Ph.D. értekezés A FOTODINAMIKUS HATÁST MEGELŐZŐ FOLYAMATOK. Készítette: dr. Bárdosné dr. Nagy Irén. Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

Átírás

1 Ph.D. értekezés A FOTODINAMIKUS HATÁST MEGELŐZŐ FOLYAMATOK PORFIRINEK KÖTŐDÉSE ÉS MEGOSZLÁSA TREHALÓZ MENTES ÉS TREHALÓZT TARTALMAZÓ LIPOSZÓMA HUMÁN SZÉRUM ALBUMIN MODELLRENDSZEREKBEN Készítette: dr. Bárdosné dr. Nagy Irén Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti orvostudományok Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai c. program Programvezető: Dr. Rontó Györgyi Budapest, 2001

2 Összefoglalás A dolgozatban ismertetett munka célja a fotodinamikus terápia és diagnosztika molekuláris hátterének vizsgálata volt. Mindkét orvosi eljárás megköveteli valamilyen fényre érzékeny molekula jelenlétét a vizsgált szövetekben. A kiváltott fotodinamikus hatást nagymértékben befolyásolja a fényérzékeny vegyület transzportja, illetve sejteken belüli feldúsulása és eloszlása is. A fényérzékenyítő kémiai karaktere, a sejtmembrán fizikai-kémiai tulajdonságai és a festék valamint a környezetében lévő sejtalkotók között kialakuló esetleges kölcsönhatások mind módosíthatják a feldúsulás mértékét és folyamatát. Munkám során ezeknek a folyamatoknak a részleteit vizsgáltam egy porfirineket, liposzómákat és humán szérum albumint tartalmazó modellrendszer segítségével. Fényérzékeny vegyületként mezoporfirint és Mg-mezoporfirint használtam. A sejtmembrán modelljéül semleges (DMPC) és negatív töltésű (DMPC/DMPG) kisméretű unilamelláris liposzómák szolgáltak. A humán szérum albumint a vér ismert, porfirineket is szállító komponensét az esetleges környezeti változások festék lokalizációjára gyakorolt hatásának vizsgálatára alkalmaztam. A liposzómát stabilizáló szereknek a porfirinek feldúsulási folyamatában játszott szerepét a trehalóz segítségével vizsgáltam. A porfirinek kötődési állandóját a humán szérum albuminhoz valamint a semleges és negatív felületi töltésű liposzómához fluoreszcencia mérések alapján határoztam meg, trehalóz mentes és trehalózt tartalmazó oldatokban egyaránt. A porfirinek szérum albuminhoz kötődését a fluoreszcencia élettartam mérések és a meghatározott rezonáns energia átadás értékei is alátámasztották. Az eredmények azt mutatták, hogy a mezoporfirin a trehalóz jelenlététől függetlenül a szérum albuminhoz és a liposzómához is erőteljesebben kötődik, mint a Mg-mezoporfirin. Ez a különbség a két porfirin származék eltérő geometriájával magyarázható. A trehalóz jelenléte csökkentette a mezoporfirin kötődését a DMPC liposzómához. Ezt a jelenséget a liposzóma-trehalóz kölcsönhatásban kialakuló H-híd kötések eredményezhetik. Az összes többi rendszerben a trehalóz jelenléte kismértékben növelte a kötődési állandókat mutatva, hogy a trehalóz H-hídas kötődése a I

3 fehérje, ill. a liposzóma felületén nincs számottevő hatással a porfirinek kötődési folyamatára, ha a folyamatot elektrosztatikus erők (negatív töltésű felület, Mg 2+ ionok jelenléte) szabályozzák. A porfirin származékok fluoreszcencia intenzitásának és fluoreszcencia anizotrópiájának hőmérséklet függéséből arra következtettem, hogy a két porfirin lokalizációja a liposzómában nem azonos: a mezoporfirin a liposzóma mélyebb, hidrofób részébe ágyazódik, a vezikula felületi töltésétől és a trehalóz jelenlététől függetlenül, míg a fémiont tartalmazó porfirin a liposzóma felületéhez közel, a fejcsoportok közelében helyezkedik el. A magnézium-mezoporfirin liposzómán belüli helyzetére a vezikulák töltése és a trehalóz jelenléte is hatással volt. Munkám során a humán szérum albumin és a liposzómák közötti kölcsönhatást is tanulmányoztam. A szérum albuminban lévő triptofán fluoreszcencia élettartam lecsengésének mérése valamint a különböző rendszerek dinamikus fényszórás mérése alapján igazoltam, hogy a szérum albumin a liposzómák felületéhez kötődik. A kötődés mértéke a negatív felületi töltésű liposzómánál erőteljesebb, ami az elektrosztatikus erőknek a folyamatban betöltött fontos szerepére utal. A trehalóz jelenléte a szérum albumin kötődését a DMPC liposzómához erősítette, míg a DMPC/DMPG liposzómához gátolta. A stabilizáló szernek a két rendszerben mutatott ellentétes hatása a trehalóz liposzóma komplexek kialakulásával magyarázható: a semleges felületű liposzómához kapcsolódó trehalóz a H-híd kötések kialakulásának esélyét növelve elősegíti a fehérje kötődését, míg negatív felületű töltésű liposzómánál a H-hidakkal a felülethez rögzített trehalóz a felületi töltést árnyékolva éppen akadályozza azt. A porfirineknek a liposzómák és a fehérje közötti megoszlásának tanulmányozása azt mutatta, hogy a porfirin transzportja a vezikulából a fehérjébe a legtöbb rendszerben a vizes fázison keresztül lejátszódó folyamat, melyben a kötődési állandók különbsége a hajtóerő. Számottevő eltérést az általános viselkedéstől a mezoporfirin DMPC/DMPG liposzómából való kiáramlása mutatott: a porfirin effluxot a szérum albumin jelenléte egy kritikus koncentráció felett erősen gátolta. Vizsgálataim szerint a fehérje ezen hatását a negatív felületi töltésű liposzóma körül kialakított viszonylag stabil fehérjeköpeny okozza. A trehalóz jelenléte, csökkentve a fehérje liposzóma kölcsönhatás erősségét lehetővé tette a porfirin szabad kiáramlását és a transzportnak a vizes fázison keresztül történő lefolyását. II

4 Angol nyelvű összefoglalás (Summary) The aim of this study was to investigate the molecular background of the Photodynamic Therapy and Diagnosis. Both medical treatments require the presence of sensitizer molecules in the target tissues. Delivery, accumulation and distribution of the photosensitizer in the cells and tissues are the substantial steps of the photodynamic effect. Chemical character of the sensitizer, physico-chemical properties of the cell membranes and potential interactions between the dye and the molecules in the surroundings might modify the accumulation of the sensitizer. Details of these processes were examined using a model system composed of different porphyrins, liposomes and human serum albumin (HSA). Freebase- and Mg-mesoporphyrin (MP and MgMP) were used as sensitizer molecules. Small unilamellar vesicles of DMPC (neutral surface charge) and DMPC/DMPG (negatively charged) were the models for differently charged cell membranes. HSA, a well-known porphyrin carrier in the blood, was used to examine the potential environmental effect on the localization of the sensitizer. To study the effect of liposome stabilizers on the accumulation process we examined the distribution of porphyrins also in the presence of trehalose. Based on fluorescence intensity measurements, we determined the binding constants of MP and MgMP to HSA, and to both liposomes (neutral and negatively charged) in the absence and in the presence of trehalose. Binding of MP and MgMP to the HSA was verified also by fluorescence lifetime and resonance energy transfer measurements. We found that independently from the presence of trehalose, the MP binds stronger to the HSA and also to the liposomes than the MgMP. We explained this difference with the dissimilar geometry of the two porphyrin derivatives. The presence of trehalose decreased the binding constant of MP to the DMPC liposomes, which we interpret as an effect of the H-bonded trehalose on the liposome surface. In all the other systems the presence of the sugar enhanced the binding constants a little bit suggesting that the H-binding of trehalose to the protein and to the liposomes has not too characteristic effect if electrostatic forces (negatively charged surface, presence of Mg 2+ ion in the porphyrin ring) regulate the binding process. III

5 The temperature dependence of fluorescence intensity- and anisotropy of MP and MgMP suggested the distinct localization of the two porphyrin derivatives within the liposomes: The MP was embedded by the hydrophobic deeper part of the liposomes independently of the surface charge of the vesicles and of the presence of trehalose whereas the MgMP was located next to the head-groups of lipids, close to the surface of liposomes. Position of the MgMP within the vesicles was affected by the surface charge of the liposomes and also by the presence of trehalose in the system. The interaction between the HSA and the liposomes was also studied. Fluorescence lifetime measurements of HSA tryptophan and dynamic light scattering measurements of the various systems supported the view that the HSA binds to the surface of the liposomes. The binding is stronger in the case of the negatively charged liposomes suggesting the importance of the electrostatic forces in the process. The presence of the trehalose augmented the coordination of HSA to the DMPC liposomes and hindered for the DMPC/DMPG liposomes. We explained this differing effect of the sugar to the formation of trehalose liposome complexes. The H-bonding of trehalose to the neutral surface guides the coordination of HSA to the liposome, whilst in the case of the negatively charged liposome the bound trahalose covering the surface charges decreases the binding of HSA. The distribution of porphyrins among the liposomes and HSA was also studied. The transfer of porphyrins from liposomes to HSA in most of the systems took place trough the aqueous phase directed by the differences of the association constants. The efflux of the MP from DMPC/DMPG liposome, however, was strongly inhibited above a critical concentration range of HSA. This effect was interpreted as the result of the formation of an HSA-coating on the liposome surface. The presence of trehalose, by modifying the HSA liposome interaction, resulted in the transfer of MP to the HSA. IV

