Szárított élelmiszeradalékok mikrobiológiai minségének becslése közeli infravörös spektrometria felhasználásával

Átírás

1 Szárított élelmiszeradalékok mikrobiológiai minségének becslése közeli infravörös spektrometria felhasználásával Seregély Zs. a Kaffka K.J. b és Kiskó G. b a Metrika K+F Kft., H-1119 Budapest, Petzvál J. u. 25, Hungary. zsolt.seregely@metrika.hu b Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar, H-1118 Budapest, Ménesi út 45, Hungary. kkaffka@omega.kee.hu / gkisko@omega.kee.hu Bevezetés Mind a mezgazdasági, mind az élelmiszerkutatás területén a kertészeti termények penészszennyezettségének szántóföldi és a feldolgozás közbeni meghatározása mind nagyobb jelentséggel bír. A feldolgozó vagy szennyezettség mentesít kezelések és feldolgozó az él penész részleges inaktiválása technológiák során alkalmazott körülmények között nyilvánvaló. A penészek által termelt toxikus metabolitok (számos penészfaj mikotoxin termelésre képes) azonban nem feltétlenül inkativálódnak és végs fokon a jelen lehetnek a feldolgozott élelmiszerben. Ezért gomba eredet romlás és a lehetséges közegészségügyi veszélyek miatt nagy szükség van tehát olyan módszerek kidolgozására, melyek mind az életképes, mind az inaktiválódott penészgombákat, azaz a szennyez biomassza egészét képesek meghatározni, jelezve ezzel azt, hogy az élelmiszerterméket szennyezetlen magas minség anyagokból készítették, vagy sem. Az olyan módszerek, melyek alkalmasak a penészek bármely körülmény melletti felismerésére az élelmiszerben, a gomba eredet szennyezések okozta lehetséges kockázat kiértékelésében rendkívüli hasznosak lennének. Hagyományos módszerként penészek élelmiszerben történ kimutatására különböz eljárások állnak rendelkezésre. Ilyenek a tenyésztéses módszerek 1, a táptalaj vezetképességét, vagy egyéb elektromos jellemzinek változását felhasználó elektromos mérések 2 a hstabil penész összetevk, mint pl. a kitin meghatározása 3 mikroszkópos módszerek a micéliumok kimutatására 4 közvetlen epifluorescens szrtechnikák alkalmazása 5 stb. Ezek közül a módszerek közül a legtöbb ország standard módszerként a penész telepszámot és a Howard penészszámot (HMC) alkalmazza minségbiztosítási célokra. A rendelkezésre álló módszerek többségének vannak bizonyos hiányosságai. A hagyományos tenyésztéses módszerek idigényesek (idszükséglet 5-8 nap) és a hkárosodott inaktiválodott penészeket nem érzékeli. A micéliumok mikroszkópos meghatározása kis precizitású. Az ATP assay alkalmazása például a micélium és az élelmiszer elkülönítési problémái miatt nem alkalmazottak széleskören. A gomba eredet kitin meghatározásán alapuló kémiai módszerek nem teljes kören elfogadottak a penésztörzsek változó kitintartalma miatt. A HMC helyettesítésére egyébb alternatív technikákat fejlesztettek ki. Ilyen módszer az ergoszterol mennyiségi meghatározása a gomba eredet szennyezés jelzjeként Az ergoszterol tartalom meghatározását flourodensitometria alkalmazásával fejlesztették tovább 9 A penészek élelmiszerekben történ kimutatására néhány immunológiai módszert is leírtak A különböz penészek által termelt extracelluláris poliszacharidok (EPS) kimutatására enzimkötött immunoszorbent assayt (ELISA) használó serológiai módszereket fejlesztettek. A latex agglutination 445

