Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont

Átírás

1 Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Gócza Elen 1

2 Transzgénikus egerek előállítása Random inszerció DNS mikroijektálás 1980: J. Gordon, first transgenic mouse A T G Promoter Transzgén Poli A Célzott génmódosítás ES sejtek felhasználásával Célzott gén Promoter Neo gén Riporter gén 1986: A. Gossler: Transgenic mouse betagalactosidase reporter gene 2

3 Alkalmazott emlős embriológia Egér embriók fejlődése Kimérák szerepe az állatvilágban Tetrapliod embriók létrehozása, fejlődése Ősivarsejtek (PGCs) vándorlása Őssejtek fogalma Őssejtek típusai, embrió eredetű őssejtek Célzott génbevitel transzgénikus egér ES sejtek felhasználásával Humán embrionális eredetű őssejtek (huesc) alkalmazási lehetőségei 3

4 Egér embriók fejlődése 1. 2-sejtes 4-sejtes 8-sejtes szedercsíra hólyagcsíra 4

5 Egér embriók fejlődése 2. 5 Fertilizáció megtermékenyítés Barázdálódás osztódás Implantáció beágyazódás Gasztruláció bélcsíraképződés Neuruláció idegcsíraképződés Organogenezis Szervfejlődés Gametogenezis ivarsejtek kialakulása Magzat fejlődése

6 A PREIMPLANTÁCIÓS EGÉR EMBRIÓK FEJLŐDÉSÉT IRÁNYÍTÓ GÉNEK b Late morula Blastocyst Late blastocyst ICM Tr Tr Embryonic region including ICM cells Boundary Extraembryonic cells interacting with uteri during implantation Embryonic abembryonic axis c Cdx2 Trophectoderm (multipotent) Precursor (totipotent) Oct4 Inner cell mass (pluripotent) Gata6 Nanog Primitive endoderm (multipotent) Epiblast (pluripotent) Cdx2 Oct4/Nanog Gata6 Oct4 Figure 1 Genes governing the development of the preimplantation mouse Wang H, Dey SK: Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 3:

7 EGÉR EMBRIÓ FEJLŐDÉSE 3. Morula Blastocyst Late blastocyst Egg cylinder Gastrula Ectoplacental cone Extraembryonic ectoderm Pre-ICM ES cells TS cells EC cells Polar trophectoderm Primitive ectoderm E3 E4 ICM Primitive E4 E5 endoderm E5 E6 E6 E7 Mural trophectoderm PGCs EG cells Primitive ectoderm Parietal endoderm Visceral endoderm Mesoderm invagination Primitive ectoderm Boiani, Schöler, Regulatory Networks in embryo-derived pluripotent stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol (11):

8 Egér embrió fejlődése 4. zigóta totipotens totipotens szedercsíra multipotens pluripotens embriócsomó (ICM) trofektoderma pluripotens primitív ektoderma multipotens primitív endoderma mural trofectoderma polar trofectoderma endoderma ektoderma ős-ivarsejtek mezoderma extraembrionális ektoderma bél, tüdő, máj szomiták ivarlécek, vese, szív, erek, vérsejtek extraembrionális mezoderma ektoplacentális kónusz bőr, idegrendszer tengelyváz bőr kötőszövete, izom viscerális mezoderma viscerális endoderma szikzacskó zsigeri lemeze parietális endoderma trofoblaszt óriás sejtek szikzacskó fali lemeze amniotic ektoderma amniotic mezoderma allantoic mezoderma chorionic mezoderma chorionic ektoderma amnion chorion chorioallantoic placenta 8

9 PRIMORDIÁLIS ŐSSEJTEK (PGC) 1. Zwaka, A germ cell origin of embryonic stem cells?, Development 132, ,

10 PRIMORDIÁLIS ŐSSEJTEK (PGC) 2. TOTIPOTENS ŐS-IVARSEJTEK (PRIMORDIÁLIS ŐSSEJTEK (PGC)) VÁNDORLÁSA Wolpert, Principle of development, 2002, Oxford University Press ISBN