6 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 5 2. Célkitűzések 6 3. Irodalmi áttekintés A fotodinamikus terápia alapjai A fotodinamikus terápiában alkalmazott fényérzékeny anyagok A fényérzékeny anyagok beépülése a szövetekbe A fotodinamikus hatás A modellrendszert alkotó elemek A porfirinek általános jellemzése A porfirinek stabilitása A porfirinek abszorpciós és emissziós spektruma A liposzómák tulajdonságai és kölcsönhatásai A liposzómák általános jellemzése Liposzómák kölcsönhatása porfirinekkel és fehérjékkel Membránok kölcsönhatása porfirinekkel Membránok kölcsönhatása fehérjékkel Liposzómák alkalmazása A humán szérum albumin A humán szérum albumin szerkezete A humán szérum albumin, mint szállító fehérje A humán szérum albumin kölcsönhatása porfirinekkel A fehérjék spektroszkópiai tulajdonságai Alkalmazott anyagok és módszerek A felhasznált anyagok eredete, kezelése, a kísérleti munka körülményei Liposzómák készítése Porfirin oldatok készítése, fotostabilitásuk ellenőrzése Humán szérum albumin tisztítása, az oldatok koncentrációjának meghatározása 36 2

7 4.2. Alkalmazott eszközök Kiértékelési módszerek Fluoreszcenciás mérések Porfirinek kölcsönhatása HSA-val, az egyensúlyi állandók meghatározása Porfirinek kölcsönhatása liposzómákkal Porfirin származékok megoszlása a liposzómák és a HSA között Fluoreszcencia élettartam meghatározása Az energiaátadás hatásfoka Fluoreszcencia anizotrópia mérések Dinamikus fényszórás Kísérleti eredmények Az alkalmazott porfirin származékok kölcsönhatása humán szérum albuminnal Emissziós spektrumok Porfirin HSA kötődési állandók meghatározása Fluoreszcencia élettartam, energiaátadás a HSA gerjesztett Trp-ja és a porfirinek között Mezoporfirin és Mg-mezoporfirin kölcsönhatása semleges és negatív felületi töltésű liposzómákkal Fluoreszcencia spektrumok A porfirin liposzóma kölcsönhatás egyensúlyi állandójának meghatározása Liposzómához kötött porfirinek fluoreszcencia intenzitásának függése a hőmérséklettől Porfirinek fluoreszcencia anizotrópiája a különböző liposzóma rendszerekben Humán szérum albumin kölcsönhatása DMPC és DMPC/DMPG liposzómákkal Liposzómák hatása a humán szérum albumin triptofánjának fluoreszcencia lecsengésére Humán szérum albumin hatása a liposzómák méreteloszlására 59 3

8 5.4. Porfirinek megoszlása a liposzóma és a humán szérum albumin között Az eredmények értékelése Porfirinek kölcsönhatása a humán szérum albuminnal A porfirinek kötődése a modellrendszert alkotó liposzómákhoz Porfirin liposzóma kölcsönhatás trehalóz jelenléte nélkül A porfirin liposzóma kölcsönhatás változása trehalóz jelenlétében Humán szérum albumin liposzóma kölcsönhatás Humán szérum albumin liposzóma kölcsönhatás trehalóz jelenléte nélkül Humán szérum albumin liposzóma kölcsönhatás trehalóz jelenlétében A porfirinek megoszlása a liposzóma és a humán szérum albumin között Az eredmények összefoglalása Alkalmazott rövidítések Irodalomjegyzék Saját közlemények Köszönetnyilvánítás A témakörben megjelent cikkek különlenyomatai 97 4

9 1. Bevezetés A négy pírrol-gyűrűből felépülő, nagy számú delokalizált elektront tartalmazó porfin szubsztituált származékai, a porfirinek létfontosságú vegyületek. A baktériumoktól a növényi és állati szervezeteken keresztül az emberig a porfirinek széles választéka található meg az élő szervezetekben. Fémmentes (free base), és különböző, főként átmeneti fémionokat tartalmazó fémes formájuk is létezik. Az élő szervezetek a porfirin vázat önmaguk szintetizálják aminolevulinsavból kiindulva. A keletkezett termékek biológiai-, biokémiai hatásukat (elektrontranszport, oxidációs-, redukciós folyamatok, részvétel az anyagcserében) különböző fehérjékhez kapcsolódva fejtik ki (CiP 450 fehérjék, citokromok, mioglobin, hemoglobin stb.). A kutatók mellett a praktizáló orvosok érdeklődését is felkeltette az a tapasztalat, hogy bizonyos porfirin származékok (pl. hematoporfirin, Photofrin) a daganatos sejtekben szelektíven halmozódnak fel és fotokémiai úton sejtpusztulást eredményezhetnek. Az 1970-es évektől kezdődően egyre többen tanulmányozták a porfirin vegyületeket és származékaikat, a rákos daganatok kezelésének új módja, a porfirin fotokémiára épülő ún. fotodinamikus terápia módszereinek kidolgozása céljából [1-6]. A fotodinamikus terápia, vagy ahogyan az angol elnevezés Photodynamic Therapy rövidítésével a szakirodalomban nevezik, a PDT nem a XX. század végének találmánya, bár fejlődése, és elterjedése a klinikai gyakorlatban erre az időre esik. Bizonyos növények (főként az ernyős virágzatúak családjába tartozók) kivonatának erős napsugárzás hatására kialakuló gyógyító hatását néhány bőrbetegség kezelésében már az ősi indiai társadalomban is ismerték és alkalmazták. Az első tudományos feljegyzés, amely festékanyagok (akridin, eozin) és fény együttes alkalmazásakor megnövekedett sejtpusztulásról számol be, 1900-ból származik Hermann von Tapiener laboratóriumából [7]. Rákos bőrszövetek kezelésére is ő használta először ezt az eljárást eozin tartalmú festékkel, 1903-ban [8]. A jelenség szisztematikus vizsgálatával azonban csak később, a 40-es években kezdtek foglalkozni, az első porfirin származékokat (főként hematoporfirint) felhasználó állatkísérletek is ebben az időben indultak [9]. A fotodinamikus terápia új korszakának kezdete, és a modern terápiás eljárásokba történő bevezetése a 70-es - 80-as évekre tehető. A hematoporfirin mellett újabb, hatékonyabb, stabilabb és kevesebb mellékhatással rendelkező szenzibilizáló 5

10 vegyületeket fedeztek fel (Photofrin, tetrafenil-porfin, benzo-porfirin, ftalocianin, klorin származékok stb.), és kezdtek a klinikai gyakorlatban is használni [10-14]. A legújabb irány a -aminolevulinsav (ALA), a protoporfirin biológiai szintézis alapvegyületének alkalmazása, melynek segítségével a fényérzékeny vegyület, a protoporfirin az eljáráshoz szükséges mennyiségben közvetlenül a célsejten belül alakítható ki. A fényérzékenyítésre használt vegyületek rendszerbe juttatásának, a megfelelő sejtekbe épülésének, a fényforrás spektrumának és a megvilágítás intenzitásának optimalizálásán túl a folyamat mechanizmusának felderítése is jelentős szerepet kapott [15-18]. Kiderült, hogy a citotoxikus hatást a festék anyaga (fényérzékenyítő vagy fotoszenzibilizáló) közvetve váltja ki: megfelelő megvilágítás hatására a fénnyel kölcsönhatásba lépve többnyire gyökös mechanizmusú folyamatokat indít el, és a keletkező szabadgyökök idézik elő a sejtpusztulást. A lejátszódó folyamatok pontosabb és részletesebb megismerésével kialakultak azok a terápiai eljárások, amelyekben a fotodinamikus hatás alkalmazása hatékonynak bizonyult, és felismerték azt is, hogy a porfirinek szelektív feldúsulása és/vagy fotofizikai tulajdonságai diagnosztikai eljárásokban is felhasználhatók [1,4,12,19-21]. 2. Célkitűzések A porfirin származékok orvosi alkalmazásainak egyik kritikus kérdése az alkalmazott fényérzékenyítő vegyület felhalmozódása a daganatos sejtekben. A szervezetbe juttatott festék molekuláinak legalább a célsejt membránjába be kell jutnia ahhoz, hogy megvilágítás után roncsoló hatását szelektíven fejthesse ki. A különböző szenzibilizáló szerek sejtmembránnal való kölcsönhatásának vizsgálata éppen ezért a fotodinamikus terápia kutatási irányain belül fontos területet foglal el. A sejtmembrán állapota, a festék kémiai tulajdonságai, a fiziológiástól esetlegesen eltérő környezeti paraméterek mind hatással vannak a felhalmozódási folyamatra. Bonyolítja a helyzetet, ha a szenzibilizáló szer a vérárammal jut el a daganatos sejtekhez. Ilyenkor a vér komponenseivel (alakos elemek membránja, szérum fehérjék, stb.) való kölcsönhatás is módosító tényező. Az utóbbi időben egyre elterjedtebben alkalmazzák a fényérzékenyítő anyagok szervezetbe juttatását liposzómába zárt formában is, hogy az esetleges mellékreakciók hatásait csökkentsék. Ilyen esetekben természetesen nemcsak a felhalmozódás mértéke, hanem a mechanizmusa is megváltozik. Nemkívánatos 6

