KROMATOGRÁFIA Előadás BSc. hallgatóknak Dr. Balla József őszi félév

Átírás

1 KROMATOGRÁFIA Előadás BSc. hallgatóknak Dr. Balla József őszi félév 1

2 A kromatográfia felfedezője és névadója Mihail Szemjonovics Cvet ( ) 2

3 Kromatográfia 3

4 Karotinoidok Richard Kuhn ( ) 1938 Nobel-díj abszorpciós kromatográfia Zechmeiter László ( ) Cholnoky László ( ) Edgar Lederer ( ) Die chromatographische Adsorptionsmethode. Grundlagen, Methodik, Anwendungen, Wien,

5 Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge A megoszlási kromatográfia terén végzett munkásságukért 1952-ben Nobel-díj kaptak. A GC KEZDETE 5

6 Kováts Ervin, Horváth Csaba 6

7 Történet 1897 D.T.Day fullerföld, nyersolaj 1906 M.Zwett. A kromatográfia felfedezője és névadója. Chroma graphien, crm gro 1937 Zechmeister és Cholnoky (első könyv, angolul) 1937 Tiselius: Elektroforézis 1940 Ioncserélő kromatográfia Izmailov, Schreiber 1941 A.P.Matin és Synge. Megoszlási folyamatok 1944 Consden, Gordon, Martin: Papírkromatográfia E.Stahl: Rétegkromatográfia 1952 James, Martin: Gázkromatográfia 1957 E.Kováts: Retenciós index 1958 Golay: kapilláris GC 7

8 1961 G.Schay: A gázkromatográfia alapjai, Akadémiai Kiadó, Giddings: Egységes elmélet lehetősége Horváth, Huber, Snyder, Kirkland, Halász, SCOTT: HPLC Dandenau: kvarcüveg kapilláris Regnier, Horváth, Karger: biopolimerek elválasztása Jorgenson, Lukács: kapilláris elektroforézis (CE) Novotny, Lee: SCF GC-MS, HPLC-MS 8

9 Mozgófázis Állófázis szilárd folyadék GÁZKROMATOG- RÁFIA (GC) gáz GSzK (GSC) gáz-szilárd kromatográfia GFK (GLC) gáz-folyadék kromatográfia SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA (SFC) szuperkritikus fluidum SFK (SFC) FOLYADÉK- KROMATOGRÁFIA (LC) folyadék FSzk (LSC) VRK (TLC) vékonyréteg kromatográfia IK (IC) ionkromatográfia GK (Gél) gélkromatográfia FFK (LLC) PK (PC) Papír kromatográfia 9

10 A,B c A c B B A Detektor jel D A+B állandó mintaáram állófázis A, idő 10

11 Detektor jel A,B diszkrét minta K K ca B c B A állófázis c K D A K idő 11

12 c c A c B E Detektor jel integrális E B A D A állófázis Detektor jel idő differenciális idő 12

13 GC IC SFC HPLC Gél LC 13

14 a mv rossz elválasztás: nem szelektív nem hatékony b mv szelektív nem hatékony idő c mv nem szelektív hatékony idő d mv idő szelektív hatékony idő 14

15 GC 15

16 A gázkromatográfiás elválasztás leírásának alapkérdései -a mozgófázis áramlásával összefüggő problémák (áramlás szemcsés tölteten és üres csőben), -az anyagátmenetet leíró gázkromatográfiás elméleti megközelítések, -a jellemző molekulakölcsönhatások, -a koncentrációeloszlás, csúcsalak és az elválasztás jellemzésére vonatkozó legfontosabb ismeretek. 16

17 Retenció t R, C t R, B t R, A Retenciós idők Retenciós térfogatok mv A B C Relatív retenció a mintabemérés pillanata idő 1 2 mintabemérő detektor vivőgáz kolonna t R t M 17

18 Kromatográfiás alapösszefüggések I. Bruttó retenciós idő t R Holtidő t M Redukált retenciós idő t R = t R - t M Kolonnahossz L Lineáris áramlási sebesség u Megoszlási hányados c K c Retenciós tényező t R t k t Csúcsszélesség w Relatív csúcsszélesség w/ t R Tányérszám N Elméleti tányérmagasság HETP=L/N M s m M n n s m 18

19 Gázkromatográfiás alapfogalmak t R h c(t) 2 c max h 1/2 0,607 h w =4 = w ln 2 = 2 2 A = h 2 ln 2 w c = m max VR N 2 Megoszlási hányados Szelektivitás Hatékonyság Felbontóképesség mv < < t R1 t R2 > < t R > > w 1 w 2 < > < > alapvonal idő R s tr, 2 w 2 2 t R, 1 w 1 15, R s N 1 k 4 1 k 19

20 Kromatográfiás alapösszefüggések II. 1. A szükséges, de elégséges felbotóképesség. Általában: R hatékonyság t N 16 w szelektivitás tr,2 t t t s tr 2 w R,1,2 2 R,2 R,2 R,1 t w 2 R,1 t t 1 M M 1,5 Nmax k k R s illetve Hmin N 1 k 4 1 k retenció k L ( H ) N t R t t M M 2. Érzékenység: detektálás! 3. Elemzési idő t 2 NH 2 kn R, n to 1 kn 1 kn 16Rs 2 u 1 kn 1 3 H u 20

