Claudin-1 és claudin-7 expresszió növekedése cirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában

Átírás

1 Claudin-1 és claudin-7 expresszió növekedése cirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában Dr. Kiss András 2. Pathologia Intézet Semmelweis Egyetem, Budapest 67. Pathologus Kongresszus, Keszthely 2008 október 09.

2 Sejt-sejt kapcsolatok

3 Zonula adherens g-catenin -catenin a-catenin E-cadherin P-cadherin K-cadherin camp ZO-2 ZO-3 ZO-1 RGS5 Ga 1 Tight Junction Occludin Rec? cytoskeleton actin Symplekin PKC ZO-2 ZO-3 ZO-1 AF-6 Cingulin ZO-1 CASK JAM JAM Az integráns membrán fehérjék: claudinok, occludin és a junctional adhesion molekulák (JAMs).

4 A claudinok Paracelluláris diffúzió gátlása Sejt polaritás Sejt adhézió Tight Junction integráns fehérjéi Claudin-1, 2, transzmembrán domain, 2 extracellularis hurok, nem mutatnak homológiát az occludinnal. A claudin 3, 4 a Clostridium perfringens enterotoxin receptora, citolízist okoz. (Kominsky és mtsai, Am. J. Path.,2004;2007, Michl és mtsai, Gastroenterology, 2001 ) Különböző szövetekben eltérő összetételben találhatóak meg. Az integrinekhez és a cadherinekhez hasonlóan szerepet játszhatnak a sejtosztódás szabályozásában szerep a daganatok progressziójában?

5 A claudinok dimerizációs modelljei

6 A claudinok dimerizációs modelljei s Homophilic adhesion Heterophilic adhesion Homopolymer Heteropolymer NH COOH (Furuse et al 1999, Gonzalez-Mariscal 2003)

7 Claudinok patológiás elváltozásokban A claudin-1 fehérje csökkent expressziója colorectalis carcinomában emelkedett tumor kiújulással, magasabb tumor grade-el és általában rosszabb prognózissal jár együtt. (Resnick és mtsai., Modern Pathology, 2004) A claudin-1 tútermelése és magi lokalizációja colorectalis carcinomában befolyásolhatja az E-cadherin expresszióját és a -catenin jelátviteli útvonalat (Dhawan és mtsai, J. Clin. Inv., 2005) Az emelkedett claudin-10 expresszió növeli a primer hepatocellularis carcinoma helyi kiújulásának esélyét (Cheung és mtsai, Clin. Cancer Res., 2005) A claudin 4 expressziója fokozott a differenciált és csökkent az invazív és differenciálatlan húgyhólyagrákokban. (Boireau és mtsai, Carcinogenesis, 2006) A claudin 3 és 4 fehérjék túlexpresszáltak ovarium carcinomákban, de az ovarium cystadenomákban nem. ( Rangel és mtsai, Clin. Canc. Res., 2003) Melanomában a claudin-1 fokozott expresszióját a PKC szabályozza. (Leotlela és mtsai, Oncogene, 2006) A claudin-1 a HCV co-receptora. ( Evans és mtsai, Nature, 2007) A claudin -3 és -7 máj progenitor sejt marker ( Yovchev és mtsai, Hepatology, 2007; Reid és mtsai, Stem Cell, 2006) A claudin-6 és a claudin-9 a HCV célsejtbe való bejutását elősegítik, annak ko-receptorai, míg a claudin-2, 3, 4, 7, 11, 12, 15, 17, 23 nem ko-receptorai a HCV-nek. (Zheng a., et al., J. Virol., 2007) A HCV burokfehérjéi megváltoztatják a tight junction asszociált fehérjék lokalizációját és az occludin endoplazmás reticulumban való retencióját eredményezik. (Benedicto és mtsai, Hepatology, 2008)

8 CÉLKITŰZÉSEK a claudinok expressziós mintázatának karakterizálása hepatocelluláris carcinomában a claudin expresszió vizsgálata különös tekinettel a fibrosis/cirrhosis és a hepatitis C virus (HCV) infekció jelenlétére a fenti célok elérésére normal májmintájkat (10) és hepatocelluláris carcinoma (HCC) mintékat (25) visuzgáltunk és hasonlítottunk össze a tumormentes környező Májszövettel.

