(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) ( ) A61K 39/015 ( ) A61K 39/395 ( ) A61K 48/00 ( ) G01N 33/569 ( ) C12N 15/63 ( ) C07K 14/445 ( ) C07K 16/20 ( ) (72) Feltaláló: Druilhe, Pierre, Paris (FR) (73) Jogosult: INSTITUT PASTEUR, Paris Cedex 15 (FR) (54) MSP-3-szerû géncsalád (57) Kivonat (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest A találmány tárgya a malária fõ kórokozójából, a Plasmodium falciparum-ból izolált, 9 génbõl álló MSP-3- szerû géncsalád, melyet az epitópok nagyfokú konzerváltsága jellemez; valamint ilyen epitópokat tartalmazó antigénhatású polipeptidek, és az ezeket tartalmazó, malária elleni immunogén készítmények és vakcinák. A találmány tárgyai továbbá rekombináns ellenanyagok és részeik, melyek az MSP-3-szerû géncsalád számos termékével keresztreagálnak, valamint eljárások a malária in vitro diagnózisára; valamint az új P. falciparum-antigéneket kódoló nukleotidszekvenciák, és ezek alkalmazása gyógyszerben. HU T2 A leírás terjedelme 120 oldal (ezen belül 68 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T A találmány leírása A jelen találmány malária elleni védelemmel kapcsolatos. Közelebbrõl a szabadalmi bejelentés a már ismert MSP¹3 génnel társult új géncsaládot ír le, mely a kitett epitópok kivételes redundanciáját mutatja, ami arra utal, hogy ezen géncsalád fontos szerepet játszik a parazita immunogenitásában. A géncsalád jellemzése a P. falciparum elleni új immunogén és vakcinakészítmények kifejlesztését teszi lehetõvé. Az emberi maláriáért felelõs paraziták, beleértve különösen a Plasmodium falciparum¹ot, az emberi gazdaszervezetben különbözõ morfológiákat mutatnak, és a fertõzött gazdaszervezetben a lokalizációjuk függvényében különbözõ antigéneket expresszálnak. A paraziták morfológiai és antigénkülönbségei az emberben töltött életciklusuk folyamán legalább négy elkülönülõ fejlõdési stádium meghatározását teszik lehetõvé. A parazita fejlõdésének legelsõ stádiuma emberben a sporozoita formának felel meg, melyet a parazita rovarvektorai juttatnak a véráramba. A második stádium a parazita májba történõ településének, a májsejtek megfertõzésének felel meg, ebben a stádiumban a paraziták májschizontákat képeznek, melyek amikor megérnek (például a P. falciparum esetében a sporozoiták behatolásától számított 6. napon), májmerozoitákat bocsátanak ki sejtszétesés útján. A harmadik stádiumot a vörösvértestek aszexuális formák (merozoiták) általi fertõzése jellemzi, ez az eritrocitastádium a betegség patogén fázisának felel meg. A negyedik stádium a szexuális potenciállal rendelkezõ formák (gametociták) kialakulása, melyek a szúnyogban lesznek extracelluláris szexuális formák, azaz gaméták. A Plasmodium falciparum-malária elleni klinikai immunitás kifejlõdésében az ellenanyagok fontos szerepét mutatták ki több alkalommal is. Számos immunológiai tanulmány utal arra, hogy a citofil alosztályokhoz (IgG1 és IgG3) tartozó emberi ellenanyagok különösen kritikusak a védettség szempontjából. Ez a fajta parazitaellenes immunitás törzstõl független, nem sterilizáló típusú immunitás, mely a parazitának való hosszú kitettség (15 20 év) alatt alakul ki. Általában Afrikában és Pápua Új¹Guineában lehet megfigyelni, de legújabban Délkelet-Ázsiában is dokumentálták (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). Bár az ellenanyagok közvetlenül is képesek hatni a vörösvértestek merozoiták általi inváziójára, az ellenanyag-közvetített parazitakontroll leghatékonyabb in vivo mechanizmusa az endémiás területeken a monociták részvételét igényli (Khusmith és Druilhe 1983); (Lunel és Druilhe 1989). Az ellenanyagfüggõ sejtgátlási vizsgálat [antibody-dependent cellular inhibition (ADCI)] ezen, a monociták és a citofil parazitaspecifikus ellenanyagok közti együttmûködést utánozza, és manapság a legjobb in vitro helyettesítõ markernek tûnik a P. falciparum vérben élõ stádiumai ellen szerzett immunitás megítéléséhez. Eddig két molekulát azonosítottak az ADCI-ben hatékony emberi ellenanyagok célpontjaként, nevezetesen a 48 kda molekulatömegû 3. számú merozoita felszíni fehérjét (Merozoite surface-protein 3, a továbbiakban MSP¹3) (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun és munkatársai 1994) és a 220 kda molekulatömegû, glutamátban gazdag fehérjét (a továbbiakban GLURP) (Theisen, Soe és munkatársai 1998). Kimutatták, hogy a GLURP és az MSP¹3 képesek in vivo gátolni a paraziták növekedését P. falciparum¹ra humanizált SCID egerekbe történt passzív transzfer után (Badell, Oeuvray és munkatársai 2000). Szintén az MSP-3-elleni emberi ellenanyagok klinikai védettséggel való kapcsolatára utal számos immunológiai-járványtani tanulmány, melyek megmutatják, hogy az MSP-3¹ra specifikus citofil (IgG1 és lgg3) ellenanyagok szignifikánsan összefüggenek a maláriás rohamok alacsonyabb kockázatával (Roussillon 1999). Ezen tanulmányok megmutatták továbbá, hogy a citofil IgG3 ellenanyagok fontos szerepet játszanak a malária elleni védettségben, ily módon szolgáltatva epidemiológiai támogatást azon elméletnek, miszerint az MSP¹3 elleni ellenanyagok in vivo aktívan korlátozhatják a paraziták sokszorozódását az Fc II receptorokat hordozó sejtek együttmûködése révén (Bouharoun-Tayoun, Oeuvray és munkatársai 1995). Ezen receptorok magasabb affinitást mutatnak az IgG3 alosztály felé, mint az IgG1 alosztály irányában (Pleass és Woof 2001). Az ezen emberi IgG ellenanyagok által felismert fontosabb B¹sejt-epitópokat az MSP régió konzervatív szekvenciáira lokalizálták (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun és munkatársai 1994; Theisen, Soe és munkatársai 2000; Theisen, Dodoo és munkatársai 2001). Nukleotidszekvenálás segítségével kimutatták, hogy ezen fontos epitópok nagymértékben konzerváltak számos laboratóriumi P. falciparum törzs között, valamint Afrikából és Ázsiából származó terepizolátumok között is (Huber, Felger és munkatársai 1997); (McColl és Anders 1997). Trucco és munkatársai (2001) közölték az MSP6 (jelenlegi neve MSP3.2) és az MSP3 (jelenlegi neve MSP3.1) fehérjék aminosavszekvenciáit és azok párosítását. Oeuvray és munkatársai (1994) hozták nyilvánosságra az MSP3 fehérje antigénepitópjának azonosítását, és leírták a nukleotid- és aminosavsorrendjét. Ezen antigénepitópot a MoAb 2 45 ellenanyag segítségével azonosították, és egy szintetikus MSP¹3b peptid ellen termelt ellenanyaggal történõ vizsgálattal tesztelték. A Q8IJ53 elérési szám egy 424 aminosavból álló hipotetikus fehérjét ír le, melyet elméleti úton expresszáltak egy, a Plasmodium falciparum genomszekvenciájából in silico elõre jelzett nyitott leolvasási keretbõl. A feltalálók az utóbbi idõben egy 9 P. falciparum génbõl álló sorozatot jellemeztek, melyek mindegyike a 10. kromoszóma 3 ¹végén helyezkedik el, és amelyek fehérjéket és azon belül epitópokat kódolnak, melyek mind a természetben, maláriának kitett egyénekben elõforduló ellenanyagokhoz kötõdnek, és a vér monocitáival együttmûködve a P. falciparum vörösvértest-stádiumának pusztítását közvetítik, és amelyek a különféle P. falciparum izolátumok között szokatlan mértékû szekvenciakonzerválást mutatnak. A jelen szabadalmi bejelentés egy géncsaládot ismertet, melyet MSP-3-szerû géncsaládnak nevez, mely gének termékei közös szerkezeti és immunológiai 2

3 1 HU T táblázat jellemzõkkel rendelkeznek, valamint ezen gének némelyikét és a megfelelõ fehérjéket, egyenként tekintve. Az igénypontokban az említett új fehérjékbõl származó epitópokat tartalmazó antigénhatású polipeptidek kerülnek nyilvánosságra, valamint antigénhatású polipeptid-készítmények, melyek legalább két ilyen epitópot tartalmaznak, és szintén tárgyai a találmánynak. A találmány más fontos megvalósításai malária elleni immunogén készítmények és vakcinák, melyek immunogénként egy elõbb említett polipeptidet vagy polipeptidkészítményt tartalmaznak. Rekombináns ellenanyagok és részeik, melyek az MSP-3-szerû géncsalád számos termékével keresztreagálnak, szintén tárgyai a találmánynak, akár önmagukban, akár egy passzív immunterápiára alkalmazott orvosság részeként, vagy a malária in vitro diagnózisára alkalmazott kit részeként. A szabadalmi bejelentés eljárásokat ismertet valamely egyénben a malária in vitro diagnózisára, akár egy antigénhatású polipeptid alkalmazásával, vagy valamely, az elõzõekben definiált ellenanyag alkalmazásával, valamint kiteket, melyek legalább részben tartalmazzák az ezen eljárások végrehajtásához szükséges reagenseket (polipeptidek, ellenanyagok ). Az új P. falciparum-antigének legalább egyikét kódoló nukleotidszekvenciák, és ezek alkalmazása valamely P. falciparum elleni gyógyszerben vagy nukleinsavvakcinában szintén tárgyai a találmánynak. A jelen szövegben egy sor szakkifejezés kerül alkalmazásra, melyeket a következõ definícióknak megfelelõen kell érteni: A következõkben a gén kifejezés szinonim akár egy kódolószekvenciát tartalmazó természetben elõforduló szekvencia kifejezéssel, akár valamely kódolószekvenciát tartalmazó rekombináns vagy szintetikus szekvenciával. A jelen szövegben egy gén megengedõ módon tartalmazhat szabályozóelemeket, ellentétben ezen szónak a tudományos szakirodalomban gyakran elfogadott használatától. Ennek megfelelõen a jelen találmány szerinti gén bármely nukleotidszekvencia, mely a Plasmodium természetben elõforduló szekvenciájának nyitott leolvasási keretét tartalmazza, vagy amely emellett a természetben elõforduló szekvencia expressziójához szükséges szabályozószekvenciákat is tartalmazza. A jelen definíciónak megfelelõen a gén valamely izolált nukleinsav-molekula, azaz olyan nukleotidszekvencia, mely nem a saját természetes környezetében található. A jelen szövegben a géncsalád kifejezés a tudományos szakirodalomban megszokott jelentéssel bír, azaz számos gén csoportját jelöli, mely gének számos közös (szerkezeti vagy funkcionális) tulajdonsággal vagy jellemzõvel bírnak. A jelen szabadalmi bejelentés szerint az MSP-3- c/d¹szerû motívum egy 20 aminosavból álló aminosavszekvencia, mely a SEQ ID NO bármelyikével megegyezik, vagy amely ezen szekvenciákból legalább kettõnek a pozíciókat megtartó összevágásával nyerhetõ. Például a SEQ ID NO 25¹bõl az 1 5. aminosavakat tartalmazó szekvencia, melyet a SEQ ID NO 19¹bõl a aminosavak követnek, majd a SEQ ID NO 27¹bõl a aminosavak, MSP-3-c/d¹szerû motívumnak számít. Más szavakkal kifejezve egy MSP-3- c/d¹szerû motívum valamely, 20 aminosavból álló szekvencia, ahol az aminosavakat a következõkbõl választjuk: Aminosavpozíció Aminosav L E L I K L T S K D E E D I I K H N E D S H V N I S L W K N N V D E S D Q S L Y V P S R Q S N Q P I P A Ezen aminosavak közül számos hasonló töltéssel bír, és nem valószínû, hogy megváltoztatná a molekula általános szerkezetét vagy ellenanyagok általi felismerését, például a valin, izo-leucin, leucin. Bármely, 20 aminosavból álló aminosavszekvencia, mely a fent jelzett legkonzervatívabb aminosavakat tartalmazza (azaz az 1, 2, 8, 10, 12, 14 és pozíciókon lévõket), és ahol a többi aminosavpozíción más aminosav van, mint a fent jelzettek, és amelyet az MSP-3-c/d motívumok vagy a SEQ ID No: bármelyike ellen termelt ellenanyag felismer, szintén MSP-3-c/d¹szerû motívum -nak minõsül a jelen találmány szerint. Az utóbbi funkcionális tulajdonságot tetszõleges immunoassay segítségével lehet vizsgálni, amint azt a témában jártas szakember tudni fogja, vagy ahogyan alább leírásra kerül. A jelen szövegben az MSP-3-b-szerû motívum aminosavból álló szekvenciát jelöl, mely a SEQ ID NO bármelyikével megegyezik, vagy amely ezen szekvenciákból legalább kettõnek a pozíciókat megtartó összevágásával nyerhetõ. Például a SEQ ID NO 17¹bõl az 1 5. aminosavakat tartalmazó szekvencia, melyet a SEQ ID NO 22¹bõl a aminosavak követnek, MSP-3-b-szerû motívumnak minõsül. Más szavakkal kifejezve egy MSP-3-b-szerû motívum valamely, aminosavból álló szekvencia, ahol az aminosavakat a következõkbõl választjuk, ahol a az aminosav hiányát jelöli: 3