21 21 21 L, t dx dp x p,u,f p i i u i F,, p o u o F o,, u =? M dx dp K u p pu u p o o p u p u o o dx dp K p u p p o o o i p p p L o o o pdp K dx u p L o L o M o u o p pdx u dx t j u p p p p u u o o i o i o 1 ) / ( 1 ) / ( ) ( o i o o p p K L u p p ) ( o i o o L o o o M p p u p K dp u p K p t p p t M L u ) ( o i o o p p K u p L u p ) ( ) ( o i o i o o o o p p p p u p L u p L u

22 22 22 > F, c o < > dx dc o dx t x c F o dx x c v c v t m m s s dx x c v c v t dx t x c F m m s s o v s =V s /L és v m =V m /L x t c x c c x t c m m s s állandó x c c K m s m m s m t o v x t c v x t c K x c F 1 x c t c t x t x c m m m m s m m m v Kv x t c c t x x t c F m z c t x u m s m s z V KV L v Kv u F 1 u FL KV V z s m m s R V KV V

23 c s a b c Jel c m c 0,1 c 0,2 c 0,3 c 0,3 c 0,2 c 0,1 t R 23

24 c o v m c m( N-1 ) c m (N-1) c v m mn c mn v m c m(n+1) v s v s v s c s ( N-1 ) c s N c s (N+1) N - 1 N N + 1 ( c c )dv v dc v m( N1 ) m,n m m,n s dc s,n ( c 1 c )dv v dc v Kdc ( v m vsk) dcm, N m,( N ) m,n m m,n s m, N v m c K c s s,n m,n v K v eff c dc m,( N1 ) m,n c m,n dv v eff V v eff y N c c m,n o y dy N1 y N N e y N N! d N 100 ( N ) 1 y N N e 2 2N 24 2

25 25 25 A van Deemter egyenlet u D d k k u D d H s f m p g u C u B A H s zónaszélesség kezdetben zónaszélesség egy t idő után

26 HETP-u 1 H ( mm ) H A B u C s u H - u 0,5 H min =0,409 B/ u C s. u A u opt =8, u ( cm/s ) 20 v 26

27 A Golay egyenlet H 2D u m 1 6k 11k 2 24( 1 k ) 2 r D 2 c m u 2 3 k ( 1 k ) 2 d D 2 f s u H ( mm ) H B u C m u C s u H min =0, C s. u u opt =29,2 H u B / u C. m u u (cm/s) 27

28 Hmin B( C C ) 2 u m s opt C m B C s df (m) Cm (%) Cs (%) 0, ,50 82 l8 1, , , H 2D u m 1 6k 11k 24( 1 k ) 2 2 r D 2 c m u H min 1, 91r c d c D uopt 2, 1 r m c 28

29 Vékonyfilmes: d f < 1 C m > C s ( > 100 ) H (mm) 1,2 B/u B = 2 40 mm/s ; C m = s 1,0 0,8 H min. = 0,22 mm u opt. = 36,5 cm/s 0,6 0,4 C m >> C s 0,2 C m u C s u u (cm/s) Vastagfilmes: d f > 1 C s > C m ( < 100 ) H (mm) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 B/ u C s >> C m C s u C m u B&B Analitika Kft Kutatás, Fejlesztés, Tanácsadás, Oktatás u (cm/s) 29 balla@mail.bme.hu kemia@bbanalitika.hu

30 Relatív retenció: r 2, 1 t t R, 2 R, 1 V V R, 2 R, 1 k k 2 1 lg t' R lg t' R n +1 lg t' R x lg t' R n I x _ 100 n A C B C' B' lg t' R n +1 lg t' _ R x _ lg t' R n lg t' R n I x I I x lgt R, x lgt R, n n lgt lgt R, n1 R, n 30

31 31 31 Az elválasztás jellemzése 1, k k N R s k k R N s req f l s p k k ln R N n SN TZ t t R n R n n n,, u H k k R k u NH k t t n n s n n o,n R

32 N k N/4 1/ k/(1+k) R s , ,35 0,05 0,83 1,47 1, ,00 0,05 0,83 2,08 1, ,23 0,05 0,83 2,54 1, ,70 0,05 0,83 2,93 1, ,35 0,09 0,83 2,64 1, ,35 0,13 0,83 3,81 1, ,35 0,17 0,83 4,99 1, ,35 0,05 0,90 1,60 1, ,35 0,05 0,94 1,66 1, ,35 0,05 0,95 1,68 32

33 R s 5 R s =f( ) 4 3 R s =f( N ) 2 R s =f(k) 1 1,05 1,10 1,15 1, N k 33

34 GC-s kolonnák Szemcsés töltetű kolonnák makro töltetű mikro töltetű ( kapilláris méretű) adszorpciós megoszlásos adszorpciós megoszlásos Kapilláris kolonnák adszorpciós megoszlásos PLOT WCOT SCOT 34

