kölcsönhatás képezi az elválasztás alapját szelektív specifikus antigén antitest enzim inhibitor biológiai minták tisztítása analízist megelozo mintaelokészítés

82 Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására Minta halmazállapota: folyadék nagyhatékonyságú analitikai módszer kvalitatív & kvantitatív információk összetett minták analízise a mintát alkotó komponensek szétválasztása Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélo technikai kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez

83 Állófázis: térhálósított mugyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon ioncserélo funkciós csoportok módosított szilikagél Ioncserélok: kationcserélok anioncserélok eros kation: -SO 3 H (szulfonsav) gyenge kation: -COOH Ioncserélok: eros gyenge eros anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport Kationcserélo: n RSO 3 H + M n+ (RSO 3 ) n M n+ + n H + anioncserélo: n RN(CH 3 ) 3 OH + A n- [RN(CH 3 ) 3 ] n A + n OH -

84 Ionok megkötodése függ: méret töltés homérséklet ionerosség ph Állófázis: pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés hatékonyság növelése: felületi porózus réteg: éles csúcsok (kicsiny minta kapacitás) Mozgófázis: Kationok elválasztása: eros sav híg (vizes) oldata Anionok elválasztása: eros bázis híg (vizes) oldata Detektor: vezetoképesség mérés eluens: nagy a vezetoképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetoképesség elnyomó

85 Kationcserélo analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélo szupresszor Analízis: Kationcserélo: n RSO 3 H + M n+ (RSO 3 ) n M n+ + n H + Elnyomás: H + semlegesítése n RN(CH 3 ) 3 OH + A n- + nh + [RN(CH 3 ) 3 ] n A + n H 2 O A n- : az eluens anionja az eluens anionja megkötodik és vele ekvivalens mennyiségu hidroxidion kerül az oldatba lecserélodik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is: ekvivalens mennyiségu OH - jut az oldatba vezetoképesség mérés & kationok eluens tároló pumpa adagoló analitikai kolonna ionelnyomó kolonna detektor PC ionelnyomásos IC

86 anionok elválasztása: kationcserélo szupresszor nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop): kicsiny vezetoképességu mozgófázis alkalmazása eluens tároló pumpa adagoló analitikai kolonna detektor PC egykolonnás (nem szupresszált) IC Mozgófázis: benzoesav ftálsav borkosav citromsav Detektor: vezetoképesség mérés UV-Vis eltérés a HPLC-tol: Ionokat mérünk (HPLC is) Ioncserélo oszlopokat használ (HPLC is) Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari KÖRNYEZETVÉDELMI

87 Kapilláris elektroforézis elektroforézis: valamely vezeto közegben (általában víz) elektromos erotér hatására a töltéssel rendelkezo részecskék elmozdulnak elektroforetikus elválasztás: az elválasztandó komponensek adott elektromos tér hatására kialakuló eltéro migrációs sebességén alapul elektroozmotikus áramlás: (electroosmotic flow, EOF) a folyadék elektromos tér hatására valamely töltéssel bíró felület mentén kialakuló elmozdulása üveg felület & víz: szilanol csoportok ph > 2,5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak: negatív elektród (katód) felé mozognak: folyamatos áramlás (dugószeru áramlási profil)

88

89 PC D E D K E P outlet V P inlet A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza E: elektród; K: kapilláris; D: detektor, P: puffertartó edény; PC: személyi számítógép; V: tápegység

90

91 kation semleges molekula anion µ a : látszólagos mozgékonyság µ e : effektív mozgékonyság µ EOF : elektroozmotikus áramlás Alapeset: kation: komigrál anion: kontramigrál m a = m e + m EOF

92 Áramlási profil EOF lamináris áramlás

93 A kapilláris követelmények: kémiailag és elektromosan inert hajlékony kelloen szilárd megfizetheto ne nyeljen el az UV-Vis tartományban kvarc kapilláris (poliimid bevonattal) A detektor UV-Vis fluoreszcencia vezetoképesség MS

94 UV-Vis fluoreszcencia

95 A tápegység U=5-30 kv I=3-300 µa Mintabevitel Hidrodinamikai injektálás: nyomás alkalmazása Elektrokinetikus injektálás: feszültség alkalmazása

96 Alkalmazások bármi, ami befér a kapillárisba Elonyök rövid analízis ido nagy felbontóképesség (N: ) kicsiny oldószerfelhasználás egyszeru mintaelokészítés Hátrányok: kisebb érzékenység kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák)