9 Módszerek - Immunhisztokémia - Deparaffinálás - Antigén feltárás /mikrohullámú kezelés/ - Blokkoló szérum - Primer antitest Szubsztrát, színreakció Peroxidáz - Szekunder antitest - Avidin - Biotin - komplex - Peroxidáz reakció / DAB / - Háttérfestés / haematoxylin / Claudinok Avidin Biotin Szekunder antitest Anti-egér Anti-nyúl Primer antitest egér nyúl Blokkoló fehérje Antigén: claudin 1, 2, 3, 4, 5, 7

10 Módszerek Real Time RT-PCR High Pure RNA Paraffin kit (Roche) módszerrel RNS izolálás Dnáz emésztés RNS átírása cdns-re random hexamerrel: 1 μg teljes RNS-ből. Claudin 1, 2, 3, 4, 5, 7 mrns expressziójának relatív kvantifikációja a GAPDHhoz és ß-actinhoz képest 100 bp - 25 μl 1x BIO-RAD Sybr Green PCR Mix 300 nm primerrel - Denaturálás 2 percig 95 C - 95 C, 20 másodperc - 63 C, 30 másodperc / 40 ciklus / - 72 C, 30 másodperc - Detektálás BIO-RAD real time PCR-rel Claudin 1 = 112 bp

11 CLDN expresszió hepatocelluláris carcinomában (HCC) és cirrhosisban STATISZTIKAI ANALÍZIS: M. Pfaffl, G. W. Horgan and L. Dempfle. Realtive expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR Nucl. A.Res., 2002, 30:9 Institute of Physiology, Center of Life and Food Sciences, Technical University, Munich CSOPORTOK HCC Környező máj (HCC) cirrhosis HCV positivitás Normál máj

12 CLDN-1 Normál máj CLDN-7 Normál máj CLDN-1 cirrhosis CLDN-7 cirrhosis CLDN-1 HCC CLDN-7 HCC

13 A claudin fehérje expresszió kvantitatív vizsgálata CLDN-1 CLDN-2 CLDN-3 CLDN-4 CLDN-7 NM NL KM SL HCC nem non-cirrhotic cirrhotikus cirrhotikus cirrhotic w nem non-cirrhotic cirrhotikus SL w cirrhotikus cirrhotic SL ± a ± a ± a ± b ± b b ± ± ± ± a ± a ± a ± b ± b b ± ± ± ± a ± a ± a ± b ± b b ± ± ± ± a ± a ± a ± b ± b b ± ± ± ± a ± a ± a ± b ± b b ± ± ± A claudinok immunhisztokémiai reakcióit a normál és a tumormentes környező májszövetben mind az epeutakkal együtt, mind pedig nélkülük kvantitatív kiértékeltük. A százalékos értékeket a középérték ± standard hiba formájában fejeztük ki. CLDN=claudin; NM = normál máj; KM = a HCC körüli környező máj, HCC=hepatocellularis carcinoma. a =portális területekkel együtt; b =portális területek kivételével

14 A claudin-1 fehérje expresszió kvantitatív és összehasonlító elemzése * * 2.0 % 1.5 * * w/o portal tract portal tract HCC NL ncsl nchcc csl chcc A jelölt területet a normál májban és a tumormentes környező májban a portális traktusokkal és anélkül is lemértük. A csoportok jelölt területeinek százalékban kifejezett értékeinek statisztikai összehasonlítását a (a portális területeket is beleértve ott, ahol ez alkalmazható) a Mann-Whitney teszt segítségével végeztük. A csillagok szignifikáns különbséget jeleznek a két csoport között (p 0.05). CLDN=claudin; NL=normál máj; nckm= non-cirrhotikus környező máj; nchcc= hepatocellularis carcinoma non-cirrhotikus KM-al; ckm= cirrhotikus környező máj; chcc=hepatocellular carcinoma cirrhotikus KM-al, w/o= nélkül