4 1 HU T táblázat Aminosavpozíció Aminosav I L E R G W E F G G G V P E Y F D D A G L I S S A Y F P L S A G A A L L I L I E S S Ezen aminosavak közül számos hasonló töltéssel bír, és nem valószínû, hogy megváltoztatná a molekula általános szerkezetét vagy ellenanyagok általi felismerését, például a valin, izo-leucin, leucin. 15 A MSP-3-b-szerû motívumok egy csoportja megfelel a SEQ ID No: 17, 18 és 22 szekvenciáinak és ezek kombinációinak, azaz az alábbiakból választott 11 aminosavas szekvenciáknak: 3. táblázat Aminosavpozíció Aminosav I L G W E F G G G V P Y F A I A Bármely, aminosavból álló aminosavszekvencia, mely a fent jelzett legkonzervatívabb aminosavakat tartalmazza (azaz a 3. táblázatban jelzett aminosavak, melyek a 2. táblázat szerinti 1., 2., 5. és 13. pozícióknak felelnek meg), és ahol a többi aminosavpozíción más aminosav van, mint a fent jelzettek, és amelyet az MSP-3¹b motívumok vagy a SEQ ID No: bármelyike ellen termelt ellenanyag felismer, szintén MSP-3-b-szerû motívum -nak minõsül a jelen találmány szerint. Az utóbbi funkcionális tulajdonságot tetszõleges immunoassay segítségével lehet tesztelni, amint azt a témában jártas szakember tudni fogja, vagy ahogyan alább leírásra kerül. A következõkben idõnként utalás történik egy-egy génre vagy fehérjére, mely homológja egy adott génnek vagy fehérjének, melynek a szekvenciája ismertetésre kerül. Ez a szó itt és most különbözõ Plasmodium törzsek (különösen P. falciparum törzsek) között közeli rokonságot mutató szekvenciákat jelöl, azaz a hivatkozott szekvenciával legalább 70%¹os, elõnyösen legalább 90%¹os szekvencia-azonosságot mutató szekvenciákat. A konzervatív helyettesítés valamely aminosavszekvenciában valamely aminosavmaradék helyettesítését jelenti egy másikkal, mely hasonló tulajdonságokkal bír hidrofobicitás és/vagy térbeli gátlás tekintetében, miáltal a fehérje harmadlagos szerkezete nem változik számottevõen. Például konzervatív helyettesítésnek minõsül egy guanin helyettesítése egy alaninnal vagy fordítva. A valin, leucin és az izo-leucin szintén olyan aminosavak, melyek konzervatív módon helyettesíthetik egymást. A konzervatív helyettesítés más csoportjai korlátozás nélkül a (D, E), (K, R), (N, Q) és (F, W, Y) helyettesítések. Valamely polipeptid egy variánsa, melyet a polipeptid legalább egy aminosavjának konzervatív helyettesítésével nyerhetõ, a polipeptid konzervatív variánsa megjelölést kapja További definíciók is találhatók az alábbi szövegben, szükség szerint. A feltalálók a jelen dokumentumban egy 9 génbõl álló csoportot írnak le, mely 9 génbõl 6 még sohasem került leírásra, és amelyek a 10. kromoszóma ugyanazon régiójában csoportosulnak. Ez a kromoszóma valóban tartalmaz 9 nyitott leolvasási keretet egy sorozatban, melyeket nem kódolórégiók választanak el, és 5 3 irányban haladva rendre tartalmazza a következõ fehérjéket kódoló géneket: elsõbben a GLURP, majd 1300 bázispárra az MSP¹3 (újabb nevén MSP-3 1), továbbá 7 további gén, melyek jelölése MSP-3 2, MSP- 3 3, MSP-3 4, MSP-3 5, MSP-3 6, MSP-3 7, MSP Ezt a szervezõdést az 1. ábra mutatja be. Amellett, hogy ugyanazon kromoszómaszakaszon csoportosulnak, ez a 9 gén egyedülálló tulajdonságokkal bír, melyek azt jelzik, hogy a P. falciparum vérben található fertõzõ stádiumai ellen kiemelt jelentõségûek a vakcinatermelés szempontjából: Kimutatásra került, hogy mind a 9 gén egyidejûleg expresszálódik valamennyi tanulmányozott parazitában, tehát a megfelelõ fehérjék a P. falciparum eritrocitastádiumban észlelhetõk, és mindegyik fehérje a merozoita felszínén található. Ez már korábban kimutatásra került a GLURP, MSP-3 1 és MSP-3 2 (Trucco, Fernandez-Reyes és munkatársai jelölése szerint MSP6 ) esetében; emellett kimutatásra került a többi esetében is, minden egyes gén N¹terminális régiójából egyedi, keresztreagáló epitópokat nem tartalmazó szekvenciák szintézise révén, amelyeknek megfelelõ ellenanyagok mind a merozoiták felszínén reagálnak. Továbbá a transzkripciójuk is kimutatásra került RT¹PCR útján, mindegyikükre külön-külön specifikus primerekkel. Továbbá a 8 MSP-3-szerû gén ugyanazt a génszervezõdést mutatja, amit az 1. ábra illusztrál, egy kezdeti N¹terminális, 4 aminosavból álló aláírással vagy azo- 4

5 1 HU T2 2 nosítóval ( s jelzéssel az 1. ábrán), mely mindegyikükben azonos, és azonos a Plasmodium vivax-ban és Plasmodium Knowlesi-ben leírt hasonló MSP-3-homológ fehérjékben is. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgya elsõdlegesen: izolált gének egy családja vagy csoportja, melyek a következõ tulajdonságokkal rendelkeznek: A Plasmodium falciparum 10. kromoszómáján helyezkednek el; nagymértékben konzerváltak a Plasmodium falciparum törzsekben; A Plasmodium falciparum eritrocita-stádiumaiban expresszálódnak; az általuk kódolt fehérjék N¹terminálisa egy NLRN vagy NLRK azonosítóval kezdõdik, és a merozoita felszínén található, ahol a géncsalád legalább 3 génbõl áll. A NLRN vagy NLRK azonosító a leggyakrabban A vagy G aminosavakkal folytatódik a találmány szerinti MSP¹3 géncsalád által kódolt fehérjékben. A géncsalád génjei elõnyösen ugyanazon génszervezõdést mutatják, amint azt az 1. ábra illusztrálja. Az ilyen géncsaládra példa a teljes MSP-3-szerû géncsalád, mely tartalmazza a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 és 15 szekvenciák génjeit. Bármely csoport, mely legalább 3 gént tartalmaz ezen gének közül, szintén géncsaládnak számít. Eltekintve a fent említett N¹terminális azonosítótól, az N¹terminális rész nagymértékben különbözik az egyes géntermékekben, miközben ezzel ellentétesen, a C¹terminális régió szervezõdése azonos minden génben, kivéve kettõt (MSP-3 5 és MSP-3 6), beleértve a b epitópszerû hajlatot ( b ), a c/d epitópszerû régiót ( c/d ), a glutaminban gazdag régiót, és a C¹terminális legvégén a leucin-ollószerû struktúrát. A fent leírt géncsaládok közül a találmány szempontjából különösen fontos géncsaládok azok, ahol a gének a következõ további tulajdonságokkal rendelkeznek: az általuk kódolt fehérjék MSP-3-b-szerû motívumot és/vagy egy MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaznak. Az ilyen géncsaládra példa a SEQ ID No 1, 3, 5, 7, 13 és 15 szekvenciák családja, vagy bármely, ezen szekvenciák közül kiválasztott 3 gén által alkotott géncsalád. Mind a 7 fehérje (a GLURP és a 6 homológ MSP-3- szerû molekula) kivált ellenanyagválaszt a maláriának kitett egyénekben. Azon géntermékek esetében, melyekre nézve vizsgálatok történtek, különösen a GLURP, MSP-3 1 és MSP-3 2 esetében, a valós körülmények között kiváltott immunválaszok a maláriás rohamok elleni klinikai védettséggel párosulnak. Ez az összefüggés statisztikailag nagymértékben szignifikáns, különösen az IgG3 izotípusba tartozó ellenanyagok esetében, és három helyzetben, Afrikában Dielmóban és Ndiopban, valamint Burmában, Oo¹Do-ban került megerõsítésre. Az alább leírt homológiákkal kapcsolatos okokból rendkívül valószínû, hogy ugyanezen eredmény születik majd a további 5 gén esetében. A GLURP, MSP-3 1 és MSP-3 2 esetében a védettséggel kapcsolatos ellenanyagok által megcélzott régiók az R0 ismétlõdõ régió a GLURP-ben és a C¹terminális nem ismétlõdõ régió az MSP-3 1-ben, valamint az MSP-3 2. Az MSP-3 1-bõl származó különféle peptideket a 2. ábra mutatja. A védettség az MSP-3¹b, c és d régiókkal reagáló ellenanyagokhoz kapcsolódik. Mind a 7 géntermékkel reagáló ellenanyagok hatékonyak a P. falciparum vérben élõ stádiumainak elpusztításában, a monocitafüggõ, ellenanyag-közvetített ADCI mechanizmus által, in vitro körülmények között. Ezen, az 1. példában leírt eredmények azt mutatják, hogy az összes ilyen régió elleni ellenanyagok egyenlõ mértékben hatékonyan érik el a P. falciparum eritrocitastádiumának növekedési gátlását in vitro körülmények között. Az elõnyös géncsaládok továbbá a következõ tulajdonsággal bírnak: a fenti génekkel reagáló ellenanyagok a Plasmodium falciparum vérben élõ stádiumainak elpusztítását közvetítik a monocitafüggõ, ellenanyagközvetített ADCI mechanizmus által, in vitro körülmények között. További két elõnyös megvalósítás szerint a géncsalád emellett a következõ elõnyös tulajdonsággal rendelkezik: a fenti génekkel reagáló ellenanyagok a Plasmodium falciparum növekedését gátolják P. falciparum-mal fertõzött egerekben. A feltalálók azt is kimutatták, hogy szokatlanul magas fokú a szekvenciakonzerváció a 7 gén mindegyikében a különféle P. falciparum-izolátumokat tekintve. Ez már korábban kimutatásra került a GLURP esetében, és az R0 nem ismétlõdõ régió kiválasztásához vezetett, mint ami a leginkább konzervált a különbözõ izolátumok között, bár néhány aminosav helyettesítésre kerül. Ugyanez került kimutatásra az MSP1 3 1 esetében, melynek szekvenciáját 111 izolátum esetében kiemelkedõen konzerváltnak találták az MSP-3¹a, b, c és d peptideket lefedõ régióra nézve, azaz az önkéntesek immunizálására kiválasztott régióra nézve, ahol semmilyen aminosavhelyettesítést, azaz semmilyen aminosavváltozást nem találtak. Ezt újabban megerõsítették az MSP-3 1 C¹terminálisának többi részére és az MSP-3 2, MSP-3 3, MSP-3 4, MSP-3 7 és MSP- 3 8 teljes C¹terminális konzervatív régiójára nézve (9. és 10. ábra). A géncsalád ezen figyelemre méltó fokú szekvenciakonzerváltsága éles ellentétben áll a többi, újabban tanulmányozott vakcinajelölt viszonylag nagyfokú polimorfizmusával, és nyilvánvalóan fontos szempont, mely erõsíti ezen géncsalád potenciálját a vakcinafejlesztés szempontjából. A fentiek szerinti géncsaládok, melyek a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 és 15 vagy Plasmodiumban található homológjaik közül kiválasztott legalább 3 génbõl állnak, szintén elõnyös géncsaládok. Egy másik, a jelen szabadalmi bejelentésben nyilvánosságra hozott megvalósítás valamely izolált Plasmodium falciparum gén, mely a SEQ ID No: 5, 7, 13 vagy 15 szekvenciájával rendelkezik, vagy valamely izolált gén, mely a SEQ ID No: 5, 7, 9, 11, 13 vagy 15 szerinti szekvenciával rendelkezõ Plasmodium falciparum gén homológja valamely Plasmodium törzsben. 5

6 1 HU T2 2 Ezen gének, melyek nem leírt MSP-3-szerû gének, nagyon hasznosak lehetnek a témában jártas szakember kezében számos kutatási, diagnosztikus és védõoltással kapcsolatos alkalmazásban, az eddig és a továbbiakban leírt okokból. Közelebbrõl rekombináns MSP-3-szerû fehérjék termelésére lehet õket alkalmazni. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgyai a SEQ ID No: 6, 8, 10, 12, 14 és 16 szerinti rekombináns fehérjék, valamint bármely rekombináns fehérje, mely a SEQ ID No: 6, 8, 10, 12, 14 vagy 16 szerinti fehérjével homológ szekvenciával rendelkezik, valamely, a 3D7- tõl különbözõ Plasmodium törzsben. Az MSP¹3 géncsalád tagjainak összehasonlító szekvenciaelemzése az epitópok szokatlanul magas fokú konzerváltságát mutatja a géncsalád tagjai között, különösen a biológiailag aktív ellenanyagokkal reagáló epitópok esetében, melyek a védettség szempontjából kritikusak. A szekvenciák összehasonlítását a 11. ábra mutatja be. A feltalálók 2 régiót azonosítottak, melyek a géncsalád tagjaiban nagyon hasonlóak, vagy akár teljesen azonosak, és az MSP-3¹b peptidbõl egy kritikus régiót, az MSP-3¹c és d peptidekbõl egy régiót (melyet az MSP-3¹c és MSP-3¹d peptidek is lefednek) érintenek. A kis különbségeket, melyek a különbözõ gének között igen nagy mértékben konzervált epitópokban megmutatkoznak, a 12. és 13. ábrák foglalják össze. Figyelemre méltó és nagyon jelentõségteljes, hogy a különbözõ géneket tekintve a legkonzerváltabb azon kettõ régió, melyek az ADCI-tesztben in vitro és a SCID egerekben passzív transzfer után (lásd fent) biológiailag aktív ellenanyagok célpontjai. A feltalálók azt is kimutatták, hogy immunológiai keresztreaktivitás áll fenn az MSP¹3 géncsalád különbözõ fehérjéi között, a géncsalád tagjai között fennálló szerkezeti homológia következményeképpen (5. példa). Immunológiai és vakcina-fejlesztési szinten a gyakorlati következmény az, hogy a géncsalád bármelyik tagjával történõ immunizálás ellenanyagokat fog indukálni ugyanarra és az összes többi géntermékre is. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgya egy nagyon különleges többgénes géncsalád-típus, ahol az epitóp-polimorfizmus helyett, ami általában a mai napig leírt többgénes géncsaládok tulajdonsága, a fõ jellemzõ az epitóp-konzerválás, ami deléció, vagy egy adott génben, egy másikban vagy a géncsalád összes tagjában történõ mutáció esetén az antigén-funkciót át tudja venni. Ráadásul az összes gén egy idõben expresszálódik egy adott parazitában. A jelen szabadalmi bejelentés tárgya továbbá egy fehérje, melyet a fent nyilvánosságra hozott gének közül kódol valamelyik. Egy elõnyös megvalósításban a fehérje rekombináns fehérje. Ennek megfelelõen a találmány tárgya továbbá egy antigénhatású polipeptid, mely egy legalább 10, elõnyösen legalább 15 egymást követõ aminosavat tartalmaz valamely, a jelen találmány tárgyát képezõ fehérjébõl. Természetesen az MSP-3 1 vagy MSP- 3 2 fragmenseire korlátozódó polipeptidek itt nem jönnek számításba A jelen találmány szerint elõnyös polipeptidek az MSP3 3-ból származó olyan polipeptidek, melyek tartalmazzák legalább a SEQ ID NO: 27¹ben megadott MSP-3-c/d¹szerû motívumot. A találmány szerinti antigenikus polipeptid továbbá tartalmaz a SEQ ID No szerinti szekvenciákból legalább egy motívumot, és tárgya a találmánynak. A jelen találmány tárgya továbbá egy antigenikus polipeptidkészítmény, mely tartalmaz egy fent definiált MSP3 c/d¹szerû motívumot és legalább egy másik MSP-3-b-szerû motívumot. A polipeptidkészítmény polipeptid összetevõket, azaz polipeptideket vagy polipeptidrészeket tartalmazó molekulákat, mint lipopolipeptideket, szilárd hordozóhoz kötött polipeptidekbõl álló konjugátumokat stb. tartalmazó készítményt jelent. A jelen találmány szerinti polipeptidkészítmények lehetnek oldatok, tabletták stb. A találmány szempontjából különösen fontos megvalósítás esetében az antigenikus polipeptidkészítményben található legalább egy másik MSP-3-c/d¹szerû motívum a SEQ ID NO 25, 26, 28, 29 és 30 valamelyike vagy ezek konzervatív variánsaiból van kiválasztva. A találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítmény esetében a legalább két különbözõ MSP-3- c/d¹szerû motívumot hordozhatják különálló molekulák (azaz a készítmény tartalmazhat sokféle molekulát, melyek mindegyike csak egyetlen motívumot hordoz); más módon a készítmény minden egyes polipeptid alkotóeleme legalább két motívumot hordoz. A fentiek szerint leírt antigenikus készítmény, mely egyenként legalább két különbözõ MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaz, ily módon tárgya a jelen találmánynak. Ezen molekulák lehetnek komplex molekulák, melyekben legalább két motívum része különálló, egy közös hordozóhoz kapcsolt polipeptideknek; elõnyösen a polipeptidrész egyetlen polipeptid, mely a motívumokat tartalmazza. Fúziós fehérjéket lehet alkalmazni ilyen készítményekben, melyek számos, különbözõ MSP¹3 fehérjékbõl származó részeket tartalmaznak. Tekintettel az epitópok konzervált voltára, a feltalálók megvizsgálták, vajon a GLURP és MSP¹3 elleni citofil ellenanyagok részt vesznek¹e a klinikai malária elleni immunitás kifejlõdésében egy myanmari (ázsiai) népességben, amint azt Afrikában korábban találták, tehát eltérõ emberi és parazitagenetikai háttér mellett. Az alábbi 7. példában ismertetett eredmények megmutatják, hogy az MSP-3 1 és a GLURP konzervatív régiói elleni citofil IgG3 ellenanyagok szintje szignifikánsan korrelált a P. falciparum-malária elleni klinikai védettséggel. Ezzel szemben a GLURP elleni nem citofil IgG4 ellenanyagok szintje a maláriás rohamok számával párhuzamosan nõtt. A legfontosabb, hogy az MSP és GLURP-specifikus IgG3 ellenanyagok egymást kiegészítõ hatást mutattak a malária elleni védettség szempontjából. Az ezen antigének egyike ellen nem reagáló egyénekben a másik antigénnel szemben következetesen erõs válasz volt megfigyelhetõ és a védettséggel kapcsolatba hozható, ami arra utal, hogy mind az MSP3, mind a GLURP elleni ellenanyagok indukciója fontos lehet a védõ immunitás kifejlõdésében. 6

