DOKTORI (Ph. D.) ÉRTEKEZÉS CSEH ESZTER PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR KESZTHELY

Átírás

1 DOKTORI (Ph. D.) ÉRTEKEZÉS CSEH ESZTER PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR KESZTHELY 2012

2 Doktori (Ph. D.) értekezés Szılıvírusok elıfordulása Magyarországon, valamint a hazai Grapevine leafroll- associated virus 1 és 3 izolátumok molekuláris vizsgálata Cseh Eszter Okleveles növényorvos Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskola Pannon Egyetem Georgikon Kar Témavezetık Dr. Gáborjányi Richard professor emeritus Dr. Takács András Péter egyetemi docens Keszthely 2012

3 SZİLİVÍRUSOK ELİFORDULÁSA MAGYARORSZÁGON, VALAMINT A HAZAI GRAPEVINE LEAFROLL- ASSOCIATED VIRUS 1 ÉS 3 IZOLÁTUMOK MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATA Értekezés doktori (Ph. D.) fokozat elnyerése érdekében Írta: Cseh Eszter Készült a Pannon Egyetem Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskolája keretében Témavezetık: Dr. Gáborjányi Richard Elfogadásra javaslom (igen / nem) Dr Takács András Péter Elfogadásra javaslom (igen / nem) A jelölt a doktori szigorlaton...%-ot ért el, Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem. Bíráló neve: igen /nem. A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...%-ot ért el. Keszthely,. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minısítése... Az EDHT elnöke

4 Tartalomjegyzék Rövidítések... 6 Kivonat... 8 Abstract Zusammenfassung Bevezetés és célkitőzés Irodalmi áttekintés A magyarországi szılıvirológiai kutatások történeti áttekintése A Magyarországon elıforduló szılı vírusbetegségek és kórokozóinak áttekintése Szılı korai vírusos leromlás Grapevine fanleaf virus - Szılı fertızı leromlás vírus (GFLV) Arabis mosaic virus - Arabis mozaik vírus (ArMV) Grapevine chrome mosaic virus - Szılı krómmozaik vírus (GCMV) Tomato black ring virus - Paradicsom fekete győrős vírus (TBRV) Grapevine Bulgarian latent virus - Szılı bolgár látens vírus (GBLV) Levélsodródás tünetcsoport Grapevine leafroll-associated virus 1 - Szılı levélsodródás vírus-1 (GLRaV-1) Grapevine leafroll-associated virus 2 - Szılı levélsodródás vírus-2 (GLRaV-2) Grapevine leafroll-associated virus 3 - Szılı levélsodródás vírus-3 (GLRaV-3) Grapevine leafroll-associated virus 4, 5, 6, 7 - Szılı levélsodródás vírus -4, -5, -6,-7 (GLRaV-4, -5, -6; -7) A 70 kda nagyságú hısokk fehérje homológ (HSP70h) jellemzése Látens foltosság Grapevine fleck virus - Szılı foltosodás vírus (GFkV) Szılı faszöveti barázdáltság Rupestris stem pitting-associated virus - Rupestris faszöveti barázdáltság vírus (RSPaV) Grapevine virus A - Szılı A vírus (GVA) Grapevine virus B - Szılı B vírus (GVB) Szılı vonalas és győrős mintázottság Alfalfa mosaic virus - Lucerna mozaik virus (AMV) Szılı vonalas mintázottság Grapevine line pattern virus - Szılı vonalas mintázottság vírus (GLPV) Vírusszerő betegségek, még pontosan nem azonosított kórokozók Szılı enáció Szılı érnekrózis Szılı érmenti mozaik A vírusrezisztencia kialakításának lehetıségei a Vitis fajokban Anyagok és módszerek

5 3.1. A mintavételezés és a lágyszárú bioteszt módszertana Növényi minta győjtése Lágyszárú bioteszt Szerológiai módszer Molekuláris módszerek Össznukleinsav kivonás Polimeráz láncreakció Gélelektroforézis A PCR termék izolálása gélbıl Ligálás és transzformálás A plazmid tisztítása és az inzert ellenırzése A vírusgenomról készült cdns nukleotid szekvenciájának meghatározása A nukleotid és aminosav szekvenciák vizsgálata Statisztikai analízis Közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levélminta vizsgálata Eredmények Mintavételezés és lágyszárú bioteszt eredményei Tünettani vizsgálat eredményei Lágyszárú bioteszt eredménye Szerológiai vizsgálatok eredményei Molekuláris vizsgálat eredményei A közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levélminta vizsgálatának eredménye Következtetések, javaslatok Összefoglalás Új tudományos eredmények New results Irodalomjegyzék Köszönetnyilvánítás Publikációk, elıadások Melléklet

