Interferáló tényezők hatása a laboratóriumi eredmények értelmezésére

Átírás

1 Interferáló tényezők hatása a laboratóriumi eredmények értelmezésére Dr. Siska Andrea vegyész Laboratóriumi Medicina Intézet Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Klinikai Központ Zavaró tényezők A preanalitikai fázisban felismerhetők (minta színe) A beküldőtől származó információk alapján ismert A vizsgálat elvégzése után derül ki január 28. Általános ajánlások minden mintát érkezés után vizuálisan ellenőrizni kell dokumentáció kérések áttekintése után: - nem érintett vizsgálatok elvégezhetők - előkezelés - interferáló tényező által nem zavart vizsgálati módszer alkalmazása ha klinikailag releváns eltérés várható és sem előkezelés, sem metodikaváltás ezt nem tudja eliminálni, akkor a vizsgálatot nem ajánlott elvégezni, új mintát kell kérni Eredményközlés minden leleten legyen mintaleírás: rendben (appearance unremarkable), hemolizált, icterus-os, opaleszkáló, turbid/lipémiás a nem érintett vizsgálatokat külön kell jelezni zavaró tényezők sikeres eliminálása után a leleten jelenjen meg az előkezelés ténye: pl. Az erősen lipémiás mintát lipidmentesítő eljárás után mértük le. Az eredmény tájékoztató jellegű! ha az interferáló tényező nem eliminálható és a módszer nem cserélhető: a zavarja a meghatározást megjegyzés legyen a vizsgálat eredményének helyén Haemolysis Biokémiai, immunológiai, fizikai és kémiai mechanizmusok okozzák Complement-függő ~ (antitest okozza, ld. transfusio) Fizikai ~ (hypotónia kiváltotta erythrocyta degradáció, csökkent vagy emelkedett nyomás) Mechanikai hatás miatt kialakuló in-vivo ~ (katéter, szívbillentyű) In-vitro kialakuló ~ (mintavétel, szállítás, centrifugálás, hőmérséklet) Kontamináció okozta in-vitro ~ (bőrfertőtlenítőszer) 1

2 Detektálás: Vizuális megfigyelés: >300mg/l Hgb (18,8 mmol/l) szabad szemmel látható Spektrofotometriásan: bikromatikus Analitikailag: szabad Hgb mérése In-vivo? Haptoglobin Indirect bilirubin, retikulocita In-vitro? szabad Hgb és az eritocyták egyéb komponensei (K +, LDH, GOT) Haptoglobin nem változik! In-vivo hemolízis feltételezhető, ha a beteg minden mintája hemolizált, az orvost azonnal értesíteni kell (egyidejűleg, ha szükséges, ellenőrizni a szintetikus hemoglobin származékok használatának lehetőségét). Hemolízis okozta interferencia mechanizmusa: Intracelluláris komponensek koncentrációjának emelkedése az extracelluláris térben (pl. K +, LDH, GOT) Interferencia az alkalmazott analitikai módszerrel (direkt vagy indirekt módon) Hemoglobin okozta optikai interferencia Lipémia A hemolízis és az interferencia elkerülése: Dokumentálás (mindig) kiértékelés Mintavételi eszközök és eljárás standardizálása Rendszeres képzés (mintavétel) Metodikaváltás Minta-előkezelés (fehérjementesítés, molekulaszűrők stb.) Alkalmazott metodika módosítása (másodlagos hullámhossz megfelelő vakméréssel) Ultrafiltráció (multilayer film technology) Szabad szemmel látható zavarosság Tg koncentráció >300 mg/dl (>3,4 mmol/l) De: a mintában lévő lipidek típusától is függ! Okok: -Tg koncentráció növekedése a szérumban/plazmában (étkezés, lipid infúzió, lipoprotein metabolizmus zavara) -De: a metabolikus rendellenesség okozta hipertrigliceridémia nem különböztethető meg az infúzió okozta emelkedéstől, hideg agglutinációtól, monoklonális immunglobulinoktól! -A szérum centrifugálás utáni koagulációja okozhat turbiditást (heparint kapó betegtől származó minta esetén) A lipémia nem kikerülhető: diabetes mellitus, alkohol (etanol) fogyasztás, krónikus veseelégtelenség, hypothyreozis, pancreatitis, myeloma multiplex, primer biliáris cirrhosis, szisztémás lupus erythematosus, teljes parenterális táplálás, gyógyszerek (proteáz inhibitorok-hiv fertőzés, ösztrogén, szteroidok) Detektálás: Vizuális megfigyelés: szérumban, plazmában szabad szemmel látható Tg koncentráció >300 mg/dl (>3,4 mmol/l) Abszorbancia mérés a turbiditás mértékének becslésére (>600 nm) EDTA-s mintában csak rendkívül magas Tg szint (>1000 mg/l, azaz >11,3 mmol/l) okoz szabad szemmel is látható zavarosodást (hemoglobin koncentráció látszólag emelkedik a fényszórás miatt) 2