11 folyamatokat eredményezhet, ha a festéket tartalmazó liposzómát liofilizált formában tárolják a felhasználásig. A liofilizálás során bekövetkező vízvesztés negatív hatását a liposzóma szerkezetére ugyanis stabilizáló szerek (többnyire oligo- és diszacharidok) hozzáadásával ellensúlyozzák, így a készítmény felhasználásakor egy újabb vegyület esetleges hatásaival is számolni kell. Munkám során a porfirinek terápiai és diagnosztikai alkalmazásának molekuláris szintű alapjelenségeit vizsgáltam. A vizsgálatokat egy modellrendszer segítségével végeztem. A sejtmembránt különböző összetételű, kis méretű unilamelláris liposzómákkal modelleztem. Fényérzékenyítő vegyületként fémmentes és Mg 2+ ionokat tartalmazó mezoporfirint használtam, a vérszérum komponensei közül pedig a nagy koncentrációban jelenlevő általános szállító fehérjét, a szérum albumint választottam. Mérési módszerként fluoreszcencia spektroszkópiát és dinamikus fényszórás mérést alkalmaztam. Vizsgálataim alapján a következő kérdésekre kerestem választ: i.) van-e szerepe, és ha igen milyen, a membrán összetételének a festék felhalmozódásában, illetve transzportjában ii.) fémion-tartalmú- vagy fémmentes porfirin kedvezőbb-e a membránnal, illetve a fehérjével való kölcsönhatás, valamint a membrán és a fehérje közötti megoszlás szempontjából iii.) a liposzómák, illetve a fehérjék szerkezetének stabilizálására alkalmazott vegyületek mint például a trehalóz jelenléte módosítja-e a porfirineknek a membránhoz, illetve a fehérjéhez történő kapcsolódását, megváltoztatja-e a porfirin transzportját a membrán és a fehérje között. 7

12 3. Irodalmi áttekintés 3.1. A fotodinamikus terápia alapjai A fotodinamikus terápia (PDT) lényege a sejtépítő biológiai struktúrák fotooxidáció útján bekövetkező roncsolása, amit megfelelő fényérzékeny festék molekula (szenzibilizáló) megvilágításával idéznek elő a kiválasztott célsejtekben [2,3,19]. Ez természetesen megköveteli a fényérzékeny anyag jelenlétét a kezelendő sejtekben. Bár az élő sejtekben és szövetekben számos olyan vegyület található, amely fényre érzékeny, a PDT kezelés során a szenzibilizáló molekulát mesterségesen, a terápia első lépéseként juttatják a megfelelő szövetekbe. Ezt követi a szövetekben felhalmozódott festéknek a foto-oxidáció jó hatásfokához szükséges intenzitású fénnyel történő megvilágítása, melynek következtében a fényérzékeny anyag gerjesztett triplett állapotba kerül. A gerjesztett állapotnak megfelelő energiatöbbletet a sejtben (szövetben) jelenlévő molekuláris oxigénnek, illetve egyéb vegyületeknek átadva a sejtek/szövetek pusztulását előidéző oxidáló hatású termékek keletkeznek [2,3,12,19, 22,23] A fotodinamikus terápiában alkalmazott fényérzékeny anyagok A daganatos sejtek szelektív roncsolásának sikere a PDT alkalmazásánál elsősorban a fényérzékeny anyag fizikai-kémiai tulajdonságaitól és a daganatos sejtben való felhalmozódásától függ. Nem véletlen tehát, hogy a PDT témakörével foglalkozó irodalom jelentős része a különböző szerkezetű fényérzékeny vegyületek fotodinamikus terápiában való felhasználási lehetőségét vizsgálja. Az első, véletlenszerű kísérleti tapasztalatok után az 1960-as évektől szisztematikus vizsgálatok kezdődtek a festék szerkezete és a fotodinamikus hatás közötti összefüggések feltárására, a legjobb hatásfokkal működő és legkevesebb mellékhatással rendelkező fényérzékenyítő vegyületek megtalálására. Az eredmények újabb és újabb festék típusok pre-klinikai és klinikai alkalmazását szorgalmazzák. Ebben a fejezetben a gyakrabban alkalmazott fényérzékenyítők jellemző tulajdonságait, előnyeit és esetleges hátrányait szeretném bemutatni a teljesség igénye nélkül. Előbb azonban vegyük sorra, milyen tulajdonságokkal kell egy jó fényérzékenyítő anyagnak rendelkeznie. A fotodinamikus hatást a festék molekulák a célsejtben fejtik ki, ezért elsődleges szempont a festékanyag lehetőleg szelektív feldúsulása a tumor 8

13 sejtekben. A nagyobb koncentráció jobb roncsolási hatásfokot jelent. A szelektív felhalmozódás azért fontos, hogy a daganat környezetében lévő egészséges szövetek károsodását elkerüljük. A hatásosság szempontjából a beépüléshez szükséges idő, a folyamat mechanizmusa (diffúzió, endocitózis), és a festék sejten/szöveten belüli eloszlása is lényeges lehet [3,24]. A festék stabilitása és a szervezetből való kiürülése szintén központi kérdés a nemkívánatos mellékhatások csökkentése miatt. Ugyancsak fontos tényező a besugárzó fény hasznosítása, mivel a sejtpusztulást előidéző reaktív komponensek kialakulása a fény segítségével történik. A sejtekben/szövetekben feldúsult fényérzékeny anyag megvilágításakor figyelembe kell venni a szövetek fényáteresztő képességét is. Általánosan igaz, hogy a szövetek abszorpciója a rövidebb hullámhosszúságú fényre nagyobb, a rövid hullámhosszúságú fény a szövet felületi rétegében teljesen elnyelődik, a mélyebb rétegekben található festéket már nem éri el, ennek megfelelően roncsoló hatás sem alakulhat ki [1,12]. A vörös, illetve közeli infravörös fény a kisebb abszorpció miatt mélyebbre hatolhat a szövetekben, így a fotodinamikus hatás a felszíntől távolabbi rétegekben is létrejöhet. Ennek feltétele, hogy a fényérzékenyítő vegyület abszorbeáljon a spektrum vörös hullámhosszúságú részén. Jobb a fényérzékenyítés hatásfoka, ha a vegyület kvantumhatásfoka a spektrumnak ebben a tartományában nagy. A fényérzékeny vegyület alap- és triplett állapotú gerjesztett formája közötti energia különbség sem elhanyagolható tényező. A roncsolást előidéző komponensek kialakulásához a festék triplett állapotú gerjesztett formája szolgáltatja az energiát. A fényérzékenyítő alap- és gerjesztett állapota közötti energia különbségnek meg kell haladnia a reaktív termékek létrehozásához szükséges energiát (~ 1 ev) [12]. Az eredményes energiaátadáshoz az is szükséges, hogy a triplett állapot lehetőleg nagy kvantumhatásfokkal alakuljon ki, és élettartama hosszú ( s) legyen [8]. A klinikai gyakorlatban alkalmazott festékeket szokás generációkba sorolni. Az első generációba tartoznak a PDT kezdeti szakaszában alkalmazott porfirin származékok (3/1, 3/2. ábrák), a hematoporfirin (HP), illetve a HP-acetát lúgos hidrolízissel kapott származékai (HPD). Ezek a származékok valójában nem tiszta egykomponensű rendszerek, kémiai összetételük az előállítás körülményeitől, a tárolás módjától és idejétől is függ. Az alapvegyületet különböző aggregációs formában tartalmazzák, többnyire éter- és észter kötéssel létesítve kapcsolatot közöttük [12]. A fotodinamikus hatás szempontjából a dimer származékok bizonyultak a 9

14 leghatékonyabbnak, ezek koncentrációja a daganatos sejtekben nagyobb volt, mint a többi komponensé [2,12,20,25]. Ugyanakkor a MP és a PP esetében a monomerek hatása volt kedvezőbb, az aggregált forma kevésbé épült be a sejtekbe [1]. A HPD valamint a MP és a PP származékok tulajdonságainak vizsgálata eredményezte a PDTban alkalmazott első regisztrált készítmény a Photofrin II. (di-hematoporfirin éter) megjelenését. Ezt a származékot egyre elterjedtebben alkalmazzák hólyag-, tüdő-, és nyelőcső rák roncsolására, de alkalmas a gyomorban és a méhnyakban kifejlődött daganatok kezelésére is [26]. A PDT-ban alkalmazott fémmentes porfirin származékok abszorpciós spektruma 630 nm körül rendelkezik egy nem túlságosan intenzív lokális maximummal [27]. Ezt a hullámhosszat a szövetek csak viszonylag kisebb mértékben gyengítik, ennek megfelelően a felülettől távolabbi rétegekben (1-3 mm, a szövet típusától függően) is kialakulhat a festékek gerjesztett állapota. Mivel a porfirin származékok elnyelésének mértéke ebben a hullámhossz tartományban nem nagyon jelentős, a gerjesztés hatásfoka gyenge. A fényérzékenyítő vegyületek második generációja a vegyületek összetételét tekintve korántsem olyan egységes, mint az első. Hogy mégis egy csoportba sorolják őket annak oka az, hogy az újabb festékek kiválasztásánál alapvető szempont a porfirineknél távolabbi vörös elnyelés, a nagyobb abszorpció és a hatékonyabb és szelektívebb felhalmozódás volt. Ezeknek a festékeknek a többsége nm hullámhossz-tartományban nyel el, és moláris extinkciós állandójuk is nagyobb a vörös tartományban, mint a porfirin származékoké. Ezek alkalmazásával lehetőség van a szövetek hosszabb hullámhosszúságú, a mélyebb rétegekbe jobban behatoló fénnyel való megvilágítására, így a fotodinamikus hatás vastagabb szövetrétegben jöhet létre. (A nm hullámhosszúságú fény behatolási mélysége a szövetekbe 4-7 mm is lehet [19]). A nagyobb elnyelés a roncsolás hatásfokának növekedését eredményezi. A szelektívebb felhalmozódással a PDT kezelés nemkívánatos mellékhatásait (pl. a bőrszövet fokozott fényérzékenysége, a daganatos szövet környezetében található egészséges szövetek károsodása) lehet csökkenteni. A második generációs festékek egyik osztályát képezik a ftalocianin származékok [11,12,19,22,28-30] (3/1. ábra). Ezek a vegyületek monomer formában alkalmazhatók, az aggregátumok rövid idő alatt a fotodinamikus hatás szempontjából inaktív formává alakulnak át. Előnyük a porfirin származékokkal szemben, hogy 680 nm környezetében 10