6 Rövidítések AMV: Alfalfa mosaic virus Lucerna mozaik vírus ArMV: Arabis mosaic virus - Arabis mozaik vírus Bp: basepair- bázispár CLRV: Cherry leafroll virus - Cseresznye levélsodródás vírus CP: coat protein - köpenyfehérje CPm1: minor coat protein 1. copy - a köpenyfehérje kisebb molekulatömegő 1. másolata CPm2: minor coat protein 2. copy - a köpenyfehérje kisebb molekulatömegő 2. másolata DAS-ELISA: Double Antibody Sandwitch Enzime Linked Immunosorbent Assay - Kettıs ellenanyag szendvics enzimhez kötött immunválasz eljárás EDTA: Ethylenediaminetetraacetic-acid Etilén-diamin-tetraecetsav GBLV: Grapevine bulgarian latent virus - Szılı bulgáriai látens vírus GCMV: Grapevine chrome mosaic virus - Szılı króm mozaik vírus GFkV: Grapevine fleck virus - Szılı foltosodás vírus GFLV: Grapevine fanleaf virus - Szılı fertızı leromlás vírus GLPV: Grapevine line pattern virus - Szılı vonalas mintázottság vírus GLRaV 1, 2, 3, 4, 5, 7: Grapevine leafroll-associated virus 1, 2, 3, 4, 5, 7 - Szılı levélsodródás vírusok 1,-2,-3,-4,-5,-7 csoportjai GRSPaV: Grapevine rupestris stem pitting associated virus Szılı rupestris faszöveti barázdáltság vírus GYSVd-1: Grapevine yellow speckle viroid-1 - Szılı sárga foltosság viroid-1 GVB: Grapevine virus B - Szılı B vírus GVA: Grapevine virus A - Szılı A vírus GVC: Grapevine virus C Szılı C vírus HEL: helicase - helikáz enzim HP: Homing protein - önvezérlı fehérje HSP70h: 70 kda heat shock homologue protein - 70 kda hısokk fehérje homológ HSP90h: 90 kda heat shock homologue protein - 90 kda hısokk fehérje homológ IPTG: isopropyl- beta- D- thio- galactoside izopropil- beta- D- tio- galaktozid Kb: kilobase - kilobázis LB: Luria- Bertani medium Luria- Bertani táptalaj MET: methyltransferase - metiltranszferáz enzim 6

7 M-MuLV: Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase - Moloney Murine Leukemia Virus reverz transzkriptáz enzim NaOH: Sodium- hydroxide Nátrium hidroxid ORF: Open reading frame Nyílt leolvasási szakasz P30: P30 like protein - p30 szerő fehérje PEG: polyethylene glycol - polietilén-glikol P-PRO: papain like protease - papain szerő proteolitikus fehérje RBDV: Raspberry bushy dwarf virus - Málna bokros törpülés vírus RdRp: RNA dependent RNA polymerase - RNS függı RNS polimeráz enzim RpRSV: Raspberry ringspot virus - Málna győrősfoltosság vírus RSPaV-1: Rupestris stem pitting-associated virus 1 - Szılı faszöveti barázdáltság vírus RT-PCR: reverse transcription - polymerase chain reaction reverz transzkripciós polimerizáción alapuló láncreakció SDS: sodium- dodecil- sulphate nátrium- dodecil- szulfát sgrns: szubgenomi RNS SLRSV: Strawberry latent ringspot virus - Szamóca látens győrősfoltosság vírus TBE: Tris- borate- EDTA buffer Tris-borát- EDTA puffer TBRV: Tomato blackring virus - Paradicsom fekete győrős vírus TEM: transmission electron microscopy - transzmissziós elektron-mikroszkópia TGB: triple gene block - hármas génblokk TRIS: Tris-hydroxymethyl-aminomethane Tris- hidroximetil- aminometán TRIS-HCl: Tris-hydroxymethyl-aminomethane hidrochlorid Trisz- amino metánhidroklorid TRSV: Tobacco ringspot virus - Dohány győrősfoltosság vírus TSWV: Tomato spotted wilt virus - Paradicsom bronzfoltosság vírus ToRSV: Tomato ringspot virus - Paradicsom győrősfoltosság vírus X-Gal: 5-bromo- 4 chloro- 3- indolyly- beta- D- galactoside 5-bromo- 4 kloro- 3 indolilbeta- D- galaktozid VPg: virus genome linked protein - vírus genomhoz kötött fehérje 7

