3. MegvizsgÄltuk a kapszaicin-årzåkeny idegek szerepåt a krçnikus thiazolidinedione teräpia

Átírás

1 SZAKMAI ZÄRÅ BESZÄMOLÅ A pälyäzat munkatervåben 4 cål megvalçsétäsät fogalmaztunk meg, melyek elvågzåsåvel pontosabb betekintåst kaptunk a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek szånhidrät anyagcseråben betñltñtt szerepåre vonatkozçan. Az eredeti munkatervnek megfelelően az elvågzett késårletek az aläbbiak szerint 4 råszre tagolçdtak: 1. MegvizsgÄltuk, hogy a 2-es tépusü cukorbetegsågben a hasnyälmirigy inzulintermelő båta sejtjeinek szämänak csñkkenåsåben Ås az inzulin rezisztencia kialakuläsäban a kapszaicin- ÅrzÅkeny szenzoros rostok milyen szerepet jätszanak. 2. MegvizsgÄltuk, hogy a hasnyälmirigyet szenzoros idegekkel ellätç gerincvelői hätsç gyñki idegdüc (dorsal goot ganglia, rñviden: DRG) lokälis kapszaicin kezelåse lassétja-e a betegsåg progressziçjät 3. MegvizsgÄltuk a kapszaicin-årzåkeny idegek szerepåt a krçnikus thiazolidinedione teräpia hatåkonysägäban 4. MintÄkat gyűjtànk annak vizsgälatära, hogy az emberi hasnyälmirigyben hogyan vältozik a Langerhans szigetsejtek neuropeptid- Ås hormon tartalma A kapott eredmånyeimet az aläbbiakban foglalom Ñssze, råszletesen kitårve az alkalmazott vizsgälati mçdszerekre, a kapott eredmånyekre valamint az ezen eredmånyekre tämaszkodç, toväbbi kutatäsi lehetősågekre Ås azok gazdasägi hasznoséthatçsägära, valamint (amennyiben volt) a tervezettől valç eltårås okära. Ad 1. Annak vizsgälata, hogy a NIDDM-ban a båta sejtek szämänak csçkkenåsåben Ås az inzulin rezisztenciäban a kapszaicin ÅrzÅkeny szenzoros rostok milyen szerepet jätszanak. A késårlethez Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) patkänyokat hasznältunk, melyeket standard ÄllathÄzi kñràlmånyek kñzñtt (12-12 ÇrÄs nappal-åjszaka periçdus, âc, 50-70% relatév päratartalom, standard laboratçriumi täp Ås csapvéz) tartottunk. E modell Ällatok jellegzetessåge, hogy a CCK-1 receptor genetikai hibäja kñvetkeztåben az Ällatok folyamatosan esznek, elhéznak Ås ez inzulin rezisztenciähoz Ås vågàl NIDDM-hez vezet (1). Az Ällatokat 6 hetes korukban (ÅrkezÅst kñvetően 1 håttel) 2 csoportra osztottuk (csoportonkånt Ällattal), az egyik csoportot

2 szisztåmäsan kapszaicinnel (läsd aläbb), még a kontroll csoportot a kapszaicin vivőanyagäval a koräbban mär leért mçdon (2) előkezeltàk E kezelåst kñvetően az Ällatok metabolikus paramåtereit folyamatosan regiszträltuk 19 håten keresztàl. Ennek sorän heti rendszeressåggel meghatäroztuk a testsülyban bekñvetkezett vältozäst, az Ätlagosan elfogyasztott napi Åtel Ås véz mennyisågåt valamint az àrétett szåklet Ås vizelet mennyisågåt. Az anyagcsere paramåterek måråsåt metabolikus ketrec (Tecniplast, OlaszorszÄg) felhasznäläsäval vågeztàk. A kezelåst kñvető 18. håten orälis glàkçz tolerancia tesztet vågeztànk, majd ezt 1 håttel kñvetően hyperinzulinåmiäs euglikåmiäs glàkçz clamp måråst vågeztànk, illetve mindkåt kezelåsi csoportbçl 3-3 Ällatban 3 H-glàkÇz felhasznäläsäval meghatäroztuk a bazälis (Åhgyomri) Ås a HEGC steady state Ällapotban az inzulin stimulält endogån glàkçz termelåst. Az Åhgyomri vårcukor Ås plazma inzulin eredmånyekből meghatäroztuk a hasnyälmirigy sejteinek funkciçjära utalç HOMA-B% indexet. ALKALMAZOTT MÅDSZEREK Kapszaicin előkezelés Az Ällatokat elbçdétottuk (30 mg/kg pentobarbital ip), majd a dorsalisan subcutan a nyak bőre alä 50 mg/kg kapszaicin fecskendeztànk. A teljes ÅbersÅgi Ällapot visszatåråse utän az Ällatok visszakeràltek az ÄllathÄzba. A kezelås sikeråt a szembe cseppentett kapszaicinre adott välasz hiänya igazolta. Csak olyan Ällatot vontunk be a kapszaicinnel kezelt csoportba, amelyeknål ily mçdon sikeràlt a kapszaicin előkezelås hatåkonysägät visszaigazolni. A kontroll csoportot hasonlç mçdon, a kapszaicin oldçszeråvel kezeltàk (fiziolçgiäs sçoldat, Tween 80 Ås etanol 8:1:1 aränyü oldata). Metabolikus vñltozök meghatñrozñsa A metabolikus paramåterek meghatärozäsähoz metabolikus ketrecet (Tecniplast, OlaszorszÄg) hasznälunk Ås a kñvetkező paramåterek måråsåt foglalja magäba: napi testsüly vältozäs (g), naponta elfogyasztott täp (g) Ås véz mennyisåge (ml), napi àrétett vizelet (ml) Ås szåklet (g) mennyisåge. E paramåterek meghatärozäsät 3 napos (påntek-vasärnap) akklimatizäciç előzi meg. OrÑlis GlÜkÖz Tolerancia Teszt Az Ällatokat a késårlet előtti nap eståjåtől (kb. 16 ÇrÄn Ät) Åheztettàk. A késårlet napjän a farok vånäjäbçl nyert vånäs vårből meghatäroztuk az Åhgyomri vårcukorszintet, majd orälisan