2 446 Zs. Seregély, K.J. Kaffka and G. Kiskó érzékeny technikáját is leírták. 14,15 A különböz illékony gomba eredet metabolitok szintén a gombnövekedés indikátoraként alkalmazhatók Jonsson és munkatársai egy elektronikus orrot (különböz érzékel típusokból álló érzékelsort) alkalmaztak zab jó, penészek, gyengén vagy ersen dohos illatosztályainak becslésére 19 Egy új fluorescens lecitin vizsgálatot fejlesztettek ki paradicsomlé penésztartalmának mennyiségi meghatározására. 20 Asher jó eredményeket ért el sárga és barna árparozsda spóra, valamint barna búzarozsda estében közeli infravörös (NIR) spektroszkópi felhsználásával. 21 Davies 22 eltanulmányt végzett túlzott penésztartalmú paradicsom püré NIR monitorozására. Roberts munkatársai penész kémiai és spektrális mennyiségi meghatározásáról számoltak be szénában 23 és szennyezett árpában 24 NIR alkalmazásával. Aramaki rizsben micélium tömegét becsülte meg NIR spektroszkópiával. 25 Anyagok és módszerek A búzakorpa mintákat búzaszemek gyakorlatilag penészmentes termények közül történ körültekint kiválogatásával gyjtöttük. A gyakorlatilag penészmentes mintát, látható penészszennyezdés mentes mintaként határoztuk meg. A mintákat 1998-ban, 1999-ben é 2000ben gyjtöttük. Kísérleteink során mindhárom évbl három fajtát vizsgáltunk: Régia, Mlynské otruby és Ilona. A mintákat 30 kgy sugárdózissal sugároztuk be, mely steril minták rendelkezésre állását tette lehetvé. A paprika mintákat kiskereskedelmi üzletbl, a fekete bors mintákat a Kotanyi GmbHtl, Bécs (Ausztria) szereztük be. Kísérleteink során a következ penésztörzsek álltak rendelkezésre:: Aspergillus flavus (nonaflatoxigenic), Penicillium verrucosum (non-ochratoxigenic) and Fusarium graminearum (nonfumonisinogenic). A Szent István Egyetemen (korábbi Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest), ezeket a törzseket Czapek Dox agar (Merck ) felületén egy hétig 25 C-on tenyésztettük. A penész kultúrákat tartalmazó hígító oldatot (0.1% peptont és 0.85% NaCl-ot) pipettáztunk Czapek Dox agar felületére. A micéliumokat az agar felületérl egy kis rozsdamentes acél oltótvel steril vizes oldatba távolítottuk és keveréssel homogenizáltuk. Azt a szuszpenziót használtuk beoltáshoz. Fusarium graminearum esetében a micélium szuszpenzió homogenizálásakor apró steril gyöngyöket helyezetünk az üveg keveredénybe. A különböz minták ergoszterol tartalmának meghatározására módosított Seitz és Paukstelis 26 módszert alkalmaztunk. Az ergoszterol mennyiségi meghatározását nagy teljesítmény folyadék kromatográfiával (HPLC) 27 végeztük. Ezt a HPLC módszert eredetileg karotinoid elemzéshez fejlesztették ki, de e módszer alkalmas az ergoszterol tartalom elkülönítésére és meghatározására. A módszer pontossága (ismételhetsége) ± mg ergosterol/g alacsony ergoszterol tartalomnál (0,04 mg ergosterol/g körül) és mg ergosterol/g magas ergoszterol tartalomnál (0,6 mg ergosterol/g körül). NIR méréseink során a mintákat egy Spectralyzer (PMC type10-25, Svájc) scanning NIR spektrométer felhasználásával elemeztük. Log(1/R) spektrumokat nm hullámhossz tartományban rögzítettük 2 nm lépésközzel. Kvalitatív kiértékeléseinket Kaffka és Seregély28 nyomán a Polár Minsít Rendszer (PQS) program alkalmazásával hajtottuk végre. A minták "minségpontjait" határoztuk meg a "minségsíkon". A minségpontot a polár koordináta rendszerben ábrázolt spektrum (a spektrális pontok) középpontjaként határoztuk meg.