35 Kapilláris kolonnák kapilláris cső fala porózus adszorbens réteg mm PLOT megosztófolyadék, 5-20 mm WCOT megosztófolyadék, 0,01-5 mm kapilláris 2r c = 0,05 1 mm SCOT hordozó hordozó, 0,1-3 mm megosztófolyadék, 0,01-5mm 35

36 m i n t a k a p a c i t ás ng NB belső átmérő, mm ST WB hatékonyság 0,5 1,5 2,5 f il m vas t ag s á g mm 36

37 Belső átmérő (mm) Filmvastagság (mm) Fázisarány ( ) Mintakapacitás (ng) 0,2 0,1 0,2 0,25 0,1 0, ,32 0,1 0, ,53 0,1 0,

38 Rohrschneider McReynolds (1970) F I 1 I ax by cz du es F sq I 2 I ax by cz du es F sq sq I 5 I ax by cz du es F i I I I, i F i sq OV 275 i i OV 275 I I I i sq. CP 5 i1 5 i1 I I F i OV 275 i

39 A megosztó-folyadék neve Min. max.hôm.c Oldószer Benzol 1-Butanol 2-Pentanon 1-Nitro-propán Piridin Summa CP-index Apiezon L 50/300 C,T Butándiol-szukcinát 50/225 C Carbowax /175 C Carbowax /200 C Carbowax 4000 monosztearát 60/200 C Carbowax 20M 60/225 C Carbowax 20M-tereftálsav 60/225 C Dexsil /450 T Dexsil /400 T Dexsil /400 T DEGA 0/200 A DEGS 20/200 A Squalan 20/100 T,C EPON /225 A,C Etilénglikol-szukcinát 100/200 C FFAP 50/250 C

40 A megosztófolyadék neve Min.max.hôm.C Oldószer Benzol 1-Butanol 2-Pentanon 1-Nitropropán Piridin Summa CP-index SE-30 50/300 C SE-52 50/300 C,T SE-54 50/300 C,T XE-60 0/250 A OV-1 100/350 C,T OV-3 0/350 C,T OV-7 0/350 C,T OV-11 0/350 C,T OV-17 0/375 C,T OV-22 0/350 C OV-25 0/350 C OV-73 0/325 T OV-101 0/350 C OV-210 0/275 A OV /250 A OV /250 C

41 41

42 42

43 43

44 SGE Restek Quad-rex JW HP Chrom-pack Allteck Supel-co Minõség BP-1 Rtx DB-1 HP-1 Ultra-1 BP-5 Rtx DB-5 HP-5 Ultra-2 BP-10 Rtx DB CP-Sil 19CB - Rtx DB-17 HP-50 HP-17 BP-21 Stabilwax- DA 007-FFAP DB-FFAP HP-FFAP CP-Wax 58CB CP-Sil 5CB AT-1 SPB-1 SE-30, OV-1, OV-101, SP-2100 CP-Sil 8CB AT-5 SPB-5 SE-54, SE-52, OV-73 AT-1701 SPB-1701 OV AT-50 SPB-50 OV-17, OV-2250 AT-1000 Nukol SP-1000, FFAP - Rtx CP-Sil 88 - SP-2340 SP-2340, OV-275 PONA F BPX Stabil wax-db - PONA Squalane - Petro col 50.2 Rtx DB-624 HP-624 CP-Sil 13CB AT-624 VOCOL - - CAM - CP-Wax 51 - Carbowax Amin Squala-ne - 44

45 GC általános felépítése T,Sz. vivőgáz forrás (2-3 bar) Ny. Á szeptum purge split minta B K D make-up E segédgázok 1 A/D C 45

46 Mintabeviteli megoldások 46

47 Gázminta bemérés a) b) mintahurok mintahurok vivőgáz vivőgáz kolonnára kolonnára minta be minta be 47

48 Mintaáram elosztó: splitter elvi vázlata vivőgáz áramlás szabályozó fűtés szeptum szeptum "purge" gáz üveg, kvarc betét (liner) változtatható áramlási ellenállások split mintaáram leosztás kapilláris kolonna 48

49 Splitless bemérés mikrofecskendő a) b) zárva nyitva vivőgáz vivőgáz adszorbens adszorbens kapilláris kolonna zárva kapilláris kolonna nyitva 49

50 Oldószerhatás Detektorjel a idő Detektorjel b idő 50

51 PTV injektor áramlás szabályozó vivőgáz kvarc betét (liner) programozott hűtés szeptum programozott fűtés kvarcgyapot szeptum "purge" gáz változtatható áramlási ellenállások split mintaáram leosztás kapilláris kolonna 51

52 GC-s detektorok 1. hővezetőképességi detektorok, 2. ionizációs detektorok, 3. fotometriás detektorok 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás detektorok (MSD) 5. elektromos vezetőképességi detektorok, 6. oxigén szelektív detektor, 7. kombinált detektorok, stb. 52