3 gyomorszondän keresztàl 1g/kg glàkçzt adtunk Ås az ezt kñvető 15., 30., Ås 120. percben a farokvånäbçl nyert vårből meghatäroztuk a vårcukor szintet. A késårlet vågån az Ällatok visszakeràltek az ÄllathÄzba. Teljes test inzulinérzékenység meghatñrozñsa A teljes test inzulinårzåkenysåg meghatärozäsära hyperinzulinåmiäs euglikåmiäs glàkçz clamp (HEGC) mçdszerrel, a kapszaicinnel vagy oldçszerrel tñrtånt előkezelåst kñvető 19. håten keràlt sort (3). A késårletet megelőzően az Ällatokat 16 ÇrÄn Ät Åheztettàk, majd tiopentällal (Trapanal 50mg/kg, i.p.) elaltattuk. Behelyeztànk 2 vånäs kanàlt a våna juguläris kåt szäräba cukor Ås inzulin adäs cåljäbçl, egy artåriäs kanàlt vårvåtel (vårcukor Ås plazma inzulin meghatärozäshoz) valamint szisztåmäs vårnyomäsmårås cåljäbçl illetve lågcső kanàlt, az ÄtjÄrhatÇ lågutak biztosétäsa cåljäbçl. A műtåtet kñvetően az Ällatokat kb. 30 percig magukra hagytuk, hogy az esetlegesen a műtåt sorän fellåpő stressz hatäsa lecsillapodjåk. Ezt kñvetően vårt vettànk (1 ml) az Åhgyomri vårcukor Ås a plazma inzulin meghatärozäshoz, majd elindétottuk az inzulin infüziçt 6 mu/kg/min sebessåggel. Az inzulin infüziç 120 percen keresztàl tartott, ez alatt az idő alatt a vårcukorszinten 5-10 percenkånt ellenőriztàk Ås az inzulininfüziçval pärhuzamosan elindétott cukorinfüziç sebessågåt Ügy vältoztattuk, hogy a vårcukor ÅrtÅke folyamatosan 5.5ä0.5 mmol/l maradjon. A 120. perc vågån Üjra vårvåtel tñrtånt plazma inzulinszint meghatärozäshoz. A teljes test inzulinårzåkenysåget a 90. Ås 120. perc kñzñtt mårt Ätlagos cukorinfüziçs sebessåg (mg/kg/min) jellemzi. A HEGC vågån az Ällatokat tülaltattuk (thiopental 100 mg/kg iv). A vårcukor meghatärozäs 1 csepp vårből tñrtånt glàkçz oxidäz mçdszer segétsågåvel (Accu Check Active, Roche, MagyarorszÄg). BazÑlis És Inzulin-stimulÑlt EndogÉn CukortermelÉs MeghatÑrozÑsa A műtåti előtti előkåszàletek Ås a műtåt sorän elvågzett beavatkozäsok mindenben megegyeznek a HEGC sorän leértakkal, azzal az eltåråssel, hogy egy 3. vånäs kanàl keràlt beàltetåsre a 3 H-glàkÇz infüziç szämära. A műtåtet kñvető nyugalmi periçdus utän 5 Ci 3 H-glàkÇzt adtunk bolusban, majd 0.15 Ci/min sebessåggel folyamatos, 180 percig tartç infüziçt indétottunk. A radioaktév cukorinfüziç indétäsa előtt (a 0. percben), majd a 60., 120., 150., 160., 170. Ås 180. percben vårmintät vettànk a radioaktivitäs meghatärozäsa cåljäbçl. A 0. percben vett minta szolgält az Åhgyomri mintakånt a vårcukor Ås plazma inzulinszint illetve a HOMA indexek kiszämétäsähoz. A 60. percben levett minta alapjän szämétottuk a bazälis, még a perc kñzñtt levett mintäk ÄtlagÄbÇl az inzulin-stimulält endogån cukortermelås ÅrtÅkeket.