3 Szárított Élelmiszeradalékok Mikrobiológiai Minsége ábra A korpa minták log(1/r) spektruma a Descartes (fent) és a polár (lent) koordináta rendszerben, piros: kontrol, kék: kétszeres ergoszterol tartalom 2. ábra A korpa minták 2. derivált spektruma a Descartes (fent) és a polár (lent) koordináta rendszerben. Az optmális hullámhossz tartomány nm, piros: kontrol, kék: kétszeres ergoszterol tartalom Az els ábra a legnagyobb és a legkisebb penész-szennyezettség korpa minta log(1/r) spektrumait szemlélteti a Descartes (fent) és a polár (lent) koordináta rendszerben. Bár a polár spektrum szokatlannak tnhet, a két ábrázolásmód egymással teljesen egyenérték.. Néha elfordulhat, hogy a spektrumot a polár koordinátarendszerben ábrázolva ugyanazon összetev abszorpciós csúcsai 180 ra kerülnek egymástól, gyengítve egymás, a minségpontok elhelyezkedésére gyakorolt hatását. Ezt a problémát az ún. hullámhossztartomány optimizálás bevezetésével oldottuk meg. A hullámhossztartomány optimizálás célja azon hullámhossztartomány (spektrumrészlet) meghatározása, amely a két minta közötti legjobb elkülönülést biztosítja, a minták minségpontjainak alapján. A legjobb elkülönítés meghatározására három kifejezést ismertettünk. Az optimum egy lehetséges feltétele az abszolút távolság, a normalizált távolság, vagy az érzékenység maximuma. A normalizált távolság maximális értéke 1, míg az érzékenység értéke azt mutatja meg, hogy mennyivel nagyobb a klaszterközéppontok közötti távolság szórásaik összegénél. Az elz kifejezések értékének kiszámításával az osztályozás minsége számszeren is kifejezhet, lehetvé téve a különböz osztályozó modellek eredményeinek összehasonlítását. Eredmények és értékelésük Mieltt a mintákat a fenti módszerekkel minsítettük számos, a NIR spektroszkópia területén általánosan használt eltranszformációs eljárást (simítás, deriválás, MSC, stb.) alkalmaztunk a zaj, részecske méret hatás, stb. kiküszöbölésére. Ezen eljárások a PQS elkülönít hatékonyságára, ebben az alkalmazásban kifejtett hatását a maximális érzékenység értékeinek összehasonlításával vizsgáltuk. A fenti eltranszformációkat követen futtatott hullámhossz tartomány optimizálás eredményeit (az optimális hullámhossz tartományok és a vonatkozó érzékenység értékek a két széls szennyezettségi szint között) az 1. táblázat foglalja össze.

4 448 Zs. Seregély, K.J. Kaffka and G. Kiskó 1. Táblázat Az ILONA, REGIA és MLYNSKE búzafajtákból elállított, ASPERGILLUS flavus 301, PENICILLIUM verrucosum 499 és FUSARIUM graminearum 457 penésztörzsekkel szennyezett korpa minták hullámhossztartomány optimizálási eredményei, a log(1/r) spektrumokra alkalmazott elkezelések hatásainak összehasonlításával (a táblázat minden cellájában fent: optimális hullámhossz-tartomány, lent: érzékenység) A 2. ábra a legkisebb és a legnagyobb penész-szennyezettség korpa minták ismételt méréseinek 2. derivált spektrumait mutatja be a Descartes (fent ) és a polár (lent) koordináta rendszerben.