8 Kivonat Szılıvírusok elıfordulása Magyarországon, valamint a hazai Grapevine leafroll- associated virus 1 és 3 izolátumok molekuláris vizsgálata A disszertáció a Magyarországon eddig leírt szılıvírusok molekuláris vizsgálati eredmények alapján történı új rendszerezésének bemutatásával, a hazánkban elıforduló vírusok termıültetvényekben való elterjedésének vizsgálatával, valamint egy szılı levélsodródás 1 vírus (Grapevine leafroll-associated virus 1, GLRaV-1) és négy szılı levélsodródás 3 vírus (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3) hazai izolátum 70 kda nagyságú hısokk fehérje homológ (HSP70) gén szakaszának molekuláris jellemzésével, aminosav sorrendjének meghatározásával és külföldi izolátumok genetikai összehasonlításával foglalkozik. A és között 17 borvidék 31 termıültetvényét érintı virológiai vizsgálata során a szimptomatológailag fertızöttnek ítélt tıkékrıl 277 levélminta begyőjtésére, majd DAS-ELISA módszerrel vírusok kimutatására került sor. Megállapítást nyert, hogy a szerológia vizsgálat sokkal kevesebb, 76 mintában adott a vizsgált vírusok közül kilencre pozitív eredményt, mint az a tapasztalt tünetek alapján feltételezhetı volt. A korábban jelentısnek tartott nepovírusok, elsısorban szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV), arabis mozaik vírus (Arabis mosaic virus, ArMV), paradicsom fekete győrős vírus (Tomato black ring virus, TBRV), szılı króm mozaik vírus (Grapevine chrome mosaic virus, GCMV) egyenként kisebb arányban voltak jelen, de együtt hasonló arányt képviseltek, mint a szılı levélsodródás 1, 2 és 3 (Grapevine leafroll associated virus 1, 2, 3, GLRaV 1, 2, 3) szerológiai csoportok. Továbbá nagyarányú fertızöttség volt tapasztalható szılı foltosodás vírus (Grapevine fleck virus, GFkV) esetében. Jelenléte az eredmények alapján az ország észak-keleti részén és Közép- illetve Nyugat Dunántúlon volt kimutatható elsısorban. Tizennégy minta esetében két-két vírus együttes jelenléte igazolódott. A vizsgálat eredményeibıl feltételezhetı, hogy más kórokozók pl. fitoplazma, vagy anyagcserezavarok, esetleg tápanyaghiány is szerepet játszhat a vírusfertızésre hasonlító tünetek kialakulásában. A munka további részében molekuláris (RT-PCR) vizsgálat tárgyát képezte egy GLRaV-1, és négy GLRaV-3 hazai izolátum. A vizsgálathoz használt, a HSP70-es génszakasz 500 bp hosszúságú szekvenciájának kimutatására alkalmas primerek tervezésének 8

9 alapjai GLRaV-1 esetében az AF génbanki számú szekvencia, a GLRaV-3 esetében pedig az AF nyilvántartási számú NY1 izolátum szekvencia voltak. Az így nyert szekvenciák génbanki adatok alapján összevetésre kerültek külföldi izolátumokkal. Az elkészített dendrogrammokból látható, hogy a korábban GLRaV3 esetében öt csoportra osztott izolátumok közé beilleszthetık a magyarországi izolátumok. A 3.5, a 2.2 és a 4.2-es izolátumok a 2. számú csoportba, a 1.4-es izolátum a 4. számú csoportba tartoznak. A es GLRaV-1 izolátum a dendrogram szerint az E jelzéső csoportba tartozik. Az izolátumok szekvencia adatai HE HE nyilvántartási számokkal elsıként kerültek be a Génbankba a magyarországi szılı levélsodródás vírus izolátumok közül. 9

10 Abstract Occurrence of grapevine viruses in Hungary and molecular studies of some Hungarian Grapevine leafroll- associated virus 1 and 3 isolates The task of this work was to survey the occurrence of grapevine viruses in Hungarian vineyards, its classification on recent molecular base. Further aim was the characterization and sequencing the HSP70h gene of one Grapevine leafroll- associated virus 1 (GLRaV-1) and three Grapevine leafroll- associated virus 3 (GLRaV-3) isolates and their comparison with other isolates, found in gene bank of National Centre for Biotechnology Information (NCBI). The first aim of the present study was the examination of frequency of virus infection in thirty one Hungarian vineyards. Symptoms bearing leaf samples were collected from seventeen wine growing regions from to Among 277 samples, seventy- six gave positive results in the serological tests. These numbers were much lower, than it might be supposed on the basis of symptoms. Among the Nepovirus group four viruses could be detected, but the occurrence of Grapevine fanleaf virus, Arabis mosaic virus, Tomato black ring virus and Grapevine chrome mosaic virus were not so frequent, than it was thought earlier. The ratio of the Grapevine leafroll- associated virus 1, -2 and -3 was similar, as in case of Nepoviruses. High infection of Grapevine fleck virus was detected. This virus was mostly present in the North-East part of Hungary and in the Middle-West part of Transdanubian region. Complex infections were found in fifteen samples. These results indicate that other pathogens can also induce similar symptoms, like phytoplasmas, other viruses or deficient of nutrition and disorders of plant metabolism. The second aim was to characterize one GLRaV-1 and three GLRaV-3 isolates from the earlier collected and serological positive samples by molecular ways. Five hundred bp fragments were encompassed and purified in case of both viruses 70 kda heat shock homologue protein (HSP70h) genes. The primer pairs were designed on the bases of nucleic sequence of isolate GLRaV-3 NY1 (Gene Bank accession number AF037268) and GLRaV-1 according the Gene Bank accession number AF The molecular data were run in a phylogenetic analysis in which the HSP70h genes of a large number of isolates from elsewhere in the world. The phylogenetic trees showed that the four Hungarian isolates 2.2, 3.5 and 4.2 isolates could be inserted into the earlier classified five 10