3 Lipémia okozta interferencia mechanizmusa: spektrofotometriás vizsgálat: alacsonyabb vagy magasabb lehet az eredmény a ténylegesnél (fényszórás, abszorpció) térfogat-kihasználás-hatás (depletion): alacsonyabb Na +, K + szint (lángfotometria, indirekt meghatározások) inhomogenitás fizikai-kémiai mechanizmus: lipofil összetevők kivonása a reakcióból A lipémia és a turbiditás okozta interferencia elkerülése: Vérvétel előtti előírások betartása (ld. éhgyomor, lipid infúzió) Lipoproteinek kivonása szérumból/plazmából: centrifugálás extrakció (Frigen, polietilén-glikol) Tg gazdag lipoproteinek precipitálása (polianion, - cyclodextrin) mágneses szemcsék egyéb (Freon 113, dextrán-szulfát 500 S, Aerosil 300, butanol/diizopropil-éter) optikai tisztító módszer (triton X-100) Lipoclear használata: Pontos recept Korlátozás: A LipoClear nem használható (1) lipid vizsgálathoz való tisztításra, (2) alvadási vizsgálatokra szánt plazma tisztítására, (3) monoklonális gammopátiás immunglobulinok becslésére. A LipoClearrel kezelt minta esetén kb. 0,4-0,8 g/dl fehérje vesztéssel kell számolni a lipoproteinek mintából való kivonása miatt. A foszfor szint kb. 10%-ot emelkedhet LipoClear használata után bizonyos analitikai rendszerekben. A hígítatlan mintából mért ionokat nem kell 1,2-vel szorozni. (A kapott eredményeket a hígulás miatt 1,2- vel kell szorozni, második kezelés után a szorzás 1,44- gyel történik). Kiadható paraméterek: Albumin GOT Magnézium Alk. foszfatáz GPT Karbamid Amiláz Húgysav Kálium Kálcium LDH Klór Eredménykiadás Lipoclear-es kezelés után: A fent felsorolt egyes paraméterekhez a külső megjegyzésbe: Az erősen lipémiás mintát lipidmentesítő eljárás után mértük le. Az eredmény tájékoztató jellegű! A többi kért paraméter nem adható ki, érték helyére: A lipémia zavarja a meghatározást. Centrifugálás: általában: 10 perc g szükséges chylomicronok okozta turbiditás esetén g elegendő, hatékony Ultracentrifugálás kell LD- és HD-lipoproteinek szeparáláshoz (30 perc, g) Ajánlás: Dokumentáció Átlátszó mintatartó Centrifugálás, mint alternatíva (10 perc, g) Kémiai anyagokkal történő lipidmentesítés esetén ellenőrizni: zavarja-e a mérési módszert a lipidmentesítő anyag használata Lipidmentesítő eljárás utáni eredménykiadás esetén számolni kell a hígulással is EDTA-s minta esetén: centrifugálás után a sejtmentes felülúszót pótolni azonos térfogatú izotóniás oldattal 3

4 Lipémia vizsgálatának nehézségei: Nincs egységes humán lipid standard A magas lipidtartalmú betegminta nem fagyasztható Szimuláció: parenterális táplálásban használt növényi eredetű zsír emulzióval (Intralipid) Komoly különbségek a fiziológiás mintából és a mesterségesen előállított lipémiás mintából mért eredmények között, pl. karbamid és a kálium esetén a VLDL (kicsi: nm, közepes: nm, nagy: nm) és a chylomicronok ( nm) adják a tejszerűséget, turbiditást a VLDL és chylomicron részecskék triglicerid tartalma is nagymértékben változatos, ezért csak a triglicerid direkt mérése nem mutat jó korrelációt a fényszórással IntraLipid összetétel: 1 literben van 200 ml szójabab olaj, 12 ml tojássárga foszfolipid, 22 ml glicerin és víz az IntraLipid (steril, nem pirogén zsíremulzió) más, mint a VLDL és chylomicron részecske mérete: nm (átlagosan 345 nm körüli), azaz hiányzik belőle a nagy VLDL és a magas chylomicron lipémia szimulációja: IntraLipid, vagy más szintetikus emulzió hozzáadásával a mintához de az ilyen minták viselkedése nem olyan, mint a natív mintáknak az előforduló hibák típusai: (1) interferencia a natív mintánál, de az IntraLipidesnél nem (2) interferencia a IntraLipidesnél, de a natív mintánál nem (3) mindkét típusú minta interferenciát mutat, de az interferenciák irányában, vagy mértékében eltérőek Icterus Bilirubin interferencia vizsgálata: konjugálatlan (free) bilirubin és vízoldékony ditauro-bilirubin szérumhoz való hozzáadásával Vizeletben: konjugált bilirubin jelenik meg, ha a vérben is megnőtt a szintje (proteinuriás betegeknél albuminhoz kötött bilirubin jelenhet meg a vizeletben) CSF-ben: intracelebrális vérzést követően konjugálatlan (free) formában jelenik meg (látható xanthochromia), a megnövekedett permeábilitással (blood-brain barrier) pedig albuminhoz kötött bilirubin jelenhet meg Icterus okozta interferencia mechanizmusa: spektrális interferencia: a bilirubin nm közötti magas abszorbanciája és az állandó magas háttér abszorbancia limitáló tényezők ezeken a hullámhosszakon (pl. turbidimetriás elvű analizátor esetén az AT III értékét klinikailag releváns módon megváltoztatja a 25 μmol/l-t meghaladó bilirubin koncentráció) A fehérjementesítés nélküli módosított Jaffé metodikánál a bilirubin okozta interferencia fő oka az alkalikus közegben lejátszódó bilirubin oxidáció miatti abszorbancia-csökkenés Erősen savas közegben a konjugált bilirubin abszorbanciája az UV tartomány felé tolódik, ez pedig a foszfát meghatározásban okoz interferenciát (foszfomolibdát metodika) 4