4 Plazma inzulinszint meghatñrozñs, HOMA-IR És HOMA-B% indexek A késårlet elejån, az inzulin infüziç megkezdåse előtt, valamint a HEGC steady state ( perc) alatt keràlt sor vårvåtelre plazma inzulinszint meghatärozäs cåljäbçl. A levett vårt (4 âc, 2 perc, rpm) lecentrifugäztuk Ås a plazmät levettàk Ås lefagyasztottuk -70 âc-ra amég nem keràlt sor az inzulinszint meghatärozäsra. A plazma inzulinszintet kereskedelmi forgalomban kaphatç RIA kitt segétsågåvel hatäroztuk meg (4). A HOMA-IR index meghatärozäs a szervezet inzulinårzåkenysågånek meghatärozäsära szolgälç egyszerű mçdszer, mely az Åhgyomri inzulin Ås vårcukorszint ismerete alapjän ad felvilägosétäst a teljes test inzulinårzåkenysågre (Åhgyomri vårcukor (mmol/l) x Åhgyomri plazma inzulin ( U/ml)/22.5). MinÅl alacsonyabb ez az ÅrtÅk, az inzulinårzåkenysåg annäl jobb (5). A HOMA-B% index a hasnyälmirigy inzulintermelő sejtjeinek a szekråciçs kapacitäsärçl ad felvilägosétäst Ås az aläbbi kåplet szerint szämétandç: Åhgyomri plazma inzulinszint ( U/ml) x 20/(Åhgyomri vårcukor (mmol/l)-3.5). MinÅl magasabb ez az ÅrtÅk, a sejtek szekråciçja annäl kifejezettebb (5). Statisztika Az eredmånyek a statisztikai Ätlagot Ås annak a standard deviäciçjät mutatjäk. A statisztikai szämétäst ANOVA szerint vågeztàk, majd Bonferroni szerint mçdosétott t-prçbät vågeztànk. Akkor tekintettànk valamit szignifikäns eltåråsnek, ha p<0.05 volt (6). EREDMáNYEK A kapszaicin kezelés hatñsa a metabolikus vñltozökra A kapott eredmånyeket az 1. Äbra illetve az 1. täbläzatban foglaltam Ñssze. A kapszaicin előkezelt csoport testsülynñvekedåse elmaradt az oldçszerrel kezelt kontroll csoporttçl, mely eltårås a kezelåst kñvető 15 håten vält szignifikänssä. A tñbbi metabolikus vältozçban nem mutatkozott statisztikailag szignifikäns kàlñnbsåg.

5 600 Control Capsaicin pretreated Body weight (g) week 1. Ñbra. A kapszaicin előkezelés hatñs a testsàly vñltozñsñra OLETF patkñnyban. A -gal jelâlt ÉrtÉkek szignifikñns eltérést mutatnak az oldöszerrel kezelt kontroll csoport hasonlö ÉrtÉkeitől. Elfogyasztott tñp (g) Elfogyasztott väz (ml) ãrätett széklet (g) ãrätett vizelet (ml) Kontroll 32.3ä ä ä ä1.9 Kapszaicin kezelt 31.9ä ä ä ä tñblñzat. A kapszaicin előkezelés hatñsa a metabolikus vñltozökra OLETF patkñnyban. Az egyes âsszetartozö ÉrtÉkek kâzâtt nincs statisztikailag szignifikñns eltérés. A kapszaicin kezelés hatñsa a vércukorvñltozñsra OrÑlis GlÜkÖz Tolerancia Teszt sorñn A kapszaicinnel kezelt Ällatok Åhgyomri vårcukorårtåke valamivel alacsonyabbnak adçdott, mint a kontroll csoportå, azonban nem Årt statisztikailag szignifikäns szintet. Ugyanakkor az orälis glàkçzterhelåsre kapott vårcukor emelkedås a kapszaicin kezelt Ällatokban szignifikänsan kisebb volt, amit mutat az egyes időpontokban mårt alacsonyabb vårcukorårtåk (2. Äbra.) illetve a gñrbe alatti teràletek kñzñtti szignifikäns kàlñnbsåg is mutat (kontroll: 1844ä124 vs kapszaicin kezelt: 1287ä87).

6 30 25 Control Capsaicin pretreated Blood glucose (mmol/l) Ñbra. A kapszaicin előkezelés hatñs a vércukorvñltozñsra OGTT sorñn OLETF patkñnyban. A -gal jelâlt ÉrtÉkek szignifikñns eltérést mutatnak az oldöszerrel kezelt kontroll csoport hasonlö ÉrtÉkeitől. A kapszaicin kezelés hatñsa a teljes test inzulinérzékenységre valamint a bazñlis És inzulin-stimulñlt cukortermelésre A kapszaicinnel kezelt Ällatok perifåriäs szñveteinek inzulin iränti ÅrzÅkenysÅge szignifikänsan javult a kontroll OLETF patkänyokhoz kåpest (3. Äbra), azonban nem Åri el az egåszsåges patkänyokban mårhető szintet (Long Evans Tokushima Otsuka (LETO) patkäny inzulinårzåkenysåge HEGC alatt: 28.2ä3.5 mg/kg/min koräbbi késårletek alapjän).

7 Glucose infusion rate (mg/kg/min) Control Capsaicin pretreated 3. Ñbra. A kapszaicin előkezelés hatñsñra a teljes test inzulinérzékenység szignifikñnsan javul OLETF patkñnyban HEGC mérés sorñn. A -gal jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutatnak az oldöszerrel kezelt kontroll csoport hasonlö ÉrtÉkÉtől. HasonlÇ eredmånyt kaptunk, amikor 3 H-glàkÇz felhasznäläsäval meghatäroztuk a bazälis Ås inzulinstimulält endogån cukortermelåsårtåkeit. A kapott eredmånyek arra utalnak, hogy a kapszaicin kezelt Ällatokban kevåsbå sülyos inzulinrezisztencia alakul ki a kontroll OLETF patkänyokhoz kåpest (2. täbläzat). BazÑlis endogén glüköz termelés (mg/kg/min) Inzulin stimulñlt endogén glüköz termelés (mg/kg/min) Kontroll 7.54ä ä1.2 Kapszaicin kezelt 12.9ä ä tñblñzat. A kapszaicin előkezelés hatñs a vércukorvñltozñsra OGTT sorñn OLETF patkñnyban. A -gal jelâlt ÉrtÉkek szignifikñns eltérést mutatnak az oldöszerrel kezelt kontroll csoport hasonlö ÉrtÉkeitől. A kapszaicin kezelés hatñsa az Éhgyomri vércukor És plazma inzulin ÉrtÉkekre illetve az ezekből szñmätott HOMA-IR És HOMA-B% indexekre