53 MSD A Melyik előnyösebb detektorként? Z DAH DFH linearitási típus FID A LOD LOQ tartomány g g Univerzális, specifikus g/s koncentráció 10-5 g/s 10 7 szerves tömegáram érz. ECD V g 10-9 g 10 4 specifikus konc. érz. FPD P gp/s FPD S gs/s 10-7 gp/s 10 5 (lgalgc) 10-7 gs/s 10 3 (lgalgc) specifikus specifikus tömegáram érz. tömegá. ramérz. PID A g 10-9 g 10 4 specifikus konc. érz. 53

54 54 54 Követelmények a készülékekkel szemben: ex R D kol R telj N t F V N t A kol ex det inj

55 Fast GC k H 2D u m 2 rc 24D m u H min 2 B C m C s u opt C m B C s H min = 0,6r c u 6, 9 opt D r m c 55

56 56

57 GC-s detektorok 1. hővezetőképességi detektorok, 2. ionizációs detektorok, 3. fotometriás detektorok 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás detektorok. 5. elektromos vezetőképességi detektorok, 6. oxigén szelektív detektor, 7. kombinált detektorok, stb. 57

58 HWD, TCD kapcsolás a) vivőgáz b) M R M R B B vivőgáz K K M R B vivőgáz K B vivőgáz K 58

59 mikro-tcd B B vivőgáz vivőgáz M mérőszál R M mérőszál R X X szabadba szabadba a) moduláló b) gázáram moduláló gázáram 59

60 Az ionizációs detektorok működési elve elektródok R > o R U o vivőgáz V=1V-1kV energia 60

61 FID elvi vázlata anód (+) láng katód (-) levegő hidrogén tömítés kolonna 61

62 A lángban lejátszódó folyamatok O 2 O 2 O 2 előmelegítő zóna 2500 K O 2 oxidációs zóna O 2 reakció zóna (pirolízis) K 1. H2 + O 2 HO2 + H. H 1 230,3 kj H 2. + O2 OH + O H 67,8 kj 2 3. OH + H kj 2 H + H 2 O H -63, O + OH + H H 4 4,4 kj H 2 Rekombinációs reakciók 5. H. + OH + X H + X H O kj 6. H + H + X H 2 + X H 6-436,3kJ 7. O + O + X O + X H -498,6 kj H kj 1. C H n m pirolízis n C H. + (m-n) H. 2. n C H. + n O. oxidáció n C HO. 3. n C HO. ionizáció n CH O + + n e 62

63 A FID jellegörbéje, érzékenysége R i (A) R i (A) I 0 I 0 tg = a D R a i D = dn i dt t g/s 10-5 g/s dn i dt a D hi dmi dt max c h i max F A m i i 4ln 2 a D gq M 12n M i c 4ln 2 63

64 AFID RbCl anód (+) só gyöngy láng katód (-) levegő hidrogén tömítés kolonna 64

65 sugár ionizációs detektorok: Ar, He V-os polarizációs feszültség - 63 Ni fólia Ar vivôgáz Ar 158, ev Ar 2e kolonna Ar Ar Ar M e 116, ev 2Ar M e Ar 65

66 ECD + öblítő gáz ki 63 Ni fólia kollektor elektród - katód polarizációs feszültség 1-10V öblítő gáz be make-up gáz ( ) kolonna 66

67 Az ECD érzékenysége R i (A) a D a c D h i max gi o R c i,max max 1 ii M gio iic c M i max max i V 1ms t Elektron konc ms t állandó feszültségű üzemmód esetén t 67

68 Az ECD relatív érzékenysége Vegyület Relatív érzékenység Vegyület benzol 0,06 oktafluor-propán 1,0 aceton 0,50 trifluor-klór-metán 3,3 di-n-butiléter 0,60 trifluor-klór-etén 100 metil-butirát 0,90 pentafluor-klór-etán butanol 1,00 1,1-difluor-2,2-diklór-etén klór-bután 1,00 difluor-diklór-metán 3*10 4 Relatív érzékenység 15,00 kloroform 3,3*10 4 klór-benzol 75,00 1,1,2-triklór-etén 6,7*10 4 1,4-diklórbután 1,1-diklórbután 111,00 bróm-trifluor-metán 8,7* bróm-bután 280,00 1,1,2-trifluor-1,2,2-triklór-etán 1,6*10 5 bróm-benzol 450,00 1,1,1-trifluor-2-bróm-2-klóretán kloroform 6*10 4 1,1,1,2,2,3,3-heptafluor-3-jódpropán 1-jód-bután 6*10 4 1,1,2,2-tetrafluor-1,2-dibrómetán 4,0*10 5 6,0*10 5 7,7*10 5 széntetraklorid 6*10 4 fluor-triklór-metán 1,2*

69 PID DID (-) Xe lámpa kvarc ablak He szikrakisülés (+) (-) (+) kolonna He vivőgáz kolonna 69

70 FPD gyújtó levegő P,S szűrő PM H 2 + levegő a FID monitor elektród b FID monitor elektród hűtő kolonna + + PM PM - - levegő H 2 interferencia szűrő H 2 levegő interferencia szűrő levegő H2 kolonna kolonna 70