15 A claudin-7 fehérje expresszió expresszió kvantitatív és összehasonlító elemzése * * * * * % w/o portal tract portal tract HCC NL ncsl nchcc csl chcc A jelölt területet a normál májban és a tumormentes környező májban a portális traktusokkal és anélkül is lemértük. A csoportok jelölt területeinek százalékban kifejezett értékeinek statisztikai összehasonlítását a (a portális területeket is beleértve ott, ahol ez alkalmazható) a Mann-Whitney teszt segítségével végeztük. A csillagok szignifikáns különbséget jeleznek a két csoport között (p 0.05). CLDN=claudin; NL=normál máj; nckm= non-cirrhotikus környező máj; nchcc= hepatocellularis carcinoma non-cirrhotikus KM-al; ckm= cirrhotikus környező máj; chcc=hepatocellularis carcinoma cirrhotikus KM-al, w/o= nélkül

16 A claudin-1, -2, -3, -4 és -7. fehérje expresszió Western blot analízise HCC-ben és a környező tumormentes májban NK NM KM1 KM2 HCC1 HCC2 CLDN-1 24 kda CLDN-2 25 kda CLDN-3 23 kda CLDN-4 22 kda CLDN-7 24 kda CLDN: claudin, NK: negatív kontroll, NM: normál máj, KM1: nem cirrhotikus környező máj, SL2: cirrhotikus környező máj, HCC1-2: hepatocellularis carcinoma

17 Claudin mrns expresszió KM HCC NM nemcirrhotikus KM cirrhotikus KM nemcirrhotikus KM cirrhotikus KM CLDN ± ± ± ± ± CLDN ± ± ± ± ± CLDN ± ± ± ± ± CLDN ± ± ± ± ± CLDN ± ± ± ± ± A relatív gén expressziót a középérték ± standard hiba értékekkel jelöltük. A caludinok relatív expresszióit a 2-ΔCt (ΔCt=a célgén Ct értéke mínusz a GAPDH és beta-actin Ct értékeinek átlaga) képlettel számoltuk minden mintára. CLDN=claudin; NM=normál máj; KM= HCC körüli tumormentes máj; HCC=hepatocellularis carcinoma.

18 Fold change A claudin mrns expresszió összehasonlító elemzése 12 mrns expresszió a normál májhoz viszonyítva claudin-1 claudin nckm ckm nchcc chcc

19 CLDN-1 CLDN-2 CLDN-3 CLDN-4 CLDN-7 HCV fertőzés és claudin fehérje expresszió NM - HCV neg KM NS NS NS NS NS NM - HCV pos KM 2.34* * p=0.042 NS NS NS p= HCV neg. KM - HCV pos KM NS NS NS NS NS NM - HCV neg HCC * * 2.93 Nincs a vírusinfekció jelenlétével összefüggő nagy változás! NS p=0.013 NS p=0.004 NS HCV neg KM - HCV neg HCC * * NS p= NS p= NS NM - HCV pos HCC 4.02* -1.86* 1.25 NA 3.48 p=0.033 p=0.023 NS NS HCV pos KM - HCV pos HCC * NA NS p< NS NS HCV neg HCC - HCV pos HCC NA 1.19 NS NS NS NS

20 Következtetések Adataink arra utalnak, hogy a cirrhosis kialakulása során és a cirrhotikus májakban kifejlődő HCC-kben egyaránt megemelkedik a claudin-1 és -7 expressziója. A claudin expressziós mintázatnak a cirrhosis progressziójában talált jellemző változása ellenére a HCV fertőzés nem gyakorolt direkt, szignifikáns hatást a claudin expresszióra. Mivel a HCV fertőzés nem változtatja meg nagymértékben a claudin expressziót, adataink szerint a HCV fertőzés indirekt módon, a cirrhosis indukcióján át vezet a claudin-1 és a claudin-7 emelkedett expressziójához. Ez a HCV fertőzés új hatásmechanizmusát veti fel, amennyiben a fertőzés következtében kialakuló cirrhosis a vírus hepatocytákba való bejutását hatékonyabbá teszi és ezáltal a fertőzés krónikussá válását segíti elő és egyben befolyásolhatja a carcinogenesist.