8 A kapszaicin kezelt Ällatok Åhgyomri vårcukorszintje alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportå, azonban az eltårås nem Årte el a statisztikailag szignifikäns szintet. Az Åhgyomri plazma inzulinszint a kapszaicin kezelt Ällatokban szintån alacsonyabb volt, mint a kontroll OLETF ÄllatokÅ (3. täbläzat). Ugyanakkor az egåszsåges LETO patkänyok vårcukor (4.2ä0.6 mmol/l) Ås plazma inzulinszintje (13.3ä2.3 U/ml) szignifikänsan alacsonyabb, mint a kapszaicin kezelt OLETF ÄllatokÅ (a LETO adatok nem e pälyäzat keretåben kåszàltek). áhgyomri áhgyomri plazma HOMA-IR HOMA-B% vércukorszint inzulinszint ( U/ml) (mmol/l) Kontroll 6.6ä ä ä ä36 Kapszaicin kezelt 5.7ä ä ä ä32 3. tñblñzat. A kapszaicin előkezelés hatñs az Éhgyomri vércukor És plazma inzulinszintre illetve az ezen ÉrtÉkek alapjñn szñmätott HOMA-IR És HOMA-B% indexekre. A -gal jelâlt ÉrtÉkek szignifikñns eltérést mutatnak az oldöszerrel kezelt kontroll csoport hasonlö ÉrtÉkeitől

9 Ad. 2. Annak vizsgälata, hogy a pankreäszt szenzoros idegekkel elläté DRG lokälis kapszaicin kezelåsåvel elårhető-e a betegsåg progressziéjänak lassötäsa A késårlethez non-obese diabetic (NOD) egereket hasznältunk, melyeket standard ÄllathÄzi kñràlmånyek kñzñtt (12-12 ÇrÄs nappal-åjszaka periçdus, âc, 50-70% relatév päratartalom, standard laboratçriumi täp Ås csapvéz) tartottunk. E modell Ällatok jellegzetessåge, hogy az elhézäs kñvetkeztåben a humän 2-es tépusü cukorbetegsågre jellemző tàneteket produkäljäk. Az Ällatokat 3 csoportra osztottuk (csoportonkånt Ällattal), az egyik csoportot szisztåmäsan, egy mäsikat lokälisan kezeltàk kapszaicinnel (läsd aläbb), még a kontroll csoport a kapszaicin oldçszeråt (läsd fentebb) kapta szubkutän. ALKALMAZOTT MÅDSZEREK Kapszaicin előkezelés A szisztåmäs kapszaicin előkezelåst ugyanügy csinältuk, mint az OLETF patkänyok esetåben (läsd fentebb). A lokälis kapszaicin kezelåskor Ällatokat elbçdétottuk (30 mg/kg pentobarbital ip), majd a dorsalisan a gerinc mentån a thoracalis 8-11 szakasz mentån felkerestàk a hätsç gyñki idegdücokat Ås kapszaicinnel Ätitatott vatta darabot helyeztànk kñråjàk 20 percre, majd eltävolétottuk Ås a sebet aszeptikus kñràlmånyek kñzñtt bezärtuk. A kezelås sikeråt a szembe cseppentett kapszaicinre adott välasz meglåte illetve a TRPV1 pozitév szenzoros idegek hasnyälmirigybeli hiänya igazolta. AzokbÇl a kapszaicinnel kezelt ÄllatokbÇl nyert minden eredmånyt kizärtuk, ahol a post mortem elvågzett szñvettani vizsgälat TRPV1 pozitév idegeket mutatott a hasnyälmirigyben (hatästalan lokälis kapszaicin kezelås). Az oldçszerrel kezelt kontroll csoportot az OLETF patkänyoknäl ismertetett mçdon, a kapszaicin oldçszeråvel kezeltàk (fiziolçgiäs sçoldat, Tween 80 Ås etanol 8:1:1 aränyü oldata). Szâvettani És immunhisztokémiai vizsgñlat Az Ällatokat elvåreztettàk Ås hasi feltäräsbçl eltävolétottuk a hasnyälmirigyet, amit 4%-os formalinos fixälç oldatba tettànk 24 ÇrÄra, majd felszällç alkoholsorozat segétsågåvel a vizet eltävolétottuk Ås vågàl a mintäkat paraffinba Ägyaztuk. Ezt kñvetően keràlt sor a metszetek elkåszétåsåre, melyeken a vizsgälat cåljätçl fàggően vagy haematoxilin eozin feståst vågeztànk a T sejtes infilträciç mårtåkånek