11 groups of foreign GLRaV-3 isolates, into the group Nr. 2., but the isolate 1.4 belonged to the group Nr. 4. The GLRaV isolate could be classified into the earlier created group E. These sequence data of Hungarian Grapevine leafroll-associated virus isolates have been registered in the Gene Bank, under accession numbers of HE794021, HE794022, HE794023, HE and HE

12 Zusammenfassung Das Vorkommnis der Rebenviren in Ungarn und molekulare Untersuchungen einiger ungarischer Grapevine leafroll- associated virus 1 und 3 Isolaten Die Dissertation beschäftigt sich mit der Vorstellung des neuen Systems der Viren und Viruskrankheiten der Rebe in Ungarn. Weitere Zielsetzung war die molekulare Charakteristik eines Abschnittes des Genes HSP70h einer Grapevine leafroll- associated virus 1 (GLRaV-1) und vier Grapevine leafroll- associated virus 3 (GLRaV-3) aus Ungarn, sowie die Bestimmung der Aminosäurenreihenfolge und der Vergleich mit ausländischen Isolationen. Zweihundertsiebenundsiebzig Blattmuster wurden zwischen 2007 und 2010 gesammelt, die nach Fachliteratur symptomatisch vorkommen haben. Diese Muster stammen von dreißig Weintraubenplantagen des siebzehn Weingebietes. Die Viren wurden serologisch, mit der ELISA Methode untersucht. Nach den Ergebnissen ist festzustellen, dass nur in sechsundsiebzig Mustern Viren gefunden wurden und damit weniger Virusinfektion als vermutet, verglichen mit den Symptomen. Die früher bedeutenden Nepoviren, sowie Grapevine fanleaf virus, Arabis mosaic virus, Tomato blackring virus und Grapevine chrome mosaic virus, sind einzeln im Verhältnis weniger als früher, aber zusammen sind diese vier Viren soviel wie die GLRaV1-3 serologische Gruppe. Großzügige Grapevine fleck virus Infektionen konnten auch in Erfahrung gebracht werden. Dieser Virus ist konzentriert auf dem nordöstlichen Teil des Landes und im mittelwestlichen Transdanubien gefunden worden. Im Fall von fünfzehn Mustern sind gleich zwei Viren gleichzeitig anwesend. Nach den Ergebnissen zu urteilen, können die Virusinfektion ähnliche Symptome anderer Krankheitserreger, wie z.b. Phytoplasmen, anderer Viren, eventuell Stoffwechselstörungen oder Nährstoffmangel verursachen. Der andere Teil der Arbeit hat molekulare mit Polymerasenkettenreaktion Methode einer gesammelten GLRaV-1 und vier GLRaV-3 Isolationen gebildet. Ein 500 bp langer Genabschnitt der beiden Viren konnte hervorgehoben und vermehrt werden. Primere haben zu der Untersuchung nach bei GLRaV-1 unter der Datenbank Registernummer AF Sequenz, bei GLRaV-3 unter Nummer AF geplant werden. Die Sequenzen sind danach 12

13 mit der Datenbank NCBI verglichen und ausländische Isolationen sowie phylogenetische Bäume konstruiert worden. Im Fall der GLRaV-3 Isolate konnten die ungarischen Daten in die früher in fünf aufgeteilten Gruppen angepasst werden. Die Isolaten 3.5, 2.2 und 4.2 gehen in die zweite Gruppe, aber die Isolate CSE.1.4 wurde der vierten Gruppe zugeordnet. Nach dem Ergebnis und der phylogenetischen Analyse nach zu urteilen, gehört die GLRaV-1 und die Isolation in die sogenannten Gruppe E. Diese Sequenzdaten von Ungarn werden vorerst in der internationalen Datenbank unter Registernummern HE794021, HE794022, HE794023, HE und HE eingegeben. 13