97 Tömegspektrometria (MS) Alapelve: a gázállapotú ionizált molekulákat, ezek töredékeit (un. fragmenseit) vagy bizonyos esetekben az atomokból képzodött ionokat tömegük alapján szétválasztja, majd mennyiségileg meghatározza 1. mintabevitel és a minta gázállapotba hozása 2. ionizáció és bizonyos esetekben fragmentáció 3. a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 4. a szétválasztott, különbözo tömegu ionok mennyiségének meghatározása A készülék felépítése: vezérlo- és adatfeldolgozó rendszer mintabevitel ionforrás analizátor detektor vákuumrendszer

98 A vákuumrendszer 1. az ionforrásban megfelelo hatékonysággal elo állíthatók legyenek az ionok 2. megfelelo hosszúságú szabad úthosszat kell biztosítani: az ionforrásban képzodött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba kb Pa vákuumszivattyú: 1. atmoszférikus nyomásról képes közvetlenül gázt elszívni (rotációs szivattyúk) 2. muködéséhez un. elovákuum megteremtése szükséges (diffúziós szivattyúk) Ionizációs módszerek lehetové teszik a különféle halmazállapotú, igen eltéro tulajdonságokkal bíró anyagféleségek ionizációját Elektronionizáció (electron impact ionization, EI) legáltalánosabban alkalmazott ionizációs technika

99 EI 1: mintabevezeto nyílás; 2: ionvisszavero lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezeto nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépo nyílás; 8: ionképzodés helye; 9: anód U=5-100 V

100 T 200 o C p atm EI elektronok U energia molekula gerjesztett molekula elektron emisszió molekulaion fragmens ionok fragmentáció: elektronok energiája (gyorsító feszültség: 70 ev) minoségi azonosítás (ujjlenyomat) általában : egyszeres pozitív ionok képzodnek negatív ionok: nagy elektronegativitású atomok vannak jelen a molekulában

101 Kémiai ionizáció (CI) a mintát az elektronforrásba történo belépése elott un. reagens gázzal hígítják nem a vizsgálandó minta lép közvetlen kölcsönhatásba az elektronokkal, hanem a hígító gáz molekulái mintát alkotó komponensek: szekunder ionizáció RH e - RH + RH + + M MH + + R protontranszfer primer-ion képzodés CH 4 + e = CH e (CH 3+ ) szekunder-ion képzodés CH 4+ + CH 4 = CH 5+ + CH 3 (CH 3+ + CH 4 = C 2 H 5+ + H 2 ) a) proton transzfer CH 5+ + MH = CH 4 + MH 2 + b) hidrogén absztrakció CH 3+ + MH = CH 4 + M + (C 2 H 5+ + MH = C 2 H 6 + M + ) c) töltésátvitel CH 4+ + MH = CH 4 + MH +

102 Kémiai ionizáció (CI) Reagens gáz: metán i-bután ammónia Ionizáció: a hígító gáz minoségétol függoen Elonyök: egyszerusíti a tömegspektrumot molekulaion tömegét adja meg [M+H] +, [M-H] -, [M+NH 4 ] +

103 Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák (atmoszférikus nyomáson muködnek) minta T elpárologtatás ionizálás kapcsolt technikák: HPLC-MS termikus ionizáció elektromos tér okozta ionizáció ionütközés okozta ionizáció gyors atom ütközési

104 Analizátorok az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása Jellemzése: 1. maximális tömegszám: amelynek vizsgálatára még alkalmas az adott analizátor 2. transzmisszió: a detektort eléro és az ionforrásban keletkezett ionok hányadosa 3. felbontás: az analizátor mekkora tömegkülönbséggel tud elválasztani két iont szektor típusú kvadrupól ioncsapdás repülési ido analizátor

105 Szektor típusú analizátorok Ionok elválasztása: Mágneses tér vagy a gyorsító feszültség változtatása ionnyaláb mágnes E= qu=zeu E kin = ½ mv 2 ½ mv 2 = zeu v = 2zeU m ionforrás detektor Lorentz-ero F L = zevb F c = mv 2 /r F L = F c mv 2 /r= zevb r = mv 2 zevb r = mv/(zeb) = (m/z) (v/eb) egyszeres fókuszálás: felbontása korlátozott kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás

106 Kvadrupólus analizátorok olcsó, egyszeruen kezelheto, stabilis, reprodukálható tömegspektrumot eredményezo analizátor 1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszurt ionok útja 3: az analizátor által átengedett ionok útja; 4: detektor

107 egymással szemben elhelyezkedo rudakat elektromosan összekötve azokra egyenés váltóáramot kapcsolva kvadrupoláris változó elektromos tér alakul ki az ionok oszcilláló mozgást végezve haladnak át oszcilláció amplitúdója függ: ion töltése ion tömege alkalmazott feszültségek Ioncsapdás analizátor: módosított kvadrupólus analizátor