5 Szárított Élelmiszeradalékok Mikrobiológiai Minsége 449 A számított optimális hullámhossz tartomány nm. Ezt a tartományt a fels ábrán szaggatott vonal határolja, míg a polár diagram kizárólag e kijelölt tartományt ábrázolja. E spektrumok középpontjait (minségpontjait) a 3. ábra fels fele mutatja be. Mint látható a mintacsoportok közötti távolság nagy szórásaikhoz hasonlítva. A 3. ábra alsó felén a két széls szennyezettségi szint közötti penésztartalmú minták minségpontjainak elhelyezkedése látható ugyanazon hullámhossz tartomány felhasználásával ugyanazon a minségsíkon. A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl (0 50%-ig 5% -os lépésközzel, c: 0%, 1: 5%,...10: 50 %, 11: 100% relatív penésztartalom). Mint látható a közbens minták pontjai az optmizálásban résztvev minták között megfelel sorrendben helyezkednek el. 3. ábra A legnagyobb és a legkisebb penészszennyezettség korpa minták 2. derivált spektrumainak optimális tartományából számított minségpontjai. (fent). A széls szennyezettségi szintek közötti penésztartalmú minták minségpontjai (lent). A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl. 4. ábra A 2000-ben betakarított kontrol- és a Fusarium-mal különböz mértékben szennyezett minták minségpontjai közötti polár távolságok az ergoszterol tartalom függvényében. (fent). Az 1999-ben betakarított kontrol- és a Fusariummal, Aspergillus-szal, Pennicillium-mal különböz mértékben szennyezett minták minségpontjai közötti polár távolságok az ergoszterol tartalom függvényében. (lent). A 4. ábra fels része a 2000-ben betakarított kontrol- és a Fusarium-mal különböz mértékben szennyezett minták minségpontjai közötti polár távolságokat mutatja be az ergoszterol tartalom függvényében. Az ábra alsó fele a 1999-ben betakarított kontrol- és a Fusarium-mal, Aspergillus-szal, Pennicillium-mal különböz mértékben szennyezett minták minségpontjai közötti polár távolságokat szemlélteti az ergoszterol tartalom függvényében. A 4. ábra segítségével a penésznövekedés által

6 450 Zs. Seregély, K.J. Kaffka and G. Kiskó okozott változásokban fennálló tendencia figyelhet meg, illetve hasonlítható össze a vizsgált penésztörzsek között. Mint látható a Penicillium növekedésének van a polár spektrumok középpont eltolódásában jelentkez legérzékenyebben detektálható hatása.. 5. ábra A Pennicillium-mal szennyezet pirospaprika minták minségpontjai a két széls szennyezési szint között. A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl. Az optimális hullámhossz tartomány: nm Figure 6. A Pennicillium-mal szennyezet fekete bors minták minségpontjai a két széls szennyezési szint között. A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl. Az optimális hullámhossz tartomány: nm Az 5. és a 6. ábrákon Pennicillium-mal különböz mértékben szennyezett pirospaprika és a feketebors minták minségpontjai láthatók optimális hullámhossz tartományaikban a PQS felhasználásával. Következtetések A penészszennyezettség a korpa termékek egyik legfontosabb mikrobiológiai minségi jellemzje. A penészek különböz toxikus metabolitokat termelhetnek, melyeket a feldolgozó technológiák nem távolítják el, inaktiválják, miközben az él biomasszát drasztikusan csökkentik. Ezért rendkívül fontos az mind él és a nem él penész biomassza együttes detektálása. A rendelkezésre álló mikroszkopikus, immunológiai és kémiai módszerek lassúak, drágák és pontatlanok. A NIR spektroszkópia - új távlatokat nyitva a termékek minsítésére és azonosítására közeli infravörös spektrumaik felhasználásával gyors, pontos és olcsó módszert kínáló PQS alkalmazására - roncsolásmentes, reagenst nem igényl módszert nyújt e célra. Köszönetnyílvánítás A szerzk szeretnék kifejezni öszinte köszönetüket Vydrany Taraslovakianak (Szlovákia), a Szlovák Agrártudományi Egyetemnek, Nyitra (Szlovákia), a Kotanyi GmbH, Bécs (Ausztria) és a the BundesforschungSanstalt für Ernahrung, Karlsruhe (Németország) szíves segítségükért, hogy a a különböz mintákat, azok analitikai adatait, a penész törzseket a szerzk rendelkezésére bocsátották. Munkánkat támogatta az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA) No: T és No: T és az EU INCO Copernicus project ERB IC15-CT Irodalom 1. L.R. Beuchat, B.V. Nail, R.E. Brackett and T.L. Fox, J. Food Prot. 54(6), 443 (1991).