14 1. Bevezetés és célkitőzés A vírusmentes szılı szaporítóanyag használata alapvetıen fontos tényezı a megfelelı termésmennyiség és minıség elérése érdekében. A vírusbetegségek gazdasági következményei: a fokozott tıkeleromlás és elhalás, a hozamok csökkenése és a minıség romlása, a tıkék produktív idıszakának megrövidülése, az oltványkészítés eredményességének csökkenése, a szaporítóanyag gyökeresedı képességének romlása, a beteg tıkék környezeti tényezıkkel szembeni ellenálló képességének csökkenése (Lehoczky, 1965). Az elmúlt két évtizedben több vírusbetegség leírására és a kórokozók hagyományos virológiai módszerekkel történt azonosítására is sor került. A kórokozók rendszertani megítélésében történt változások ugyanakkor számos félreértésre is alapot adtak. Célszerő volt ezért a hazai eredményeket egységes rendszerbe foglalni és megemlíteni azokat a kórokozókat is, amelyek rövid idın belül megjelenhetnek Magyarországon. Az utóbbi 50 évben jelentıs eredmények születtek a szılıvírusok szabadföldi körülmények között történı kutatásában. Ennek alapján azonosították a kórokozókat és alakították ki a szaporítóanyagok vírusfertızöttségét ellenırzı programot. Hazánkban ez idáig a szılırıl 15 vírusbetegséget írtak le és rendeltek hozzá kórokozót (Lázár, 1996). A vizsgálatokat hagyományosnak tekinthetı lágyszárú és fás szárú teszteléssel végezték, valamint Lehoczky János által elıállított antiszérumok segítségével szerológiai módszert is alkalmaztak. Napjainkban az országok közötti kereskedelem és szaporítóanyag csere miatt fennáll a veszélye Magyarországon eddig még le nem írt, új kórokozók behurcolásának. Indokolttá vált az elızetes felmérések adatai alapján vírusizolátumok győjtése, génbankban való elhelyezése a további molekuláris vizsgálatok elvégzéséhez. A kimutatási módszerek fejlıdésével elıtérbe kerültek a molekuláris módszerek. Elınyük, hogy kisebb víruskoncentrációnál is megbízhatóan alkalmazhatók, olyan vírusok kimutatására is használhatók, amelyek esetében nem áll rendelkezésre antiszérum. Segítségükkel, sokkal pontosabb képet kaphatunk a vírusgenom szerkezetérıl, tulajdonságairól, a kódolt fehérjék szerepérıl, továbbá információkat nyerhetünk arról is, hogy egyes vírusok mely más hazai, esetleg más országban megtalált és molekulárisan jellemzett izolátumokhoz hasonlítanak, illetve állnak rokonságban vagy honnan származnak. E módszerek hátránya, hogy a szerológiai és más hagyományos módszereknél drágábbak, így tömeges ellenırzésre nem alkalmasak (Weber és mtsai, 2002). 14

15 A külföldön már használatos molekuláris módszerek adatai alapján, a korábban ismert nevezéktani rendszer is javításra szorul. Ezek alapján a szimptomatológiai alapú, külön elnevezéső vírusbetegség- korokozó rendszerezést meg kellett újítani. A dolgozat elkészítésének célkitőzései: A hazánkban leírt szılıpatogén vírusok eddig használt rendszerezésének aktualizálása A vírusbetegségek és kórokozóik azonosítása Magyarország szılıterületein virológiai felmérés végzése A begyőjtött vírusizolátumok molekuláris jellemzésének megindítása és génbankba történı elhelyezése. 15