108 Repülési ido analizátorok azonos kinetikus energiájú ionok sebessége vákuumban, külso elektromos vagy mágneses teret nem tartalmazó közegben, tömegük négyzetgyökével fordítva arányos ionforrás U Ionok (egyenlo mozgási energia) repülési cso (tér mentes) Kisebb tömegu ion: nagyobb sebesség v = 2 zeu m

109 Detektorok az analizátor által elválasztott, adott ido alatt becsapódott ionok számát határozza meg pontdetektor: az ionok egymást követoen érik el a detektor ugyanazon pontját Csak olyan analizátorral alkalmazható együtt, amely képes az ionokat idoben elválasztani egymástól: pl. kvadrupólus Elektronsokszorozó: 1. a fókuszált ionnyaláb egy un. konverziós dinódába ütközve onnan elektronokat lök ki 2. kilökodött elektronokat megfelelo feszültséggel gyorsítjuk 3. újabb és újabb felülettel ütköztetve megsokszorozott elektronáramot kapunk fotokonverziós detektorok: a becsapódó ionok hatására kilökodött elektronokat szcintillátor segítségével fotonokká alakítjuk, majd a kibocsátott fotonokat fotoelektronsokszorozóval elektromos jellé alakítjuk jobb hatásfok, hosszabb élettartam és kisebb karbantartási igény

110 Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidoben érik el a kiléporésnél elhelyezett detektor sort drága: magasabb árfekvésu készülékekben alkalmazzák (TOF, szektor)

111 Kapcsolt technikák valós minták: komplex, sokkomponensu rendszerek A pontos és megbízható minoségi és mennyiségi analízis elképzelhetetlen a mintát alkotó komponensek elválasztása nélkül. elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges A hagyományos kromatográfiás technikák azonban még tökéletes szeparáció esetén sem kínálnak abszolút biztonságos minoségi azonosítást. minoségi információ: csak az adott komponens retenciós viselkedése a manapság megkövetelt megbízható és reprodukálható meghatározások indokolják a tömegspektrometria és az elválasztástechnikai módszerek kombinálását

112 A következo feltételeknek kell teljesülnie ahhoz, hogy a két, meglehetosen eltéro körülmények között muködo módszert kapcsolni tudjuk egymáshoz: A kombináció ne vezessen kromatográfiás hatékonyság csökkenéshez. A kromatográfból a tömegspektrométerbe történo bevezetés során a minta alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe. A minta megfelelo mennyisége bejusson és ionizálódjon a tömegspektrométerben. A kromatográfot és az MS-t összekapcsoló un. interfész ne növelje számottevoen a háttérzajt. Az interfész legyen egyszeru felépítésu, könnyen használható, tisztítható és karbantartható valamint lehetoség szerint olcsó. Az interfész legyen kompatibilis valamennyi kromatográfiás körülménnyel (pl. vivogázok, oldószerek, áramlási sebesség, ph, homérséklet, stb.). Az interfész ne korlátozza az MS nyújtotta lehetoségeket (pl. ionizáció, vákuum, felbontóképesség, stb.). Az interfész alkalmazásával nyert eredmények reprodukálhatók legyenek.

113 HPLCMS Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák ESI (ElectroSpray Ionization)

114 ESI az oldatbeli ionok gázfázisba juttatása COULOMB FISSION ION EVAPORATION

115 APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) nem szükséges ionok jelenléte az oldatban elektromos kisülés: szekunder ionizáció

116 Interface: jet-szeparátor membrán alkalmazása GCMS kicsiny átméroju (d = 0,25 mm) kapilláris oszlopok elterjedése: interface nélküli, közvetlen csatlakoztatás 1. anyamolekula gerjesztodik 2. ionizálódik 3. fragmentáció EI fragmentáció: kötéshasadás a molekulát alkotó atomok átrendezodése tömegspektrum: m/z függvényében ábrázolt beütésszám molcsúcs: molekulaion csúcsa báziscsúcs: legintenzívebb vonal leányion: molekulaionból képzodo ion unokaion: leányionokból képzodo ion

117 relatív intenzitás m/z = 15 I r 95 m/z = 16 I r = 100 CH 4 m/z = 14 I r 20 m/z = 17 I r = 1,1 m/z

118 hexán: C 6 H 14 homológ sorozatok: 14 tömegkülönbséggel

119 3-Pentanol C 5 H 12 O M = 88,15

120 relatív intenzitás m/z = 78 I r = 100 C 6 H 6 m/z = 76 I r 5 m/z = 77 I r 15 m/z = 79 I r = 6,6

121 naftalin: C 10 H 8

122