15 abszorbeálnak, és moláris extinkciós állandójuk ebben a tartományban egy nagyságrenddel nagyobb. A triplett állapot élettartama is hosszabb, különösen NH N NH N NH N N NH N NH N NH a b c OR N H N OR NH N O R N N H N N H d OR e N NH N N N N NH N f 3/1. ábra: A fotodinamikus terápiában gyakrabban alkalmazott fényérzékenyítő vegyületek vázszerkezete: a./ porfirin, b./ klorin, c./ bakterioklorin, d./ benzoporfirin, e./ tetra-m(hidroxi)fenil-porfirin, f./ ftalocianin 11

16 az alumínium- és a cink-származékok esetén. Szulfonált származékaik vízben oldhatók, így a festék sejtbe/szövetbe juttatása egyszerűbb [2,11,22,31]. A következő osztályt a benzoporfirin származékai alkotják [2,26] (3/1. ábra). Ezeknek a vegyületeknek 690 nm körül van abszorpciójuk, és a ftalocianin származékokhoz hasonló fotodinamikus hatást mutatnak. Előnyük, hogy gyorsan épülnek be, és rövid idő alatt ürülnek ki a szervezetből. A klinikai gyakorlatban alkalmazott Verteporfin fényérzékenyítő készítmény benzoporfirin alapú vegyület. A tetra-m(hidroxi)fenil-porfirin (3/1. ábra) víz oldható származékai ugyancsak hatékonyabbnak bizonyultak a HP származékoknál. Ez elsősorban a jobb feldúsulási aránynak, a mitokondriummal való kölcsönhatásnak és a nagyobb kvantumhatásfoknak köszönhető, mivel a vegyületcsoport abszorpciója a vörös tartományban nem sokkal tolódik el (650 nm) a porfirin származékokhoz viszonyítva [24,32,33]. A részlegesen telített porfirin gyűrűt tartalmazó klorin (3/1. ábra) származékot a tetra-m(hidroxi-fenil)- klorint Foscan néven forgalmazzák és alkalmazzák, főleg légúti- és nyelőcső rák kezelésére [24,26]. A hasonló összetételű bakterio-klorin származék (3/1. ábra) még előnyösebb tulajdonságokkal rendelkezik a fotodinamikus hatást illetően, mivel abszorpciós maximuma 740 nm-nél van [34]. Az eddig említett tetra-m(hidroxi-fenil) származékok mellett a klorin számos más típusú vegyülete is jó hatásfokkal használható fényérzékenyítésre, a viszonylag jelentős hosszú 720 nm-es hullámhosszon való elnyelés miatt [26,35,36]. A purpurinok is klorin vázzal rendelkező hidrofób karakterű vegyületek. A kísérleti tapasztalatok alapján főként az oktaetil- és az etio-purpurin ón és cink tartalmú származéka okoz fény hatására számottevő sejtpusztulást [2,29]. Leghatékonyabb közöttük az ón-etil-etiopurpurin, ami a klinikai gyakorlatban használt Purlytin anyaga [26]. A második generációs fényérzékenyítők között az egyik legjelentősebb a aminolevulinsav (ALA) (Levulan ), a sejtekben lejátszódó protoporfirin szintézis alapvegyülete [2,16-18,21]. A vegyületet közvetlenül a sejtbe juttatva stimulálja a protoporfirin bioszintézisét, így a szenzibilizálásra alkalmas porfirin származék helyben termelődik. Megvilágítás után a fotodinamikus hatást a keletkezett protoporfirin fejti ki, ennek megfelelően a kvantumhatásfok és a kezelt térfogat (mélység) az első generációs festékekhez képest nem javul. A lokális sejtbe/szövetbe juttatás azonban a káros mellékhatásokat (környező egészséges szövetek roncsolása, fényérzékenység kialakulása a bőrben) gyakorlatilag nullára redukálhatja. 12

17 A harmadik generáció festékei a klinikai próbákig még nem jutottak el, de a laboratóriumi és az állatkísérletek folytatódnak a még hatékonyabb, még szelektívebb és kevesebb mellékhatással rendelkező újabb fényérzékenyítő anyagok alkalmassá tételére, a klinikai használatra A fényérzékeny anyagok beépülése a szövetekbe A szenzibilizáló festékek beépülésének módja és mértéke a festék és a sejtek típusától egyaránt függ. Az eredmények azt mutatták, hogy sejt szinten a legtöbb festék esetében nincs szelektivitás, a szenzibilizáló szerek az egészséges és a daganatos sejtekbe egyformán beépülnek. A szelektív felhalmozódás csak szöveti szinten tapasztalható [2,3,19]. Ezt a daganatos szövetek eltérő struktúrájával, nagyobb kollagén és makrofág tartalmával, a lipoprotein receptorok nagyobb sűrűségével, a kapilláris erek falának megváltozott szerkezetével és az alacsonyabb ph-val hozzák összefüggésbe [2,3,12,19,22]. A beépülési folyamat részletei még nem teljesen ismertek. Vannak eredmények, amelyek különböző közvetítők, többnyire szérum fehérjék (lipoproteinek, albumin) szerepét támasztják alá [37]. Ezek az adatok összhangban vannak a tumoros szövetek nagyobb lipoprotein-receptor sűrűségével. A különböző porfirin származékok sejtmembránban mért diffúziós állandója ugyanakkor azt mutatja, hogy a festékek, különösen a porfirin vegyületek, elsődlegesen a sejtmembránon keresztül, diffúzió útján lépnek be a sejtbe [30]. A ftalocianin és a klorin származékoknál viszont az endocitózissal történő beépülést igazolták [3,19]. A felhalmozódás mértékére hatással van a festék töltése és a molekula hidrofób, illetve hidrofil karaktere. Az anion típusú festékek például könnyebben beépülnek a sejtekbe akkor, ha oldalláncaik hidrofób jellege növekszik [3]. A porfirin gyűrű szerkezete is befolyásolja a felhalmozódást. A fémionokat tartalmazó porfirinek esetében, ahol a gyűrű nem planáris, hanem négyzetes-piramisos szimmetriával rendelkezik, a festék felvételt hidrofil csoportok jelenléte segíti. A vizes fázisban rosszul, vagy egyáltalán nem oldódó fényérzékenyítők szövetekbeli felhalmozódását elősegíti, ha a festéket liposzómába zárva juttatják be a szervezetbe [2,3,13,38-40]. A beépült fényérzékenyítő molekula szöveten belüli eloszlása a fotodinamikus hatás szempontjából igen fontos, hiszen a megvilágítás hatására bekövetkező folyamato(ka)t (a membrán-szerkezet megváltoztatása, a mitokondrium működésének 13

18 gátlása, DNS-, illetve fehérje-roncsolás stb.) alapvetően a festék lokalizációja határozza meg. Szerteágazó vizsgálatok folynak ezen a területen is, de a festékek eloszlását meghatározó paraméterek szerepe még nem teljesen tisztázott. Általános tapasztalat, hogy a hidrofób karakterű festékek (pl. porfirin származékok) az intracelluláris térben, míg a hidrofil jellegűek (szulfonált ftalocianin származékok) az extracelluláris térben dúsulnak fel elsődlegesen. A porfirin alapú festékek többségét a mitokondriumban és a lizoszómában is kimutatták [2,41]. Az endocitózissal beépülő fényérzékenyítők (pl. klorin származékok) a lizoszómában fordulnak elő nagyobb mennyiségben [2,3,12,42] A fotodinamikus hatás A fotodinamikus hatást elindító alapfolyamat az ionizáló sugárzásokhoz hasonlóan nagyon rövid idő alatt játszódik le. A fényérzékenyítő vegyületet tartalmazó szövetet megfelelő hullámhosszúságú fénnyel megvilágítva, a festék gerjesztett (triplett) elektron-állapotú formája a rövid élettartamú (~10-10 s) szingulett formából azonnal kialakul. A gerjesztett elektron-állapot viszonylag hosszú élettartama alatt ( s) kétféle reakcióban vehet részt: - közvetlen kölcsönhatásba léphet a környezetében lévő molekulákkal (víz molekulák vagy egyéb szubsztrátok) és elektron (vagy H atom) átadással szabad gyököket hozhat létre, amelyek oxigénnel reagálva oxidáló hatású vegyületeket alakíthatnak ki. Ez az úgynevezett I. típusú gyökképző, vagy redox reakció. A roncsoló hatást sok esetben az oxigén oxidáló hatású formái, a hidrogénperoxid vagy a szuperoxid fejtik ki. - a szövetben jelenlévő alap állapotú (triplett elektron-állapot) molekuláris oxigénnel lép kölcsönhatásba, energiáját közvetlen energia transzfer útján adja át és szingulett oxigént ( 1 O 2 ), egy nagyon reakció képes, oxidáló hatású ágenst hoz létre. Ez a II. típusú reakció út. Az 1 O 2 élettartama a környezettől függően változik. Vízben s, lipid környezetben (50-100) 10-6 s, sejt környezetben pedig 0, s. A szingulett oxigén gyors reakcióba léphet a biológiai rendszert felépítő molekulák elektron-gazdag részeivel. Tipikus reakció lehet a fehérjék cisteinil-, histidil-, metionil-, triptofil- és tirozil-csoportjának, a DNS guanin részletének, a telítetlen lipideknek és foszfolipideknek, vagy a koleszterinnek az oxidálása [12,14,43]. 14