71 AED diódasor detektor N 174,2 nm P 178,1 nm kolonna Ar make-up gáz energia plazma hűtővíz diffrakciós rács fókuszáló rés S Br H Cl 180,7 nm 478,6 nm 479,6 nm 486,1 nm tükör C 495,7 nm kvarc ablak F O 685,6 nm 777,2 nm 71

72 Fontosabb detektorok jellemzői Z DAH DFH a D Linearitási tartomány Típus 1. Típus 2. TCD g 10-1 g 10 6 mvcm3/m g univ. konc. FID A g/s 10-5 g/s szerves tömegára m érz. ECD 5-6 V g 10-9 g spec. konc. FPD P gp/s 10-7 gp/s FPD S gs/s 10-7 gs/s spec. tömegára m érz spec. tömegára m érz. PID A g 10-9 g spec. konc. MS 10-6 V g 10-9 g univ. szelektív 72

73 Mindennapi feladataink: 1. az irodalom követése, 2. a mintavétel, mintaelőkészítés problémáinak áttekintése, 3. a gázkromatográfiás elválasztás, 4. a minőségi azonosítás, mennyiségi elemzés kérdéseinek eldöntése, 5. az eredmények megadása és dokumentálása, valamint 6. az eredmények hihetőségének a bizonyítása, 7. gyakori feladat a készülék hibáinak felismerése és elhárítása. 73

74 Gyakorlati alkalmazások Permanens gázok mennyiségi elemzése Szénhidrogénipari elemzések Környezetvédelmi analízis Gyógyszeripari elemzések Élelmiszerek, mezőgazdasági termékek gázkromatográfiás vizsgálata, stb. 74

75 HPLC 75

76 A HPLC-s elválasztás Célja: minden termikusan érzékeny nemionos, ionos és ionizálható szerves és szervetlen alkotók eredményes elválasztása és a identifikálása, azaz a szükséges és elégséges felbontóképesség biztosítása: R s 2 t R,2 w 2 t R,1 w 1 1,5 R s N 1 k 4 1 k 76

77 Hatékonyság Szelektivitás Kapacitás 77

78 A szorpciót eredményező kölcsönhatások: 1. diszperziós: apoláris-apoláris (hidrofób) 2. indukciós: apoláris-poláris 3. orientációs: poláris-poláris 4. H-hidas: donor-akceptor 5. ionos 6. biospecifikus 7. molekulaméret MINTA» S M» (álló) (mozgó) 78

79 Szelektivitás: állófázis megválasztása eluens összetétel megválasztása izokratikus gradiens elúció hőmérséklet szerepe 79

80 Az elválasztás hatékonysága I. van Deemter egyenlet: HETP : töltési tényező 2d H p 2gD u A m B u 2 3 C d p : a kolonnatöltet átlagos szemcseátmérője k 1 k D m : az alkotó lineáris diffúziós állandója a mozgó fázisban g : a töltet zeg-zugosságát kifejező tényező u : az eluens lineáris áramlási sebessége k : a retenciós tényező D s : az alkotó lineáris diffúziós állandója az álló fázisban m u 2 d D 2 p s u 80

81 Az elválasztás hatékonysága II. A : az áramlási egyenetlenségekből származó csúcsszélesedés ( eddy-diffusion ) B : a diffúzió csúcsszélesítő hatása C s : az anyagátadás csúcsszélesítő hatása Knox-egyenlet: h A / 1 3 B C s h H d p ud D m p 81

82 82 82 Az elválasztás hatékonysága III. C s = H anyagátadás = H áramlásidiff + H filmellenállás + H pórusdiff + H kinetikai u D d k ) ( k c H m p a áramlási ) (1 ) 30(1 ) ( k D k k u d k k k k H m pórus pórusdiff a d kin k k k k k k k k H ) )(1 (1 2 ) )(1 (1 2

83 H ( mm ) 0,020 0,015 0,010 H - u H min=0,0065 mm 0,005 0 A B/ u 0 1 0,3 C s. u u opt =1, u ( cm/s ) 0,9 1,1 cm 3 /min 83

84 Áramlás szemcsés tölteten : az eluens viszkozitása : a kolonna áramlási ellenállása p Lu 2 d p 84

85 HPLC-s elválasztások: 1. Normál fázisú (NP) 2. Fordított fázisú (RP) 3. RP ionpár kromatográfia 4. Ioncserés kromatográfia 5. HILIC 6. UHPLC 7. Méretkizárásos 8. Affinitás kromatográfia 9. Hidrofób kölcsönhatáson alapuló 10. Konvergens kromatográfia 11. Folyadék-folyadék megoszlásos 12. Elektrokromatográfiás módszerek 85