10 kimutatäsära vagy immunfluoreszcens feståst a TRPV1 Ås CGRP pozitév idegek kimutatäsära. Az T- sejtes infilträciç mårtåkånek megällapétäsähoz 3 egymästçl fàggetlen megfigyelő legaläbb 200 sziget T-sejtes infilträciçjänak kiterjedåsåt ÅrtÅkelte az aläbbi pontrendszer szerint: 0 pont, ha normälis Langerhans sziget, 1 pont, ha sziget kñràli gyulladäs kiterjedåse kevesebb, mint 25%, 2 pont, ha az infilträciç mårtåke 25-50% Ås 3 pont, ha az infilträciç kiterjedåse tñbb, mint a sziget teràletånek 50% (7). Plazma inzulinszint meghatñrozñs, HOMA-IR És HOMA-B% indexek A késårlet elejån keràlt sor vårvåtelre Åhgyomri vårcukor Ås plazma inzulinszint meghatärozäs cåljäbçl. A vårcukor meghatärozäs 1 csepp vårből tñrtånt glàkçz oxidäz mçdszer segétsågåvel (Accu Check Active, Roche, MagyarorszÄg). A levett vårt (4 âc, 2 perc, rpm) lecentrifugäztuk Ås a plazmät levettàk Ås lefagyasztottuk -70 âc-ra amég nem keràlt sor az inzulinszint meghatärozäsra. A plazma inzulinszintet kereskedelmi forgalomban kaphatç RIA kitt segétsågåvel hatäroztuk meg (4). A HOMA-IR index meghatärozäs a szervezet inzulinårzåkenysågånek meghatärozäsära szolgälç egyszerű mçdszer, mely az Åhgyomri inzulin Ås vårcukorszint ismerete alapjän ad felvilägosétäst a teljes test inzulinårzåkenysågre (Åhgyomri vårcukor (mmol/l) x Åhgyomri plazma inzulin ( U/ml)/22.5). MinÅl alacsonyabb ez az ÅrtÅk, az inzulinårzåkenysåg annäl jobb (5). A HOMA-B% index a hasnyälmirigy inzulintermelő sejtjeinek a szekråciçs kapacitäsärçl ad felvilägosétäst Ås az aläbbi kåplet szerint szämétandç: Åhgyomri plazma inzulinszint ( U/ml) x 20/(Åhgyomri vårcukor (mmol/l)-3.5). MinÅl magasabb ez az ÅrtÅk, a sejtek szekråciçja annäl kifejezettebb (5). EREDMáNYEK A szisztémñs És lokñlis kapszaicin kezelés hatñsa a hasnyñlmirigyet ellñtö hñtsö gyâki idegdàc idegeire És a Langerhans szigetek T-sejtes infiltrñciöja A kapszaicin oldçszerrel kezelt ÄllatoknÄl a hasnyälmirigy Langerhans szigetei kñràl TRPV Ås CGRP pozitév neuronokat lehetett kimutatni, még a szisztåmäs Ås lokälis DRG kapszaicin előkezelt Ällatokban e neuron populäciç nem volt kimutathatç (4. Ås 5. Äbra). A Langerhans szigetek gyulladäsos infilträciçjänak ÅrtÅkelÅsekor az insulinitis kifejezett volt (2.17ä0.06 pont) az oldçszerrel kezelt

11 csoportban, ugyanakkor a T-sejtes infiltr ci nagym rt kben lecs kkent mind a sziszt m s (0.23Š0.1 pont), mind a lok lis DRG kapszaicin előkezel s (0.31Š0.2 pont) hat s ra (6. s 7. bra). 4. bra. Hasny lmirigy Langerhans szigetsejtet beidegző szenzoros idegfonat CGRP tartalmˆ rostjainak kimutat sa 40-szeres nagyšt s mellett. 5. bra. Langerhans szigetsejt negatšv kontroll, nincsenek z lden festődő, CGRP tartalmˆ szenzoros idegek. 6. bra. NOD egƒr egƒszsƒges Langerhans szigete. 7. bra. NOD egƒr fehƒrvƒrsejtekkel infiltr lt Langerhans sziget. A limfocit k a sziget peremƒn lƒvő s tƒt magok, mšg a sziget belseje nem infiltr lt.

12 A szisztémñs És lokñlis kapszaicin kezelés hatñsa az inzulinérzékenységre És a sejt funkciöra A kontroll csoport Åhgyomri vårcukor Ås plazma inzulin szintje szignifikänsan emelkedett az egåszsåges egårre (C57BL ezen egerekből szärmazç eredmånyek koräbbi vizsgälatok sorän szàlettek) jellemző ÅrtÅkekhez (vårcukor: 4.3ä0.6 mmol/l ill. 11.3ä2.1 U/ml) kåpest. VÉrcukor Plazma inzulin HOMA-IR HOMA-B% (mmol/l) ( U/ml) Kontroll 10.4ä ä ä ä9.5 SzisztÉmÑs Kapszaicin 6.7ä ä ä ä12.4 LokÑlis Kapszaicin 7.2ä ä ä ä tñblñzat. A szisztémñs És lokñlis kapszaicin kezelés hatñs az Éhgyomri vércukor És plazma inzulinszintre illetve az ezen ÉrtÉkek alapjñn szñmätott HOMA-IR És HOMA-B% indexekre. A -gal jelâlt ÉrtÉkek szignifikñns eltérést mutatnak az oldöszerrel kezelt kontroll csoport hasonlö ÉrtÉkeitől.