7 1 HU T2 2 A találmány egy másik megvalósítása szerint az antigenikus polipeptidkészítmény még egy további antigenikus polipeptidmolekulát is tartalmaz, mely legalább 10 egymást követõ aminosavat tartalmaz a GLURP R0 régiójából. Amint azt fentebb említettük, a találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítmény tartalmazhat korlátozott számú molekulát, melyek mindegyike többféle epitópot hordoz, vagy sokféle molekulát, melyek mindegyike korlátozott számú epitópot hordoz. Egy különösen fontos megvalósítás esetében az antigenikus polipeptidkészítmény legalább 2, elõnyösen legalább 3, legfeljebb 9, a találmány szerinti gének által kódolt polipeptidet tartalmaz. Az utóbbi lehetõségnek megfelelõ antigenikus polipeptidkészítményre példa egy mixotóp, mely sokféle szintetikus peptidet tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 G X9 X10 X11 X12 (SEQ ID No31), ahol: X1=I, Y vagy semmi; X2=L, F vagy semmi; X3=E, D, P vagy semmi; X4=R, D vagy semmi; X5=G, A, L vagy semmi; X6=W, G, S, I vagy E; X7=E, L vagy A; X8=F, I, G, L vagy S; X9=G, S vagy A; X10=V, A, L, I vagy S; X11=P, Y vagy L; X12=E, F vagy semmi. A mixotóp egy kombinatorikus peptidkönyvtár, melyet egyetlen szintézislépésben is elõ lehet állítani, amint azt Gras-Masse, Georges és munkatársai ben leírták. Az MSP-3-b-bõl származó egy másik mixotóp, melyet találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítménybe lehet adagolni, egy peptidkeverék, mely sokféle szintetikus peptidet tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: X1 X2 X3 W E X4 G G G X5 P (SEQ ID No 32), ahol: X1=I vagy Y: X2=L vagy F; X3=G vagy A; X4=F vagy I; és X5=V vagy A. Hasonlóképpen egy másik mixotóp, melyet a találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítménybe lehet adagolni, egy peptidkeverék, mely sokféle szintetikus peptidet tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: L X1 X2 X3 X4 X3 X5 X6 X7 D XS X9 X10 I X11 X12 X13 X14 X15 X16 (SEQ ID No 33), ahol: X1=E, vagy S; X2=L, H, S vagy Q; X3=I, V vagy L; X4=K, N, Y vagy P; X5=T, S vagy P; X6=S vagy L; X7=K, W vagy S; X8=E, K, R vagy I; X9=E vagy N; X10=D, N vagy Q; X11=I, V, S, P vagy A; X12=K, D vagy N; X13=H vagy E; X14=N vagy S; X15=E vagy D; X16=D vagy Q. A fenti antigéntulajdonságú mixotópkészítmény lehet legalább 50, legalább 100, vagy legalább 500 különbözõ szekvenciájú peptid keveréke. A készítmény tartalmazhatja szintetikus peptidek egy kombinatorikus könyvtárát, mely minden egyes megfigyelt és potenciális helyettesítést tartalmazza. A találmány tárgya továbbá valamely antigenikus készítmény, mely a két fentebb leírt mixotóp keverékét tartalmazza. A fentebb leírt antigenikus polipeptidek vagy antigenikus polipeptidkészítmények bármelyikében lehetséges egy lipidmolekula kötése a polipeptidmolekulák legalább egy részéhez. Ilyen célra alkalmazható lipidmolekulára példa a C¹terminális palmitoil-lizilamid-maradék. Amint azt már említettük, a találmány szerinti antigenikus polipeptidben lévõ polipeptidek vagy polipeptid jellegû molekulák legalább egy része valamely szilárd hordozóhoz köthetõ, ily módon konjugátumokat képezve. Ebben a megvalósításban elõnyös szilárd hordozók a vírusrészecskék, nitrocellulóz vagy polisztirolgyöngyök, és biológiailag lebontható polimerek, mint a lipofoszfo-glikánok vagy a poli-l-tejsav. A jelen találmány egy másik megvalósításában egy immunogén készítmény olyan polipeptidet vagy polipeptidkészítményt tartalmaz immunogénként, mely a fent leírtaknak megfelel, és amelyet rekombinációval állítottak elõ. Amint azt az 5. példában kifejtjük, az itt leírt géncsalád egy figyelemre méltó jellemzõvel bír, nevezetesen a géncsalád különbözõ tagjai közötti epitópkonzerválással, ami a géncsalád különféle termékei közötti immunológiai keresztreaktivitáshoz vezet. Az MSP- 3 1 és fragmenseinek vakcinációs potenciálja, amit a 2. és 3. példa illusztrál, a fent említett epitópkonzerválással és keresztreaktivitással olyan figyelemre méltó tulajdonságok, melyek ezen géncsaládot és a belõle származó polipeptidkészítményeket különösen érdekes maláriaellenes vakcinajelöltté teszik. A jelen találmány egy másik fontos tárgya ennek megfelelõen valamely fent leírt polipeptid vagy polipeptidkészítmény alkalmazása malária elleni vakcina készítésére, valamint egy ilyen vakcina, mely immunogénként ilyen polipeptidet vagy polipeptidkészítményt tartalmaz, valamely alkalmas farmakológiai hordozóval együtt. A találmány szerinti immunogén készítmény és vakcina továbbá tartalmazhat legalább egy, a követke- 7

8 1 HU T2 2 zõkbõl kiválasztott antigént: LSA¹1 (Guerin-Marchand, Druilhe és munkatársai 1987), LSA¹3 (Daubersies, Thomas és munkatársai 2000), LSA-5, SALSA (Bottius, BenMohamed és munkatársai 1996), STARP (Fidock, Bottius és munkatársai 1994), TRAP (Robson, Hall és munkatársai 1988), PfEXPI (Simmons, Woollett és munkatársai 1987), CS (Dame, Williams és munkatársai 1984), MSP1 (Miller, Roberts és munkatársai 1993), MSP2 (Thomas, Carr és munkatársai 1990), MSP4 (Marshall, Tieqiao és munkatársai 1998), MSP5 (Marshall, Tieqiao és munkatársai 1998), AMA¹1 (Peterson, Marshall és munkatársai 1989; Escalante, Grebert és munkatársai 2001), SERP (Knapp, Hundt és munkatársai 1989) és GLURP (lásd fent). A találmány egy különösen fontos megvalósítása szerint az immunogén készítmény vagy vakcina intradermális vagy intramuszkuláris injekcióként van formulázva. Ebben az esetben az immunogén készítmény vagy vakcina elõnyösen 1 és 100 g közötti immunogént tartalmaz adagonként, elõnyösebben 2 és 50 g között. Más módon az immunogén készítmény vagy vakcina orális beadásra lehet formulázva, amint azt BenMohamed, Beikaid és munkatársai 2002-ben leírták. A találmány szerinti immunogén készítmény vagy vakcina továbbá tartalmazhat SBAS2¹t és/vagy alumínium-sót és/vagy Montanide¹t adjuvánsként. A jelen találmány további tárgyai az itt tárgyalt antigének ellen termelt ellenanyagokkal és ellenanyagfragmensekkel kapcsolatosak. Amint az fent és az 5. példában leírásra kerül, az MSP¹5 géncsalád epitópkonzerváltsága egy adott antigén ellen nyert ellenanyagok keresztreaktivitásához vezet. Például valamely szintetikus vagy rekombináns ellenanyag, mely keresztreagál az MSP-3 3-mal, és amely in vitro körülmények között a Plasmodium falciparum vérben élõ stádiumainak gátlását vagy elpusztítását közvetíti a monocitadependens, ellenanyag-közvetített ADCI mechanizmusban, a találmány szempontjából különösen fontos ellenanyag. A találmány szerinti polipeptidek ellen termelt ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek keverékei szintén tárgyai a találmánynak. A találmány szerinti ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek egy másik keveréke valamely fent leírt polipeptidkészítmény ellen irányul. A találmány szerinti elõnyös ellenanyagok (vagy fragmensek) az emberi vagy humanizált ellenanyagok. Ilyen ellenanyagokat vagy ellenanyagfragmenseket például Lemna-ban, valamint kukoricában, dohányban, CHO sejtekben és hasonlókban lehet termelni. CHO sejtekben termelve például a WO 03/ által ismertetett eljárásokat lehet alkalmazni. A jelen találmány tárgya továbbá egy, a fentiekben leírt ellenanyagot vagy ellenanyag-keveréket vagy ezek fragmenseit tartalmazó készítmény alkalmazása malária elleni gyógyszer készítésére. Természetesen a malária passzív immunterápiájára szolgáló, ilyen ellenanyagot vagy ellenanyag-keveréket tartalmazó gyógyszer szintén a találmány tárgyát képezi. Az ilyen gyógyszer továbbá tartalmazhat a következõ listából válogatott legalább egy antigén ellen irányuló ellenanyagokat: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. A malária megelõzésére, enyhítésére vagy kezelésére szolgáló eljárások, melyek a fentiekben leírt immunogén készítmény, vakcina, vagy ellenanyagot tartalmazó gyógyszer rászoruló betegeknek történõ beadását alkalmazzák, szintén tárgyai a találmánynak. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a malária in vitro diagnózisára P. falciparum-mal feltehetõen fertõzõdött egyénben, mely eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: az egyénbõl származó biológiai minta érintkezésbe hozása a találmány szerinti antigenikus polipeptiddel az antigenikus polipeptid és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ ellenanyagok közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetõvé tévõ körülmények között, és az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek detektálása. Ezen eljárásban az in vitro diagnózis ELISA módszerrel végezhetõ. Az eljárás további lépéseként lehetséges emellett a biológiai minta érintkezésbe hozása egy vagy több antigenikus peptiddel, mely a következõ listából választott valamely antigénbõl származik: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP- 3 1, MSP-3 2, MSP-3 5, MSP-3 6, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. Egy alternatív eljárás a malária in vitro diagnózisára P. falciparum-mal feltehetõen fertõzõdött egyénben a következõ lépéseket tartalmazza: az egyénbõl származó biológiai minta érintkezésbe hozása a találmány szerinti ellenanyagokkal, az ellenanyagok és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ antigének közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetõvé tévõ körülmények között, és az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek in vitro detektálása. A malária diagnózisára szolgáló kitek, melyek az MSP¹3 géncsaládnak a találmány szempontjából különösen fontos tulajdonságain alapulnak, szintén tárgyai a találmánynak. Példának okáért tartalmazhatnak legalább egy, a találmány szerinti peptidet vagy polipeptidet, akár szilárd hordozóhoz kötve. Egy ilyen kit továbbá tartalmazhat reagenseket, melyek lehetõvé teszik az antigenikus peptid vagy polipeptid és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ ellenanyagok közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását, és reagenseket, melyek lehetõvé teszik az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek detektálását. Egy másik, a malária diagnózisára szolgáló kit a találmány szerint a fent leírt ellenanyagokat tartalmazza, továbbá szükség szerint reagenseket, melyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és az MSP¹3 géncsalád fehérjéi közül a biológiai mintában jelen lévõk között antigén-ellenanyag komplexek kialakulását, és reagenseket, melyek lehetõvé teszik az esetlegesen képzõdött antigénellenanyag komplexek in vitro detektálását. A jelen találmány tárgya ugyancsak valamely rekombináns nukleotidszekvencia, mely a találmány szerinti antigenikus polipeptidet kódol. A találmány szem- 8