16 2. Irodalmi áttekintés 2.1. A magyarországi szılıvirológiai kutatások történeti áttekintése A szılıt károsító vírusok elıfordulásának vizsgálatát Dr. Lehoczky János és munkatársai kezdték meg az 1960-as években Magyarországon a kecskeméti a Szılészeti és Borászati Kutatóintézetben. Külföldi kutatóintézetekbıl megkezdıdött a virológiai szőrésben nemzetközileg használt indikátorfajták behozatala és felszaporítása a Kecskeméti Szılészeti és Borászati Kutatóintézet miklóstelepi, majd katonatelepi állomásán (Lehoczky és mtsai, 1992). A vírusfertızött egyedek fenntartására ugyancsak Kecskeméten létrehozták a Patológiai Kertet, olyan vírus génbankot, amely a vírustesztelési munka alapját képezte a külföldi kutatóintézetekbıl behozott és felszaporított fás szárú indikátorokkal. A szılıfajták rendszeres virológiai szőrése ben kezdıdött. A ma is használatos rendszer három szőrési módszeren alapul: tüneti vizsgálat, biológiai tesztelés és szerológiai ellenırzés (Lázár, 1998; Lázár és mtsai, 2002). Az elsı évben a vírustüneteket nem mutató tıkéket kell kiválasztani és megjelölni. Ezeket a tıkéket egy vegetációs periódus alatt kétszer (virágzás körül és szeptember második felében) kell vizsgálni. Az elsı szelekció idejében mintát kell győjteni ELISA tesztelés elvégzéséhez óta többször módosult az ELISA teszteléssel vizsgálandó vírusok köre, a jelenleg érvényben lévı szılı szaporítóanyagok forgalomba hozataláról szóló 87/2006. (XII. 28.) FVM rendelet szerint a következı jelentıs szılıpatogén vírusokra kötelezı a rendszeres tesztelés: szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV), arabis mozaik vírus (Arabis mosaic virus, ArMV), a szılı foltosodás vírus (Grapevine fleck virus, GFkV), szılı levélsodródás vírus 1 és 3 (Grapevine leafroll-associated virus 1, 3, GLRaV 1, 3), szılı A, B és D vírusok (Grapevine virus A, B, D, GVA, GVB, GVD). Novemberben azokat a vesszıket kell begyőjteni további vizsgálatok elvégzéséhez, amelyek a felméréskor tünetmentesnek bizonyultak és a szerológiai tesztelés sem mutatta ki kórokozó jelenlétét. A mintákat célszerő mőanyag zacskókba győjteni és 2-3 o C-on tárolni. A második év tavaszán, az elıbbi módon teleltetett vesszıket 8 indikátorfajta segítségével, szövet-oltással (chip-transmission) kell vizsgálni szabadföldön: ezek az FS-4 ( Siegfriedrebe ), Vitis rupestris cv. St. George, Vitis vinifera cv. Pinot noir és Chardonnay, V. berlandieri x V. riparia Teleki Kober 5 BB, Couderc 1613 x V. berlandieri LN 33, V. riparia cv. Gloire de Montpellier, V. rupestris x V. berlandieri 110 Richter. 16

17 A szabadföldi tesztelı-iskolába kitelepített dugványokon jelentkezı tüneteket júniusban és szeptemberben kell vizsgálni. A második év tavaszán az átteleltetett vesszıket esetenként biológiai teszteléssel, mechanikai átvitellel, lágyszárú növényeken is tesztelni kell. Erre a célra használhatók a Chenopodium quinoa, C. amaraticolor, Cucumis sativus Delicates, Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii, N. tabacum cv. Samsun, N. glutinosa, Phaseolus vulgaris cv. Beautiful fajok illetve fajták. A harmadik évben is két alkalommal kell elvégezni az értékelést. A vizsgálat végére a kijelölt, és minden indikátoron, minden esetben negatív eredményt adó növények vírusmentesnek tekinthetık (Baracsi, 1999, Lázár és mtsai, 2002). A szerológiai vizsgálat megbízható eredményt ad, hátránya, hogy nem minden vírus kimutatására alkalmas. A rupestris faszöveti barázdáltság vírus (Rupestris stem pitting-associated virus, RSPaV) fertızöttség kimutatása ELISA módszerrel jelenleg még nem, PCR vizsgálattal azonban kimutatható. Ezért nagyon fontos a három módszer (fásszárú, lágyszárú teszt és szerológia) együttes alkalmazása. Az újabb eredmények szerint a legérzékenyebb módszer mégis a molekuláris genetikai vizsgálatok használata, de az elızı módszerekhez képest drágább, így ennek használata csak kivételes esetekben javasolt (Weber és mtsai, 2002). Azokhoz a vírusokhoz, amelyek elıször kerülnek meghatározásra, a leírásához szükség van elektronmikroszkópos felvételek készítésére is. A vírusok növénybe jutása passzív folyamat, így szükséges annak ismerete, hogy milyen úton kerülhet a kórokozó a növénnyel kapcsolatba. Ez lehet állatvektorokkal vagy állatvektor nélküli egyéb módokon, például oltással, mechanikailag, vegetatív szaporítószervekkel, esetleg maggal, pollennel (Pribék, 1999) A Magyarországon elıforduló szılı vírusbetegségek és kórokozóinak áttekintése Hazánkban ez idáig a szılırıl 15 vírusbetegséget írtak le (Lázár, 1996). Ezek a tünetek alapján alkotott hét csoportba sorolhatók: 1) szılı korai vírusos leromlás (grapevine degeneration), 2) levélsodródás (grapevine leafroll), 3) látens foltosság (grapevine fleck), 4) vonalas és győrős mintázottság (grapevine yellow mottle) 5) vonalas mintázottság (grapevine line pattern) és 6) faszöveti barázdáltság (grapevine rugose wood). A hetedik csoportba azokat a vírusszerő betegségeket soroljuk, amelyek kórokozói feltehetıen vírusos eredetőek, de pontosan még nem kerültek meghatározásra. A víruscsoportok és tagjainak általános 17