19 A két reakcióút egymás mellett, párhuzamosan is kialakulhat. A két folyamat részaránya nagymértékben függ az alkalmazott festék minőségétől, a megfelelő szubsztrát és a molekuláris oxigén koncentrációjától [12,19]. Mint az a fentiekből kiderül, a fotodinamikus hatás létrejöttéhez a molekuláris O 2 jelenléte is szükséges. Photofrin esetében például 100 %-os hatás eléréséhez 5 % oxigén szükséges, 1 % oxigén mellett csupán 50 %-os hatás figyelhető meg. Molekuláris oxigén hiányában a legtöbb festék esetében teljesen elmarad a fotodinamikus hatás. Ez alól kivételt csak a kation-típusú ftalocianinok csoportja képez, ezek oxigén jelenléte nélkül is képesek szabad gyökök létrehozására és a szövetek roncsolására [12] A modellrendszert alkotó elemek Az előző, a fotodinamikus terápia alapvető folyamatait áttekintő fejezetből kitűnik, hogy az alkalmazott fényérzékenyítők és a célsejt/szövet különböző részei között lejátszódó folyamatok részletei, és a részfolyamatokat meghatározó tényezők még sok esetben nem ismertek. Modellrendszerünk segítségével a részfolyamatokat befolyásoló paraméterek közül többet vizsgáltunk. A vizsgálatokhoz használt modell három elemből áll: a fényérzékeny molekula, a membránt (sejt-, mitokondrium membrán), illetve a festéket szállító vezikulát modellező liposzóma, és a fényérzékenyítő szállításában és/vagy beépülésében esetlegesen résztvevő szérum fehérje. A porfirin alapú szenzibilizáló származékok közül a PP vizsgálata lett volna a legjobb. Ez a molekula azonban vinil oldallánca miatt nem stabil, könnyen oxidálódik, a laboratóriumi mintakészítés során is fény hatására viszonylag rövid idő alatt átalakul. A fotostabilitás a gyakran hosszabb ideig tartó lumineszcencia mérések során különösen fontos [44]. Ezzel magyarázható, hogy a vinil-csoport helyett etilcsoportot tartalmazó mezoporfirint IX (MP) választottuk, amely viselkedésében és tulajdonságaiban (eltekintve az instabilitástól) nagyon hasonló a PP-hez (3/2. ábra). A porfirin gyűrűhöz kapcsolódó fémion szerepének tanulmányozásához a MP Mg 2+ iont tartalmazó származékát használtuk, mivel a MgMP triplett elektron-állapotának élettartama hosszú (500 s), kvantumhatásfoka is nagy (0,6), és ezek a paraméterek a fotodinamikus hatás szempontjából fontosak [45]. A Mg 2+ ion választását az is indokolja, hogy az újabban javasolt szenzibilizáló szerek, a bakterioklorofill származékok hatásmechanizmusának megértéséhez is közelebb kerüljünk [46]. 15

20 Rendszerünkben a liposzóma többféle szerepet játszott. Egyrészt lehetővé tette a szenzibilizáló sejtbe juttatásának hatékonyságát növelő liposzóma szerepének tanulmányozását, másrészt modellezte a sejtmembránt és a mitokondrium-membránt. Az előbbi a festék felszívódásának kiürülésének, az utóbbi pedig a sejtben lejátszódó porfirin szintézisnek és a kívülről felvett porfirin származékok felhalmozódásának helye. A membrán felületi töltésének a festékek sejten belüli felhalmozódására gyakorolt hatását különböző töltésű liposzómák segítségével vizsgáltuk. A felületi töltéssel nem rendelkező, semleges liposzómákat 1,2-dimirisztoil-sn-glicero-3-foszfatidilkolinból (DMPC) készítettük, a negatív felületi töltést pedig 1,2-dimirisztoil-sn-glicero-3- foszfatidilglicerol (DMPG) hozzáadásával értük el. A DMPC/DMPG liposzómák készítésénél a 19/1 tömegarány a mitokondrium-membrán összetételének modellezését szolgálta [47]. (Ezt a lipid összetételű liposzómát a későbbiekben DMPC/DMPG liposzómának nevezzük.) A fényérzékenyítő vegyületeket nagyon sok esetben a vérkeringés segítségével juttatják el a célsejtekhez, ezért fehérje modellnek olyan fehérjét kerestünk, ami a vérszérumban megtalálható, és a festékek szállításában is részt vesz. A porfirin származékok egyik szállítója a vérben a humán szérum albumin (HSA), ezért vizsgálatainkhoz ezt a fehérjét választottuk A porfirinek általános jellemzése A porfin (3/2. ábra) négy metin-csoport által összekapcsolt pirrol-gyűrűből felépülő vegyület. A porfin 1-8, illetve,, szubsztituált származékait gyűjtő néven porfirineknek nevezzük. Megkülönböztetünk fémes, illetve fémmentes vagy más néven szabad bázisú (free base) porfirineket. Az egyik legjelentősebb természetes porfirin vegyület, a hem Fe 2+ iont tartalmaz. (A hem oxidált formája a hemin, melyben Fe 3+ található.) Itt jegyezzük meg, hogy a Fe iont tartalmazó hem csoport nem használható érzékenyítő molekulaként, mivel gerjesztett elektronállapotának élettartama igen rövid. A 3/2. ábrán a porfinváz, a hem vas nélküli vázának szerkezete a PP, illetve az ehhez igen hasonló deuteroporfirin (DP), hematoporfirin (HP) és MP molekula látható. 16

21 2 3 R CH 3 1 NH N 4 CH 3 NH N R 8 N NH 5 CH 3 N NH CH MP: R = -CH CH 2 3 PP: R = -CHCH 2 DP: R = -H HP: R = -CH(OH)CH 3 CH 2 CH 2 CH COOH 2 CH COOH 2 3/2. ábra: A protoporfirin (PP), a mezoporfirin (MP), a deuteroporfirin (DP) és a hematoporfirin (HP) szerkezete A porfirinek az élő szervezet minden fejlődési szintjén megtalálhatóak. Fehérjékhez kötötten működnek. A szabadon található porfirin koncentrációja normális körülmények között igen kicsi. (Pl. az érett vörösvértestekben a szabad hem koncentrációja M, ami a hemoglobinba épült hem koncentrációjának tizede [48].) A sejtek a porfirinvázat -aminolevulinsavból kiindulva szintetizálják, a táplálékkal bekerülő porfirineket a szervezet lebontja A porfirinek stabilitása A szerkezetből adódóan a porfirin vegyületek nagy része könnyen oxidálódó, instabil vegyület. Az oxidációs reakció sok esetben már fény hatására is bekövetkezik. További nehézségeket jelenthet a kísérleti munkánál, hogy a porfirin vegyületek különösen vizes közegben rosszul oldódnak. A hidrofil környezet elősegíti a porfirin gyűrűk egymással való kölcsönhatását, és több gyűrűt is tartalmazó, nagyobb méretű aggregátumok jöhetnek létre. A keletkezett dimerek, illetve oligomerek a monomer formától eltérő tulajdonságokkal rendelkeznek. Amint arra a 3.1. fejezetben is utaltunk, a sejtekben/szövetekben tapasztalt felhalmozódásuk sem azonos. A víz és levegő határfelületén porfirinekből képzett monomolekuláris rétegben a porfirin gyűrűk síkja egymással párhuzamosan, a víz felszínére merőlegesen helyezkedik el. A poláris karboxil-csoportok a vízbe merülnek, míg az apoláris vinil-, illetve etil-csoportok a levegőben vannak [49]. Ilyen jellegű porfirin szendvicseket 17

22 később vizes oldatban is kimutattak [44]. Az aggregációt az aromás gyűrűk között kialakuló hidrofób-, és kölcsönhatásokkal magyarázták [50]. A gyűrűhöz kapcsolódó, jól szolvatálódó, poláris oldalláncok csökkentik a porfirinek aggregációját, mivel sztérikus, illetve elekrosztatikus taszítást hoznak létre a monomerek között. A porfirinek fluoreszcenciájának mérése azt mutatta, hogy vizes közegben monomer formában csak ~10-7 M-nál kisebb koncentrációjú oldatokban fordulnak elő. Ennél töményebb oldatukban főként dimerek, a koncentráció növelésével pedig nagyobb méretű aggregátumok, akár micellák is képződhetnek [51] A porfirinek abszorpciós és emissziós spektruma A porfirinek abszorpciós spektrumát egy (2-4) 10 5 M -1 cm -1 moláris extinkciós együtthatójú, B- vagy Soret sávnak nevezett intenzív, és (1-2) 10 4 M -1 cm -1 moláris együtthatójú "kvázi-megengedett", kevésbé intenzív Q sávokra oszthatjuk [27]. Az első az S 0 -S 2, a Q sávok pedig az S 0 -S 1 szingulett-szingulett átmenetnek feleltethetők meg. Optikai spektrumuk alapján megkülönböztetünk szabályos és szabálytalan porfirineket [52]. A szabályos porfirinek abszorpciós és emissziós spektrumát alapvetően a porfirin gyűrű -elektronjainak eloszlása határozza meg, a gyűrű közepén lévő szubsztituens elektronjainak módosító hatása csak kismértékű. Ebbe a csoportba tartoznak a fémmentes porfirinek, valamint a lezárt elektronhéjú (pl. Zn 2+, Mg 2+ ), központi fémet tartalmazó porfirinek. Ha részlegesen betöltött pályákkal rendelkező fémion épül be a gyűrűbe, a fémion d-pályái és a gyűrű -elektronjai közötti kölcsönhatás megváltoztatja a porfirin abszorpciós és emissziós tulajdonságait. Ezek a vegyületek a szabályos porfirinekétől eltérő, "szabálytalan" spektrumot mutatnak. Mivel az általunk vizsgált modellben szabályos porfirin származékok szerepeltek, a továbbiakban csak a szabályos porfirinek spektroszkópiai tulajdonságaival foglalkozunk. A Q sávok száma a gyűrű szimmetriájának függvénye: a D 2h szimmetriájú fémmentes porfirinek spektrumában négy Q sáv figyelhető meg, míg a D 4h típusú szimmetriájú fémes porfirinek esetén kettő [52]. A sávok egymáshoz viszonyított intenzitása a porfirin gyűrűhöz kapcsolódó szubsztituensektől függ. A porfirinek spektrumának elméleti értelmezésére több modell is született. Gouterman a korábban meglévő, de csak részben megfelelő modellekre építve dolgozta ki a négy molekulapálya (four orbital) modellt, amely az átmenetek számában és 18