86 Oszlopos megoldású HPLC módszerek LC módszer Állófázis minősége Mozgófázis minősége NP-HPLC, normálfázisú kr. poláris töltet apoláris RP-HPLC, fordított fázisú kr. apoláris töltet poláris IC ionkromatográfia -ionpár kromatográfia apoláris töltet poláris eluens+ionpárképző -ioncserés kromatográfia (HPIC) töltéssel rendelkező töltet puffer oldat -ionkizárásos kromatográfia kationcserélő töltet puffer oldat SEC, méretkizárásos kromatográfia HIC, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia HILIC, hidrofil kölcsönhatáson alapuló kromatográfia pórusos töltet hidrofób felületű töltet erősen poláris töltet víz, vagy szerves oldószer sótartalmú oldat: csökkenő sókoncentráció apoláris, majd növekvő polaritású 86

87 A szilikagél mint állófázis alapanyag: polikovasavak halmaza a leggyakrabban használt állófázis Fajlagos felülete: m 2 /g Pórusmérete: A (2-10nm) Pórustérfogat: 0,1-3 cm 3 /g Szemcseméretek: 1,3; 1,7; 3; 5 µm Módosított szilikagél carbon telítettsége: 5-20% 87

88 88

89 89

90 90

91 91

92 92

93 93

94 94

95 Méretkizárásos kromatográfia 95

96 96

97 Rétegkromatográfia toluene - ethyl acetate (93:7 v/v), next sprayed with vanillin in H 2 SO 4 and heated. From left to right oils from: bergamot, cedar, eucalyptus, syzygium, malaleuca, lavandula, mint, orange, pine, spruce. Identified components: B1 and L1 - linalol, B2 and L2 - linalyl acetate, E1 - cinneol, G1 - eugenol, G2 - carryophyllene. Doubtfully identified components - C1 - cedrol, M3 - menthol, P1 - limonene. 97

98 HPLC Töltetek fejlődése Őskor: (-1966) Szabálytalan, µm, gravitáció Kőkor: Szabálytalan, µm (40-70 µm) ( ) Száraz töltés, kényszeráramlás (pumpa) Első generáció: Szabálytalan, µm Porózus felületű, (1970-) Iszapfázisú töltés, hatásosság Kémiailag kötött ( fordított) fázisok Polimer gélek Második generáció: Gömbalakú, 3-5 µm Endcapping (1980-) Tágpórusú (WP) töltetek ( nm) Poláris (Diol, NH 2, CN) fázisok Hatásosság + szelektivitás Polimer töltetek Királis töltetek 98

99 Harmadik generáció: Szintézis szilánokból, nagy tisztaság (1990-) 3-5 µm, Endcapping, védett (stabil) fázisok (SB) Hatásosság + szelektivitás + stabilitás + reprodukálhatóság Nemporózus töltetek, 1-2 µm, Gyorsaság Monolit töltetek Héjszerkezetű töltetek 99

100 Töltetek anyaga Szervetlen oxidok: szilika gél alumínium-oxid TiO 2, ZrO 2 hidroxil-apatit (Ca 3 (PO 4 ) 2 ) Szerves polimerek: sztirol-divinilbenzol poli-alkilmetakrilát polivinil-alkohol-észter poliéter alkilált poliakrilamid dextrán-akrilamid Porózus grafitált karbon (PCG) 100

101 Töltetek aktív részei Adszorbens / normál fázisú: szilika-gél-sioh Alumínium-oxid Al 2 O 3 Florisil Mg 2 SiO 3 Diol -(CH 2 ) 3 -OCH 2 -CHOH-CHOH Amino -(CH 2 ) 3 -NH 2 Ciano -(CH 2 ) 3 -CN Fordított fázisú: Oktadecil -(CH 2 ) 17 -CH 3 Oktil -(CH 2 ) 7 -CH 3 Etil -CH 2 CH 3 Ciklohexil -CH 2 CH 2 -C 6 H 11 Fenil -CH 2 CH 2 CH 2 -C 6 H 6 Endcapping Embedding -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CF 3 101

102 Ioncserélő: anioncserélő: Amino -(CH 2 ) 3 -NH 2 kationcserélő: Királis fázisok: Affinitási töltetek: SEC töltetek: HIC töltetek: Kvaterner amin -(CH 2 ) 3 -N + - (CH 3 ) 3 Karbonsav -(CH 2 ) 2 COOH Propil szulfonsav -(CH 2 ) 3 SO 2 OH Benzol szulfonsav -(CH 2 ) 3 - -SO 2 OH a,agp, (R) Urea, (R)DBF ciklodextrin Fenilboronát Biospecifikus ligandok Silica Polimer Silica Polimer 102

103 NP-HPLC mozgó fázisokkal szembeni elvárások polaritás viszkozitás UV áteresztés tisztaság toxicitás mentesség forráspont oxigén oldódás víztartalom elegyíthetőség ár 103

104 NP-HPLC mozgó fázisok Alap oldószerek: n-hexán n-heptán izooktán Oldhatóság növelők: diklór-metán diklór-etán kloroform Modifikátorok: észterek, éterek, alkoholok, stb. 104

105 RP-HPLC mozgó fázisok acetonitril 1,4-dioxán etanol 2-propanol metanol tetrahidrofurán VÍZ 105

106 Oldószerek jellemző adatai Oldószer Refraktív index (20 ºC) Polaritás [P ] Viszkozitás [cp, 20ºC] Forráspont [ºC] Tetrahidrofurán Dioxán Acetonitril Propanol Etanol Metanol Víz UV Cut off [nm] 106