9 1 HU T2 2 pontjából különösen fontos szekvenciák a találmány szerinti szekvenciák, melyek legalább két MSP-3-bszerû, és/vagy MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaznak, ahol ezen motívumok legalább egyike a SEQ ID No: és valamelyike, vagy ezek konzervatív variánsa. Egy példa erre egy rekombináns nukleotidszekvencia, mely számos MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmazó fúziós fehérjét kódol, ahol a motívumok közül legalább kettõ a SEQ ID No: valamelyike, vagy ezek konzervatív variánsa. A találmány tárgya továbbá valamely rekombináns klónozó és/vagy expressziós vektor, mely a találmány szerinti valamely nukleotidszekvenciát tartalmazza, amint azt fentebb leírtuk, mely szekvencia például valamely promoter és valamely gazdasejt szempontjából homológ vagy heterológ szabályozóelemek ellenõrzése alatt áll, a gazdasejtben történõ expresszió céljából. A fenti bekezdésben leírt expressziós vektor elõnyösen alkalmazható a Plasmodium falciparum elleni genetikai immunizálásra szolgáló gyógyszer készítésére. A találmány tárgya továbbá valamely nukleinsavvakcina, mely a találmány szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. Valamely rekombináns gazdasejt, például baktérium, élesztõ, rovarsejt vagy emlõssejt, mely a fent leírtaknak megfelelõ expressziós vektorral transzformálva van, szintén tárgya a találmánynak. A jelen találmány számos vonatkozása és elõnye illusztrálva van a következõ ábrákkal és kísérleti adatokkal. Ábraaláírások 1. ábra: A 10. kromoszóma azonos régiójában található kilenc gén szervezõdése. A kilenc nyitott leolvasási keretet nem kódoló régiók választják el, és 5 3 irányban sorban elõször a GLURP-nek nevezett fehérjét kódolják, majd 1300 bázispár távolságra az MSP¹3 (újabb elnevezése MSP-3 1) következik, azután 7 másik gén, melyet MSP-3 2, MSP-3 3, MSP- 3 4, MSP-3 5, MSP-3 6, MSP-3 7, MSP-3 8 jelölés illet. 2. ábra: Az MSP-3 1-bõl származtatott különféle peptidek. A védettség az MSP¹3b, c és d peptidekkel reagáló ellenanyagokkal hozható összefüggésbe. 3., 4. és 5. ábra: In vivo tanulmányok. Specifikus ellenanyagok átvitele passzív transzferkísérletekben P. falciparum-mal fertõzött, emberi vörösvértestekkel transzfundált, immunkompromittált egerekbe. Az MSP 3¹b peptiddel, MSP-3¹d peptiddel és a GLURP¹R0 régióval reagáló ellenanyagok mind képesek in vivo, a passzív transzfer körülményei között, az immunkompromittált SCID egerekben elõidézett P. falciparum-parazitémia megszüntetésére. 6. ábra: In vivo tanulmányok. Megerõsítõ eredmények Egy, az MSP-3¹b epitóp ellen irányuló emberi rekombináns ellenanyag, mely az MSP-3 2 rekombináns fehérjével keresztreagál, passzív transzferben képes a P. falciparum-fertõzött SCID egerekben a parazitémia megszüntetésére. 7. ábra: Emberi önkénteseknek egy, az MSP- 3¹b, c, d peptidek régióit lefedõ hosszú szintetikus peptiddel történt mûvi immunizálásával kiváltott ellenanyagok alkalmazásával nyert eredmények. Ugyanezt a hatást lehet megfigyelni mind in vitro körülmények közt, mind in vivo körülmények között, a P. falciparum-fertõzött SCID egér modellben. 8. ábra: A teljes afrikai IgG és az afrikai IgG koncentrációjára beállított, tisztított anti- MSP-3¹b biológiai hatásának összehasonlítása. Az anti-msp-3¹b ellenanyagok erõsebb és teljesebb hatása figyelhetõ meg, ami vakcinapotenciáljukat húzza alá. 9. ábra: Az MSP¹3 géncsalád nukleotidszekvenciáinak összeigazítása a ClustalW program segítségével. 10. ábra: Az MSP¹3 géncsalád peptidszekvenciáinak összeigazítása a ClustalW program segítségével. 11. ábra: Az MSP3 géncsalád génjei szekvenciáinak összehasonlítása. Az összehasonlítás felettébb szokatlan epitópkonzerválást mutat a géncsalád tagjai körében, a biológiailag aktív ellenanyagok által megcélzott epitópokra vonatkozóan, ami kritikus a védettség szempontjából. 12. ábra: MSP-3-b-szerû motívumok. 13. ábra: MSP-3-c-d-szerû motívumok. 14. ábra: A. Az lgg3 ellenanyagválaszok mintázata minden egyes antigén ellen 30 OoDobeli védett egyénben (az IgG3 specifikus válaszok arányainak átlagai és standard hibái). B. Az IgG3 ellenanyagválaszok mintázata 7 védett, alacsony IgG3 anti- MSP3 választ mutató OoDo-beli lakosban (alacsony IgG3 határérték: az átlag 95%¹os konfidenciaintervallum-határértéke alatt, azaz anti-msp3b IgG3 <2,30). C. Az IgG3 ellenanyagválaszok mintázata 15 védett, alacsony IgG3 anti¹ro választ mutató OoDo-beli egyénben (alacsony IgG3 határérték: az átlag 95%¹os konfidenciaintervallum-határértéke alatt, azaz anti-glurp R0 <1,38). D ban magas lgg3 MSP3 választ mutató 7 védett egyén változásai 5 évi idõtartamban. E ban magas IgG3 anti- GLURP R0 választ mutató 7 védett egyén változásai 5 évi idõtartamban. 15. ábra: Az MSP¹3 géncsaládból származtatott különféle konstrukciókon affinitástisztított ellenanyagok ADCI-aktivitása. Az eredményeket SGI (specifikus növekedésgátlási index) átlagokként fejezzük ki a pozi- 9

10 1 HU T tív kontrollhoz, egy afrikai immunglobulinkeverékhez (PIAG) viszonyítva. Ezt a keveréket thai gyermekekbe vitték át passzív transzferrel. Az affinitási tisztításhoz használt szekvenciák a C¹terminális régiónak felelnek meg, amely a leghomológabb rész a gének között és az egyetlen jól konzervált szakasz. A szekvenciákat a C¹terminális régió alatt vonal jelzi a 18. ábrán. Az eredmények azt mutatják, hogy a 6 gén minden egyes régiójára specifikus összes ellenanyag erõsen aktív az ADCI mechanizmusban annyira, mint az afrikai immunglobulinkeverék, melyrõl kimutatták, hogy hatékony a P. falciparum eliminálásában, fertõzött egyénekben, passzív transzferrel. 16. ábra: Az MSP¹3 géncsalád minden egyes tagjának C¹terminális régióján affinitástisztított ellenanyagok keresztreakciós mintázata az MSP¹3 géncsalád többi tagjával. A GLURP, 571 és a BSA negatív kontrollként szolgálnak. Az eredmények megmutatják, hogy a géncsalád egyik tagjának C¹terminális régióján affinitástisztított ellenanyagok keresztreagálnak, különbözõ mértékben, az MSP¹3 géncsalád többi tagjával. A legerõsebb keresztreakciós mintázatot az MSP- 3 4 adja, ami erõs pozitív reakciót ad az összes többi családtaggal; õt követi az MSP-3 8. Mindazonáltal ez a dot-blot mindössze az MSP¹3 géncsalád minden egyes tagjának keresztreagáló epitópjait mutatja. 17. ábra: Az MSP¹3 géncsalád minden egyes tagjának C¹terminális régióján affinitástisztított ellenanyagok keresztreakciós mintázata az MSP¹3 géncsalád MSP-3 1 és MSP-3 2 tagjaiból származó peptidekkel. A peptidek az MSP-3 1 és MSP- 3 2 a, b, c, d, és f peptidjei. A rekombináns MSP¹3 C¹terminális és a BSA rendre pozitív és negatív kontrollként szolgálnak. Az eredmények azt mutatják, hogy a géncsalád különbözõ tagjainak C¹terminális régióival reagáló ellenanyagok reagálnak, különbözõ mértékben, az MSP- 3 1 C¹terminálisának különbözõ régióival, különösen az MSP¹3b és c¹vel, és a legerõsebb választ az MSP- 3-f¹en kaptuk. A keresztreaktivitás az MSP-3 2- különféle peptidjeivel nem olyan erõs, mint az MSP-3 1- gyel. Végezetül az MSP-3 1-CT-vel, a C¹terminális rekombinánssal kapott nagyon erõs keresztreaktivitás szintén egy, nem az egyedi peptidek bármelyike által meghatározott, hanem valószínûleg a hosszabb C¹terminális rekombináns által generált konformációs epitópra irányuló keresztreaktivitásra utal. Ebben az esetben bármely affinitástisztított ellenanyagnak a géncsalád bármely adott tagjával szemben mutatott keresztreaktivitásának mértéke a géncsalád különbözõ tagjainak szerkezeti homológiáját és a keresztreagáló epitópok meglétét mutatja, beleértve a 3¹dimenziós konformáció által generált epitópokét. Ugyanez igaz az MSP- 3 2¹re. 18. ábra: Az MSP¹3 géncsalád különbözõ tagjainak sematikus megjelenítése. Az immunoassay-kben használt rekombináns antigének felépítésére alkalmazott C¹terminális régió alá van húzva. Példák 1. példa: A P. falciparum vérben élõ stádiumának elpusztítása a géntermékek elleni ellenanyagok által, az ADCI mechanizmussal 2.A. Anyagok és módszerek: az ADCI teszt 2.A.1. Bevezetés Az ellenanyagfüggõ sejtgátlás [Antibody Dependent Cellular Inhibition (ADCI)] vizsgálata az ellenanyagok azon képességének megítélésére szolgál, hogy mennyire képesek gátolni a Plasmodium falciparum növekedését monociták jelenlétében, in vitro. Tanulmányok kimutatták, hogy ellenanyagok, melyek a P. falciparum vérben élõ stádiumai ellen védelmet nyújtanak emberben, passzív transzfer útján nem képesek a parazitát in vitro gátolni, hacsak nem tudnak együttmûködni a vér monocitáival. Azt is kimutatták, hogy az in vivo védelemre nem képes ellenanyagok nincsenek hatással a P. falciparum növekedésére az ADCI tesztben. Ennek megfelelõen az ADCI egy olyan in vitro teszt, melynek eredményei az antimalária-ellenanyagok emberben in vivo körülmények között megfigyelhetõ védõhatását tükrözik. A monocitákkal együttmûködni képes ellenanyagok nyilvánvalóan citofilek: az IgG1 és IgG3 izotípusok hatékonyak az ADCI-ben, míg az IgG2, IgG4 és IgM izotípusok nem hatékonyak. Ez összhangban van azokkal az eredményekkel, melyek szerint a védett egyének szérumában a citofil anti-p. falciparum ellenanyagok dominálnak, míg a nem védett egyénekben a parazita ellen termelt ellenanyagok nagyrészt nem citofilek. Az eredmények arra utalnak, hogy az ADCI feltehetõen a következõ eseménysorozatot foglalja magában, amikor a schizonták felhasadnak, egyes merozoita felszíni komponensek és a monocitákhoz az Fc fragmensükkel kötött citofil ellenanyagok kölcsönhatása oldott mediátorok felszabadulását váltja ki, amelyek a tenyészfolyadékba diffundálva az eritrocitán belül élõ paraziták osztódását gátolják. Az ADCI teszt fõbb lépései a következõk: (i). Szérum-IgG preparálása ioncserés kromatográfiával. (ii). Monociták izolálása egészséges véradóból. (iii). P. falciparum paraziták preparálása, szinkronizálás és schizontadúsítás. (iv). Parazitatenyésztés 96 óra hosszat, ellenanyagok és monociták jelenlétében. (v). A gátló hatás megítélése mikroszkópos megfigyeléssel és parazitaszámlálással. 10