5 Detektálás és dokumentáció: Kémiai interferencia: a bilirubin interferenciával számolni kell az oxidáz/peroxidáz alapú reakciókban: a bilirubin a koncentrációjával arányosan reakcióba lép az oxidáz/peroxidáz típusú metodikákban képződő H 2 O 2 - dal, ezért a H 2 O 2 felhasználódás miatt enzimatikus eljárásoknál szisztematikusan alacsonyabb eredményeket kapunk (pl. glükóz, koleszterin, karbamid és kreatinin meghatározás) A vizuális megfigyelés gyakran nem elég szenzitív módszer a hiperbilirubinémia felismerésére, ez különösen akkor igaz, amikor a mintát egyidejűleg más anyag is pigmentálja (pl. hemoglobin vagy származékai) Gyakran a mintatartó címkéje is gátolja az alapos vizuális megfigyelést Spektorfotometriásan nagyobb pontossággal határozható meg a hiperbilirubinémia: 450 és 575 nm közötti abszorpció mérés megfelelő mintahígítással (ezt az eljárást használják újszülöttek esetén a hiperbilirubinémia direkt mérésére) Sok karotin, karotinoid fogyasztása esetén a direkt mérés felülbecslést okoz A hiperbilirubinémia nagy prevalenciája miatt (intenzív osztályos betegek, gasztroenterológiai, sebészeti, gyermek osztályok) fontos a bilirubin zavaró hatására kevésbé érzékeny metodikákat alkalmazni a laboratóriumban. A bilirubin interferencia elkerülése: Vak mérés a spektrális bilirubin interferencia eltávolítására (pl. Jaffé szerinti kinetikus kreatinin meghatározásban a módszer része a vak mérése) A párhuzamos vakmérés jobb eredményt ad azoknál a metodikáknál, ahol a reagensek egymást követően mérődnek be a küvettába A kémiai interferencia nem kerülhető el vak mérésével. A Trinder reakción alapuló H 2 O 2 képződéssel járó enzimatikus eljárások esetén K 4 [Fe(CN) 6 ] hozzáadás hatásos a bilirubin okozta interferencia eliminálásában (a Trinder reakció komponenseinek optimális koncentrációja is csökkenti a bilirubin interferenciát). Nemionos tenzidek hozzáadása szintén csökkentheti az interferenciát (pl. foszfát meghatározás foszfomolibdát módszerrel) Előkezelés (pl. bilirubin-oxidázzal kicsi a stabilitása ) Ultraszűrés centrifugálással kombinálva A szérumindex Szérumindex mérése Szemikvantitatív eljárás: icterus index haemolysis index lipaemia index (zavarosságmérés, nem a triglicerid cc-t méri!) A spektrumból számol: mintahígítástól függő faktorok Spektrum átfedések korrekciójára szolgáló faktorok (függetlenek a mintahígítástól, mert csak az abszorbanciák arányán alapulnak) Abszorbancia NADH Lipaemia Icterus Haemolysis Hullámhossz (nm) Range 1 Range 2 Range 3 5

6 Triglicerid tartalom és a L-index (adatok: Modular PPP, ) Lipémia index y = 6,0553x - 9,3925 R 2 = 0, Triglicerid tartalom (>3,4 mmol/l) a triglicerid koncentráció kevéssé korrelál a lipémia index-szel Szérumindex alkalmazása Köszönöm a figyelmet! Minden minta esetén automatikusan mérhetjük Minimális mintaigény, nincs reagensigény (fiz.só) A szérumindex-táblázat alkalmazásával lehetővé válik az interferáló tényezők objektív megítélése Az eredményeket validáló diplomások egységesen döntenek arról, hogy kiadható-e az eredmény vagy sem Az eredmények megbízhatóak a gyógyító orvos számára az interferáló tényezők esetén is 6