18 genomjellemzéséhez használt ábrák a Swiss Institute of Bioinformatics Expert Protein Analysis System adatbázisában ( található ábrák és szakirodalmi adatok alapján készültek Szılı korai vírusos leromlás A szılı korai vírusos leromlását, mint általános elnevezést több víruskórokozóra vezetik vissza. A Nepovirus nemzetségbe tartozó vírusok, nevezetesen a szılı fertızı leromlás vírusa (Grapevine fanleaf virus), a szılı tıkesatnyulás A és T vírusbetegséget okozó Arabis mosaic virus (ArMV) és Tomato black ring virus (TBRV), a szılı bolgár látens vírus (Grapevine bulgarian latent virus), és a szılı króm mozaik vírus (Grapevine chrome mosaic virus) okozzák. A nemzetség a nevét a Nematode transmitted- polihedral (NEPO) rövidítésbıl kapta, azaz fonalféreggel terjedı izometrikus vírusok csoportja (Horváth, 1972). Világszerte elterjedt kórokozók is vannak közöttük. Egyes vírusok erıs tüneteket idéznek elı, mások enyhébbeket. Akár 80%-os termésveszteséget is okozhatnak (Martelli, 1993; Pompe-Novak és mtsai, 2007). Jóllehet némelyik külön-külön is nagyobb kárt képes okozni helyenként, viszont nem túl nagy területen terjedt el, így kevésbé van gazdasági jelentısége. Leggyakrabban a szılı ültetvény korai pusztulását okozzák (Bovey és mtsai, 1980). A szılı vírusos leromlását elıször 1865-ben figyelte meg és írta le Cazalis és Allut Franciaországban (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). A kórokozó és két törzse által okozott tünetek hazai megjelenésérıl, pedig Sárospataki (1964) és Lehoczky (1965) számoltak be. A leromlást okozó vírusok elkülönítése késıbb következett be, ezért, ezek a vírusok külön is részletezésre kerülnek. A nepovírusok izometrikus virionjai nm átmérıjőek osztott, kétkomponensőek - B és M -, pozitív egyszálú RNS genommal rendelkezık. Az elıbbi mérete 7,5 kb, az utóbbié 3,9 kb. Az 5 végeiken VPg vírusgenomhoz kötött fehérjét tartalmaznak, 3 végük poliadenilált (Andret- Link és mtsai, 2004a). Az RNS1-en (B komponens) az elsı nyílt leolvasási szakasz a proteáz kofaktor (P1A), a következı a helikáz (HEL) enzimet, a vírusgenomhoz kötött fehérjét (VPg), a proteáz (Pro) és az RNS függı RNS polimerázt (POL) kódolja (1. ábra). A 2. RNS szál (M komponens) az ún. homing protein- önvezérlésért felelıs fehérjét (P2A), melynek pontos funkciója nem ismert, a mozgási fehérjét (MP) és a köpenyfehérjét (CP) kódolja (Vigne és mtsai, 2008). 18