11 1 HU T2 2 2.A.2. Anyagok igg preparálása 1. Tris-puffer: 0,025 M Tris-HCl, 0,035 M NaCl, ph=8,8. 2. Foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS), ph=7,4. 3. GF-05-Trisacryl szûrõoszlop (IBF, Biothecnics, Villeneuve La Garenne, Franciaország). 4. DEAE-Trisacryl ioncserélõ kromatográfiás oszlop (IBF). 5. G25 gélszûrõ oszlop. 6. Amicon szûrõk és csövek fehérjekoncentráláshoz (molekulatömeg-határérték: Da). 7. Sterile Millex szûrõk, 0,22 m pórusátmérõ (Millipore Continental Water Systems, Bedford MA, USA). 8. Ultraibolya lámpával ellátott spektrofotométer. Monociták preparálása 1. Heparinos vér egészséges donortól, ml térfogat. 2. Ficoll Hypaque sûrûséggradiens (Pharmacia LKB Uppsala, Svédország). 3. Hank s-oldat kiegészítve NaHCO 3 -mal, ph=7,0. 4. RPMI 1640 tenyészközeg kiegészítve 35 mm HE- PES-sel és 23 mm NaHCO 3 -mal; ásványvízzel készítve; 4 C¹on tartva. 5. Nem specifikus észteráz (NSE)-festéshez reagensek: fixálóoldat, nitrit, festék, puffer és szubsztrát mélyülettel ellátott steril mûanyag tálcák (TPP, Svájc). 7. Hûthetõ centrifuga. 8. CO 2 -inkubátor. 9. Inverz mikroszkóp. Parazitapreparálás 1. RPMI 1640 tenyészközeg (lásd fent) % Albumax törzsoldat; 4 C¹on tárolva legfeljebb 1 hónapig. 3. 5% szorbitol a paraziták szinkronizálásához. 4. Plasmagel a schizonták feldúsításához. 5. Reagensek kenetek fixálásához és festéséhez: metanol, eozin, metilénkék. 2.A.3. Módszerek IgG preparálása Az IgG¹t emberi szérumból vonjuk ki (lásd az 1. megjegyzést) a következõk szerint: 1. A szérumot 1:3 arányban hígítjuk a Tris-pufferrel. 2. A hígított szérumot az elõzõleg a Tris-pufferrel egyensúlyba hozott GF¹05 Trisacryl gélszûrõ oszlopon gélszûrjük. Ellenõrizzük, hogy a szérum:gél arány 1 térfogat hígítatlan szérum 4 térfogat GF¹05 gélre. 3. A fehérjét tartalmazó frakciókat összeöntjük. 4. Az összeöntött frakciókat az elõzõleg a Tris-pufferrel egyensúlyba hozott DEAE Trisacryl ioncserés kromatográfiás oszlopra töltjük. Ellenõrizzük, hogy a szérum:gél arány 1 térfogat hígítatlan szérum 4 térfogat DEAE Trisacryl gélre ml térfogatú frakciókat gyûjtünk. 6. Minden egyes frakció optikai denzitását (OD) megmérjük 280 nm¹es szûrõvel Az IgG-koncentrációt a következõképpen számítjuk: IgG mg/ml=od 280 nm /1,4. 8. Az IgG-tartalmú frakciókat összeöntjük. 9. Az IgG-oldatot Amicon szûrõn koncentráljuk. Az Amicon szûrõt elõzõleg desztillált vízben áztatjuk 1 óra hosszat, majd speciális csövekhez illesztjük, melyekbe adagoljuk az IgG-oldatot. 10. A csöveket 876 g¹n 2 óra hosszat centrifugáljuk 4 C¹on. Ez általában 25¹szörös koncentrálódást eredményez. 11. Végezetül gélszûrünk egy elõzõleg RPMI tenyészfolyadékkal egyensúlyba hozott G24 oszlopon. 12. Az RPMI-ben IgG¹t tartalmazó frakciókat gyûjtjük. 13. Minden egyes frakció optikai denzitását mérjük 280 nm¹es szûrõvel. 14. Az IgG-koncentrációt számítjuk. 15. Összeöntjük az IgG-tartalmú frakciókat. 16. Az IgG-frakciókat 0,22 m pórusátmérõjû szûrõn átszûrve sterilizáljuk. 17. A steril IgG-oldatot 4 C¹on legfeljebb 1 hónapig tároljuk (vagy Albumax¹ot adunk hosszabb tároláshoz nem ajánlott eljárás). Monocitapreparálás A monocitapreparálásra alkalmazott eljárás a Boyum (Scand J. Clin. Lab. Invest. 1968, 21, 77 89) által leírtakon alapul, és a következõ lépéseket foglalja magában: 1. A heparinos vért 3¹szorosan hígítjuk Hank s-oldattal. 2. A hígított vér két térfogatnyi mennyiségét gondosan felülrétegezzük 1 térfogat Ficoll Hypaque¹ra (centrifugacsövenként legfeljebb 20 ml hígított vér) g¹n 20 percig centrifugáljuk 20 C¹on. 4. A Ficoll/plazma határfelületrõl a mononukleáris sejteket leszívjuk. 5. A mononukleáris sejtszuszpenziót 45 ml Hank s-oldattal hígítjuk g¹n 15 percig centrifugáljuk 20 C¹on. 7. A leülepedett sejteket gondosan felszuszpendáljuk 45 ml Hank s-oldatban. 8. Ismét 1000 g¹n 15 percig centrifugáljuk 20 C¹on. A mosási lépést még kétszer ismételjük. 9. Végezetül 180 g¹n 6 percig 20 C¹on centrifugáljuk a vérlemezkék eltávolítására, melyek a felülúszóban maradnak. 10. A mononukleáris sejteket 2 ml RPMI-ban felvesszük. 11. A mononukleáris sejtek (azaz a limfociták és monociták) koncentrációját a sejtszuszpenzióban úgy számítjuk, hogy egy 20 l¹es mintát RPMI-vel 3 hígítunk, és hematológiai sejtszámláló automatában (például Malassez típusúban) számláljuk. 12. A monociták számát nem specifikus észteráz- (NSE) festési technikával határozzuk meg: (i). Az A jelû mikrokémcsõbe 40 l mononukleáris sejtszuszpenziót és 40 l 1 fixálóoldatot adunk. (ii). A B jelû mikrokémcsõben összekeverjük az NSE-festés reagenseit a következõ sorrendben: 11

12 1 HU T l nitrit, 60 l festék, 180 l puffer, és 30 l szubsztrát. (iii). A B jelû mikrokémcsõben lévõ keveréket az A jelû mikrokémcsõben lévõ sejtekhez adjuk. (iv). A festett sejtekbõl 20 l mintát veszünk és a monocita:limfocita arányt meghatározzuk az alapján, hogy a monociták barnára festõdtek, míg a limfociták festetlenek maradtak. Általában a monociták aránya 10 20% az összes mononukleáris sejten belül. 13. A sejtszuszpenziót monocita/100 l koncentrációra állítjuk RPMI-vel. 14. A sejtszuszpenziót 96 mélyülettel ellátott tálcára adagoljuk 100 l/mélyület adagokban C¹on 90 percig inkubáljuk 5% CO 2 alatt. Az inkubáció alatt a monociták a mûanyag felületére tapadnak. 16. A le nem tapadt sejteket eltávolítjuk, a monocitákat mélyületenként 200 l RPMI hozzáadásával és gondos eltávolításával mossuk. 17. Ezt a mosási eljárást háromszor ismételjük, hogy az összes le nem tapadt sejtet eltávolítsuk. 18. Az így nyert sejtek legalább 95%¹a monocita lesz. Ellenõrizzük a sejtek kinézetét és az egyes mélyedésekben a sejteloszlás relatív homogenitását fordított fényutas mikroszkóppal (lásd a 2., 3. és 4. Megjegyzést). Parazitapreparálás A P. falciparum törzseket 0,5% Albumaxszal kiegészített RPMI 1640 tápfolyadékban tartjuk. A parazitákat szorbitolkezeléssel szinkronizájuk a következõk szerint: 1. A szorbitol törzsoldatot 5%¹ra hígítjuk ásványvízzel. 2. Az aszinkron parazitaszuszpenziót 1200 rpm¹en 10 percig 20 C¹on centrifugáljuk. 3. Az üledéket felvesszük az 5% szorbitololdatban. Ez a schizontákkal fertõzött vörösvértestek líziséhez vezet a gyûrûs alakokra és fiatal trofozoitákra gyakorolt bármilyen hatás nélkül. Ha szükséges, a schizontákat plazmagélen flotációval lehet dúsítani a következõk szerint: 1. Az aszinkron parazitatenyészetet 250 g¹n 10 percig 20 C¹on centrifugáljuk. 2. Az üledéket felvesszük a vörösvértestek 20%¹os koncentrációjáig 30% RPMI, 50% plazmagélben C¹on 30 percig inkubáljuk. A schizontával fertõzött vörösvértestek a felülúszóban maradnak, míg a fiatal trofozoitával fertõzött és nem fertõzött vörösvértestek leülepednek. 4. A felülúszót gondosan összegyûjtjük, centrifugálással 250 g¹n 10 percig 20 C¹on. 5. A leülepedett sejtekbõl készítsünk kenetet, fessük meg, és határozzuk meg a parazitémia mértékét mikroszkópos számlálással. 6. Ezen eljárás használatával a szinkronizált schizontafertõzött vörösvértestek kinyerési aránya ~70% parazitémia. Az ADCI-teszthez szinkronizált korai schizonta parazitákat használunk. Általában a parazitémia 0,5 1,0% és a haematokrit 4% Az ADCI-teszt 1. Az utolsó mosási lépés után minden egyes monocitatartalmú mélyülethez a következõket adjuk: (i). 40 l RPMI 0,5% Albumaxszal kiegészítve (tenyészközeg). (ii). 10 l vizsgálandó ellenanyagoldat. Általában az IgG-ket az eredeti, szérumbeli koncentrációjuk (~20 mg/ml hiperendémiás területekrõl származó felnõttekben, és ~12 mg/ml endémiás területekrõl származó gyermekekben és elsõ alkalommal fertõzõdött betegekben) 10%¹án alkalmazzuk (lásd az 5. megjegyzést). (iii). 50 l parazitatenyészet, 0,5% parazitémia és 4% hematokrit mellett. 2. A kontrollmélyületek a következõket tartalmazzák: (i). Monociták (MN) és paraziták normál IgG-vel (N IgG), mely malária-elõtörténettel nem rendelkezõ donorból készült. (ii). Parazitatenyészet a vizsgálandó IgG-vel, de monociták nélkül. 3. A tenyészetet 37 C¹on tartjuk 96 óráig felfordított befõttesüvegben (vagy alacsony O 2,5%CO 2 -inkubátorban) és 72 óra múlva adjunk 50 l tenyészközeget minden egyes mélyületbe óra után a felülúszókat eltávolítjuk, minden egyes mélyületbõl kenetet készítünk, festjük, és mikroszkóp alatt a parazitémiát meghatározzuk. A viszonylagos pontosság biztosítása érdekében legalább vörösvértesben meg kell határozni a fertõzött sejtek arányát (lásd 6. és 7. megjegyzések). 6. A specifikus növekedésgátlási indexet [Growth Inhibitory Index (SGI)] számítjuk, figyelembe véve a monociták vagy az ellenanyag által önmagukban okozott esetleges gátlást: SGI=100 1 százalékos parazitémia monocitákkal és ellenanyagokkal/százalékos parazitémia ellenanyagokkal/százalékos parazitémia monocitákkal és normál IgG-vel/százalékos parazitémia normál IgG-vel. 2.A.4. Megjegyzések 1. A vizsgálandó szérumokból az IgG kipreparálása elengedhetetlen, mivel frakcionálatlan szérum alkalmazásakor a parazitanövekedés nem ellenanyagfüggõ gátlása gyakran megfigyelhetõ, valószínûleg oxidált lipideknek tulajdoníthatóan. 2. Az ADCI-ben a monocita (MN)-mûködés számos tényezõtõl függ, így az RPMI 1640 elõkészítésére használt víztõl. A magas fokban tisztított víz, mint például a Millipore-víz, bár megfelelõ a paraziták tenyésztéséhez, a mûanyag mélyületekhez tapadt monociták számában rossz kitermelést eredményez. Másfelõl ásványi anyagokat nyomokban tartalmazó víz, például a kereskedelemben kapható Volvic víz, vagy üvegen desztillált víz, következetesen jó monocitamûködést eredményez. 3. Fokozott monocitaletapadást lehet elérni a tenyésztõedények fibronektines bevonásával, azaz a monocitadonor autológ plazmájával történõ bevo- 12

13 1 HU T2 2 nással, majd azt követõ RPMI 1640¹es mosással, a mononukleáris sejtekkel történõ inkubálás elõtt. 4. Vírusfertõzött (például influenza) alanyokból származó monociták gyakran képesek nem IgG-függõ parazitanövekedés-gátlást indukálni. Ez a nem specifikus gátló hatás megakadályozhatja az IgGfüggõ hatás észlelését az ADCI-ban. Ennek okáért kerülendõk azon monocitadonorok, akik gyaníthatóan vírusos fertõzésen esnek át, vagy lázuk volt az elõzõ 8 napban. Az ADCI eredményei nem megbízhatóak, ha a monociták közvetlen hatása 50%¹os gátlásnál nagyobb. Heterológ szérumot, például fötális borjúsavót tartalmazó közegben történõ preparálása a monociták differenciálódását, makrofággá történõ progresszív transzformációjukat eredményezi, mellyel elvesztik ADCI-elõsegítõ hatásukat. 5. Ha szükséges, egér IgG¹t lehet emberi monocitákkal vizsgálni ADCI-ban. Az IgG2a izotípus képes az emberi monocitákon található Fc -receptor II¹höz kötõdni, amelyrõl kimutatták, hogy az ADCI mechanizmusában szerepet játszik. 6. Az ADCI-teszt egy lehetséges variánsa a merozoita felszíni antigének elleni, védõhatású citofil ellenanyagok (hiperendemikus területrõl származó felnõttekbõl) és a nem védõhatású ellenanyagok (endémiás területekrõl származó gyermekekbõl és elsõ alkalommal fertõzõdött betegekbõl) közötti kompetitív hatás vizsgálatára alkalmas. Az utóbbiak ugyanazon antigéneket ismerik fel, de nem képesek a monocitaaktiválódás kiváltására, mert nem kötõdnek az Fc gamma-receptorokhoz. Ennek megfelelõen a kritikus antigénekkel reagáló nem citofil IgG blokkolhatja a védõhatású ellenanyagok ADCI-hatását. Minden IgG-frakciót az eredeti, szérumbeli koncentrációja 10%¹án kell alkalmazni. 7. Az ADCI teszteljárás módosítható, és kétlépéses ADCI-ként is végre lehet hajtani, a monociták rövid idõtartamú aktivációjával az alábbiak szerint: (i). A monocitákat óra hosszat inkubáljuk a vizsgálandó Ig¹vel és szinkronizált, érett schizontákkal fertõzött vörösvértestekkel, 5 10% parazitémia mellett. Az elsõ tenyészidõszak alatt a vörösvértestek széthasadása megtörténik, és a merozoiták kiszabadulnak. (ii). Minden egyes mélyületbõl a felülúszót összegyûjtjük, és 700 g¹n centrifugáljuk. (iii). A felülúszókat 96 lyukú tálcára osztjuk szét, 100 l/mélyület térfogatban. (iv). Minden egyes mélyületbe 100 l P. falciparum aszinkron tenyészetet teszünk, mely friss tápközeget tartalmaz, 0,5 1% parazitémia, 5% hematokrit mellett (ezen második tenyésztéshez alkalmazott vörösvértest-preparátum fehérvérsejtes szennyezését különös gonddal kell a minimumra csökkenteni). (v). A tenyésztés 36. órájában adjunk 1 mci 3 H-hipoxantint minden egyes mélyületbe. (vi). A tenyésztés 48. órája után gyûjtsük össze a sejteket, és mérjük meg a 3 H-felvételt folyadékszcintillációs számlálóval. 2.B. Eredmények 1. táblázat ADCI körülmények Ellenanyag Térfogat MN ( ) MN (+) SGI % Adj SGII % Direkt ADCI 02/03 17/1/03 RPMI 10 l 7,8 7,1 0% 0% Parazitatörzs 3D7 NIG dializált 5 l 7,5 6,3 8% 4% MN (monocita) preparálás letapadás PIAG (IFA 10 l 11,8 5 53% 100% 51% 35,000) Ali Kezdeti parazita (%) 0,5% aszinkron anti-msp3.1 CT 10 l 11,8 5 53% 100% 51% AB+RBC-ben (MSP3 Simon) Végsõ parazita (%) 7,8% anti-msp3.4 CT 10 l 12,6 5,1 56% 104% 62% Az ADCI idõtartama 72 h 15 l 9,4 5 42% 78% 21% MN-gátlás 9% anti-msp3.7 CT 10 l 9,9 5 45% 83% 27% % MN donor fagyasztott cito 15 l 11,4 10 4% 7% 46% 18/10/02 ADCI standard anti-msp3.1 CT 10 l 11 4,6 54% 101% 41% (MSP3 old) 15 l 11,3 4,6 55% 103% 45% 1. tálca anti-msp3.2 CT 10 l 12,5 3,4 70% 131% 60% (MSP6) Minden ellenanyagot 1:200¹as IFA-titerre állítottunk 15 l 9,8 4,5 50% 93% 26% be anti-msp3.8 CT 10 l 12 4,4 60% % 15 l 8,2 7,7 3% 6% 5% anti-msp3.3 CT 10 l 9,1 4,1 51% 94% 17% 15 l 9,1 4,5 46% 85% 17% 13