107 Oldószerek jellemző adatai Oldószer Oldószer erősség (εº) Oldhatósági paraméter (δ) Polaritási index (P ) Sűrűség [g/cm 3 ] Viszkozitás [cp 20ºC] Forráspont [ºC] n-pentán n-heptán Izooktán CCl Toluol Dietiléter Kloroform Diklórmetán Tetrahidrofurán Metil-etilketon Etilacetát Acetonitril Propanol Etanol Metanol Víz > UV Cut off [nm] 107

108 Az oldószerek erőssége e o sz=1,1e o alox i i 1 Ei 2 Hv, i V i Vi diszp ind RT 4. Snyder-féle polaritási index: etanol (akceptor), or don acc dioxán (donor) nitrometán (orientáció) P, log K et log K diox log K nitrom 108

109 RP-HPLC elválasztás optimalizálása SZELEKTIVITÁS Hatékonyság Kapacitás Az elválasztások ph függése: ionos és ionizálható alkotók (savak, bázisok) nem disszocibilis alkotók elválasztása (nem ph függő) 109

110 Az ionizálható vegyületek jellemzői: -elektrolitos disszociáció (pk a ), - ionizálhatók szerves és vizes fázisok közötti megoszlás (lgd) lg D lg D sav bázis lg P lg 10 Nem ionizálható vegyületek - oktanol-víz megoszlási hányadosa (lgp), lg P phpk 1 a pk ph 1 lg P lg 10 lg c c okt víz a 110

111 AB A B D sav AB AB A aq aq org D bázis AB AB B aq aq org 111

112 Retenciós idő A pk a + 1,5 B pk a 2 7 ph 112

113 Retenciós idő A pk b + 1,5 B pk b 2 10 ph 113

114 ph szerepe: savak, bázisok, sók 114

115 ph beállítás ammónium formiát 2,8-4,8 ph ammónium-acetát 3,8-5,8 ph ammónium-hidroxid 8-11 ph amm.-hidrogén-karbonát 6-8 ph 115

116 HILIC 116

117 HILIC 117

118 HILIC 118

119 UHPLC 119

120 120

121 121

122 122

123 123

124 Gradiens elúció 124

125 125

126 126

127 IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA 127

128 128

129 Ioncserélő állófázisok 1. Kationcserélők erős SO 3- H + gyenge - COO - H + Anioncserélők erős -N + (CH 3 ) 3 OH - gyenge -N + H 3 OH - 129

130 Ioncserélő állófázisok 2. divinil-benzol gyöngy kopolimer alap módosított szilikagél alap polisztirol alap polimetil-metakrilát alap Porózus, pórusméret 2-40 nm Héjszerkezetű HPIC 130

131 Eluensek Kationok meghatározásához híg HCl (0,01M) Anionok méréséhez híg NaHCO 3, Na 2 CO 3, KOH VEZETŐKÉPESSÉGI DETEKTÁLÁS! 131

132 Ioncsere-ionkromatográfia Döntő az állófázis ioncserélő kapacitása Teljes ioncsere: nagy ioncserélő kapacitás 2-10 mgeq/g Ionkromatográfia: kis ioncserélő kapacitás 0,1-0,2 mgeq/g Megvalósítás Kiszorításos módszer Elúciós módszer 132

133 Kétkolonnás elválasztás, ionelnyomó kolonna (supressor): nagy ioncserélő kapacitás! kémiai elektrokémiai Egykolonnás elválasztás 133

134 Kationok elválasztása erős kationcserélőn Állófázis: kis kapacitású szulfonsavas Mozgófázis: 0,01M HCl Minta: Li +, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, (Cl - ) R-SO 3- H + Li +, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, (Cl - ) ELVÁLNAK Supressor: nagy kapacitású anioncserélő kvaterner amin R-N(CH 3 ) + 3 OH - + H + Cl - R-N(CH 3 ) + 3 Cl - + H 2 O R-N(CH 3 ) + 3 OH - + Li + Cl - R-N(CH 3 ) + 3 Cl - +Li + OH - Li +, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2- (OH - ) 134

135 Anionok elválasztása Állófázis: kis kapacitású kvaterner amin Mozgófázis: 0,01M NaHCO 3, Na 2 CO 3, KOH Minta: F -, Cl -, Br -, NO 2-, NO 3-, HPO 4 2-, SO 4 2-, I -, ClO 4-, BrO 3 - R-N(CH 3 ) 3+ HCO Na + + F -, Cl -, Br -,. elválnak! Supressor: nagy kapacitású kationcserélő R-SO 3- H + + Na + HCO - 3 R-SO 3- Na + + H 2 CO 3 R-SO 3- H + +Na + F -, Cl - R-SO 3- Na + + (H + )F -, Cl -,.. Br -, NO 2-, NO 3-, HPO 2-4, SO 2-4, I -, ClO 4-, BrO