21 Köszönetnyilvánítás: Prof. Dr. Schaff Zsuzsa Dr. Lotz Gabor Dr. Holczbauer Agnes Dr. Tátrai Péter Dr. Kaposi-Novák Pál Dr. Batmunkh Enkhjargal Prof. Dr. Kupcsulik Péter Dr. Szíjártó Attila

22

23 A claudin fehérje expresszió expresszió kvantitatív és összehasonlító elemzése CLDN-1 CLDN-2 CLDN-3 CLDN-4 CLDN-7 NM ncsl w w/o NA 1.90 NM csl w 3.68* ** 9.25** w/o 2.84* NA 8.45** nckm ckm NM nchcc nckm nchcc NM chcc ckmchcc w 2.86** * 4.38** w/o 2.61** NA 4.46* w ** ** 2.21 w/o ** 1.15 NA 2.78 w ** ** 1.05 w/o NA 1.47 w 6.32** -1.72* 1.65 NA 5.01** w/o 6.77** -1.72* 1.73 NA 6.29** w * 1.05 NA -1.85* w/o 2.39* -2.09** 1.13 NA nchcc - chcc 2.08* NA 2.26* Immunostainings for claudins in normal and non-tumorous surrounding liver were quantified including and excluding portal tracts. Values represent the fold difference of stained area percentage in the underlined group compared to the other group. Negative values indicate decreased area positivity percentage in the underlined group. Groupwise comparison of stained area percentage was made by Mann-Whitney test. CLDN=claudin; w=calculated with portal tracts; w/o=calculated without portal tracts; NL=normal liver; ncsl= non-cirrhotic HCC surrounding liver; csl=cirrhotic HCC surrounding liver; nchcc=hepatocellular carcinoma with non-cirrhotic SL; chcc=hepatocellular carcinoma with cirrhotic SL; NA=not applicable (due to no expression of CLDN-4 in NL and SL w/o portal tract and in chcc); NS=not significant; *significant difference at the 0.05 level; **significant difference at the 0.01 level.

24 Values represent the fold change ratios of relative claudin gene expression in the underlined group compared to the other group. Relative gene expressions were calculated as 2-ΔCt (ΔCt=Ct of target gene minus the average Ct of GAPDH and beta-actin). Negative values indicate decreased claudin gene expression in the underlined group. Groupwise comparison of relative gene expression was made by Mann- Whitney test. CLDN=claudin; NL=normal liver; ncsl= non-cirrhotic HCC surrounding liver; csl=cirrhotic HCC surrounding liver; nchcc=hepatocellular carcinoma with noncirrhotic SL; chcc=hepatocellular carcinoma with cirrhotic SL; p = significance; NS = not significant; *significant difference, p A claudin mrns expresszió kvantitatív elemzése CLDN-1 CLDN-2 CLDN- 3 CLDN-4 CLDN-7 NM nckm NS NS NS NS NS NM ckm * 3.11* NS (0.059)!! NS NS p=0.045 p=0.034 nckm ckm 10.34* * 2.55* p=0.020 NS NS p=0.004 p=0.012 NM nchcc * nckmnchcc NS p=0.032 NS NS NS * NS p=0.002 NS NS NS NM chcc * NS NS NS NS p=0.018 ckm- chcc * * 1.39 nchcc - chcc NS p=0.005 NS p=0.013 NS 1.98* * p=0.027 NS NS NS p=0.027

25