13 Ad 3. Annak vizsgälata, hogy a kapszaicin-årzåkeny idegek szerepet jätszanak-e a krénikus thiazolidinedione teräpia hatåkonysägäban Ebben a késårlet sorozatban OLETF Ås Wistar patkänyokat hasznältunk, melyeket a koräbban råszletezett mçdon tartottunk ÄllathÄzban. ALKALMAZOTT MÅDSZEREK A 2-es töpusü diabetes modell: Az OLETF patkänyok esetåben a szisztåmäs kapszaicin kezelåst (läsd fentebb) az Ällatok 6 hetes koräban vågeztàk, majd ezt 12 hetes, 3 mg/kg per os adott roziglitazon (Avandiaå) kezelås kñvette. Az Avandia kontrolljakånt az Ällatok csapvizet kaptak, ugyanolyan volumenben, mint amennyiben az AvandiÄt adtuk. A vizsgälat sorän az OLETF Ällatok kñzñtt 4 csoport keràlt kialakétäsra (läsd: 6. Äbra). Az 1-es töpusü diabetes modell: A Wistar patkänyokat 6 hetes korukban intraperitoneälisan 70 mg/kg streptozotocinnal illetve a koräbban leért mçdon kapszaicinnel kezeltàk. Ezt kñvetően 12 håten Ät napi 1 alkalommal per os 3 mg/kg roziglitazonnal (Avandia) kezeltàk az Ällatokat. Az Avandia kontrolljakånt az Ällatok csapvizet kaptak, ugyanolyan volumenben, mint amennyiben az AvandiÄt adtuk. A vizsgälat sorän a Wistar Ällatok kñzñtt 6 csoport keràlt kialakétäsra (läsd: 6. Äbra). EgÅszsÅges kontroll csoportkånt hasonlç ÅletkorÜ Wistar patkänyok szolgältak. A kezelås vågån a koräbban ismertetett menet szerint HEGC-et vågeztànk teljes test inzulinårzåkenysåg meghatärozäs cåljäbçl. A HOMA-IR Ås HOMA-B% indexek ÅrtÅkeit a HEGC elejån levett Åhgyomri vårcukor Ås plazma inzulinszintek alapjän szämétottuk a koräbban råszletezett mçdon. Minden csoportban Ällat volt. ImmunhisztolÖgia És Radioimmunoassay Az immunhisztologiai vizsgälatot a koräbban leért mçdon vågeztàk el. A hasnyälmirigy neuropeptid tartalmänak kvantitatév meghatärozäsähoz radioimmunoassay (RIA) mçdszert hasznältuk. Ennek sorän az Ällatok kivåreztetåse utän kivett hasnyälmirigy mintäkat azonnal lefagyasztottuk folyåkony nitrogån segétsågåvel a toväbbi vizsgälatok elvågzåsåig. A mintäkat felolvasztäst kñvetően homogenizältuk, lecentrifugältuk Ås a felàlüszçt eltävolétottuk RIA mårås cåljära. Az egyes neuropeptidek (SP, CGRP) meghatärozäsära sajät fejlesztåsű RIA assay Ällt rendelkezåsànkre (8;9).

14 A kapszaicin-érzékeny szenzoros idegek funkciöjñnak vizsgñlata izolñlt szervi preparñtumon Az inzulinårzåkenysåg meghatärozäsät kñvetően az Ällatokat kivåreztettàk, majd a lågcsñvet a gågeporc Ås a 2 főhñrgő kñzñtti szakaszon kipreparältuk Ås megtisztétottuk a kñrnyező kñtőszñvetektől. Minden esetben kåt, azonos kezelåsi csoportba tartozç ÄllatbÇl szärmazç lågcső preparätumot tettànk egy szervfàrdőbe. Ezt kñvetően a szervfàrdőben a preparätumokat Ätmostuk oly mçdon, hogy 60 percen keresztàl 1 ml/perc sebessåggel 37 âc-os, 7.2 ph-jü, oxigenizält (95% O2, 5% CO2) Krebs oldatot (NaCl mm, KCl 4.7 mm, MgSO4 1.0 mm, KH2PO4 1.0 mm, CaCl2 2.5 mm, NaHCO mm, glàkçz 11.1 mm) Äramoltattunk Ät a szervfàrdőn (1.8 ml). Az egy Çra letelte utän az ÄtmosÄst leällétottuk. Ezt kñvetően indult a késårlet Årdemi råsze, mely 3, egyenkånt 8 percig tartç råszből tevődñtt Ñssze Ås mindegyik råsz a szervfàrdő folyadåk ÑsszegyűjtÅsÅvel Årt våget. A szervfàrdő folyadåk ÑsszegyűjtÅsÅt kñvetően a szervfàrdőt Ätmostuk, majd Üjra feltñltñttàk. Az első råsz az Ün. ingerlås előtti frakciç volt, a mäsodik az ingerlås alatti, még a harmadik frakciç az ingerlås utäni volt. Az ingerlås tåringerlåst jelentett Ås a kñvetkező paramåterekkel tñrtånt: 40V, 0.1 ms, 10 Hz, 120 mp. A levett mintäkat jåghideg csñvekbe tettàk, hogy az enzimatikus fehårje degradäciçt megakadälyozzuk. Ezt kñvetően a lågcsñvek nedves sülyät lemårtàk. A levett szervfàdő mintäkbçl tñrtånt a substance P (SP) Ås a CGRP meghatärozäs a koräbban leért metodika szerint (8;9). A kapott eredmånyeket a lågcső nedves tñmegåre vonatkoztatva adtuk meg (fmol/mg). EREDMáNYEK A roziglitazon kezelés hatñsa az inzulin ÉrzÉkenysÉgre Mind az OLETF (2-es tépusü cukorbeteg modell), mind az STZ-vel kezelt (1-es tépusü cukorbeteg modell) Ällatok inzulinårzåkenysåge szignifikänsan alacsonyabb volt, mint a kontrollnak tekintett egåszsåges Wistar patkänyokå. Ugyanakkor a szisztåmäs kapszaicin kezelås minden inzulin rezisztens csoportban az inzulinårzåkenysåg javuläsät eredmånyezett, még az egåszsåges Wistar patkänyok inzulinårzåkenysågåt nem befolyäsolta. A 3 hçnapos, 3 mg/kg per os roziglitazon kezelås javuläst eredmånyezett az egyes inzulin rezisztens csoportok inzulinårzåkenysågåben, azonban ez statisztikailag szignifikäns szintet csak a kapszaicin oldçszerrel kezelt csoportokban eredmånyezett, a kapszaicin kezelteknål a javuläs nem Årte el a szignifikäns szintet. Az egåszsåges Wistar patkänyok inzulinårzåkenysågåt sem a kapszaicin előkezelås, sem a roziglitazon kezelås (ezek az adatok nincsenek benne a grafikonban) nem befolyäsolta (8. Äbra).