11 PRIMORDIÁLIS ŐSSEJTEK (PGC) nap: az epiblasztban (pek) megjelennek 7. nap: extraembrionális mezoderma területén (8 darab, AP pozitív sejt) 7.5 nap: primitiv csík mezodermája majd endodermája, allantois felé, majd a szikzacskó kezdeménybe majd két felé az ősivarlécbe 11. nap: gonádokba ér ( darab) 11

12 KIMÉRÁK 1. Különböző állatok testrészeit összeállítva létrehozott képzeletbeli lények a mitológiában 12

13 KIMÉRÁK 2. Két különböző faj embrióiból keletkezett, mindkét faj embriójából származó sejteket tartalmazó állatok Birka-Kecske aggregációs és injektálásos kimérák birka embrióba kecske embrióból származó sejteket injektálnak birka a recipiens alkalmazása felnőtt birkecsben csak a birka embrióból származó sejtek maradnak meg Kihalással veszélyeztetett fajok megmentése (tetraploid gazda embrió) Csirke - Fürj injektálásos kimérák csirke embrióba fürj sejteket (fekete) injektálnak fürj rész a fejlődés során kilökődik késői fejlődési rendellenességek alakulnak ki a szív embrionális fejlődésének feltérképezése 13

14 KIMÉRÁK 3. birka-humán kiméra humán BMC intraperitoneálisan birka magzatba máj, szív, tüdő, agy 15% humán sejt Esmail Zanjani University of Nevada 14

15 KIMÉRÁK nap 0. nap Tetraploid embrió (4n) 1. nap Diploid embrió (2n) Kiméra blasztociszta 2. nap 15

16 KIMÉRÁK nap 0. nap Tetraploid embrió (4n) 1. nap Diploid embrió (2n) Kiméra blasztociszta 2. nap 16

17 EGÉR EMBRIÓ FEJLŐDÉSE ŐSSEJTEK TÍPUSAI Morula Blastocyst Late blastocyst Egg cylinder Gastrula Ectoplacental cone Extraembryonic ectoderm Pre-ICM ES cells TS cells EC cells Polar trophectoderm Primitive ectoderm E3 E4 ICM Primitive E4 E5 endoderm E5 E6 E6 E7 Mural trophectoderm PGCs EG cells Primitive ectoderm Parietal endoderm Visceral endoderm Mesoderm invagination Primitive ectoderm Boiani, Schöler, Regulatory Networks in embryo-derived pluripotent stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol (11):

18

19 Blasztociszta eredetű sejtvonalak TS sejtek TS cells TS sejtek Trophoblast Stem cells TE TS kiméra ES sejtek ES cells ES sejtek Embryonic Stem cells pek ES kiméra XEN cells sejtek pen XEN sejtek Extra-Embryonic Endoderm cells 4.5 nap XEN kiméra Ralston, Rossant, Clin. Genet., 2005

20 Trofoblaszt őssejt vonalak (TS sejtvonalak) kimérát képes képezni a kiméra extraembrionális szöveteibe épülnek be egér fibroblaszt függő FGF4 faktor függő

21 Extra-embrionális endoderma sejtek (XEN sejtvonalak)

22 Epiblast eredetű sejtvonal-patkány I.G.M. Brons, L.E. Smithers, M.W.B. Trotter, P.Rugg-Gunn, B. Sun, S.M. Chuva de Sousa Lopes, S.K. Howlett, A. Clarkson, L. Ahrlund-Richter, R.A. Pedersen, L. Vallier :Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature 448,

23 Extra embrionális csírasejt sejtvonalak (EG sejtvonalak) minden szövetféleséget képes létrehozni in vitro kimérát képes képezni AP pozitív sejtek Oct4 pozitív sejtek fibroblaszt függő LIF, SCF, FGF-2 faktor függő rendellenességek az IMPRINTINGBEN