23 energiájában is jó egyezést mutat a kísérleti eredményekkel [27]. Eszerint a Q és B sávok a legmagasabb betöltött (highest occupied molecular orbital, HOMO) a 1u ( ) és a 2u ( ) molekulapályák és a legalacsonyabb energiájú betöltetlen (lowest unoccupied molecular orbitals, LUMO) e g ( *) molekulapályák közötti átmenetnek felelnek meg. A B(0,0) átmenet intenzív, mivel a közel megegyező irányú átmeneti dipólusmomentum vektorok összeadódnak, a Q(0,0) átmenetnél azonban az átmeneti dipólusmomentum vektorok kioltják egymást, következésképpen sokkal kisebb az intenzitás. D 4h szimmetria esetén mindkét átmenet degenerált. A fémmentes porfirinek szobahőmérsékleten mért abszorpciós spektrumában látható négy sáv a Q sávok felhasadásával értelmezhető. A szimmetria csökkenése miatt a Q(0,0) sávok felhasadnak, az átmeneti dipólusok iránya alapján az x és y-nal jelölt Q x (0,0) és Q y (0,0) sávok mellett az abszorpciós spektrumban a magasabb vibrációs szintekre történő átmenetek burkoló görbéi is jelentkeznek. Ezeket Q x (0,1) illetve Q y (0,1) módon jelölik. A 3/3. ábra a dimetil-formamidban (DMF) oldott MP, és az etil-alkoholban oldott MgMP abszorpciós és emissziós spektrumát mutatja. Optikai denzitás Relatív fluoreszcencia intenzitás Hullámhossz (nm) 3/3. ábra: A MP DMF-ban (folytonos vonal) és a MgMP etil-alkoholban mért (szaggatott vonal) abszorpciós és emissziós spektruma 19

24 Az emissziós fluoreszcencia spektrum a porfirin gyűrű szimmetriájától függetlenül két sávból áll. A rövidebb hullámhossznál jelentkező intenzívebb sáv főként az S 1 állapot 0 vibrációs szintjéről az alapállapot alapszintjére történő átmenetnek felel meg (S 0,0 ), a hosszabb hullámhosszaknál megfigyelhető sáv pedig ugyanezen állapotból az S 0 alapállapot magasabb vibrációs szintjeire történő emissziós átmenetek burkoló görbéje. Az emissziós spektrum két sávjának maximum helye a porfirin kémiai szerkezetétől, az oldószertől és a hőmérséklettől függ. A porfirin származékok tanulmányozására gyakran használják a fluoreszcencia lecsengésének vizsgálatát is. A fluoreszcencia élettartam (néhány tized ns-tól ~ 30 nsig) a porfiringyűrűhöz kapcsolódó oldalláncok típusától, a gyűrűben esetlegesen elhelyezkedő fémion minőségétől és töltésétől, a porfirin aggregációs állapotától és a környezet hidrofób karakterétől is függ [27,45,49]. Ennek megfelelően a porfirin származékok környezetében beálló változásokat a fluoreszcencia élettartam mérések alapján is követni lehet. A porfirin vegyületek oldatának fluoreszcencia lecsengése egykomponensű. A membránhoz kötött porfirin fluoreszcencia lecsengését vizsgálva kettő vagy több komponenst is megfigyeltek, ami a porfirin gyűrűnek a rendszeren belüli különböző környezeteire (hidrofób és hidrofil régió a membránon belül), illetve az eredeti származék részleges átalakulására utal A liposzómák tulajdonságai és kölcsönhatásai A liposzómák általános jellemzése A liposzómák amfipatikus molekulák vizes közegben történő diszpergálásakor kialakuló hólyagszerű képződmények, amelyek belsejében membrán által bezárt vizes oldat található (3/4. ábra). A liposzómák leggyakrabban foszfolipidekből készülnek, mivel ezek a molekulák a biológiai membránok fő alkotóelemei is. A foszfolipid molekulák vizes közegben kettősrétegbe rendeződnek, ilyen módon nem jöhet létre a hosszú zsírsavláncok és vízmolekulák közötti kedvezőtlen kölcsönhatás. A kettősrétegek bezáródása, a hólyagok kialakulása a láncok vízzel való érintkezését tovább csökkenti. A természetben a foszfatidil-kolinok (PC) a legelterjedtebb foszfolipidek. A PC fejcsoport össztöltése semleges. A foszfatidil-glicerol (PG) fejcsoporttal rendelkező foszfolipidek a magasabb rendű növényekben elsősorban a kloroplasztiszban fordulnak elő, emlősökben pedig a mitokondriumban találhatók [47]. A PG fejcsoport negatív 20

25 töltésű, ennek megfelelően a membrán ion, membrán fehérje közötti kölcsönhatásokban nagyobb valószínűséggel ezek a fejcsoportok működnek közre [53]. A liposzómák csoportosítása többféle szempontból is történhet. Szerkezetük alapján megkülönböztetünk egyetlen kettősrétegből álló úgynevezett unilamelláris vezikulákat, vagy több koncentrikusan egymásba ágyazott kettősrétegből felépülő multilamelláris liposzómákat. Méretük szerint is többnyire két csoportba sorolják őket: kis és nagyméretű szerkezetet különböztetnek meg. A kisméretű liposzómák minimális átmérőjét (kritikus érték) a vezikulát felépítő foszfolipid szerkezete határozza meg. A ~ 25 nm átmérőnél kisebb kettősrétegben a belső lipid réteg nagy görbülete már megakadályozza a stabil szerkezet kialakulását [54]. A felső határt tekintve a liposzóma átmérője elérheti a m-es nagyságrendet, a sejtek mérettartományába is eshet. A fejcsoportok által meghatározott felületi töltés alapján a liposzómákat szokás semleges, negatív és pozitív felületi töltésű csoportokba sorolni. 3/4. ábra: A liposzómák szerkezete (Khetrapal C.L., Kunwar A.C., Tracey A.S. Diehl P.: Nuclear magnetic resonance studies in lyotropic liquid crystals, Springer-Verlag p.5) 21

26 Az irodalomban használt elnevezésük a méretükre és a szerkezetükre is utal [55]. A multilamelláris vezikula (MLV) átmérője ~1000 nm, általában öt vagy annál több koncentrikus kettősrétegből áll. A nagy méretű unilamelláris vezikula (LUV) átmérője nm, míg a kis unilamelláris vezikula (SUV) átmérője az elméletileg lehetséges legkisebb, illetve ehhez közeli érték, nm. A liposzómák előállítása mechanikai úton (rázás, ultrahangos kezelés, szűrés), az oldhatóság megváltoztatásával (amfifil anyagok, oldószerek hozzáadása /eltávolítása) vagy elektrokémiai folyamatok felhasználásával (ionerősség, felületi feszültség, ph, változtatása) történhet. A mechanikai úton történő előállításkor a száraz lipid film hidratálásával kapott MLV-ból indulnak ki, amit fizikai diszpergálás követ. A liposzómák előállításának sokfélesége mutatja, hogy a liposzóma kialakulásában számos tényező játszik szerepet és nehezíti az előállítási folyamat reprodukálhatóságát. A lipid molekulák liposzómákká alakulásának termodinamikai alapja a molekulák aggregálódása során bekövetkező szabadentalpia csökkenés. Bár a rendezett lipid molekulák a rendszer entrópiáját csökkentik, ezt a hatást az energetikailag kedvező folyamatok (a hosszú szénhidrogén láncok vizesből apoláris fázisba lépése, a láncok között kialakuló vonzó kölcsönhatások) kompenzálják [56]. A poláris fejcsoportok hidratációja is csökkenti a szabadentalpiát, különösen a töltéssel rendelkező fejcsoportok esetén. Elsősorban a hidratáció következménye a kettősrétegek felszínei között kialakuló taszítás, ami nem kötött ionok jelenlétében általában csökken. A főként hosszabb távolságokon ható elektrosztatikus kölcsönhatáson túl különösen a töltéssel rendelkező lipideknél a lipid rétegek fluktuációjából adódó taszító erő is szerepet játszhat a liposzómák között fellépő taszításban. A termodinamikai instabilitást mutatja a liposzómáknak az idő múlásával bekövetkező aggregálódása, illetve fúziója. A stabilitásra több tényező is hatással van, az összetétel (a felületi töltéssel nem rendelkező liposzómák kevésbé stabilak), a méret, a tárolási hőmérséklet, a készítési mód, a ph, az ionerősség, stb. [57,58]. Kisméretű liposzómák kialakulásakor a kettősréteg nagy görbületéből adódó többlet-energiával is számolni kell. Mivel ez a többlet-energia a kisméretű liposzómák számával arányos, termodinamikailag kedvezőbb a nagyméretű liposzómák képződése [59]. A fizikai instabilitás a legtöbb esetben nem választható el élesen a foszfolipidek oxidációja és hidrolízise miatti kémiai átalakulástól. Az oxidáció a telítetlen 22