14 1 HU T2 2 Az ellenanyagok elõállításához alkalmazott C¹terminális régiókat a 18. ábra jelzi, a minden egyes fehérje alatti vízszintes vonalaknak felelnek meg. E. coli-ban a PTCR¹His vektor alkalmazásával klónoztuk õket. 2. példa: In vivo vizsgálatok egérben, ellenanyagok passzív transzferével Az 1. példában bemutatott in vitro eredmények megerõsítésre kerültek passzív transzferkísérletekben, ahol specifikus ellenanyagokat vittünk P. falciparumfertõzött, emberi vörösvértestekkel átültetett, immunkompromittált egerekbe. A jelen példában alkalmazott anyagok és módszerek le vannak írva: (Brahimi, Perignon és munkatársai. 1993; Badell, Oeuvray és munkatársai 2000). Közelebbrõl az ellenanyagok kinyerésére alkalmazott eljárások le vannak írva Brahimi és munkatársai közleményében. Ezen modell kezelésének komplexitása miatt egyelõre nem lehetett az összes ellenanyagot vizsgálni, de az MSP-3¹b peptid, az MSP-3¹d peptid és a GLURP¹R0 régió elleni ellenanyagok mindre képesek in vivo, passzív transzfer körülményei között, az immunkompromittált SCID egerekben elõidézett P. falciparum parazitémia megszüntetésére (3., 4. és 5. ábra). Látható, hogy az anti-msp-3¹b és anti-msp-3¹d ellenanyagok parazitaellenes hatása kivételesen erõs, és viszont, az azonos ellenanyag-koncentrációra állított anti-glurp ellenanyagok által indukált parazitaellenes hatás kevésbé hatékony: az anti-glurp ellenanyagok esetében a paraziták eltûnéséhez szükséges idõtartam kétszer olyan hosszú, mint az anti-msp¹3 ellenanyagok esetében. A fentebb leírt okokból a részletesen leírt 6 gén keresztreakciós hálózata azt jelenti, hogy a többi gén ellen termelt ellenanyagok valószínûleg ugyanolyan biológiai hatást mutatnak, ha P. falciparum-fertõzött egerekbe visszük át õket. Végezetül ezen in vivo hatás további megerõsítést nyert az MSP-3¹b epitóp elleni emberi rekombináns ellenanyag alkalmazásával (6. ábra), mely ellenanyag keresztreagál az MSP-3 2 rekombináns fehérjével, és passzív transzfer alkalmával megszünteti a parazitémiát a P. falciparumfertõzött SCID egerekben. Lényegében hasonló eredmények születtek emberi önkénteseknek az MSP-3¹b, c, d peptideket átfedõ, mind in vitro, mind in vivo, a P. falciparum-fertõzött SCID egér modellben ugyanezen hatást mutató hosszú szintetikus peptiddel történõ mesterséges immunizálásakor (7. ábra). 3. példa: Immunizációs kísérletek majmokon Az in vitro és in vivo körülmények között gyûjtött, védettségre vonatkozó adatok további független megerõsítést nyertek annak kimutatásával, hogy Freundféle teljes adjuvánssal adjuvált rekombináns MSP-3 1- gyel immunizált Aotus majmok az ADCI mechanizmusban hatékony ellenanyagokat termeltek, és hogy a majmok, ha virulens, vérben élõ stádiumban lévõ P. falciparum-mal oltották be õket, képesek voltak a P. falciparum-parazitémiájuk korlátozására és megszüntetésére, míg a kontrollmajmok nem példa: Teljes afrikai IgG-vel és tisztított anti- MSP-3¹b ellenanyagokkal kapott biológiai hatások összehasonlítása A teljes afrikai IgG-vel és a teljes afrikai IgG koncentrációjára állított, tisztított anti-msp-3¹b ellenanyagokkal kapott biológiai hatások összehasonlítása az anti-msp-3¹b ellenanyagok erõsebb és teljesebb hatását mutatja, ami aláhúzza vakcinapotenciáljukat. A megelõzõ és jelen kutatások folyamán a feltalálók megfigyelték, hogy az MSP-3¹b peptid elleni, affinitástisztított ellenanyagok észlelhetõen gyorsabb és erõsebb hatást mutattak, mint a teljes afrikai IgG, melybõl kinyerésre kerültek. Ez a megfigyelés rendkívül érdekes, minthogy a P. falciparum mintegy 6000 különféle fehérjébõl épül fel, és az MSP-3¹b az egyik fehérje kis szakasza mindössze, így kiszámítható, hogy az anti- MSP-3¹b ellenanyagok a parazitának való kitettség hatására keletkezõ ellenanyagok kevesebb mint 1/10 000¹ed részének felelnek meg. További kutatásokat folytattunk a teljes IgG-vel és az anti-msp-3¹b ellenanyagokkal, melyeket a 8. ábra foglal össze. Figyelemre méltó, hogy ezen kísérletekben az anti-msp-3¹b ellenanyagok mennyisége a teljes IgG-ben és a tisztított készítményben pontosan ugyanannyi volt. Ezen kísérletek, melyek 6 anti-msp-3¹b ellenanyaggal kezelt egér és 6 teljes afrikai tisztított IgGvel kezelt egér átlag ± szórásának felelnek meg, világosan megerõsítették, hogy az anti-msp-3¹b ellenanyagok hatása sokkal erõsebb, az anti-msp-3¹b ellenanyagok hatása teljesebb, minthogy az egérben a parazitémia teljes megszûnéséhez vezetnek, míg az immun-igg csökkenéshez vezet sterilitás nélkül, amint az ugyanezen készítmény esetében emberi önkéntesekbe történt injekciózásnál is megmutatkozott (és jelen esetben az afrikai felnõtt donoroknál, akik krónikus, alacsony szintû parazitémiát tartanak fenn). Ezen megfigyelés arra utal, hogy az afrikai immun- IgG-ben olyan más ellenanyagok vannak jelen, melyek az anti-msp¹3 ellenanyagok hatásával versengenek vagy azt gátolják. Ezen, különbözõ ellenanyagok közötti negatív kölcsönhatás például a Blackman és munkatársai által az anti-msp¹1 ellenanyagokra vonatkozóan leírtakra emlékeztet. A negatív kölcsönhatás szintén összekapcsolható más merozoita felszíni antigénekre irányuló nem citofil ellenanyagok által okozott interferenciával, melyek indirekt módon hathatnak, például térbeli gátlás útján, az anti-msp¹3 ellenanyagok számára gátolva az MSP¹3 antigének elérését. Mindenesetre ezen megfigyelés a vakcinafejlesztés számára is fontos következményekkel bír: felfogható annak jelzésének, hogy kiválasztott maláriaantigénekkel történõ immunizálás erõsebb védõhatású választ válthat ki, mint az összes maláriafehérjének, de legalábbis közülük számosnak való kitettségbõl eredõ védettség. Más szavakkal: a védõmechanizmusok célpontjaként azonosított molekulákkal történõ immunizálás erõsebb védelem kialakulásához vezethet, mint a természetes kitettség által kifejlesztett védettség, ami az aszexuális vérben élõ stádiumok elleni eddig legerõ- 14

15 1 HU T2 2 sebb védettség emberi lényekben. Tehát rendkívül ígéretes a jövõbeni hatékony maláriavakcinák kifejlesztése szempontjából. 5. példa: Epitópkonzerválás az MSP¹3 géncsaládban A jelen példában alkalmazott anyagok és módszerek le vannak írva: (Brahimi, Perignon és munkatársai 1993; Badell, Oeuvray és munkatársai 2000). Közelebbrõl az ellenanyagok kinyerésére alkalmazott eljárások le vannak írva Brahimi és munkatársai közleményében A géncsalád tagjai közötti szerkezeti homológia következményeképpen a megfelelõ fehérjék közötti immunológiai keresztreaktivitás megléte megerõsítésre került: emberi ellenanyagokat affinitástisztítottunk minden egyes génterméken, és reagáltattuk az összes többivel. Az eredmények megmutatják, hogy az MSP¹3 géncsalád egyetlen fehérjéje ellen indukált ellenanyagok a többi antigénnel is reagálnak immunobloton (16. és 17. ábra), valamint ELISA-ban (az alábbi 2. táblázat). 2. táblázat A hét géntermék elleni ellenanyagok mind hatásosak a P. falciparum vérben élõ stádiumainak elpusztításában a monocitafüggõ ellenanyag-közvetített ADCI mechanizmusban in vitro körülmények között. Az eredmények megmutatják, hogy valamennyi ilyen régió elleni ellenanyag egyenlõ mértékben hatékony a P. falciparum eritrocitastádiumai növekedésgátlásában in vitro körülmények között. MSP3.1 CT MSP3.2 CT MSP3.3 CT MSP3.4 CT MSP3.7 CT MSP3.8 CT 571-His BSA Anti-MSP3.1 CT Anti-MSP3.2 CT Anti-MSP3.3 CT Anti-MSP3.4 CT Anti-MSP3.7 CT Anti-MSP3.8 CT Ezen, még mindig folyamatban lévõ kutatás megmutatta, hogy az egyik génterméken affinitástisztított ellenanyagok keresztreagálnak a többi gén termékeivel és viszont minden egyes génre, amit közvetett módon az ADCI-vel kapott eredmények is mutatnak (1. példa). Immunológiai és vakcinafejlesztési szinten a gyakorlati következmény az, hogy a géncsalád bármely tagjával végzett immunizálás ellenanyagokat fog indukálni ugyanazon és a többi géntermékkel szemben is. Ennek megfelelõen ez egy nagyon különleges típusú többgénes géncsalád, mely epitóppolimorfizmus helyett, ami általában a mai napig leírt többgénes géncsaládok jellemzõje, itt az epitópkonzerválás a fõ jellemzõ, ahol deléció, vagy bármely adott génben történõ mutáció esetén a géncsalád egy másik vagy összes többi tagja át tudja venni az antigénfunkciót. Ráadásul egy adott parazita az összes gént egyidejûleg expresszálja. Javaslatunk szerint ez nemcsak egy elõnyös vakcinacsaládot eredményez, hanem a parazita által annak túlélése érdekében kifejlõdött mechanizmust is jelent. A parazita csak akkor él túl, ha nem öli meg a gazdaszervezetet: az ADCI mechanizmus által a parazitémiát csökkenteni képes ellenanyagok indukálásával a parazita biztosítja az immunizálódott gazdaszervezet elegendõ mértékû védelmét, és ezáltal biztosítja saját túlélését. A géncsalád által biztosított epitópduplikáció biztosítja, hogy egynél több géntermék töltse be ezt a létfontosságú funkciót példa: Az MSP-3 2 peptidek ADCI eredményei Az MSP-3 2 a, b, c, d, e és f peptidekkel ADCI-ben kapott eredmények megegyeznek az MSP-3 1 ugyanezen peptidjeivel kapottakkal, azaz az MSP-3 2 b, c, d és e peptidek elleni ellenanyagoknak van ADCI aktivitásuk, míg az MSP-3 2 a és f ellenieknek nincs. 7. példa: Az MSP3 és GLURP elleni válaszok egymást kiegészítõ hatása longitudinális klinikai és parazitológiai követéses vizsgálatban kimutatva 7.A. Anyagok és módszerek 7.A.1. Vizsgálati terület, népesség és klinikai felügyelet OoDo falu Myanmar egy újratelepült régiója trópusi klímával, melyet forró száraz, monszun és hideg száraz évszakok jellemeznek. Ezen területen a malária stabil és hiperendemikus, az évszaktól függõ változásokkal, a fertõzések többsége (98%) Plasmodium falciparum-nak tulajdonítható, a maradék 2%¹ért a Plasmodium vivax felelõs. A maláriás rohamot 4 együttesen fennálló kritériumnak megfelelõen definiáltuk: i)¹ korrigált hónalji hõmérséklet 38,0 C, ii)- más klinikai megbetegedés hiánya, iii)- aszexuális P. falciparum-formák jelenléte a keneteken, és iv)- klinikai és parazitológiai javulás chloroquine-kezelés után. Két lázrohamot két külön maláriaepizódnak definiáltunk, ha 72 h választotta el õket. A követés elsõ 33 hónapjának eredményei újabban közlésre kerültek (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). Ugyanazon vizsgált népesség ismét követésre került egy újabb évre, december 31¹ig bezárólag, ugyanazon protokoll szerint. Vénás vérmintákat 1998 szeptembere folyamán vettünk, és az január 1. és december 31. között rögzített maláriás rohamokat elemeztük a klinikai védettséggel összefüggésben. 15