19 Rövidítések:5 VPg - vírusgenomhoz kötött fehérje, a genom 5 végén, P1A - proteináz kofaktor, HEL - helikáz enzim, Pro - proteáz enzim, POL - RNS függı RNS polimeráz enzim, P2A - ún. homing protein - önvezérlésért felelıs fehérje, MP - mozgási fehérje, CP - köpenyfehérje: 3 polya - a genom poliadeninlált 3 vége, RNS-1 - a vírusgenom 1. komponense, RNS-2 - a vírusgenom 2. komponense 1. ábra. A Nepovirus nemzetség genomszervezıdése A nepovírusok jelenleg rendszertanilag a Picornavirales rend, Secoviridae család Comovirinae alcsalád, Nepovirus nemzetségének tagjai (Carstens, 2010). A legtöbbjük fonálféreg vektora ismert, A szılı gyökerének szívogatása által veszik fel a virionokat és adják tovább. A fonálférgek a kórokozót még néhány hónapig hordozhatják, bár ezen az úton nagy távolságokra nem terjed Grapevine fanleaf virus - Szılı fertızı leromlás vírus (GFLV) A szılı fertızı leromlás kórokozója a szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV). Két törzsét különböztetik meg tünettanilag: a sárga mozaik törzs (Grapevine fanleaf virus - yellow mosaic strain, GFLV-YM) és az érmenti szalagosodás törzs (Grapevine fanleaf virus - vein banding strain, GFLV-VB) (Lázár, 1996). A GFLV-ról és a törzseirıl szóló elsı áttekintéseket, Vuittenez, Dias és Taylor írták le (Frazier, 1970). A sárga mozaik törzzsel fertızött tıkék krómsárga elszínezıdést mutatnak, ami már kora tavasszal megjelenik. Az érmenti és érközi területeken kiterjedt foltok jelennek meg, vagy teljesen elsárgul a levélzet (Martelli, 1993). Az érmenti szalagosodás törzsre a sárga foltok, illetve az ér mentén megjelenı, és az ér mellett végigfutó, hosszanti, sárga, szalagszerő lefutású, klorotikus mintázat jellemzı (Goheen és Hewitt, 1962). Szychowski és munkatársainak (1995) eredményei szerint az érmenti szalagosodás tünet a szılı páfránylevelőség vírus (GFLV) és egy viroid, a Szılı sárga foltosság viroid-1 (Grapevine yellow speckle viroid-1, GYSVd-1) komplex fertızésének következménye. Különösen nyáron és ısszel látszanak jól a tünetek. Ez a kórokozó a világ minden szılıtermesztı területén megjelent. A szılı egyik legelterjedtebb vírusa, ami az összes fajtát képes fertızni. A vírusfertızés hatással van a szılı 19

20 produktivitására és a tıke élettartamára (Andret-Link és mtsai, 2004b). A tünetek rendkívül változatosak és egyszerre több törzse is jelen lehet egy növényben. A fertızés következtében a tıke vagy nagyon gyorsan elpusztul, vagy néhány éven belül leromlik. A vesszıkön megjelenı tünetek a következık: rövid ízközök, villás elágazás, szalagos, ellaposodott hajtás és fürt. A levélerek futása páfránylevélre emlékeztetı, a levéllemez aszimmetrikus, erısen fogazott a levélszél és gyakori a klorotikus foltok megjelenése. A sárga mozaik és az érmenti szalagosodás törzs csak enyhe levél deformációt okoz, amelyeken világossárga elszínezıdés látható. Ha a sárgulás csak az erek mentén jelentkezik, akkor érmenti szalagosodásról beszélünk. A vírusfertızött leveleken klorotikus győrők, pontok, foltok jelennek meg. A fertızött tıkéken a rügyek kisebbek és számuk is kevesebb, mint az egészséges növényeken. A bogyók gyakran kiszáradnak, összeaszalódnak, kicsik maradnak, vagy magtalanok (Sárospataki, 1964). A GFLV elsısorban Xiphinema index és X. italie fonalférgekkel terjed nem cirkulatív, szemiperzisztens módon (Demangeat és mtsai, 2005). Ezen kívül ismert szaporítóanyaggal, szövetoltással (Hewitt és mtsai, 1962) és maggal (Lázár és mtsai, 1990) történı átvitele is. Fás szárú indikátorai: Vitis rupestris cv. St. George, Vitis vinifera cv. Chardonnay, FS 4 ( Siegfriedrebe ) (Kölber és mtsai, 1981). Lágyszárú tesztnövénye elsısorban Chenopodium quinoa, amelyen szisztemikus klorotikus pontokat, levéldeformációt, ritkán lokális léziókat idéz elı (Bashir, 2007) Arabis mosaic virus - Arabis mozaik vírus (ArMV) Az Arabis mozaik vírus (Arabis mosaic virus, ArMV) az A típusú tıkesatnyulás betegség kórokozója szerológiailag a GFLV-sal rokon. A volt Jugoszlávia területén találták meg elıször (Panjan és Saric 1963). Hazánkban Martelli és Lehoczky (1968) írták le szılırıl. A kórokozó által elıidézett tünetek nagyon hasonlóak a fertızı leromláshoz, általában együtt fertıznek meg egy-egy tıkét (Wetzel és mtsai, 2004). Az ArMV-nak nagyon széles a gazdanövényköre, ide tartoznak különbözı gyomnövények is (Jenser és mtsai, 1979). Szintén fonálférgek terjesztik, elsısorban a Xiphinema diversicaudatum, X. coxi, Longidorus caespiticola, és ezen kívül ismert az oltással, fertızött szaporítóanyaggal és a maggal történı terjedése is. Legfontosabb tesztnövénye a Nicotiana glutinosa, amelyen feltőnı klorotikus győrőzöttséget és pettyeket okoz. Fás szárú indikátorai: Vitis rupestris cv. St. George, Vitis vinifera cv. Pinot noir, FS 4 ( Siegfriedrebe ) (Baracsi, 1999). 20