27 zsírsavláncot tartalmazó foszfolipidekre jellemző, a foszfolipid molekula észter kötéseinek hidrolízise pedig sav, illetve bázis jelenlétében várható. A liposzómák szerkezete a hőmérsékletváltozás hatására módosul. A hőmérsékletnövekedés a kettősrétegben található lipid láncok rendezett gél állapotát (L ) megváltoztatja, magasabb hőmérsékleten a fluid, más néven folyadék kristályos szerkezet (L alakul ki. Ez a termotróp átalakulás a foszfolipid molekulák zsírsavláncainak a hőmérséklet hatására bekövetkező konformáció változásával jár. Sokszor megfigyelhető egy köztes, ún. P fázis is, melyet a fejcsoportok P O kötés körüli rotációjának nagyobb frekvenciája idéz elő. A gél és a fluid fázis közötti átmenetet főfázisátalakulásnak, az L és P közötti átmenetet elő-fázisátalakulásnak nevezik. Az elő- és fő-fázisátalakulás hőmérséklete, a lejátszódó változás hőmérsékleti intervalluma, az elő-fázisátalakulás "eltűnése" függ a vezikula méretétől, a felépítő lipid(ek) szerkezetétől [60], a liposzóma hidratáltságától [61], a fejcsoport fejcsoport és lipid oldószer közötti kölcsönhatásoktól [62], és a lipidek között kialakuló intermolekuláris hidrogénhíd vagy ionos kötésektől is. Az oldószer összetétele (ph, ionerősség, a jelenlévő ionok típusa, mérete) ugyancsak hatással van a fázisátalakulásra Liposzómák kölcsönhatása porfirinekkel és fehérjékkel Membránok kölcsönhatása porfirinekkel A porfirinek természetes membránokkal való kölcsönhatását biokémiai és felhasználási szempontokat is figyelembe véve citoplazma-, mitokondrium- illetve lizoszóma- membránok esetében vizsgálták, a sejtek és a különböző sejtalkotók modelljeként pedig a foszfolipid micellák és a liposzómák bizonyultak a legjobbnak. A kölcsönhatások vizsgálatát megkönnyíti, hogy a kötődés során a porfirinek abszorpciós és fluoreszcencia tulajdonságai megváltoznak [63]. A membránokkal való kölcsönhatás során a porfirinek kötődését, a kötődés erősségét és a porfirin kettősrétegen belüli elhelyezkedését is vizsgálták. A porfirinek bejutását a sejtekbe kétféleképpen magyarázták. Az egyik lehetőség az LDL receptorok által közvetített porfirin felvétel, a másik a passzív transzport [64]. Kísérleti eredmények ez utóbbit erősítették meg. Az is bebizonyosodott, hogy a passzív transzport két részből áll. A porfirin egy gyors lépésben (néhány tized másodperc) a citoplazma membránjához kötődik, majd egy hosszabb ideig tartó folyamat során a mitokondrium, illetve a lizoszóma membránokban halmozódik fel [65]. Igazolták azt is, 23

28 hogy a mitokondrium a hem bioszintézisében szerepet játszó protoporfirin(ogén)ix típusú vegyületeket halmozza fel elsődlegesen [66]. A porfirin molekula kettősrétegen belüli elhelyezkedését, membránon keresztüli diffúzióját, a kötődés mértékét a porfirin gyűrűn lévő csoportok tulajdonságai határozzák meg [63]. Ezek pl. a hidrofób jelleg, az oldalláncok száma, minősége, töltése. Mivel a hidrofób porfirin gyűrű számára a membrán szénhidrogén láncai közötti elhelyezkedés a kedvező, ezért még a fiziológiás ph mellett negatív töltéssel rendelkező karboxil porfirinek is nagy mennyiségben halmozódhatnak fel a nagy negatív membránpoteciálú mitokondriumban, illetve az endoplazmás retikulumban [66]. Azok a porfirinek, amelyek több hidrofil oldalláncot is tartalmaznak, nem lépnek be a membrán hidrofób részébe, hanem a fejcsoportok közelében helyezkednek el, ugyanakkor a többségében hidrofób oldallánccal rendelkező porfirinek a membrán belsejében maradnak [65]. A karboxil-porfirinek membránokkal való kölcsönhatását a kémhatás változás módosíthatja, mivel a karboxil-csoportok protonáltsága, azaz a töltés nagysága a ph függvénye [67]. Alacsonyabb ph esetén a DP és a HP PC SUV-okhoz kötődésére nagyobb a kötődési állandó. A kémhatásnak a porfirin membrán kölcsönhatásban játszott szerepe a porfirinek tumoros sejtekben való lokalizációjában is fontos. A porfirinek megkötésében a membrán viszkozitása és oldószeráteresztőképessége (mindkettő függ az összetételtől és a hőmérséklettől) meghatározó szerepet játszik. HP-nal végzett kísérletek eredménye azt mutatta, hogy a hőmérséklet emelésével a porfirin a külső monorétegből a belsőbe vándorol [68]. A HP ilyen irányú mozgása arra mutat, hogy a külső réteg erősebben hidrofillé vált, amit a külső monoréteg oldószer-áteresztőképességének megnövekedése idézhet elő. Különböző modell-membránok mikroviszkozítását koleszterinnel növelve a porfirinek mozgása a belső és a külső lipid rétegek között lelassul, és a kötődés mértéke is csökken [69]. Ez a tapasztalat magyarázat lehet a csökkent mikroviszkozitással rendelkező daganatos sejtek megnövekedett porfirin felvételére is [66] Membránok kölcsönhatása fehérjékkel A membrán fehérje kölcsönhatás módját és mértékét a fázisátalakulási és permeabilitási paraméterek segítségével tanulmányozhatjuk [70]. A tapasztalatok szerint DPPC és DPPG liposzómák és a fehérjék között kialakuló elektrosztatikus és hidrofób 24

29 kapcsolatok együttesen határozzák meg a kölcsönhatás jellegét. A kísérleti adatok alapján a fehérjék 3 csoportját különböztették meg. Az első csoportba tartozó fehérjék esetében a fehérje jelenléte a fő-fázisátalakulás entalpiaváltozását növelte, a fázisátalakulási hőmérsékletet pedig nem változtatta, illetve néhány esetben kismértékben növelte. A membrán permeabilitására gyakorolt hatásuk minimális volt, a kölcsönhatásban az elektrosztatikus elemek domináltak: a fehérjék és a liposzómák töltéssel rendelkező fejcsoportjai között elektrosztatikus kölcsönhatás alakult ki, a membrán mélyebb rétegeibe, a hidrofób szénhidrogén láncok közé viszont nem hatoltak be. A második csoportba tartozó fehérjék a fázisátalakulási hőmérsékletet és az entalpiaváltozás mértékét is erősen csökkentették, a permeabilitást pedig növelték. A liposzómákkal való kölcsönhatás ezeknél a fehérjéknél is elsősorban az elektrosztatikai hatásoktól függött. A tapasztalat szerint a fehérje liposzóma kölcsönhatásban első lépésként a fehérjék a liposzóma felületéhez kötődnek, ezt a folyamatot követi a lipid molekulák szénhidrogén láncaival való kölcsönhatás, aminek eredményeként a kettősréteget deformálva behatolnak a zsírsav láncok közé. A harmadik csoportban a fehérjék jelenléte nem változtatta meg a fő fázisátalakulási hőmérsékletet, a fázisátalakulás entalpiáját viszont a fehérje koncentrációjával arányosan csökkentette. Ezek a fehérjék a kettősréteg belsejébe ágyazódnak be, lokális hidrofób kölcsönhatást alakítanak ki a membrán hidrofób részében a környezetükben lévő szénláncokkal, a kettősréteg többi részét azonban nem módosítják. Ezeket a fehérjéket szokás belső vagy intrinsic, míg az előző két csoport fehérjéit külső vagy extrinsic fehérjéknek nevezni [71]. Az általunk használt HSA kölcsönhatását liposzómákkal szintén vizsgálták. Kimutatták, hogy a HSA képes megváltoztatni a membrán különböző ionokra vonatkozó áteresztőképességét olyan ph- és lipid összetétel mellett, melynél az albumin felületi össztöltése ellentétes a liposzóma töltésével [72]. Ebből arra következtettek, hogy a kölcsönhatást a fehérje és a liposzóma felülete között kialakuló elektrosztatikus vonzás indítja, majd ezt követheti az albuminnak a lipidláncok közé való behatolása. Később Raman-spektroszkópiai mérések alapján kimutatták a HSA és a semleges felülettel rendelkező liposzómák kölcsönhatását is, amiből a hidrofób kölcsönhatás lehetőségére és az albumin molekulák lipidláncok közé ékelődésére következtettek [73]. 25

30 Liposzómák alkalmazása Ma már gyakorlatilag minden tudományterületen az alaptudományoktól a gyógyszerészeti- és orvostudományokig találkozunk a különböző típusú liposzómák felhasználásával. Matematikában a két- és háromdimenziós terek topológiai modelljeinél, fizikában a felületi formák tulajdonságainak leírásánál, a felületi formák fluktuációjának tanulmányozásánál, a különböző mechanikai szilárdságú anyagok modellezésénél is alkalmazzák a liposzómákat [74]. A biofizika területén a liposzómák a biológiai membránok modelljei, segítségükkel a membrán szerkezete, dinamikai tulajdonságai, a membránpermeabilitás vizsgálható [75]. A biológiai kutatásokban a liposzómák szerepe ugyancsak a biológiai membránok modellezése. Az aggregációs, fúziós, illetve biokristályosodási folyamatokban, kiralitás vizsgálatoknál is gyakran alkalmazzák a különböző méretű és töltésű vezikulákat [76]. Sokrétű a liposzómák felhasználása a kémia területén is. A kolloid rendszerek tulajdonságainak tanulmányozásánál előnyösek a viszonylag jól definiált fizikai paraméterekkel rendelkező liposzómák. Katalitikus reakcióknál, fényérzékeny, gerjesztett állapotú vegyületek stabilizálásánál, mesterséges fotoszintézis létrehozásánál, reakció partnerek, illetve reakcióterek szétválasztásánál is fontos szerepet kapnak a különböző liposzómák [77]. Biokémiai rendszerekben a liposzómák segíthetik a fehérjék tisztítását, szétválasztását, de a sérült membránfehérjék helyreállítását is [78]. Az élő sejtek, szövetek pusztulását sok esetben a sejtmembrán fizikai és/vagy kémiai hatásokra bekövetkező károsodása indítja el. A környezeti ártalomként is jelentkező fizikai/kémiai tényezők membránt károsító hatásának módját és mértékét ugyancsak a liposzómák segítségével tanulmányozzák [79]. Ezek a tényezők lehetnek ionizáló sugárzások, UV sugárzás, fagyasztás, hőkezelés, ozmotikus nyomásváltozás, kiszáradás stb. A liposzómák gyógyszeripari felhasználása is sokirányú. A gyógyszeripari kutatásokban a liposzómák a modell és a reagens szerepét is betölthetik, alkalmazzák a sejt sejt kölcsönhatások, az endocitózis, a sejtfúzió, vagy a sejt felületen lévő receptorok működésének tanulmányozásánál. A liposzómák hatékony gyógyszertárolóknak és -szállítóknak is bizonyultak, ezért a gyógyszerkészítmények célzott szervezetbe juttatásában és adagolásában is egyre fontosabbak. A liposzómák előnye az egyéb gyógyszerszállítókkal szemben abban rejlik, hogy a szervezetben is megtalálható foszfolipidekből építhetők fel, ennek megfelelően biokompatibilisek, 26