136 136

137 137

138 Ionmozgékonyságok 138

139 A supressor kolonnát regenerálni kell! Kationcserélőt tömény kénsavval Anioncserélőt tömény nátronlúggal 139

140 Egykolonnás elválasztás Eluens: gyenge elektrolitok benzoesav citromsav o-ftálsav bórsav glukonsav stb. 140

141 Egykolonnás elválasztás 141

142 Gyenge ioncserélők ph függése Az ioncserélő kapacitás ph függő! gyenge kationcserélő gyenge anioncserélő töltetek esetén Erős ioncserélők kapacitása független a ph-tól! 142

143 Gyakorlati alkalmazások: Főként anionok elválasztása Aminosavak savas közegben kationos elválasztása 143

144 144

145 Kiszorításos ioncserés elválasztások 145

146 HPLC készülékek felépítése Eluens szállítás, Mintabevitel Elválasztó kolonna Detektor adatfeldolgozás 146

147 147

148 148

149 149

150 150

151 Kolonnák: töltés, csatlakozások 151

152 Mintabevitel: manuális, automatikus 152

153 Detektorok HPLC detector Commercially available Mass LOD (commercial) Mass LOD (state of the art) Absorbance Yes 100pg-1ng 1pg Fluorescence Yes 1-10 pg 10fg Electrochemical Yes 10pg-1ng 100fg Refractive index Yes 100ng-1µg 10ng Conductivity Yes 500pg-1ng 500ng Mass spectrometry Yes 100pg-1ng 1pg FT-IR Yes 1µg 100ng Light scattering Yes 10µg 500ng Optical activity No - 1ng Element selective No - 10ng Photoionisation No - 1pg-1ng 153

154 154

155 DAD 155

156 156

157 157

158 158

159 RI detektor: törésmutató mérés 159

160 ELSD: evaporating light scattering detector 160

161 161

162 CAD: Corona Charged Aerosol Detector (CAD ) 162

163 163

164 wall-jet detektor Elektromos vezetőképességi detektor MS detektorok 164

165 A HPLC gyakorlati alkalmazásai Környezeti analízis (víz, talaj, hulladék) Gyógyszeranalízis hatóanyagok metabolitkutatás Késztermék analízis Élelmiszer elemzés Szermaradvány vizsgálatok Technológiai termékek elemzése Fehérjekutatás és analízis 165

166 Gyakorlati példák 166

167 167

168 Drotaverin HCl illékony szennyezőinek HS-GC- MS meghatározása O HCl O N O gőztér V G 1/2 C 2 H 5 OH O termosztáló folyadék T= állandó minta,, m, c i,l V L o i Simaizom görcsoldó tárolás közben etil-klorid képződik 168

169 Megengedett etil-klorid koncentráció a Drotaverin hatóanyagban: 750 ppm Kapilláris kolonna: DB mx0,2mmx1,12µm (6% cianopropilfenil- 94% polidimetilsziloxán) Hőprogram: 40 o C izoterm 1 percen át, majd 5 o C/perc felfűtési sebesség 15 o C-ig Oldószer: DMSO Termosztálási hőmérséklet: 80 o C, idő 20 perc, mintabevitel 1 ml Detektor: MS Etilklorid pa Minutes 169

170 170

171 Filmtabletta analízise gyulladásgátló, lázcsillapító 171

172 172

173 Ibuprofen melléktermékeinek az elválasztása Oszlop: 150 4,6 mm; C18 álló fázis (5 µm) (Ajánlott: BDS Hypersil C18 5µm) Eluens:tisztított víz acetonitril ortofoszforsav = 600 : 340 : 0,5; az elegyedési egyensúly beállta után tisztított vízzel 1000 térfogategységre hígítva. Áramlási sebesség: 2,0 ml/min Hullámhossz: 214 nm Hőmérséklet: 25 C Mérés időtartama: 40 perc Injektált térfogat: 20 µl 173

174 174

175 Aceclofenac: gyulladásgátló Impurity A Impurity B Impurity C Impurity D Impurity E Impurity F Impurity G Impurity H Impurity I 175

176 Log D - ph diagram Aceclofenac Impurity A Log D ph Impurity B Impurity C Impurity D Impurity E Impurity F Impurity G Impurity H Impurity I gyakorlatilag semleges Imp. B, C, D, E, F semleges Imp. I gyenge sav Aceclofenac, Imp. A, G H 176

177 Aceclofenak és szennyezéseinek az analízise mau 25 *VWD1 A, Wavelength=275 nm (ACEC0414\ D - ACEC0414\ D) min 1. Impurity A 2. Aceclofenac 3. Impurity G 4. Impurity H 5. Impurity I 6. Impurity D 7. Impurity B 8. Impurity E 9. Impurity C 10. Impurity F 177

178 A mennyiségi elemzés alapjai A i a i Ai = m i tg = a i a i A = i c i A a i i A a i i m c i i A J i, 0 KH i KFHi m i c i l. kalibrációs módszer, 2. addíciós módszer 3. belső standard módszer 178

179 Ajánlott irodalom: Dr. Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Edison House Kft., Budapest, Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft., Budapest,