24 Embrió eredetű sejtvonalak EC sejtek: Embryonal carcinoma cells (ECC)(Martin,PNAS, 1975) ES sejtek: Embryonic Stem cells (ESC)(Evans,Nature,1981; Martin, PNAS,1981) EG sejtek: Embryonic germ cells (EGC)(Matsui, Cell, 1992) TS sejtek: Trophoblast Stem cells (TSC)(Tanaka, Science, 1998) EPL sejtek: Early Primitiv Ectoderm Like cells (EPL)(Rathjen, J.Cell.Sci., 1999) PEL sejtek: Parietal Endoderm Like cells line (PEL)(Murakami, Cell, 2003) GS sejtek: Germ line stem cells (GSC)(Kanatsu-Shinohara, Cell, 2003) mgs sejtek: Multipotent germ line stem cells (Kanatsu-Shinohara, Cell, 2004) XEN sejtek: extra-embryonic ENdoderm cells (Kunath, Development, 2005) mags sejtek: Multipotent adult germ line stem cells (Guan, Nature,2006) EpiSC sejtek: Epiblast stem cells (Brons, Nature, 2007, Tesar, Nature, 2007)

25 Pluripotens embrionális eredetű őssejt-vonalak (ES sejtvonalak) ICM ICM ICM csomó Letapadt ICM csomó trofektoderma blastociszta tápláló sejt réteg tripszin egér fibroblaszt teljes embrió kitéve tripszin mlif, DMEM, 20%FCS tripszin ES sejt kolónia ES sejt kolóniák ES sejt kolóniák

26 DNS ELEKTROPORÁLÁS ES SEJTEKBE Rezisztens kolónia Kolónia tripszinben ES sejt-szuszpenzió Transzgénikus ES sejt kolóniák 26

27 TRANSZGÉNIKUS ES SEJTVONALAK ALKALMAZÁSA Célzott génmódosítás Célzott gén Promoter Neo gén Riporter gén EYFP ECFP EGFP 27

28 ES KIMÉRÁK LÉTREHOZÁSA 1. ES sejt gazda-embrió gazda-embrió AGGREGÁCIÓ gazda-embriók ES sejtek ES sejt INJEKTÁLÁS gazda-embrió kiméra embrió kiméra újszülöttek 28

29 TETRAPLOID ES KIMÉRÁK LÉTREHOZÁSA 29

30 DNS elektroporálás ES sejtekbe - Cre rekombináz alkalmazása 1.

31 Evans, Capecchi, Smitish Nobel díj! The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007 "for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells" Photo: Tim Roberts/PR Newswire, HHMI Photo Cardiff University Photo: Scanpix/Dan Sears Mario R. Capecchi Sir Martin J. Evans Oliver Smithies 1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the prize USA United Kingdom USA University of Utah; Howard Hughes Medical Institute Salt Lake City, UT, USA Cardiff University Cardiff, United Kingdom University of North Carolina at Chapel Hill Chapel Hill, NC, USA b (in Italy) b b (in United Kingdom) Martin J. Evans (első ES, EC sejtek) Mario R. Capecchi (homológ rekombináció, neo, HSV-tk, hprt gén bejuttatás) Oliver Smithies (homológ rekombináció humán sejtekben, mutáns hprt gén javítás)

32 Pluripotens embrionális eredetű őssejt-vonalak alkalmazási lehetőségei in vitro Transzgénikus ES sejtvonalak ES sejtek in vitro differenciáltatása in vivo in vivo Transzgénikus állatok Teratokarcinómák fejlődése

33 Humán embrionális őssejt-vonalak létrehozása ES sejt kolónia IVF megsemmisítés embrió bank 92 eddig publikált hesc sejtvonal (2005 nyara) Martin F. Pera, előadásából 33