15 Glucose infusion rate (mg/kg/min) Vehicle treated Capsaicin treated OLETF # OLETF Avandia Wistar Wistar STZ # Wistar STZ Avandia 0 8. Ñbra. A thiazolidinedion kezelés (3 mg/kg roziglitazon; Avandia) hatñsa az 1-es És 2-es täpusà cukorbetegség Ñllatmodelljeinek inzulinérzékenységére kapszaicin előkezelés nélkül illetve mellette. A -gal jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat az âsszetartozö csoportok kâzâtt. A roziglitazon kezelés hatñsñra az 1- es És 2-es täpusà cukorbeteg Ñllatmodellek inzulinérzékenysége minden esetben javult, bñr statisztikailag szignifikñns ÉrtÉket nem Érte el. A #-el jelâlt oszlopok szignifikñns eltérést mutatnak a csapväzzel (roziglitazon oldöszere) kezelt csoporthoz képest. A thiazolidinedione terñpia hatñsa a szigetsejtek szenzoros neuropeptid tartalmñra A kapszaicinnek kezelt Ällatokban a Langerhans szigetek kñràl vågződő szenzoros idegek nem voltak kimutathatçak Ås a RIA meghatärozäs sorän sem Årte el a neuropeptid tartalom az ÅrzÅkelÅs alsç hatärät, Égy azokat nem mutatom be ÄbrÄn. Az kapszaicin oldçszeråvel kezelt OLETF Ås STZ patkänyokban a TRPV Ås CGRP pozitév idegek kimutathatçak voltak a Langerhans szigetek kñràl, még a RIA meghatärozäs sorän az egåszsåges kontrollhoz kåpest a CGRP tartalom emelkedett, még a P anyag mennyisåge csñkkent. A roziglitazon kezelås hatäsära az OLETF patkänyok hasnyälmirigyåben meghatärozott emelkedett CGRP mennyisåg lecsñkkent, még a P anyag tekintetåben a roziglitazon kezelås nem okozott vältozäst (9. Ås 10. Äbra).

16 10 fmol/ g wet weight 5 # 0 Wistar OLETF OLETF Avandia STZ STZ Avandia 9. Ñbra. A krönikus TZD terñpia hatñsa a hasnyñlmirigy P anyag mennyiségére OLETF És STZ kezelt patkñnyban. A -gal jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat az egészséges Wistar patkñnyhoz képest. A #-el jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat a TZD-vel nem kezelt csoporthoz képest. 2,5 2,0 fmol/ g wet weight 1,5 1,0 0,5 0,0 Wistar OLETF # OLETF Avandia STZ STZ Avandia 10. Ñbra. A krönikus TZD terñpia hatñsa a hasnyñlmirigy CGRP mennyiségére OLETF És STZ kezelt patkñnyban. A -gal jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat az egészséges Wistar patkñnyhoz képest. A #-el jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat a TZD-vel nem kezelt csoporthoz képest. A krönikus TZD kezelés hatñsa a szenzoros idegek neuropeptid tartalmñra izolñlt szervi preparñtumban

17 Az egåszsåges Ällatokhoz viszonyétva a lågcső bazälis Ås stimulält P anyag tartalma lecsñkkent mind az OLETF, mind az STZ kezelt Ällatokban. A krçnikus TZD kezelås egyik csoportban sem okozott szignifikäns vältozäst a trachea P anyag mennyisågåben (11. Äbra). Ugyanakkor mäs a helyzet a CGRP tekintetåben. AZ OLETF patkänyok esetåben a bazälis Ås stimulält CGRP mennyisåg a kontrollhoz kåpest megemelkedett, még az STZ ÄllatoknÄl lecsñkkent. A krçnikus TZD kezelås hatäsära OLETF Ällatban a CGRP mennyisåg lecsñkkent (12. Äbra). 6 Basal Stimulated Basal TZD treated Stimulated TZD treated fmol/ g wet weight Control OLETF STZ 11. Ñbra. A krönikus thiazolidinedione terñpia hatñsa a trachea bazñlis És stimulñlt P anyag tartalmñra. A - gal jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat az âsszetartozö csoportok kâzâtt.

18 1,00 Basal Stimulated Basal TZD treated Stimulated TZD treated fmol/ g wet weight 0,75 0,50 0,25 # 0,00 Control OLETF STZ 12. Ñbra. A krönikus thiazolidinedione terñpia hatñsa a trachea bazñlis És stimulñlt CGRP tartalmñra. A -gal jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat az âsszetartozö csoportok kâzâtt. A #-el jelâlt ÉrtÉk szignifikñns eltérést mutat a TZD-vel nem kezelt csoport stimulñlt ÉrtÉkÉhez képest.

19 Ad 4. Annak vizsgälata, hogy humän hasnyälmirigy mintäban hogyan vältozik a szigetsejtek neuropeptid- Ås hormon tartalma Ez az a programpont, ahol nem sikeràlt elårni a kitűzñtt cåljainkat, mivel nem sikeràlt elegendő mintät Ñsszegyűjtenànk ahhoz, hogy statisztikailag is ÅrtÅkelhető eredmånyeket kapjunk. Azonban szeretnånk mindenkåppen lemårni a begyűjtñtt mintäkat, a pälyäzat futamidejåt kñvető időszakban. Az ehhez szàksåges vegyszerek Ås műszerek a rendelkezåsànkre Ällnak, a mintäk ÑsszegyűjtÅse folyamatban van. Ehhez a vizsgälathoz tumoros beteg rezekciçs műtåteinål a szåli Åp råszből nyert mintäkat gyűjtjàk. A cadaverből tñrtånő mintavåtelezåstől eltekintettànk a technikai nehåzsågek Ås a pancreas gyors ÑnemÅsztődÅse miatt. Azon tervànk, hogy IDDM Ås NIDDM-es betegekből szärmazç pankreäsz mintäkhoz juthassunk nem vält megvalçséthatçvä, mivel a pankreasz biopszia igen nagy kockäzattal jär Ås nem talältunk olyan sebåszi teamet, aki ezt felelőssåggel felvällalta volna. Ilyen mintavåtel lehetősåge a donäciçra keràlő agyhalottakbçl lenne lehetsåges, azonban az elmült időszakban nem jutottunk ilyen mintähoz.