16 1 HU T2 2 7.A.2. Vérminták és parazitológiai vizsgálat A maláriás fertõzõdés felügyelete ujjbegybõl vett vékony és vastag vérkenetek rendszeres havi vizsgálataiban valósult meg. Egy kenetet negatívnak minõsítettünk, ha a Giemsa-festett vastag kenetben 200 olajimmerziós látótérben nem volt parazita észlelhetõ. A lázas esetekben két ujjbegybõl vett kenetet értékeltünk a chloroquine-kezelés elõtt és után. Vénás mintákat vákuumos csövekbe vettünk, a szérumokat aszeptikusan szétosztottuk, és vizsgálatig 20 C¹on tároltuk. A 292 lakosból álló kohorból 116 lakost választottunk ki, akinél a havi kenetek 60%-ából a parazitológiai adatok rendelkezésre álltak. 7.A.3. Antigének A három rekombináns GLURP antigén a P. falciparum F32 N¹terminális R0 nem ismétlõdõ régiójából (GLURP ), az R1 központi ismétlõdõ régióból (GLURP ), és az R2 C¹terminális ismétlõdõ régióból (GLURP ) származtak (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). Az MSP1C-terminális 19 kda fragmense, az MSP1 19, a Wellcome törzsbõl (MSP1-W¹19) rekombináns GST-fúziós fehérjeként került termeltetésre Escherichia coli-ban, és Dr. A. Holder, UK szíves ajándéka volt. A GST-taget enzimes emésztéssel és azt követõ affinitási kromatográfiával távolítottuk el használat elõtt. Az MSP3b szintetikus peptid (184-AKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEEN- 210, SEQ ID No:5) tartalmazta az MSP3b B¹sejt-epitópot, mely az ADCI-ben hatékony emberi ellenanyagokkal reagál (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun és munkatársai 1994) A.4. Ellenanyag-meghatározások A három P. falciparum-eredetû antigénnel reagáló ellenanyagok szintjét emzimkötött immunoszorbens vizsgálattal (ELISA) határoztuk meg, amint az korábban leírásra került (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). Röviden, mikrotitertálcákat (Maxisorb, Nunc, Dánia) vontunk be éjszaka 4 C¹on a rekombináns fehérjékkel vagy szintetikus peptidekkel a következõ koncentrációkban: 0,5 g/ml (R0 és R2), 1 g/ml (R1 és MSP1) és 5 g/ml (MSP3b). A GLURP antigének esetében 0,05 M Na 2 CO 3, ph=9,6 az MSP1 és MSP3 esetében foszfátpufferolt sóoldat (PBS) ph=7,4 szolgált bevonópufferként. Másnap a tálcákat PBS 0,05% Tween 20 (PBST) keverékével mostuk és 2,5% PBS¹be kevert zsírmentes tejjel blokkoltuk 2 óra hosszat. Az 1,25 % (w/v) zsírmentes tejet tartalmazó PBST-ben hígított szérumokat párhuzamos mélyületekbe adtuk, és 1 óra hosszat szobahõmérsékleten tartottuk. Minden egyes antigénhez más szérumhígítást alkalmaztunk: 1:200 a GLURP-hez, 1:100 az MSP1- hez és 1:20 az MSP3-hoz. Ezen hígításokat elõzetes elõkísérletek alapján határoztuk meg, melyek több mint 10¹szeres különbséget eredményeztek a kontroll- és vizsgálati minták között. A kötõdött ellenanyagot 1:3000¹re hígított peroxidázjelzett, kecskében termelt antihuman immunoglobulinnal (Caltag Laboratories) mutattuk ki. A színt ph=5 citrátpufferben oldott o¹fenilén-diaminnal (Sigma, St. Louis, Mo.) és H 2 O 2 -dal fejlesztettük ki 30 perc alatt. Az optikai denzitást (OD) 492 nm¹en egy tálcaleolvasóval (Titertek Multiskan MCC 1340) határoztuk meg. A tálcákat minden egyes inkubációs lépés között extenzíven mostuk PBST-vel. Minden ELISA vizsgálat 6 kontrollszérumot foglalt magába, melyeket 100, maláriának sosem kitett francia véradó közül választottunk ki véletlenszerûen. Az IgG 1 4 alosztályok meghatározásához egérbõl származó monoklonális antihumán alosztály-specifikus ellenanyagokat alkalmaztunk (NL16=IgG1 (Boehringer ), HP6002=IgG2 (Sigma ), Zg4=IgG3, és RJ4=IgG4 (Immunotech )]. Ezeket rendre 1:2 000, 1:10 000, 1:10 000, és 1:1 000 arányban hígítottuk 1,25% (w/v) zsírmentes tejet tartalmazó PBST-ben, és 1 óra hosszat szobahõmérsékleten tartottuk. 1,25% (w/v) zsírmentes tejet tartalmazó PBST-ben 1:3000¹re hígított peroxidázjelzett, kecskében termelt antiegér immunoglobulint (Caltag Laboratories ) adtunk és 1 óra hosszat inkubáltuk. A kötõdött jelzett ellenanyagot a fent leírtak szerint mutattuk ki. Az egyes izotípusspecifikus monoklonális ellenanyagok (MAb) hígítását elõzõleg határoztuk meg, mint amelyek megkülönböztetik az emberi lg alosztályokat, azaz nem adnak keresztreakciót más alosztályokkal (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). A teljes IgG és alosztályonkénti ellenanyagszinteket az ellenanyagválasz arányaként fejezzük ki, ami a vizsgálati OD átlagának és az egyidejûleg futtatott 6 kontrollszérum átlag+3 szórás értékének hányadosa. Ezen arány 1 esetén a mintát pozitívnak minõsítettük. 7.A.5. Statisztikai elemzés A Mann Whitney U¹teszt és a Spearman rang-sorrend korrelációs koefficiens került alkalmazásra a p¹értékek számítására. Az 1998-ban észlelt maláriás roham kockázata és az arányként kifejezett ellenanyagszintek összefüggésének kimutatására a JMP szoftvert alkalmaztuk, Poisson regressziós modell alkalmazásával, ahol a bemeneti faktorok, mint életkor, nem, a faluban eltöltött idõ és a transzmisszió voltak kontrollálva, vagy logisztikus regressziós elemzés alkalmazásával (a maláriás roham elõfordulásával és anélkül) Eredmények 7.B.1. P. falciparum-fertõzések a vizsgált népességben A vizsgált népesség mind a 116 alanya OoDo faluból származott, mely Myanmarban, Délkelet-Ázsiában van, ahol a malária hiperendemikus (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). A P. falciparum-parazitémia elõfordulása 1998-ban 40% körül ingadozott januártól júliusig, és 20% köré esett vissza augusztustól decemberig. A klinikai malária gyakorisága, melyet a vizsgált populációban havi átlagos rohamszámként számítottunk és százalékban fejezünk ki, az év folyamán jelentõsen változott, csúcsértékét júniusban mutatva. A fertõzõ átvitelek aránya nem került meghatározásra OoDo-ban, mindazonáltal Tun-Lin, W és munkatársai (Tun-Lin, Thu és munkatársai 1995) 13,7 fertõzõ csípést hatá- 16

17 1 HU T2 2 roztak meg fejenként és évenként egy másik faluban, mely OoDo falutól 15 km¹re fekszik keletre. Ez az adat jól egyezik a Beier, Killeen és munkatársai által ben leírt módszer szerint becsült, fejenként és évenként 11 fertõzõ csípéssel. A fertõzõdések többsége (98%) P. falciparum-nak volt betudható (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). A folyamatos klinikai felügyelet 12 hónapos idõtartama alatt a 116 falusiból 86 (74%) szenvedett el legalább egy maláriás rohamot az Anyagok és módszerek fejezet kritériumai szerint, és ezen egyének maláriára fogékonynak számítanak. Ugyanezen 12 hónapos idõszak alatt a falusiak közül 30 (26%) nem szenvedett el klinikai maláriás epizódot, ezen egyéneket klinikailag védettnek minõsítettük B.2. A P. falciparum-eredetû MSP3, GLURP és MSP1 antigének ellenanyagok általi felismerése Az 1998 szeptemberében gyûjtött 116 szérumból az MSP3b peptid (MSP3b) és a GLURP (R0), GLURP (R1), GLURP (R2), és MSP1 19 kda C¹terminális régiót reprezentáló négy rekombináns fehérje elleni IgG és IgG alosztályszintek meghatározása történt meg. Az R2 volt az IgG ellenanyagok által leggyakrabban felismert antigén (67,2%), ezt követték az R1, MSP3b és MSP1 (mind 62%), és az R0 (58,6%). A legmagasabb OD¹értékeket az R0 és R2 ellen kaptuk, míg az MSP3b alacsonyabb OD¹értékeket eredményezett. Mindhárom GLURP régió és az MSP1 elleni IgG-szintek szignifikánsan korrelláltak az életkorral (Spearman-féle rangsorrend korrelációs koefficiens, rendre r=0,51, 0,26, 0,41, és 0,43 az R0, R1, R2, és MSP1 esetében, p<0,05), míg az MSP elleni IgG-válasz az életkortól független volt (r=0,16, p=0,17). Ami az alosztályokat illeti, az MSP1 elleni IgG1 és IgG4, az MSP3 elleni IgG2, az R0 elleni IgG1 és IgG3, az R1 elleni IgG2 és IgG3, valamint az R2 elleni IgG4 mutatott szignifikáns életkorfüggést (3. táblázat). A pozitív ellenanyagválasznak sem a szintje, sem a gyakorisága nem mutatott összefüggést a nemmel egyik vizsgált antigén esetében sem. 3. táblázat Az életkor és az egyes alosztályokba tartozó ellenanyagok szintje közötti összefüggés a vizsgált antigének esetében. A p és r¹értékeket a Spearmanféle rangkorrelációs együttható alapján számítottuk. Antigének IgG alosztályok p r MSP1 IgG1 0,0002 0,344 IgG4 0,0009 0,309 MSP3 IgG2 0,0090 0,242 GLURP antigének R0 IgG1 0,0220 0,213 IgG3 0,0040 0,268 R1 IgG2 0,0040 0,268 IgG3 0,0008 0,313 R2 IgG4 0,0140 0,231 7.B.3. Ellenanyagválaszok és klinikai védettség A három antigénre vonatkozóan meglepõ különbségek voltak észlelhetõk az IgG alosztály-válaszokat illetõen (4. táblázat). Például az MSP1 C¹terminális 19 kda fragmense elleni válasz csaknem kizárólag IgG1 alosztályú ellenanyagokból áll, a mediánérték 8,6-szor magasabb a védett, mint a fogékony csoportban. Ugyanakkor az MSB3b epitóp elleni válaszban az IgG3 ellenanyagok dominálnak, 6,5-szeres mediánértékkel a védett egyénekben a fogékony egyénekhez képest. Bár kevésbé kifejezett, de hasonló különbségek voltak megfigyelhetõk a GLURP különbözõ régióival szembeni citofil IgG alosztályok esetében, ahol IgG1 ellenanyagok domináltak a nem ismétlõdõ R0 régióval szembeni, és IgG3 ellenanyagok fordultak elõ nagyobb mértékben az R2 ismétlõdõ régió elleni válaszokban. 4. táblázat A különbözõ IgG alosztályokhoz tartozó, MSP1, MSP3 és GLURP antigének elleni ellenanyagszintek mediánjai (és interkvartilis tartományai) a P. falciparum maláriás rohamok ellen védettnek, illetve fogékonynak minõsített OoDobeliekben 1 évi aktív, folyamatos követés alatt. Tekintettel az elvégzett statisztikai próbák számára, a Bonferroni-féle korrekciós faktor került alkalmazásra a szignifikanciaszintek meghatározásához, és csak a p<0,0025 értékeket tekintettük szignifikánsnak (*). A p-értékeket a nem parametrikus Mann Whitney U¹teszt alapján számítottuk. A hányados a két csoport mediánjának aránya. A # jellel jelölt értékek kismértékben különböznek. Antigén IgG alosztály Védett csoport (n=30) Fogékony csoport (n=86) p-érték Hányados MSP1 IgG1 9,5 (0,8 25,03) 1,1 (0,5 8,22) 0,003 # 8,6 IgG2 0,9 (0,8 1,26) 0,9 (0,8 1,09) >0,05 IgG3 0,9 (0,1 2,63) 0,4 (0,0 0,81) >0,05 IgG4 1,2 (0,8 3,01) 1,0 (0,7 1,47) 0,01 MSP3 IgG1 1,4 (0,8 2,4) 0,7 (0,4 7,0) <0,001* 2,0 IgG2 1,1 (0,9 1,57) 0,8 (0,7 1,0) >0,05 IgG3 6,5 (2,5 14,03) 1,0 (0,6 1,49) <0,001* 6,5 IgG4 1,3 (1,0 1,82) 1,0 (0,9 1,35) <0,001* 1,3 17

18 1 HU T táblázat (folytatás) Antigén IgG alosztály Védett csoport (n=30) Fogékony csoport (n=86) p-érték Hányados R0 IgG1 3,9 (2,4 7,62) 1,8 (1,0 3,15) <0,001* 2,2 IgG2 0,9 (0,4 2,5) 0,8 (0,4 1,33) >0,05 IgG3 1,3 (0,6 3,76) 0,9 (0,3 1,44) 0,019 IgG4 0,2 (0,2 2,05) 0,6 (0,2 1,07) >0,05 R1 IgG1 0,3 (0,1 0,9) 0,2 (0,1 0,4) >0,05 IgG2 0,9 (0,4 1,64) 0,6 (0,4 0,91) >0,05 IgG3 1,2 (0,4 2,64) 0,5 (0,2 0,91) 0,039 IgG4 0,2 (0,2 0,52) 0,7 (0,2 0,94) 0,021 R2 IgG1 2,0 (0,9 5,4) 1,1 (0,3 3,11) 0,01 IgG2 2,0 (1,0 4,02) 0,9 (0,2 1,73) <0,001* 2,2 IgG3 6,4 (1,7 12,01) 0,9 (0,3 2,83) <0,001* 7,1 IgG4 1,0 (0,6 1,2) 0,6 (0,4 0,85) 0,003 Tekintettel a GLURP és MSP1 elleni ellenanyagtiterek növekedésére az életkor függvényében, újravizsgáltuk a falusiak klinikai státusa és a különféle ellenanyagok közötti összefüggéseket egy logisztikus-regressziós modellben, az életkort és az összes (logaritmizált) ellenanyagválaszt magyarázó változónak véve. Ezen paraméterek ezen modell szerinti vizsgálatakor, különösen, ha az életkor kontrollált volt, az összes ellenanyagválasz közül a malária elleni védettség legerõsebb prediktorai az MSP3b és a GLURP¹R0 elleni megnövekedett IgG3-szintek (F arány=67,5; p<0,0001 és F arány=23,1; p<0,0001). Más ellenanyagok nem mutattak szignifikáns összefüggést a védettséggel. Ezzel szemben az elemzés azt mutatta, hogy az R0 és R1 elleni IgG4 szintek (F arány=4,4; p=0,038 és F arány=3,9; p=0,051) növekedtek a maláriás rohamok számával, azaz bizonyos mértékig prediktívek voltak a maláriával szembeni fogékonyságra nézve B.4. Az IgG3-válaszok antigénspecificitása a védett falusiakban A 14A. ábra mutatja a különbözõ vérben élõ stádiumok elleni IgG3 ellenanyagválaszok mintázatát OoDoban. A legtöbb antigénspecifikus ellenanyagválaszra vonatkozóan az értéktartomány széles, ami arra utalhat, hogy a responderek ¹en belül több csoport létezhet. A klinikai malária ellen védett falusiak közül nem mindenkinek a széruma mutatott magas IgG3-értékeket egyidejûleg az MSP3b és a GLURP¹R0 ellen. Egyes egyének nem várt módon alacsony IgG3-reaktivitást mutattak ezen két antigén egyikére. Megkísérelve megérteni, milyen módon védettek ezen falusiak a maláriás rohamok ellen, két alcsoportot azonosítottunk, melyek jellemzõi: a) alacsony IgG3-válaszok az MSP3 ellen (a 30¹ból 7 esetben) vagy b) alacsony IgG3-válaszok az R0 ellen (a 30¹ból 15 esetben). A többi három antigén elleni IgG3 ellenanyagszinteket szintén mértük (14B. ábra). Az MSP3b ellen alacsony IgG3-választ (IgG3- arány=1,26±0,22) mutató 7 védett egyénben (átlagéletkort 1 standard hiba=33,9±7,0 év) erõs IgG3-válaszokat találtunk az R0 (IgG3-arány=9,09±3,41) és R2 (IgG3- arány=8,36±5,86) ellen. A többi 15 egyénbõl álló második alcsoportnál (24,7±4,3 életév), akik a GLURP¹R0 elleni alacsony IgG3-válasz (IgG3 arány=0,55±0,08) ellenére védettek voltak, a fordított helyzetet találtuk (14C. ábra): magas IgG3-ellenanyagválaszt észleltünk az MSP3b ellen (IgG3-arány=10,45±2,07) és kisebbeket a GLURP¹R2 ellen (IgG3-arány=4,43±0,80). Azoknál, akik csak egy antigénre adtak választ, a titerek jellemzõen magasabbak voltak, mint a mindkét antigénre reagálók között (4. táblázat). Az OoDo faluban eltöltött évek száma nem különbözött szignifikánsan az MSP3 ellen alacsony választ mutatók (20,43±4,70 év helybenlakási idõtartam) és az R0 ellen alacsony választ mutatók (18,7±10,6 év helybenlakási idõtartam) csoportjai között. Az 1998-ban védettnek minõsített 30 egyén közül 13¹tól korábban már vettünk vérmintát 1993-ban, és így össze tudtuk hasonlítani az anti-msp3 és anti¹ro IgG1 és IgG3 ellenanyagok relatív szintjeit 5 év különbséggel. Amint azt a 14D. és 14E. ábrák mutatják, nagyobb változások nem voltak detektálhatók a két antigén elleni specifikus IgG1-szintekben. Ezzel szemben mind az MSP3, mind a GLURP elleni IgG3 ellenanyagszintek emelkedtek 1993 és 1998 között. Az 1998-ban emelkedett MSP3-elleni IgG3-szinteket mutató 7 egyén alcsoportja esetében (14D. ábra) a különbség 1,67- szeres emelkedésnek felelt meg (p=0,11). Az ban emelkedett R0 elleni IgG3-szinteket mutató 6 egyén alcsoportja esetében (14E. ábra) a különbség markánsabb, 3,93-szoros emelkedés (p=0,05). Az 1998-ban emelkedett MSP3 elleni IgG3-szinteket mutató 6 egyén 5 évvel korábban is már magas titerrel rendelkezett, ami arra utal, hogy egy fenntartott anti- MSP3 IgG3-válasz miatt már 1993-ban is védettek voltak, amikor életkoruk 18,2±9,8 életév volt. Ezzel szemben a GLURP¹re vonatkozóan a 7 egyén, akik erõs anti¹r0 IgG3-választ mutattak 1998-ban, lényegesen alacsonyabb anti¹ro IgG3-válaszokat mutatott 5 évvel 18