34 Humán embrionális őssejt-vonalak létrehozása egér fibroblaszt tápláló sejtréteg humán embrió ICM izoláció Xiao, Yuan, Sharkis letapadt ICM 1481 ICM csomó Thomson, 1998 as Cripto), thus preventing the assembly of an active Nodal/ receptor complex [21]. To investigate the function of Nodal in hescs, we used Lefty-A to block the function of Nodal in H1 hescs. When Nodal signaling was blocked by adding Lefty-A inicm the CM, csomó the expression izolálás of Oct4humán and Nanog ES was sejt downregulated in a dose-dependent manner (Fig. 2A). This indicates kolónia that Nodal does contribute to maintaining the expression of Oct4 and Nanog. Although Nodal is necessary to maintain the expression of Oct4 and Nanog, Nodal is not sufficient to fully maintain the expression of Oct4 and Nanog even at a concentration of 1,000 ng/ml (Fig. 2A). Follistatin is an inhibitor of Activin A that functions by directly binding with this protein [22]. Follistatin was able to inhibit the expression of Oct4 and Nanog in a dose-dependent manner under the specific conditions used (Fig. 2B, 2G), and the inhibition was reversed by adding Activin A (Fig. 2B). This indicates that Activin A is necessary to maintain the expression of Oct4 and Nanog. Activin A was able to fully maintain the expression of Oct4 and Nanog in a dose-dependent manner (Fig. 2C, 2F). We also used flow cytometry to detect a phenotypic SSEA-1 negatív, SSEA-3, SSEA-4 pozitív, AP pozitív, Oct4 pozitív, telomeráz pozitíve, euploid sejtvonalak bfgf, egér tápláló sejtréteg, LIF nem tripszines passzálás (kis agregátumokban) EB, teratokarcinoma formálás Homolog rekombináció, GFP transzgénikus hesc Oct4 Nanog Telomeráz SSEA3 SSEA4 Figure Tra Activin ATra is 1-81 able to support long-term feeder-free culture of H1 human embryonic stem cells (hescs). H1 hescs maintained in 5 ng/ml Activin A for 15 passages express undifferentiated hesc mark-

35 ES sejtek in vitro differenciáltatása EC/ES/EG sejtek Oct4 +, AP +, Telomeráz + Embrió-testecskék (EB csomók) nincs tápláló sejtréteg nincs LIF Szuszpenzióban tenyésztés NATURE, 414. November

36 Egér potential of human ES cells in vitro ES sejtek in vitro differenciáltatása Humán Cell Types Developed Ectoderm, endoderm, mesoderm, and neural precursors Cardiomyocytes Cardiomyocytes, endodermal, hematopoietic, and neuronal cells Neuronal, epithelial, pancreatic, urogenital, hematopoietic, muscle, bone, kidney, and heart cells Neural epithelium, embryonic ganglia, stratified squamous epithelium, gut epithelium, cartilage, bone, smooth and striated muscle cells Cells with properties of pancreatic -like cells Cardiomyocytes, pigmented and nonpigmented epithelial cells, neural cells, mesenchymal cells, erythroid, macrophage, granulocyte, and megakaryocyte cells Myeloid, erythroid, megakaryocyte colonyforming cells Neural precursors, glial and neuronal cells: incorporation into the brain (H1, H9, H9.2 lines) Neural precursors, glial and neuronal cells: incorporation into the brain (HES-1 line) Neural progenitor, dopaminergic, GABAergic, glutamatergic, glycinergic neurons, astrocytes Neural progenitor, neuronal cells Trophoblast Hepatocytes A. Wobus, 2006 Cell Type Adipocytes Astrocytes Cardiomyocytes Chondrocytes Definitive hematopoietic cells Primitive hematopoietic cells Dendritic cells Endothelial cells Hepatocytes Keratinocytes Lymphoid precursors Mast cells Neurons Dopaminergic neurons Serotonergic neurons GABAergic neurons Cholinergic neurons Glutamatergic neurons Motor neurons Oligodendrocytes Osteoblasts Pancreatic cells Smooth muscle cells Skeletal muscle cells Yolk sac