7 Szárított Élelmiszeradalékok Mikrobiológiai Minsége I.A. Watson-Craik, K.E. Aidoo, and J.G. Anderson, Food Microbiol. 7, 129 (1990). 3. J.P. Ride, and R.B. Drysdale, Physiol. Plant. Pathol. 1, 409 (1971). 4. P. Blaser, Zbl. Bakt. Hyg. 166, 45 (1978). 5. G.L. Pettipher, R.A. Williems and G.S. Gutteridge, Lett. Appl. Micribiol. 1, 49 (1985). 6. P. Bertoni, G.P. Ghiretti, L. Sandei, F. Strina and C. Leoni, Ind. Conserve 69(1), 18 (1994). 7. P. Battalini, G. Chiusa, C. Cervi, M. Trevisan and C. Ghebbioni, Ital. J. Food Sci. 4, 283 (1996). 8. H. Gourama and L.B. Bullerman, Lebensm. Wiss. u.-technol. 28, 185 (1995). 9. J.D. Bailly, P. Le Bars, A. Pietri, G. Benard and J. Le Bars, J. Food Prot. 62(6), 686 (1999). 10. S. Notermans, C.J. Heuvelman, H.P. Van Egmond, W.E. Paulusch and J.R. Besling, J. Food Prot. 49, 786 (1986). 11. H.H. Lin, R.M. Lister and M.A. Cousin, J. Food Sci. 51, 180 (1986). 12. H.H. Lin and M.A. Cousin, J. Food Sci. 52, 1089 (1987). 13. G.J. Tsai and M.A. Cousin, J. Dairy Sci. 73, 3366 (1990). 14. H.J. Kamphuis, S. Notermans, G.H. Veeneman, J.H. Van Bomm and F.M. Rombouts, J. Food Prot. 52, 244 (1989).o 15. S. Notermans and H. Kamphuis, Food Agr. Imm. 2, 37 (1990). 16. T. Börjesson, U. Stöllman and J. Schnürer, Appl. Environ. Microbiol. 56(12), 3705 (1990). 17. T, Börjesson, U. Stöllman and J. Schnürer, Appl. Environ. Microbiol. 58(8), 2599 (1992). 18. H. Jelen and E. Wasowicz, Food Rev. Int. 14(4), 391 (1998). 19. A. Jonsson, F. Winquist, J. Schnürer, H. Sundgren and I. Lundström, Int. J. Food Microbiol. 35, 187 (1997). 20. S.J. Potts, D.C. Slaughter and J.E. Thompson, J. Food Sci. 65(2), 346 (2000). 21. M.J.C. Asher, I.A. Cowe, C. E. Thomas and D.C. Cuthbertson, Plant Pathol. 31, 363 (1982). 22. A.M.C. Davies, C. Dennis, A. Grant, M.N. Hall and A. Robertson, J. Sci. Food Agric. 39, 349 (1987). 23. C.A. Roberts, K.J. Moore, D.W. Graffis, R.P. Walgenbach and H.W. Kirby, J. Dairy Sci. 70, 2560 (1987). 24. C.A. Roberts, R.R. Marquardt, A.A. Frohlich, R.L. McGraw, R.G. Rotter and J.C. Henning, Cereal Chem. 68(3), 272 (1991). 25. I. Aramaki, K. Fukuda, T. Hashimoto, T. Ishikawa and Y. Kizaki, J. Soc. Ferment. Bioeng. 73, 33 (1995). 26. L.M. Seitz and J.V. Paukstelis, J. Agric. Food Chem. 25, (1977). 27. P.A. Biacs and H.G. Daood, J. Plant Physiol. 143, 520 (1994). 28. K.J. Kaffka and Zs. Seregély, Acta Alimentaria 31, 3 (2002).