19 1 HU T2 2 korábban (p=0,0157), amikor életkoruk 23,7±6,9 életév volt. Tehát drasztikus változás volt az 1998-ban R0 elleni IgG3 révén védett 7 egyénben, és védettségük 5 évvel korábban feltehetõen MSP3 elleni IgG3-nak volt köszönhetõ C. Megbeszélés A jelen tanulmány az elsõ, mely összefüggést mutat ki Délkelet-Ázsiában egyes antigénspecifikus ellenanyagválaszok és a klinikai malária elleni védettség között. A GLURP és MSP3 elleni pozitív ellenanyagválaszok elõfordulása magas volt OoDo-ban, 58,6%-tól (R0) 67,2%¹ig (R2). Ezen megfigyelés összhangban van azzal az eredménnyel, mely szerint a GLURP¹n és MSP3¹n belüli B¹sejt-epitópok nagymértékben konzerváltak a P. falciparum laboratóriumi vonalai és az afrikai, valamint ázsiai terepizolátumok között (Huber, Felger és munkatársai 1997), (McColI és Anders 1997; de Stricker, Vuust és munkatársai 2000). Az MSP1- W¹19 elleni ellenanyagok elõfordulása szintén magas volt, a Gambia és Sierra Leone területén (Egan, Morris és munkatársai 1996), valamint Ghanában (Dodoo, Theander és munkatársai 1999) találtaknál csaknem kétszer magasabb, ami arra utal, hogy a Wellcome törzszsel rokon törzs lehet gyakori OoDo-ban. A legmagasabb ELISA-titereket a rekombináns GLURP RO¹ és R2¹régiók és az MSP1 ellen találtuk. A GLURP¹R0, ¹R1, ¹R2 és MSP1 ELISA-titerek különbségei nagy valószínûséggel a szérumellenanyagok reaktivitásának különbségeit tükrözik. Ezzel szemben az MSP3-ELISA ennél alacsonyabb értékeket adott, bár ezen eltérés legalábbis részben az egyetlen vagy korlátozott számú epitópot tartalmazó rövid peptid alkalmazásának is betudható, szemben a GLURP és MSP1 esetében alkalmazott rekombináns fehérjékkel, melyek számos epitópot definiálnak (Theisen, Soe és munkatársai 2000). Az összes GLURP-régió és az MSP1 elleni IgGszintek összefüggést mutattak az életkorral (p<0,05), míg ezzel ellentétben az MSP3 elleni IgG-válasz nem az életkorral nem függött össze. Ami az IgG alosztályokat illeti, közülük számosnak az esetében találtunk összefüggést az életkorral; ezen változások tükrözhetik a maláriaparazitáknak kitettség idõtartamát vagy az immunrendszer fokozatos érését az idõ múlásával. Statisztikailag szignifikáns növekedést mutattak az R0 és MSP3 elleni IgG3 válaszok az OoDo-ban élõ védett egyének között a nem védettekhez viszonyítva. Ezen eredmények összhangban vannak Dodoo és munkatársai (Dodoo, Theisen és munkatársai 2000) adataival, akik azt találták, hogy az R0 és R2 elleni citofil ellenanyagválaszok a védettség erõs prediktorai a ghanai gyermekek körében, nemkülönben Oeuvray és munkatársai adataival, akik következetes korrelációt találtak a védettség és a GLURP¹R0 és R2 elleni emelkedett IgG3-szint között Dielmóban, Nyugat-Afrikában (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). Hasonlóképpen az MSP3-specifikus IgG3 válaszokat korábban a klinikai malária elleni védettséggel összefüggésben lévõnek találták Dielmóban. Együttesen ezen eredmények arra utalnak, hogy ugyanazon kritikus epitópok elleni, ugyanazon alosztályú IgG-válaszok vesznek részt a P. falciparum-malária elleni védettség fokozatos kifejlõdésében a maláriaendemikus területeken élõ afrikai és ázsiai népességekben. Ráadásul a jelen kutatás szignifikáns negatív korrelációt talált az R0 és R1 elleni nem citofil ellenanyagok szintjei és a klinikai védettség között. Tehát egyfelõl pozitív összefüggés van a citofil IgG alosztályú válaszok és a védettség között, másfelõl negatív összefüggés van az ugyanazon epitópspecificitású nem citofil IgG alosztályú válaszok és a védettség között. Ezen epidemiológiai eredmény összhangban van azon in vitro megfigyeléssel, hogy nem citofil ellenanyagok képesek gátolni a merozoiták és az emberi monociták közötti, ugyanazon antigénnel szemben képzõdött citofil ellenanyagok által közvetített hídképzõdést, ily módon csökkentve azok parazitasokszorozódást gátló, ADCI mechanizmusú hatását (Bouharoun-Tayoun és Druilhe 1992). Míg az OoDo-beli védett lakosok többsége magas IgG3-válasszal rendelkezett mind az MSP3, mind a GLURP ellen, számos egyén tûnt szintén védettnek, akinek alacsony vagy majdnem semmilyen válasza nem volt ezen két antigén egyikére. A feltalálók az találták, hogy az összes, alacsony GLURP-RO-specifikus IgG3- választ mutató egyén szignifikánsan emelkedett anti- MSP3 IgG3 ellenanyagszinttel rendelkezett, és fordítva. Ezen megfigyelés arra utal, hogy a GLURP és MSP3 elleni ellenanyagok egymást kiegészítõ módon hathatnak az immunizálódott egyénekben a parazita szaporodásának gátlásában. Ez lényeges ezen ellenanyagok ADCI mechanizmusbeli szerepének megítélésében. Csak számos antigén egyidejû vizsgálata fedte fel ezt a kiegészítõ hatást. Ezen eredmény arra ösztönöz, hogy egyidejûleg számos antigén vizsgálatára kerüljön sor a kiegészítõ és lehetséges ellentétes hatások felderítése céljából, mely hatások következményekkel bírhatnak a kombinált vakcinák tervezése nézõpontjából. Következtetésképpen a jelen kutatás megmutatja, hogy (1) az MSP3 és GLURP antigénekben a kritikus epitópok azok, melyek a leginkább konzerváltak, védõhatású ellenanyagok célpontjai a világ földrajzilag távoli, endemikus területein. (2) Az MSP3 és GLURP¹R0 elleni IgG3 ellenanyagok a klinikai malária elleni védettség legerõsebb prediktorai egy afrikai és egy ázsiai helyzetben. (3) Ázsiában és Afrikában is a védett állapot eléréséhez kritikus antigének (nevezetesen az MSP3b és GLURP, melyek ADCI-ben aktív ellenanyagokat indukálnak) elleni citofil ellenanyagok termelése szükséges. (4) Ezen két antigén között, úgy tûnik, kiegészítõ hatás áll fenn. Az IgG3-válaszok hasonló hatással lehetnek a maláriás rohamok kivédésében, feltéve, hogy tartósan fennállnak az egyik antigénnel szemben, ha a válaszok a másikkal szemben alacsony szintûek vagy csaknem hiányoznak. (5) Az egy adott antigénen jelen lévõ különbözõ B¹sejt-epitópok elleni válaszok egymástól függetlenül fejlõdõnek tûnnek, és a felismerés szintje idõben változhat. Az ADCI mai napig azonosított két fõ célpontja elleni válaszok egymást kiegészítõ volta az elsõ ízben 19

20 1 HU T2 2 szolgáltat racionális alapot ezen két antigén kombinálására egy hibrid vakcinakészítményben. Emellett preklinikai állatkísérletekben a hibrid vakcinával végzett immunogenitási kísérletek további támogatást nyújtanak ezen antigénkombináció számára, mivel javított immunogenicitást mutatnak mindkét molekula elleni jól kiegyensúlyozott, egyenletes válaszokkal. Hivatkozások Badell, E., C. Oeuvray, et al. (2000). Human malaria in immunocompromised mice: an in vivo model to study defense mechanisms against Plasmodium falciparum. J Exp Med 192(11): Beier, J. C., G. F. Killeen, et al. (1999). Short report: entomologic inoculation rates and Plasmodium falciparum malaria prevalence in Africa. Am J Trop Med Hyg 61(1): BenMohamed, L., Y. Belkaid, et al. (2002). Systemic immune responses induced by mucosal administration of lipopeptides without adjuvant. Eur J Immunol 32(8): Bottius, E., L. BenMohamed, et al. (1996). A novel Plasmodium falciparum sporozoite and liver stage antigen (SALSA) defines major B, T helper, and CTL epitopes. J Immunol 156(8): Bouharoun-Tayoun, H. and P. Druilhe (1992). Antibodies in falciparum malaria: what matters most, quantity or quality? Mem Inst Oswaldo Cruz 87 Suppl 3: Bouharoun-Tayoun, H., C. Oeuvray, et al. (1995). Mechanisms underlying the monocyte-mediated antibody-dependent killing of Plasmodium falciparum asexual blood stages: J Exp Med 182(2): Brahimi, K., J. L. Perignon, et al. (1993). Fast immunopurification of small amounts of specific antibodies on peptides bound to ELISA plates. J Immunol Methods 162(1): Dame, J. B., J. L. Williams, et al. (1984). Structure of the gene encoding the immunodominant surface antigen on the sporozoite of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science 225(4662): Daubersies, P., A. W. Thomas, et al. (2000). Protection against Plasmodium falciparum malaria in chimpanzees by immunization with the conserved preerythrocytic Iiver-stage antigen 3. Nat Med 6(11): de Stricker, K,, J. Vuust, et al. (2000). Conservation and heterogeneity of the glutamate-rich protein (GLURP) among field isolates and laboratory lines of Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol 111(1): Dodoo, D., T. G. Theander, et al. (1999). Levels of antibody to conserved parts of Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 in Ghanaian children are not associated with protection from clinical malaria. Infect Immun 67(5): Dodoo, D., M. Theisen, et al. (2000). Naturally acquired antibodies to the glutamate-rich protein are associated with protection against Plasmodium falciparum malaria. J Infect Dis 181(3): Egan, A. F., J. Morris, et al. (1996). Clinical immunity to Plasmodium falciparum malaria is associated with serum antibodies to the 19¹kDa C¹terminal fragment of the merozoite surface antigen, PfMSP¹1. J Infect Dis 173(3): Escalante, A. A., H. M. Grebert, et al. (2001). Polymorphism in the gene encoding the apical membrane antigen¹1 (AMA¹1) of Plasmodium falciparum. X. Asembo Bay Cohort Project. Mol Biochem Parasitol 113(2): Fidock, D. A., E. Bottius, et al. (1994). Cloning and characterization of a novel Plasmodium falciparum sporozoite surface antigen, STARP. Mol Biochem Parasitol 64(2): Gras-Masse, H., B. Georges, et al. (1999). Convergent peptide libraries, or mixotopes, to elicit or to identify specific immune responses. Curr Opin Immunol 11(2): Guerih-Marchand, C., P. Druilhe, et al. (1987). A liver-stage-specific antigen of Plasmodium falciparum characterized by gene cloning. Nature 329(6135): Huber, W., I. Felger, et al. (1997). Limited sequence polymorphism in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3. Mol Biochem Parasitol 87(2): Khusmith, S. and P. Druilhe (1983). Cooperation between antibodies and monocytes that inhibit in vitro proliferation of Plasmodium falciparum. Infect Immun 41(1): Knapp, B., E. Hundt, et al. (1989). Molecular cloning, genomic structure and localization in a blood stage antigen of Plasmodium falciparum characterized by a serine stretch. Mol Biochem Parasitol 32(1): Lunel, F. and P. Druilhe (1989). Effectorcells involved in nonspecific and antibody-dependent mechanisms directed against Plasmodium falciparum blood stages in vitro. Infect Immun 57(7): Marshall, V. M., W. Tieqiao, et al. (1998). Close linkage of three merozoite surface protein genes on chromosome 2 of Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol 94(1): McColl, D. J. and R. F. Anders (1997). Conservation of structural motifs and antigenic diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein¹3 (MSP¹3). Mol Biochem Parasitol 90(1): Miller, L. H., T. Roberts, et al. (1993). Analysis of sequence diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein¹1 (MSP¹1). Mol Biochem Parasitol 59(1): Oeuvray, C., H. Bouharoun-Tayoun, et al. (1994). Merozoite surface protein¹3: a malaria protein inducing antibodies that promote Plasmodium falciparum killing by cooperation with blood monocytes. Blood 84(5): Oeuvray, C., M. Theisen, et al. (2000). Cytophilic immunoglobulin responses to Plasmodium falciparum glutamate-rich protein are correlated with protection against clinical malaria in Dielmo, Senegal. Infect Immun 68(5):