20 åsszefoglaläs A vizsgälataink legfontosabb eredmånye annak igazoläsa, hogy a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek szerepet jätszanak az NIDDM kialakuläsäban azältal, hogy kçros funkciçjuk a perifåriäs szñvetek inzulin iränti csñkkenåsåhez Ås inzulin rezisztencia kialakuläsähoz vezet. Ugyanakkor a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek szerepåt a HOMA-B% index szämétäsa alapjän a -sejt funkciç romläsäban nem sikeràlt igazolni. Emellett elsőkånt igazoltuk, hogy a hasnyälmirigyet ellätç kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek a gerincvelői hätsç gyñki idegdücokbçl erednek. VÅgezetàl kimutattuk, hogy krçnikus thiazolidinedione teräpia hatäsära a hasnyälmirigy CGRP tartalma csñkken Ås P anyag tartalma nñvekedik, mely hatäsok hozzäjärulnak a TZD teräpia hatåkonysägähoz, azonban arra vonatkozçan nem sikeràlt egyårtelmű eredmånyt elårni, hogy a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegeknek szerepe van-e a TZD hatäs kialakuläsäban, hiszen a kapszaicin kezelt Ällatokban bär a TZD kezelås hatäsära az inzulinårzåkenysåg javuläst mutatott, azonban mårtåke nem Årte el a szignifikäns szintet. Ugyanakkor igazoltuk azt is, hogy a TZD kezelås nemcsak a hasnyälmirigyet ellätç kapszaicin ÅrzÅkeny Årző idegek funkciçjät befolyäsolja, hanem a szervezet egyåb helyein is, de legaläbbis a lågcső esetåben. Ennek jelentősågåt az adja, hogy a TZD kezelås a vårcukorszint javétäsa mellett, kåpes helyreällétani a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek lecsñkkent neuropeptid tartalmät. KÉsÅrleteinkkel igazoltuk a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek szerepåt a cukorbetegsåg Ås inzulin rezisztencia kialakuläsäban valamint, hogy a TZD kezelås inzulinårzåkenyétő hatäsäban a kçros szenzoros neuropeptid aränyok helyreällétäsa is szerepet jätszik. TovÄbbi késårleteket tervezànk arra vonatkozçan, hogy feltärjuk azokat a låpåseket melyek a kapszaicin-årzåkeny szenzoros idegek diszfunkciçjät ÑsszekapcsoljÄk a perifåriäs szñvetek inzulin rezisztenciäjänak kialakuläsäval.

21 IRODALMI HIVATKOZÄSOK 1. Kawano,K, Hirashima,T, Mori,S, Natori,T: OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) rat: a new NIDDM rat strain. Diabetes Res Clin Pract 24 Suppl:S317-S320, Peitl,B, Petho,G, Porszasz,R, Nemeth,J, Szolcsanyi,J: Capsaicin-insensitive sensory-efferent meningeal vasodilatation evoked by electrical stimulation of trigeminal nerve fibres in the rat. Br J Pharmacol 127: , Peitl,B, Nemeth,J, Pankucsi,C, Szilvassy,Z: Insulin sensitization induced by oral cicletanine in conscious rabbits. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 373: , Peitl,B, Dobronte,R, Nemeth,J, Mezey,G, Kovacs,P, Paragh,G, Szilvassy,Z: The prandial insulin sensitivity-modifying effect of vagal stimulation in rats. Metabolism 54: , Matthews,DR, Hosker,JP, Rudenski,AS, Naylor,BA, Treacher,DF, Turner,RC: Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 28: , Wallenstein,S, Zucker,CL, Fleiss,JL: Some statistical methods useful in circulation research. Circ Res 47:1-9, Winer,S, Tsui,H, Lau,A, Song,A, Li,X, Cheung,RK, Sampson,A, Afifiyan,F, Elford,A, Jackowski,G, Becker,DJ, Santamaria,P, Ohashi,P, Dosch,HM: Autoimmune islet destruction in spontaneous type 1 diabetes is not beta-cell exclusive. Nat Med 9: , Nemeth,J, Gorcs,T, Helyes,Z, Oroszi,G, Kocsy,T, Pinter,E, Szolcsanyi,J: Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological research. Neurobiology (Bp) 6: , Nemeth,J, Oroszi,G, Than,M, Helyes,ZS, Pinter,E, Farkas,B, Szolcsanyi,J: Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Neurobiology (Bp) 7: , Nemeth,J, Helyes,Z, Gorcs,T, Gardi,J, Pinter,E, Szolcsanyi,J: Development of somatostatin radioimmunoassay for the measurement of plasma and tissue contents of hormone. Acta Physiol Hung 84: , Nemeth,J, Jakab,B, Reglodi,D, Lubics,A, Jozsa,R, Hollosy,T, Tamas,A, Lengvari,I, Gorcs,T, Szolcsanyi,J: Comparative distribution of VIP in the central nervous system of various species measured by a new radioimmunoassay. Regul Pept 109:3-7, Jakab,B, Reglodi,D, Jozsa,R, Hollosy,T, Tamas,A, Lubics,A, Lengvari,I, Oroszi,G, Szilvassy,Z, Szolcsanyi,J, Nemeth,J: Distribution of PACAP-38 in the central nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem Biophys Methods 61: , 2004