37 EGÉR ES SEJTEKBŐL PETESEJTEK, EMBRIÓK SCIENCE, 300, May spermium is!!! (2004, 2005) + HESC-ből is (2006) 37

38 ES SEJTEK ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉI IN VITRO TESZTEKBEN KO, illetve transzgénikus ES sejtvonalak jó in vitro modellrendszerként szolgálhatnak Toxikológiai tesztekben kiválthatják az állatkísérletek egy részét. In vivo, az embrionális fejlődés során lejátszódó folyamatokat, in vitro differenciálódás során is tanulmányozni lehet. Humán betegségek modellezése, gyógyszertesztek alkalmazása in vitro a mutációt hordozó ES sejtvonalak alkalmazásával gyógyszer tesztek során. Transzplantációs kísérletekben való alkalmazás Allogén transzplantáció sok új ES sejt kellene (kb. 1000) Autológ transzplantáció terápiás klónozás 38

39 Transzplantációs terápia-terápiás klónozás ES sejtek Martin F. Pera, előadásából Petesejt forrás: saját, anyai, rokon, petesejt bank Bőrsejtek Problémák: Nem túl hatékony (legalább 100 petesejt kell) Technikailag nagyon igényes: majdnem minden kórházban szükség lenne rá 39 Immunkompatibilis transzplantáció

40 Transzplantációs terápia NATURE, 414. November 2001 Parkinson's disease Diabetes Infarktus Alzheimer's disease Gerincvelő sérülés Multiple Sclerosis Leukaemia Muscular dystrophy 40

41 ES SEJTEK SZEREPE A SZÍVBETEGSÉK GYÓGYÍTÁSÁBAN SCIENCE, 306: , 2004

42 HUMÁN ES SEJTVONALAK ALAPÍTÁSA KLÓNOZOTT NYÚLEMBRIÓKBÓL CELL RESEARCH, 13(4): ,

43 Eight-cell stage Alternatív lehetőségek embrionális őssejtek létrehozására h Somatic-cell dedifferentiation Somatic cell Reprogramming e.g. Culture with ES cells or defined factors +Oct4, Sox2, Klf4, c-myc Dedifferentiated cell Pluripotent hesc line Figure 1 Approaches to generating human embryonic stem cells (hescs). The current method of deriving hescs following fertilization of an egg and development to the blastocyst stage is shown in part a. Parts b h show the alternative approaches to hesc generation that are discussed in the main text. CDX2, caudal-type homeobox 2 gene; ES, embryonic stem; OCT4, octamer-binding transcription factor gene. VOLUME 8 JUNE

44 INDUKÁLT PLURIPOTENS SEJTEK Jaenisch and Young, 2008: Stem Cells, the Molecular Circuitry of Pluripotency and Nuclear reprogramming. Cell 132,

45 SZÖVETI ŐSSEJTEK ADULT STEM CELLS SOMATIC STEM CELLS iss, Kovács et al. Veronika S. Urbán, Judit Kiss, János Kovács, Elen Gócza, Virág Vas, Eva Monostori, Ferenc Uher (2008): Mesenchymal Stem Cells Cooperate with Bone Marrow Cells in Therapy of Diabetes Stem cells, 26;

46 KLINIKAI ALKALMAZÁS? Kiev Barbados Kína Kaposvár? Yuliy Baltaytis professzor kijevi orvosi egyetem dékánja New York-i tudományos akadémia tagja abortált magzatokból őssejt szuszpenzió - szelekciótranszplantáció 46

47 Human fetal neural stem cells- brain tumor N. Amariglio 2009: Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med Feb 17;6(2):e Ataxia-telangiectasia (AT) (Boder-Sedgwick syndrome[1] or Louis-Bar syndrome[2] is a rare, neurodegenerative, inherited disease which affects many parts of the body and causes severe disability. Ataxia refers to poor coordination and telangiectasia to small dilated blood vessels, both of which are hallmarks of the disease. AT affects the cerebellum (the body's motor coordination control center) and also weakens the immune system in about 70% of the cases, leading to respiratory disorders and increased risk of cancer. It first appears in early childhood (the toddler stage) with symptoms such as lack of balance, slurred speech, and increased infections. Because all children at this age take time to develop good walking skills, coherent speech, and an effective immune system, it may be some years before AT is properly diagnosed.