31 biológiailag lebonthatók, nem toxikusak és nem váltanak ki immunreakciót. Kismértékű stabilitásuk, a sterilizálási problémák és a részecskeméret eléggé gyenge reprodukálhatósága ugyanakkor nehezíti felhasználásukat. Bár maguk a liposzómák nem toxikusak, bizonyos gyógyszerek esetén a liposzóma jelenléte a készítmény mérgező hatását növelheti. Egyéb mellékhatásokkal is számolni kell. A túl nagy részecskeméret a kapillárisok elzáródását eredményezheti, és embóliát okozhat. A lipoproteinek működése megváltozhat a szérumban a foszfolipid kicserélődés miatt, a sejtmembránok lipid-, koleszterin-, illetve membránfehérje tartalma pedig csökkenhet a sejtekkel való kölcsönhatás eredményeként, ami a sejtek működését megzavarhatja. A lipidek hidrolízise, illetve peroxidációja bizonyos esetekben hemolízishez is vezethet azonban ez a hatás antioxidánsok alkalmazásával elkerülhető [80]. A felsorolt mellékhatások ellenére általánosságban azt mondhatjuk, hogy megfelelő összetételben a liposzómák előnyös és biztonságos gyógyszerszállító rendszerek. A liposzómák kedvező hatásait a gyógyszerek szervezetbe juttatásában a következőkben foglalhatjuk össze [80]: a./ a vizes közegben nem, vagy rosszul oldódó készítmények a liposzóma lipid részében oldva bejuttathatók a szervezetbe, b./ a megfelelő liposzómába zárt gyógyszer hosszabb ideig képes a keringésben maradni, így a liposzóma mikrotartályként folyamatosan (akár több napig is) biztosítja a hatóanyag jelenlétét, c./ a liposzómák alkalmazásával sok gyógyszer bél-, vese-, szív-, illetve agyműködést zavaró mellékhatása kiküszöbölhető, mivel ezek a szövetek a liposzómákat nem, vagy csak kis mértékben veszik fel, d./ az önmagukban toxikus gyógyszerek terápiás indexe is jelentősen növelhető a liposzómák segítségével, mivel kiürülésük az immunrendszer segítségével történik, e./ a liposzómába zárt gyógyszer célirányosan a beteg sejtbe/szövetbe juttatható, és felhalmozható a daganatos és gyulladásban lévő sejtek megváltozott anyagcserefolyamatai és szerkezete miatt, f./ vegyületet liposzómába zárva növelhető a hidrofil, illetve a töltéssel rendelkező molekulák sejtbe irányuló transzportja. A hatóanyag szervezetbe jutása a liposzómából egy sokparaméteres folyamat eredménye. A vérszérum összetétele (lipoprotein tartalom, ph, Ca 2+ ion koncentráció, stb.) és a környezet hőmérséklete mellett fontos tényező a liposzóma foszfolipid 27

32 összetétele, és koleszterin tartalma. A koleszterin szint növelése általában növeli a liposzóma stabilitását és ezzel a bezárt vegyület liposzómán belüli élettartamát. Ez kedvez az időben elnyújtott gyógyszerfelvételnek [81]. Hidrogén-híd kötések kialakítására képes fejcsoportok szintén a szérumban való keringési idő hosszabbodását segítik. Egyéb stabilizálószerek (pl. trehalóz, maltóz, dextrán) in vitro alkalmazása hasonló eredményekre vezetett [82-84]. A liposzóma és a sejtek kölcsönhatása is fontos a gyógyszerszállítás szempontjából. A kölcsönhatás négy folyamatra bontható: a./ lipidek és proteinek cseréje a membránok felületén, b./ a liposzóma adszorpciója, vagy kötődése a sejt felületéhez, c./ a liposzóma bekebelezése endocitózis, vagy fagocitózis útján, d./ a felületen kötött liposzóma fúziója a sejttel. A fenti kölcsönhatások mindegyikében meghatározó szerepe van a lipid összetételnek, a sejt típusának, és a megfelelő receptorsejtek jelenlétének. A szervezetbe juttatott liposzómák a bennük szállított hatóanyaggal együtt az immunrendszer védekező mechanizmusának megfelelően, előbb vagy utóbb az immunoglobulinok és a makrofágok segítségével kikerülnek a keringési rendszerből. A gyógyszerszállítás hatékonyabbá akkor tehető, ha az immunrendszer védekezése blokkolható a hatóanyagot hordozó liposzómával szemben. Megfelelő adalék anyagokat (töltéssel rendelkező csoportok, koleszterin, glikolipidek, polioxi-etilénglikol) adva a liposzómákhoz a felület merevebbé válik, így az immunrendszer "jelölő" molekulái nem képesek a liposzómához kötődni, mivel ezt a liposzóma sztérikus stabilizáltsága megakadályozza [85]. Ezek az ún. Stealth liposzómák hosszú ideig (20-50 óra) képesek a keringésben maradni, ami a hatóanyag biológiai eloszlását és a farmakokinetikai folyamatokat megváltoztatja, új utakat nyitva ezzel a liposzómák még hatékonyabb gyógyszeripari alkalmazásához. 28

33 A humán szérum albumin A szérum albumin a szérum legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjéje, koncentrációja mg/ml. A szervezet teljes albumin készletének 80 %-a található az intravaszkuláris térben, a maradék extravaszkulárisan, legnagyobb mennyiségben a gyomor- és bélcsatorna nedveiben és a nyirokban fordul elő. A szérum albumin élettani szerepe sokrétű. Képes megkötni, és ilyen formában szállítani a vérkeringésbe jutó vegyületek jelentős részét, inaktiválja a mérgező bomlástermékeket (pl. a bilirubin), biztosítja a kolloid ozmotikus nyomás nagy részét (~80 %), szerepet játszik a vér ph-jának stabilizálásában. Az albumin felületi adszorpciója fontos lépés a vér koagulációs kaszkádjában is [86]. A plazmafehérjék közül általában az albumin adszorbeálódik elsőként, és az adszorpció következtében a felület fizikokémiai, illetve biológiai tulajdonságai jelentősen megváltoznak. Élettani szempontból a HSA és a sejtmembrán közötti kölcsönhatás is fontos, részben az albumin szoros sejtkapcsolatokon keresztüli transzportja (ezáltal a HSA szervezeten belüli eloszlása [87]), részben a fehérje által szállított anyagok felszívódása (intra- és extracelluláris térben való megoszlása) miatt. Érdemes megemlíteni, hogy a HSA jelenlétének módosító hatását sejttenyészetek porfirin felvétele esetében is leírták [88,89] A humán szérum albumin szerkezete A HSA 585 aminosavból épül fel, molekulatömege D. Teljes aminosav sorrendjét 1975-ben határozták meg [90]. Izoelektromos pontja 4,7, tehát semleges kémhatású oldatban felületi össztöltése negatív. Egy szabad szulfhidrid csoportot tartalmaz, amely interalbumin diszulfid-kötés kialakítására képes. Röntgen krisztallográfiás szerkezetét 1992-ben határozták meg (0,28 nm felbontással) [91] (PDB ID kód: 1uor). A fehérje alakját és felületi töltéseloszlását ph 7 mellett a 3/5. ábra mutatja. A molekulának ~67 %-a -helikális, ~10%-a -redőzött, a polipeptidlánc fennmaradó része pedig flexibilis régiókba rendeződött. Három szerkezetileg homológ doménból épül fel (I, II, III), ezek mindegyike további két-két alegységre bontható (A és B). 29

34 3/5. ábra: A humán szérum albumin felületi töltés eloszlása ph 7-es közegben A HSA 17 diszulfid hidat tartalmaz, amik elsősorban az -hélixek között létesítenek kapcsolatot. A fehérjében egyetlen triptofán van (Trp 214), amely fontos szerepet játszik a IIA kötőhely szerkezetének kialakításában, és részt vesz a IIA és IIIA domének zsebeinek hidrofób kölcsönhatásában is. Bár az aminosav-sorrend alapján a röntgendiffrakciós szerkezet meghatározása előtt aszimmetrikus töltéseloszlást becsültek (-10, -8, 0 az I, II, III doménekre), a térszerkezet eléggé egyenletes töltéseloszlást mutat. A molekula felszínén semleges felületek is találhatók, amelyeknek a hosszú oldalláncú aminosavakkal való kölcsönhatásban lehet szerepük. A HSA a rendszer ph-jától függően különböző konformációkban létezhet. Az N ("normális" normal) konformáció semleges közegben, a B ("bázikus", basic) konformáció ph 8 környezetében, az F ("gyorsan mozgó", fast) konformáció ph 4 alatt, az E ("nyújtott", extended) konformáció 3,5-nél kisebb ph mellett, az A ("elöregedett", aged) konformáció pedig 8-nál nagyobb ph-nál válik dominánssá [92]. Fiziológiás körülmények között (ph 7,4 foszfát puffer) a B és az N konformáció %-ban van jelen [93]. Ca 2+ ionok jelenléte elősegíti a B konformáció képződését, a B forma aránya 80 %-ra is emelkedhet [93,94]. Figyelembe véve, hogy számos szövet membránjának felszínén 4 körüli ph értéket mértek, feltételezhető, hogy az F konformációnak is van 30